СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СТАДИИ ФИБРОЗА ПЕЧЕНИ У ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКИМ ВИРУСНЫМ ГЕПАТИТОМ С Российский патент 2019 года по МПК G01N33/49 G01N33/50 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для оценки состояния печени у больных хроническим вирусным гепатитом С путем определения стадии фиброза, которая рассматривается в качестве критерия.

Хронический вирусный гепатит С (ХВГС) и хронический вирусный гепатит В (ХВГВ) в настоящее время представляют собой актуальную проблему: по оценкам экспертов Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), вирусом гепатита С во всем мире инфицировано 150-500 миллионов человек, при этом более 50% живущих с вирусным гепатитом, не знают о своем заболевании по причине бессимптомного течения инфекции, что приводит к постоянному росту заболеваемости.

Прогноз для пациентов с хроническим вирусным гепатитом С (ХВГС) (точно так же, как хроническим вирусным гепатитом В) зависит от своевременной диагностики фиброза печени на начальных стадиях (F0-2 по классификации METAVIR), поскольку многочисленными исследованиями установлено, что ведущими процессами в прогрессировании заболевания являются фиброз печени и деструкция ДНК, приводящая к мутационным изменениям. При своевременном и эффективном лечении на этих стадиях возможно избежать формирования цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК), ассоциированных с вирусом гепатита С (ВГС) и, более того, добиться полного регресса фиброза.

В настоящее время «золотым» стандартом в диагностике заболеваний печени, включая стадию фиброза, является тонкоигольная аспирационная пункционная биопсия печени с последующим гистологическим определением стадии фиброза (Leftkowich J.H. Liver biopsy assessment in chronic hepatitis // Arch. Med. Res. - 2007. - Vol. 38. - №6. - P. 634-643). Однако известный способ является трудоемким, занимает продолжительное время и требует высокой квалификации морфологов, при этом инвазивный метод не всегда позволяет получить материал из нужного участка с максимально выраженным фиброзом, имеет ряд противопоказаний к применению и может сопровождаться развитием осложнений после выполнения процедуры.

Другой используемый на практике способ диагностики стадии фиброза печени осуществляемый с помощью Фибротеста (Biopredictive, Франция), описан в работе Poynard Т., Imbert-Bismut F., Munteanu М. Overview of the diagnostic value of biochemical markers of liver fibrosis (FibroTest, HCV FibroSure) and necrosis (ActiTest) in patients with chronic hepatitis C. (Comp Hepatol 2004; 3: 8). В соответствии с известным способом, по стандартной методике в сыворотке крови определяют значение шести специфических маркеров, включающих гаптоглобулин, альфа-2-макроглобулин, аполипопротеин А1, гамма-глутамилтранспептидазу (ГГТП), аланинаминотрансферазу (АЛТ) и общий билирубин. На основании полученных данных, с помощью программного обеспечения по разработанному алгоритму, с учетом пола и возраста, вычисляют результирующую величину, определяющую степень активности гепатита и стадию фиброзных изменений в печени по классификации METAVIR. К недостаткам известного метода, в первую очередь, следует отнести его высокую стоимость, а также ряд ограничений, связанных с тем, что значения тестируемых маркеров меняются не только при патологии печени, но и при заболеваниях других органов, а также под влиянием различной терапии, что может существенно искажать объективную картину.

Известные на текущий момент технические решения, в том числе выполненные на уровне изобретений, не дают исчерпывающего решения проблемы; создание и внедрение в практику малоинвазивных, доступных и простых способов определения стадии фиброза печени, в частности, с применением маркеров, полученных из периферической крови, остаются актуальными.

Известен способ оценки фиброза печени у больных хроническим вирусным гепатитом С (RU 2416794, опубл. 20.04.2011), включающий исследование фенотипа CD56 + лимфоцитов крови и, по определенному диапазону значений процентного содержания CD3+/CD56+, CD3+/CD56+/CD4+, CD3+/CD56+/CD8+, CD56+/CD94+, CD56+/NKG2D+, CD56+/CD107a+ клеток в крови, позволяющий судить о наличии третьей (предцирротической) стадии фиброза, при этом изменение содержания в крови 5 из 6 параметров: CD3+/CD56+ клеток ниже 4,3%, CD3+/CD56+/CD4+ клеток ниже 24%, CD3+/CD56+/CD8+ клеток выше 27,7%, CD56+/CD94+ клеток ниже 31,6% или выше 41,6%, CD56+/NKG2D+ клеток ниже 98,5%, и CD56+/CD107a+ клеток выше 58,9% рассматривают как переход заболевания в цирроз печени. Недостатком известного способа является ограниченность его применения конечной стадией фиброза печени и переходом в цирроз, при этом необходимость определения большого количества иммунологических показателей и высокая стоимость исследования затрудняет его применение в широкой клинической практике.

Известен способ дифференциальной диагностики фиброза печени при ХВГС (RU 2408289, опубл. 10.01.11), основанный на исследовании венозной крови пациента, согласно которому методом твердофазного иммуноферментного анализа в сыворотке крови определяют концентрацию трансформирующего фактора роста-1β (TGF-1β). При значении концентрации TGF-1β более 400 пг/мл диагностируют слабый или умеренно выраженный фиброз печени. При значении TGF-1β менее 400 пг/мл - тяжелый фиброз или цирроз печени. Недостатком известного способа является его ограниченность и неточность, связанная с тем, что в нем не учитывается процесс фибролиза, поскольку ТФР-β1 может свидетельствовать только о фиброгенезе печени, в то время как фиброз печени представляет собой универсальный патофизиологический процесс, характеризующийся нарушением равновесия между синтезом и разрушением компонентов экстрацеллюлярного матрикса. Кроме того, недостатком известного способа является его низкая чувствительность при начальных стадиях фиброза печени и при его отсутствии.

Известен способ диагностики выраженного фиброза печени при хроническом гепатите С естественного течения с 1 генотипом (RU 2639480, опубл. 21.12.2017), согласно которому в нейтрофилах и моноцитах периферической крови определяют активность цитохимических ферментов: лактатдегидрогеназы (ЛДГ), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ) и никотинамидадениндинуклеотид-диафоразы (НАД-диафоразы) и при снижении их активности в нейтрофилах и моноцитах более чем в три раза по сравнению с нормой диагностируют выраженный фиброз печени. Недостатком известного способа является ограниченность его применения: он не предназначен для расчета стадии фиброза печени при ХВГС с другими генотипами.

Известен способ диагностики фиброза печени у пациентов с ХВГС (RU 2601113, опубл. 27.10.2016), согласно которому в сыворотке крови больного определяют количество тромбоцитов, уровень аспартатаминотрансферазы и концентрацию фактора некроза опухоли альфа с последующим вычислением на их основе индекса фиброза (ИФ) печени по следующей формуле:

где 1,52 - константа, вычисленная методом множественной регрессии,

-0,0047,0,0091 и 0,0429 - коэффициенты показателей, вычисленные методом множественной регрессии,

TP - тромбоциты (10⁹/л),

ACT - аспартатаминотрансфераза (Е/л),

ФНО-α - фактор некроза опухоли альфа сыворотки крови (пг/мл),

и при значении индекса фиброза печени в интервале от 0 до 0,5 определяют отсутствие фиброза (стадия F0), при этом значение ИФ в интервале от 0,6 до 2,5 соответствует умеренной стадии фиброза (F1-2), значение ИФ более 2,5 соответствует выраженной стадии фиброза печени (F3-4). Известный способ указывает лишь возможный диапазон, в котором с определенной степенью вероятности находится искомая степень фиброза, при этом низкая специфичность изменений уровня ФНО-α, не всегда связанных именно с образованием фиброза в печени, снижает точность диагностики фиброза в начальной стадии. Возможность применения известного способа ограничена пациентами с ХВГС 1 генотипа.

Наиболее близким к заявляемому способу является метод диагностики фиброза печени при хроническом вирусном гепатите, основанный на генотоксическом эффекте влияния вирусов гепатита С на ДНК лимфоцитов, который включает оценку степени повреждения ДНК методом ДНК-комет в щелочной среде (Эпидемиология и инфекционные болезни. 2015. 20(2). С. 29-33). Согласно известному методу, в лимфоцитах, выделенных известным методом из разовой пробы крови, степень повреждения ДНК оценивают с помощью показателя содержания ДНК в хвосте комет (DNA t, %), регистрируют количество комет с повреждениями ДНК более 50%, определяют уровень общей антиоксидантной активности по содержанию 8-нитрогуанина (8-NO2G) и 8-оксо-7,8-дигидро-2'-дезоксигуанозина (8-OHdG), после чего путем статистической обработки данных устанавливают коэффициент корреляции между исследуемыми параметрами в группах больных ХВГС и степенью фиброза.

Учитывая тот факт, что определяющую роль в развитии и прогрессировании хронического гепатита играет иммунная система, а ВГ-индуцированное поражение печени в большей степени опосредовано иммунными механизмами, чем прямыми цитопатическими эффектами самого вируса, характер иммунного ответа может служить одним из критериев прогрессирования фиброза и, в конечном итоге, развития цирроза печени. Оценка полученных результатов по критерию содержание ДНК (в %) в «хвосте» кометы свидетельствует, что уровень показателей изменяется в зависимости от степени проявления фиброза.

Однако точность известного способа, обеспечивающего только качественную оценку уровня фиброза печени, которую, вдобавок, можно считать однозначной только в случае пациентов с ХВГС 1 генотипа, является недостаточной, что является причиной того, что в оценке формирования фиброза печени метод ДНК-комет играет вспомогательную роль.

Задачей изобретения является разработка доступного, не требующего значительных затрат способа диагностики, позволяющего однозначно и с высокой вероятностью определять стадии фиброза печени при ХВГС у пациентов с естественным течением заболевания, т.е. не получавших ранее лечение.

Техническим результатом предлагаемого способа является повышение достоверности определения стадии фиброза печени при одновременном расширении области его применения за счет возможности диагностики фиброза печени у пациентов с ХВГС всех генотипов.

Указанный технический результат достигают способом диагностики фиброза печени у пациентов с хроническим вирусным гепатитом С, в соответствии с которым в лимфоцитах периферической крови методом ДНК-комет определяют процент повреждений ДНК, проводят дополнительный анализ крови и с помощью полученных данных оценивают стадии фиброза печени у больных ХВГС, при этом, в отличие от известного способа, оценку осуществляют с использованием предсказательной математической модели, при этом выполняют клинический и общетерапевтический биохимический анализ крови, по результатам анализов находят коэффициенты порядковой логистической регрессии с регуляризацией для пациентов с гепатитом С, рассчитывают значения вспомогательных показателей e_s1 и e_s2, подставляя полученные коэффициенты в следующие формулы:

где ехр - экспоненциальная функция,

возраст - возраст пациента (в годах),

эритроциты - содержание эритроцитов, 10¹²/л

ACT - аланинаминотрансфераза, ЕД/л

АЛТ - аспартатаминотрансфераза, ЕД/л

глобулины - содержание глобулинов, в %

% ДНК в хвосте кометы - содержание ДНК в хвосте кометы лимфоцита, в %, гемоглобин -содержание гемоглобина, г/л,

после чего находят значения вероятности Р для каждой стадии фиброза по формулам:

и определяют в качестве наиболее вероятной стадию фиброза печени, которая соответствует максимальному значению вероятности.

Предварительно была обследована группа пациентов с хроническим вирусным гепатитом С (ХВГС), при этом критериями исключения из исследуемой группы служили: наличие коинфекции вирусного гепатитаВ и вирусного гепатита D, признаки хронической артериальной недостаточности, ишемическая болезнь сердца, сердечная недостаточность, сахарный диабет; другие инфекционные и сопутствующие заболевания внутренних органов в стадии обострения. Исключены из исследования были также беременные, пациенты с психическими заболеваниями, курильщики. Все больные получали стандартную патогенетическую терапию ХВГС.

Проведенные исследования включают детальный анализ клинико-лабораторных данных, при этом диагноз хронического вирусного гепатита устанавливали на основании выявленных методом иммуноферментного анализа (ИФА) суммарных антител к ВГС с давностью заболевания более 6 месяцев, идентифицированной методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) РНК ВГС с чувствительностью не менее 15 МЕ/мл. Стадию фиброза печени определяли на аппарате FibroScan по шкале METAVIR: F0 (нет фиброза) - не более 6,2 кПа; F1 (слабый фиброз) - 6,2-8,3 кПа; F2 (умеренный фиброз) - 8,3-10,8 кПа; F3 (тяжелый фиброз) - 10,8-14 кПа; F4 (цирроз печени) - более 14 кПа.

У всех пациентов проводили стандартные исследования, включающие физикальное обследование; общеклинический анализ крови на гематологическом анализаторе с определением скорости оседания эритроцитов (СОЭ) по Панченкову; общий анализ мочи, биохимическое исследование крови с определением содержания общего билирубина, холестерина, общего белка, альбуминов, глобулинов, креатинина, мочевины, глюкозы, сывороточного железа, протромбинового индекса (ПТИ), активности аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспарагинаминотрансферазы (АСТ),щелочной фосфатазы (ЩФ), гамма-глутамилтранспептидазы (ГГТП), амилазы; исследование профиля маркеров: Anti-HCV-суммарные (IgM+IgG), антитела IgG к структурным: Cor-1, Cor-2 и неструктурным: хеликаза, NS3, NS4, NS5 нуклеокапсидам, генотипирование вируса с определением РНК ВГС количественно, Также были использованы инструментальные методы обследования: ультразвуковое исследование (УЗИ) органов брюшной полости и щитовидной железы, рентгенография легких, электрокардиография (ЭКГ), эзофагогастродуоденоскопия (ЭГДС). У всех пациентов определялась степень деструкции ДНК лимфоцитов.

Результаты показали наличие деструктивного процесса ДНК лимфоцитов практически у всех пациентов, а стадии фиброза обнаружили прямую зависимость со степенью повреждения ДНК. Наименьший %ДНК в хвосте кометы у пациентов с ХВГС - 12,7%.

На основании детального изучения полученных данных была разработана предсказательная математическая модель для оценки стадии фиброза печени у больных ХВГС с использованием порядковой логистической регрессии с регуляризацией.

Способ осуществляют следующим образом.

На первом этапе определяют этиологию вирусного гепатита по общепринятым методикам и делают анализ крови пациента, включающий клинические показатели и биохимический анализ.

Оценку стадии фиброза печени пациентов с хроническим вирусным гепатитом С (ХВГС) выполняют, опираясь на предсказательную математическую модель, в которой упомянутая стадия является наблюдаемой переменной, принимающей дискретные значения 1, 2, 3 (F0, F1-2 и F3-4, соответственно).

Поиск модели проводился на отдельной подвыборке пациентов с гепатитом, С, причем при выборе оптимальной предсказательной модели была использована процедура кросс-валидации, которая позволяет при небольшом объеме выборки получить более корректные оценки качества классификации при использовании модели на наблюдениях, не входящих в имеющуюся выборку.

Согласно этой модели, количественный показатель выраженности у пациента определенной стадии фиброза является ненаблюдаемой непрерывной переменной (FIB*):

где i - номер наблюдения; - вектор объясняющих переменных (включая константу); β - коэффициенты регрессионной модели; ε_i - независимые случайные величины, имеющие одинаковое распределение.

Наблюдаемой переменной является стадия фиброза, которая была зафиксирована по результатам эластометрии печени для пациента i (FIB_i) и которая в нашем случае может принимать дискретные значения 1, 2, 3 (F0, F1-2 и F3-4, соответственно). Поэтому фактически вместо модели (1) мы можем оценить модель вида:

где i - номер наблюдения; - вектор объясняющих переменных (включая константу); β_j - вектор коэффициентов при объясняющих переменных (включая константу), который может зависеть от стадии фиброза j (j=1, 2, 3); ε_i - независимые случайные величины, имеющие одинаковое логистическое распределение; γ_j - неизвестные границы.

Предсказанная по результатам оценки модели (2) вероятность j-й стадии фиброза для i-го пациента будет следующей:

где - гамма-функция, - вектор объясняющих переменных (включая константу); β_j - вектор коэффициентов при объясняющих переменных (включая константу), который может зависеть от стадии фиброза j (j=1, 2, 3); ε_i - независимые случайные величины, имеющие одинаковое логистическое распределение.

Оценки параметров β_j могут быть получены с помощью метода максимального правдоподобия.

Для определения стадии фиброза вероятность каждой стадии представляют следующим образом:

Вероятность F0:

Вероятность F1-2:

Вероятность F3-4:

Соответственно, по той вероятности, которая окажется наибольшей из этих трех, можно будет предсказать, какая стадия фиброза, вероятнее всего, имеется у данного пациента.

Для отбора предикторов и получения оценок коэффициентов регрессионной модели используют оценку порядковой логистической регрессии по штрафам и оценку с помощью метода эластичной сети.

Во избежание переобучения модели (чрезмерной подгонки под имеющуюся выборку), используют процедуру кросс-валидации по K блокам (для выборки пациентов с гепатитом С берут K=10). Для каждой из K обучающих подвыборок поиск оптимального значения регуляризационного параметра (λ) производится с помощью оценки модели по 20 различным значениям λ с выбором того из них, при котором значение информационного критерия Акаике (AIC) является минимальным. Для ряда предикторов после регуляризации с тем или иным параметром λ коэффициенты регрессии могут оказаться нулевыми - эти переменные не будут участвовать в предсказании стадии фиброза.

Результаты оценки порядковой логистической регрессии с регуляризацией по методу эластичной сети по 10 блокам выборки пациентов с гепатитом С представлены в таблице 1. В среднем ошибка классификации составила около 20%.

Полученные с выделенным выше значением λ ненулевые оценки коэффициентов представлены в таблице 2.

В данном случае гипотеза о равенстве коэффициентов для разных стадий фиброза была принята для всех предикторов, кроме возраста и эритроцитов.

С помощью оценок коэффициентов модели можно предсказать наличие у пациента i с гепатитом С определенной стадии фиброза по формулам (4, 5, 6) с использованием следующих вспомогательных показателей:

где exp - экспонента,

-0,933; 0,049; 0,410; 0,012; 0,014; 0,053; 0,023; 0,027; -6,497; 0,043; 2,417 - константы,

e_s1, e_s2 - переменные коэффициенты формул (4, 5, 6);

%ДНК в хвосте кометы - содержание ДНК в хвосте кометы лимфоцитов периферической крови (в %);

эритроциты - содержание эритроцитов в периферической крови, 10¹²/л;

ACT- содержание аспартатаминотрансферазы, ЕД/л;

АЛТ - содержание аланинаминотрансферазы, ЕД/л;

глобулины - содержание глобулинов в периферической крови, %;

гемоглобин - содержание гемоглобина в периферической крови.

Содержание вышеперечисленных параметров относится к крови и сыворотке крови i-того пациента.

Соотношение фактической и предсказанной с помощью данной модели стадии фиброза для пациентов с гепатитом С представлено в таблице 3. Посчитанная по этой таблице ошибка классификации составляет 14%.

Пример конкретного осуществления способа

Пациент И. (45 лет) обратился на прием по поводу положительного анализа крови на aHCV и положительной ПЦР РНК ВГС (качественно). В результатах обследований (значимых для расчета стадии фиброза):

1) Подставляют данные значения в формулы для e_s1 и e_s2:

2) Полученные значения e_s1 и e_s2 используют для подсчета вероятности по формулам (4, 5 и 6). Оценивают, какое значение из них является максимальным, и определяют по нему предсказанную стадию фиброза.

Вероятность F0:

Вероятность Fl-2:

Вероятность F3-4:

Наибольшим в данном случае является значение, которое соответствует стадии фиброза F3-F4. Фактическая степень фиброза печени у данного пациента по результатам эластометрии - F4.

Простота технического выполнения, а также интерпретации результатов исследования, малая инвазивность; безопасность для пациентов, а именно отсутствие противопоказаний и потенциального риска развития осложнений, позволяют рекомендовать предлагаемый способ к применению в клинической практике.

К дополнительным преимуществам способа можно отнести невысокие затраты средств; кратковременное ожидание заключения с момента проведения диагностики; возможность повторного исследования, осуществляемого с необходимой частотой в динамике; применение не только «рутинных» биохимических, но и специфических показателей в качестве маркеров фиброзного перерождения печени, повышающее точность диагностики.

Изобретение относится к области медицины и может найти применение в диагностике стадии фиброза печени у пациентов с хроническим вирусным гепатитом С (ХВГС). Согласно предлагаемому способу определяют методом ДНК комет степень повреждений ДНК лимфоцитов периферической крови, осуществляют клинический и общетерапевтический биохимический анализ крови, с использованием предсказательной математической модели по результатам анализов пациентов с ХВГС находят коэффициенты порядковой логистической регрессии с регуляризацией, с помощью которых рассчитывают значение вспомогательных показателей e_s1 и e_s2 по формулам e_s1=exp(-0,933-0.0498*Возраст+0,410*Эритроциты-0,0128*АСТ-0,014*АЛТ-0,053*Глобулины-0,023*%ДНК в хвосте кометы+0,0278*Гемоглобин); e_s2=exp(-6,497-0,043*Возраст+2,417*Эритроциты-0,012*АСТ-0,014*АЛТ-0,053*Глобулины-0,023*%ДНК в хвосте кометы+0,0,27*Гемоглобин), где ехр - экспоненциальная функция; возраст - возраст пациента (в годах); Эритроциты – содержание эритроцитов; ACT – аспартатаминотрансфераза; АЛТ – аланинаминотрансфераза; Глобулин – содержание глобулина в периферической крови, г/л; %ДНК в хвосте кометы – содержание ДНК в хвосте кометы лимфоцитов периферической крови у i-того пациента (%). Затем вычисляют значения вероятности P для каждой стадии фиброза по формулам

и устанавливают ту стадию фиброза печени, которая соответствует максимальному значению вероятности. Изобретение обеспечивает повышение достоверности и точности определения стадии фиброза печени и характеризуется малой инвазивностью и безопасностью для пациентов. 3 табл., 1 пр.

Способ диагностики фиброза печени у пациентов с хроническим вирусным гепатитом C, согласно которому в лимфоцитах периферической крови методом ДНК-комет определяют процент повреждений ДНК, проводят дополнительный анализ крови и с помощью полученных данных оценивают стадии фиброза печени у пациентов, отличающийся тем, что оценку проводят с использованием предсказательной математической модели, при этом выполняют клинический и общетерапевтический биохимический анализ крови, по результатам анализов находят коэффициенты порядковой логистической регрессии с регуляризацией, вычисляют значения вспомогательных показателей e_s1 и e_s2, подставляя полученные коэффициенты в следующие формулы:

где ехр - экспоненциальная функция; возраст - возраст пациента (в годах);

эритроциты - содержание эритроцитов;

ACT - аспартатаминотрансфераза;

АЛТ - аланинаминотрансфераза;

Глобулин - содержание глобулина в периферической крови, г/л;

%ДНК в хвосте кометы - содержание ДНК в хвосте кометы лимфоцитов периферической крови у i-того пациента (в %);

после чего вычисляют значения вероятности Р для каждой стадии фиброза по формулам

и устанавливают ту стадию фиброза печени, которая соответствует максимальному значению вероятности.