Способ повышения клеточного иммунитета лабораторных животных Российский патент 2019 года по МПК A61K31/721 A61P37/00 

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии, экспериментальной и клинической фармакологии, в частности к разработке способа повышения клеточного иммунитета организма и может быть использовано в лабораторной работе по изучению клеточного иммунитета.

Иммунная система является основной защитной системой организма, которая контролирует поддержание гомеостаза внутренней среды и обеспечивает нормальное функционирование организма в целом.

Клеточный иммунитет - иммунные реакции, опосредуемые клетками, а не антителами или другими гуморальными факторами. В процессе клеточного иммунитета активируются макрофаги, натуральные киллеры, антиген-специфичные цитотоксические Т-лимфоциты, и в ответ на антиген выделяются цитокины. То есть клеточный иммунитетом называется - часть иммунной системы, представляющая собой комплекс взаимодействующих клеток, связанных между собой внутренними регуляторными связями посредством цитокинов.

Известен способ стимуляции гуморального и клеточного иммунитета при холодовом воздействии. Сущность способа заключается в том, что животным перед Холодовым воздействием перорально вводят препарат "Эпсорин" ежедневно в течение 5 дней в дозе 0,5 мл/кг (П РФ №2142809 от 20.12.1999, МПК A61K 35/36). Недостатком этого способа является способ введение препарата, подразумевающий индивидуальное пероральное применение каждому животному. Так же возникает потребность в дополнительном оборудовании (холодильнике и др.).

Наиболее близким решением, принятым за прототип, является способ применения композиции, обладающей иммуностимулирующим действием при сублингвальном применении (П РФ №2647455 от 31.05.2017, МПК A61K 9/50, A61K 31/7105, A61K 31/732). Сущность способа заключается в применении композиции, обладающей иммуностимулирующим действием для сублингвального применения, состоящую из двуспиральной РНК бактериофага Ф6, одноцепочечной дрожжевой РНК, пектина, лактата кальция, декстрана, хлорида натрия и воды очищенной. Данное изобретение обеспечивает стимуляцию клеточного звена иммунитета.

Однако данную композицию подразумевает сублингвальное индивидуальное применение каждому животному, что исключает одновременное применение большому количеству животных, особенно содержащихся в условиях вивария. Также данная композиция предполагает использование только в медицине, так как разработана для индивидуального применения для людей.

Задача изобретения - расширение арсенала способов повышения клеточного иммунитета лабораторных мышей.

Поставленная задача решается тем, что в способе повышения клеточного иммунитета лабораторных мышей, включающем применение биологически активного препарата, согласно изобретению в качестве препарата используют биотинилированное производное окисленного декстрана, представляющее собой конъюгат, полученный реакцией гидрозида биотина и окисленного декстрана с молекулярной массой 40-70 кДа с образованием азометиновой связи, при внутримышечном введении, в дозе 5 мл/кг живого веса мыши.

Способ осуществляется следующим образом.

Способ получения биологически активного препарата биотинилированного производного окисленного декстрана (П РФ №2537246 от 27.12.2014).

Сухой окисленный декстран с молекулярной массой 40-70 кДа предварительно растворяют в трис-ацетатном буферном растворе с рН 5,0-5,5 до концентрации 5%. Для запуска реакции в реакционную смесь добавляют гидразид биотина в качестве активного реагента в весовом соотношении с декстраном 1:(20-25) в пересчете на массу сухого вещества. Реакцию проводят при температуре 80-90°С в течение 30-60 минут. Гидразид биотина взаимодействует с карбонильными группами окисленного декстрана с образованием азометиновой связи -C=N-.

Полученный биологически активный препарат биотинилированного производного окисленного декстрана представляет собой конъюгат, в котором гидразид биотина и окисленный декстран связаны ковалентными связями. Именно наличие азометиновой связи в конъюгате гидразида биотина с окисленным декстраном обусловливает его специфические биологические свойства имитировать (моделировать) конъюгаты с лекарственными препаратами, имеющими в своей структуре первичные аминогруппы. Далее по тексту препарат обозначается «БОД». Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Определение дозировки и способ введения препарата БОД лабораторным мышам.

Для определения дозировки и способа введения были сформированы по принципу аналогов десять групп: девять опытных и одна контрольная (n=15). Животным опытной группы вводился препарат БОД по схеме, представленной в таблице 1.

Результаты влияния препарата БОД на морфологический состав клеток крови отвечающих за клеточный иммунитет представлены в таблице 2.

Из таблицы видно, что максимальное увеличение числа клеток ответственных за клеточный иммунитет отмечалось в группе с внутримышечным введением препарата в дозе 0,1 и 0,2 мл. Число моноцитов увеличилось на 58,33%, а число гранулоцитов увеличилось на 31,19 и 32,57% соответственно по сравнению с контрольной группой.

Также увеличение числа фагоцитирующих клеток отмечено в группе с подкожным введением препарата в дозе 0,1 и 0,2 мл: количество моноцитов увеличилось на 41,67%, а количество гранулоцитов - на 4,59 и 4,13% соответственно по сравнению с контрольной группой, что значительно меньше, чем в группах с внутримышечным введением.

В группе с оральным введением препарата установлено небольшое увеличение числа моноцитов (на 16,67 и 12,5% соответственно) и уменьшение числа гранулоцитов (на 13,76 и 13,30% соответственно) в сравнении с контрольной группой.

Проведенные исследования определили эффективный способ введения и дозировку БОД. Максимальное увеличение числа клеток отвечающих за клеточных иммунитет наблюдалось в группах мышей, препарат которым вводился внутримышечно в дозировке 0,1 и 0,2 мл. Применение дозировки препарата 0,2 мл не целесообразно, так как это ведет к перерасходу препарата при таких же показателях, как и при дозе 0,1 мл. При дозе менее 0,1 мл отсутствуют заметные эффекты от его применения.

Пример 2. Определение длительности применения препарата БОД лабораторным мышам.

Для определения длительности применения препарата БОД в дозе 0,1 мл (5 мл/кг) у лабораторных мышей на 7, 9 и 11 сутки опыта брали пробы крови для изучения морфологического состава. Результаты влияния длительности применения исследуемого препарата на морфологический состав клеток крови отвечающих за клеточный иммунитет представлены в таблице 3.

Максимальное увеличение числа клеток ответственных за клеточный иммунитет отмечалось в группе с внутримышечным введением препарата на 9 и 11 день введения. Число моноцитов увеличилось на 58,33 и 44,0% соответственно, а число гранулоцитов увеличилось на 31,19 и 32,26% соответственно по сравнению с контрольной группой.

Также увеличение числа фагоцитирующих клеток отмечено в группе с подкожным введением препарата на 9, 11 день введения: количество моноцитов увеличилось на 41,67 и 40,0%, а количество гранулоцитов - на 4,59 и 3,2% соответственно по сравнению с контрольной группой, что значительно меньше, чем в группах с внутримышечным введением.

В группе с оральным введением препарата установлено уменьшение числа моноцитовво (на 21,74, 16,67 и 8% соответственно) и уменьшение числа гранулоцитов (на 16,2, 13,76 и 13,82%) соответственно) в сравнении с контрольной группой.

Проведенные исследования определили длительность применения препарата БОД лабораторным мышам. Максимальное увеличение числа клеток отвечающих за клеточных иммунитет наблюдалось в группах мышей, препарат которым вводился внутримышечно 9 и 11 дней. Применение препарата 11 дней не целесообразно, так как это ведет к перерасходу препарата при таких же показателях, как и при 9 днях введения. Семь дней не достаточно для заметных эффектов от применения исследуемого препарата.

Пример 3. Влияние препарата БОД на гуморальный иммунитет.

Для определения влияние препарата БОД на гуморальный иммунитет определяли бактерицидную (БАСК) и лизоцимную (ЛАСК) активность сыворотки крови по стандартным методикам с использованием суточных культур E.coli и микроорганизмов рода Micrococcus, путем фиксирования разницы оптической плотности питательных сред с внесенной в них исследуемой сыворотки. Результаты изучения иммунологических и биохимических показателей крови представлены в таблице 4.

Установлено, что применение БОД лабораторным мышам, независимо от способа введения, не оказывает стимулирующего действия на показатели БАСК и ЛАСК. Количество общего белка, альбуминов и глобулинов в сыворотке крови животных контрольных групп, также существенно не изменяется.

По результатам исследования биохимических и иммунологических показателей сывороток крови в опытных группах в сравнении с контрольной группой можно сделать вывод, что применение БАД не оказывает влияние на гуморальный иммунитет.

Пример 4 Изучение влияния препарата БОД на активность иммунного фагоцитоза у лабораторных мышей.

Опыт проводился на 30 белых беспородных мышах, разделенных по принципу аналогов на три группы: две опытные и одну контрольную (в каждой группе по 10 мышей). Животным опытных групп препарат БОД вводился по следующей схеме:

1 группа - внутримышечное введение в дозе 0,1 мл один раз в два дня в течение 9 суток;

2 группа - внутримышечное введение препарата в дозе 0,1 мл один раз в сутки в 1 и 6 день введения.

Для оценки активности опсонизации проводили опсонофагоцитарную реакцию (ОФР) по стандартной методике. Результаты представлены в таблице 5.

Максимальные показатели фагоцитарной активности, фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа были отмечены в группе мышей, препарат которым вводили на протяжении 10 суток с интервалом 48 часов. При этом фагоцитарная активность больше в 1,2 раза, фагоцитарный индекс больше в 1,7 раза, а фагоцитарное число больше в два раза в сравнении с контрольной группой.

Выводы:

1. Учитывая специфику содержания животных в виварии, исключающую проведение профилактических вакцинаций применение данного препарата позволит повысить уровень клеточного звена иммунитета лабораторных мышей. Так же применение данного препарата обеспечит профилактику заболеваний бактериальной этиологии маточного поголовья и молодняка вивария, а так же животных используемых для проведения исследований.

2. Данный препарат обеспечит научную базу для проведения дальнейших исследований на сельскохозяйственных животных.

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии, экспериментальной и клинической фармакологии, в частности к разработке способа повышения клеточного иммунитета организма, и может быть использовано в лабораторной работе по изучению клеточного иммунитета. Предложен способ повышения клеточного иммунитета лабораторных мышей. Способ включает применение биологически активного препарата, согласно изобретению в качестве препарата используют биотинилированное производное окисленного декстрана, представляющее собой конъюгат, полученный реакцией гидрозида биотина и окисленного декстрана с молекулярной массой 40-70 кДа с образованием азометиновой связи, при внутримышечном введении в дозе 5 мл/кг живого веса мыши. Предлагаемый способ позволяет изучить влияние БОД на стимуляцию клеточного иммунитета у лабораторных мышей. 5 табл.

Способ повышения клеточного иммунитета лабораторных мышей, включающий применение биологически активного препарата, отличающийся тем, что в качестве препарата используют биотинилированное производное окисленного декстрана, представляющее собой конъюгат, полученный реакцией гидрозида биотина и окисленного декстрана с молекулярной массой 40-70 кДа с образованием азометиновой связи, при внутримышечном введении в дозе 5 мл/кг живого веса мыши.