СПОСОБ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ СТАДИИ ФИБРОЗА ПЕЧЕНИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ВИРУСНОМ ГЕПАТИТЕ С Российский патент 2016 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, в частности к способам лабораторной диагностики заболеваний печени, и может найти применение для уточнения стадии фиброза печени в клинико-лабораторных условиях.

Характерной особенностью вирусного гепатита С является высокая частота хронизации инфекции, длительная персистенция вируса, риск развития цирроза, рака печени и тяжелых внепеченочных проявлений хронического гепатита [Alter H.J., Seff L.B. Recovery, persistence, and sequelae in hepatitis С virus. Seminars in liver disease. 2000; 20 (1): 17-35]. Формирование цирроза и рака печени происходит приблизительно у 15-20% людей инфицированных вирусом гепатита С, именно эти пациенты относятся к группе максимального риска по неблагоприятному развитию заболевания. Раннее выявление и уточнение стадии фиброза позволяет своевременно начать лечение, направленное на уменьшение темпов прогрессирования фиброза и предотвращение развития цирроза и рака печени. Известно, что при выраженном фиброзе печени лечение не столь эффективно и может потребоваться продление сроков терапии и увеличение доз препаратов. Кроме того, на фоне проводимой терапии существует возможность обратного развития фиброза печени [Ismail М.Н., Pinzani М. Reversal of Liver Fibrosis Saudi J. Gastroenterol. 2009; 15 (1): 72-79. ]. Актуальной задачей является точная диагностика стадий фиброза печени с применением малоинвазивных лабораторных методов с использованием биомаркеров крови, которые дают возможность более точно диагностировать стадию заболевания, наблюдать за темпами прогрессирования фиброза и проводить исследования в динамике лечения ХВГС.

В настоящее время наиболее достоверным методом определения степени фиброза/цирроза печени остается гистологическое исследование материала, получаемого при проведении пункционной биопсии печени [Соринсон С.Н. Вирусные гепатиты в клинической практике. - СПб.: ТЕЗА, 1998. - 331 с.]. Гистологическое исследование позволяет уточнить причину заболевания печени, а также оценить стадию фиброза и индекс гистологической активности, принять решение о тактике ведения больного, оценить естественное течение или эффективность проведенного лечения. Наиболее распространенными и общепринятыми являются полуколичественные способы оценки выраженности индекса фиброза по шкале METAVIR [Poynard Т., Bedossa P., Opolon P. Natural history of liver fibrosis progression in patients with chronic hepatitis C. The OBSVIRC, METAVIR, CLINIVIR and DOSVIRC groups. Lancet. 1997; 349 (9055): 825-832]. Согласно этой шкале выделяют 5 стадий фиброза (F 0-4), где F0 соответствует отсутствию фиброза, a F4 - циррозу печени. К сожалению, биопсия печени, оставаясь «золотым стандартом» определения стадии фиброза, все-таки является инвазивным методом с определенным процентом осложнений, проводится в госпитальных условиях и имеет ряд противопоказаний. Трудности трактовки результатов исследования биоптатов печени связаны с очень небольшим объемом исследуемого материала, не обязательно характеризующим изменения печени в целом, а также с неоднозначными оценками одного и того же препарата, которые дают разные морфологи. Динамическое наблюдение за фиброзом печени с помощью биопсии затруднено ввиду инвазивности метода.

Широко применяют аппаратно-инструментальные методы исследования (УЗИ, МРТ), которые позволяют оценить форму, размеры, структуру органа, наличие или отсутствие объемных образований, провести исследования для косвенной оценки плотности и эластичности ткани печени. Одним из таких методов является ультразвуковая эластография печени. Метод позволяет оценить наличие фиброза печени, генерируя вибрационные импульсы, и по результатам компьютерного анализа судить об изменении эластических свойств печени [Павлов Ч.С., Глушенков Д.В., Ивашкин В.Т. Современные возможности эластометрии, Фибро- и АктиТеста в диагностике фиброза печени «Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии» 2008; 16 (4): 43-52]. Однако даже эластография печени, позволяющая с высокой точностью дифференцировать выраженные и тяжелые степени фиброза/цирроза печени, не обладает достаточной чувствительностью при определении и дифференцировании ранних стадий фиброза при ХВГС умеренной и низкой активности, а также не всегда адекватно отражает активизацию процесса. Кроме того, для проведения эластографии требуется специализированное дорогостоящее оборудование.

Известен лабораторный способ оценки фиброза печени у больных ХВГС с определением количества различных субпопуляций лимфоцитов крови [Способ оценки фиброза печени у больных хроническим вирусным гепатитом С (RU 2416794), опубликован 2009 год]. Суть метода заключается в определении процентного содержания CD56+ лимфоцитов крови с фенотипом CD3+/CD56+, CD3+/CD56+/CD4+, CD3+/CD56+/CD8+, CD56+/CD94+, CD56+/NKG2D+ и CD56+/CD107a+ и по диапазону полученных значений устанавить третью стадию фиброза (предцирротическую) или цирроз печени. Данный метод не применим для дифференциальной диагностики начальных стадий фиброза печени, а позволяет определять только поздние стадии фиброза или цирроз печени, когда лечение не столь эффективно.

Известен способ определения степени фиброза печени с использованием цитокинов [Способ мониторинга фиброза печени у больных хроническим гепатитом С (ХГС), RU 2309406, опубликован 2007 год], позволяющий установить наличие выраженного фиброза печени по значениям концентраций цитокинов IL-4, IL-10, IL-12p70, TNFα в плазме крови. Недостатком данного метода является невозможность разделить стадии фиброза печени, он может быть использован только для мониторинга фиброза печени.

Наиболее близким по своей сущности к методу, предлагаемому в данном изобретении, является алгоритм оценки степени фиброза печени с использованием маркеров сыворотки крови [Assessment of liver fibrosis scoring with serum marker algorithms, WO 0186304 (A2) - 2001, 6304A2&KC=A2&FT=D&ND=3&date=20011115&DB=EPODOC&locale=ru_ru]. Способ основан на определении в сыворотке крови содержания белков внеклеточного матрикса и матриксных металлопротеиназ: PIIINP, коллагенов IV и VI, тенасцина, ламинина, гиалуроновой кислоты, ММР-2, TIMP-1 и MMP-9/TIMP-1 с последующим проведением ступенчатого дискриминантного анализа, позволяющего диагностировать степень фиброза печени в соответствии с различными шкалами оценки фиброза печени.

Основным недостатком этого метода является большое количество измеряемых показателей и сложность математической обработки полученных данных.

Задача настоящего изобретения заключается в разработке способа диагностики стадии фиброза печени при ХВГС, который позволяет сократить количество измеряемых показателей, что упрощает процедуру диагностики с одновременным повышением чувствительности и сохранением требуемой специфичности. Изобретение обеспечит более точную диагностику фиброза печени на ранних стадиях заболевания, что позволит подобрать адекватную терапию и тактику ведения больного, а также оперативно выявить группы риска.

Поставленная задача достигается тем, что производится взятие образца периферической крови пациента, центрифугирование пробы с отделением плазмы с последующим диагностированием стадии фиброза печени по содержанию белковых продуктов в плазме крови. Авторами предложено в качестве определяемых белковых продуктов использовать цитокины CXCL11/ITAC, TNFα и CCL20/MIP-3α. Их концентрацию определяют в плазме крови и по соответствию концентрации маркера пороговым значениям диагностируют степень фиброза печени. Для оценки диагностической ценности анализируемых биомаркеров был проведен анализ характеристической кривой (receiver-operating-characteristic curve-ROC). Были рассмотрены графические изображения характеристических кривых и определены значения площади под кривой - AUC (Area Under the Curve). Данные анализа показали, что самостоятельно ни один из выделенных показателей не обладает высокой чувствительностью, что исключает возможность их изолированного использования с диагностической целью. В результате был применен метод построения деревьев решений в программе JMP 11.0, на основе полученных результатов которого было установлено, что совместное определение трех маркеров CXCL11/ITAC, TNFα и CCL20/MIP-3α является достаточным для оценки степени фиброза печени у больных ХВГС. Значения AUC для трех цитокинов были более 0,8, что говорит об очень хорошем качестве выбранной модели. В результате анализа были получены следующие пороговые значения для дифференциальной диагностики F1 и F2: CXCL11/ITAC - 166,5 пг/мл, TNFα - 15,7 пг/мл, CCL20/MIP-3α - 10,6 пг/мл; для дифференциальной диагностики F2 и F3: TNFα - 15,8 пг/мл, CXCL11/ITAC - 301,8 пг/мл, CCL20/MIP-3α - 15,5 пг/мл. Использование данного алгоритма для диагностики стадий фиброза печени позволяет достигнуть чувствительности метода 67-91% при достаточной специфичности.

Сущность изобретения поясняется чертежами, где на фигуре 1 представлено дерево решений для разделения групп больных ХВГС с F1 и F2, а на фигуре 2 представлено дерево решений для разделения групп больных ХВГС с F2 и F3.

Изобретение реализуется следующим способом.

Пример 1. Выбор порогового значения содержания цитокинов.

Для расчетов пороговых значений использовали значения содержания цитокинов CXCL11/ITAC, TNFα и CCL20/MIP-3α в группах больных ХВГС с различными стадиями фиброза печени (F1, F2 и F3). Образцы периферической крови забирали в вакуумную пробирку с антикоагулянтом K2 ЭДТА, центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин для отделения плазмы, которую отбирали в пробирки типа «Эппендорф», замораживали и хранили при -80°С до проведения эксперимента. Для определения содержания цитокинов в плазме крови использовали технологию мультиплексного иммуноферментного анализа по стандартным методикам согласно инструкциям производителя (Millipore, США). Статистическую обработку проводили с применением программ GRAPH Pad Prism 6.02 и GMP 11.0. Для оценки диагностической ценности анализируемых цитокинов был применен метод построения деревьев решений, на основе полученных результатов которого было установлено, что совместное определение трех маркеров CXCL11/ITAC, TNFα и CCL20/MIP-3α является достаточным для оценки степени фиброза печени у больных ХВГС. Первую степень фиброза печени диагностируют, если концентрация CXCL11/ITAC <166,5 пг/мл. Если содержание CXCL11/ITAC ≥166,5 пг/мл дополнительно определяют TNFα, при значениях которого ≥15,7 пг/мл также диагностируют первую степень фиброза печени. Если CXCL11/ITAC ≥166,5 пг/мл и TNFα <15,7 пг/мл, то дополнительно определяют CCL20/MIP-3α, при значениях которого <10,6 пг/мл также диагностируют первую степень фиброза печени. Если концентрации биомаркеров выходят за пороговые значения, характерные для первой степени фиброза печени, то проводят дополнительный анализ данных для дифференциальной диагностики второй и третьей стадий фиброза печени. Если при этом TNFα <15,8 пг/мл и CXCL11/ITAC ≥301,8 пг/мл, то диагностируют вторую степень фиброза печени, если TNFα <15,8 пг/мл и CXCL11/ITAC <301,8 пг/мл, то дополнительно оценивают значение CCL20/MIP-3α, при значениях которого <15,5 пг/мл также диагностируют вторую степень фиброза печени. Если значения маркеров не попадают в указанные интервалы для второй степени фиброза печени, то диагностируют третью степень фиброза печени.

Пример 2. Диагностика стадии фиброза печени на основе предлагаемого метода.

Больной Ж., 34 года.

Диагноз: хронический вирусный гепатит С (анти - HCV «+», РНК HCV «+», генотип 1), с минимальной степенью морфологической активности. Из анамнеза известно, что впервые антитела к вирусу гепатита С обнаружены в 2007 году. Противовирусную терапию не получал. В апреле 2013 года впервые произведена пункционная биопсия печени, при гистологическом исследовании был выявлен фиброз печени первой стадии (F1) по шкале METAVIR. В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации биомаркеров: CXCL11/ITAC - 153,2 пг/мл, TNFα - 15,6 пг/мл, CCL20/MIP-3α - 6,2 пг/мл. Таким образом, у больного значение CXCL11/ITAC <166,5, что соответствует первой степени фиброза печени и совпадает с данными гистологического исследования.

Больной Б., 42 года.

Диагноз: Хронический вирусный гепатит С (анти - HCV «+», РНК HCV «+», генотип 1). Сопутствующие заболевания: язвенная болезнь 12-перстной кишки, ремиссия. При стационарном обследовании в мае 2009 года выявлены антитела к вирусу гепатита С и диагностирован хронический гепатит С минимальной активности. В декабре 2011 года начата противовирусная терапия альфафероном и рибавирином. Госпитализирован в клинику инфекционных болезней с целью комплексного обследования и оценки эффективности проводимого лечения. При гистологическом исследовании был выявлен фиброз печени второй стадии (F2) по шкале METAVIR. В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации биомаркеров: CXCL11/ITAC - 246,4 пг/мл, TNFα - 13,1 пг/мл, CCL20/MIP-3α - 15,3 пг/мл. Таким образом, у больного значения CXCL11/ITAC ≥166,5 пг/мл, TNFα <15,7 пг/мл и CCL20/MIP-3α ≥10,6 пг/мл и TNFα <15,8 пг/мл, CXCL11/ITAC <301,8 пг/мл и CCL20/MIP-3α <15,5 пг/мл, что соответствует второй степени фиброза печени и совпадает с данными гистологического исследования.

Больной П., 36 лет.

Диагноз: Хронический вирусный гепатит С (анти - HCV «+», РНК HCV «+», генотип 1b), слабовыраженная активность, тяжелый фиброз. Из анамнеза известно, что впервые антитела к вирусу гепатита С обнаружены в 2007 году. Противовирусную терапию не получал, пункционная биопсия печени не проводилась. В сентябре 2013 года произведена эластография печени, по данным которой средний показатель эластичности печени составил 11,4 кПа, что соответствует третьей степени фиброза печени (F3). В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации биомаркеров: CXCL11/ITAC - 217,1 пг/мл, TNFα - 15,2 пг/мл, CCL20/MIP-3α - 48,0 пг/мл. Таким образом, у больного значения CXCL11/ITAC ≥166,5 пг/мл, TNFα <15,7 пг/мл и CCL20/MIP-3α ≥10,6 пг/мл и TNFα <15,8 пг/мл, CXCL11/ITAC <301,8 пг/мл и CCL20/MIP-3α ≥15,5 пг/мл, что соответствует третьей степени фиброза печени и совпадает с данными эластографии.

Изобретение относится к медицине и предназначено для уточнения стадии фиброза печени в клинико-лабораторных условиях. В качестве определяемых белковых продуктов используют цитокины CXCL11/ITAC, TNFα и CCL20/MIP-3α. Их концентрацию определяют в плазме крови и по соответствию концентрации маркера пороговым значениям диагностируют степень фиброза печени. Пороговые значения для дифференциальной диагностики F1 и F2: CXCL11/ITAC - 166,5 пг/мл, TNFα - 15,7 пг/мл, CCL20/MIP-3α - 10,6 пг/мл; для дифференциальной диагностики F2 и F3: TNFα - 15,8 пг/мл, CXCL11/ITAC - 301,8 пг/мл, CCL20/MIP-3α - 15,5 пг/мл. Способ позволяет сократить количество измеряемых показателей с одновременным повышением чувствительности метода до 67-91% и сохранением требуемой специфичности. 2 ил., 2 пр.

Способ лабораторной диагностики стадии фиброза печени при хроническом вирусном гепатите C с использованием биомаркеров, концентрацию которых измеряют в плазме крови и определяют степень фиброза печени на основе математического алгоритма, отличающийся тем, что измеряют значения трех биомаркеров, в качестве которых используют цитокины CXCL11/ITAC, TNFα и CCL20/MIP-3α, причем математический алгоритм анализа полученных результатов включает от одной до трех стадий, в зависимости от полученных значений концентраций биомаркеров, а стадию фиброза печени устанавливают путем сопоставления полученной концентрации биомаркеров с пороговыми значениями по следующему алгоритму: для диагностики первой степени фиброза печени необходимо оценить CXCL11/ITAC, при значениях которого <166,5 пг/мл однозначно диагностируют первую степень фиброза печени, а при CXCL11/ITAC ≥166,5 пг/мл дополнительно определяют TNFα, при значениях которого ≥15,6 пг/мл также диагностируют первую степень фиброза печени, если CXCL11/ITAC ≥166,5 пг/мл и TNFα <15,6 пг/мл, то дополнительно определяют CCL20/MIP-3α, при значениях которого <10,6 пг/мл также диагностируют первую степень фиброза печени, а если концентрации биомаркеров выходят за пороговые значения, характерные для первой степени фиброза печени, то проводят дополнительный анализ данных для дифференциальной диагностики второй и третьей стадий фиброза печени: если при этом TNFα <15,8 пг/мл и CXCL11/ITAC ≥301,8 пг/мл, то диагностируют вторую степень фиброза печени, если TNFα <15,8 пг/мл и CXCL11/ITAC <301,8 пг/мл, то дополнительно оценивают значение CCL20/MIP-3α, при значениях которого <15,5 пг/мл также диагностируют вторую степень фиброза печени; если значения маркеров не попадают в указанные интервалы для второй степени фиброза печени, то диагностируют третью степень фиброза печени.