СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ГЕНЕРАЛИЗОВАННОГО ТУБЕРКУЛЕЗНОГО ПРОЦЕССА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 1997 года по МПК A61K31/455 A61K31/70 

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, а именно к лечению генерализованного туберкулезного процесса.

В известных способах лечения генерализованного туберкулеза с целью поддержания достаточных концентраций действующего начала в очагах поражения практикуется длительное назначение массивных доз туберкулостатиков, что зачастую чревато выраженными токсикоаллергическими реакциями.

Наиболее близким к изобретению по методической сущности и достигаемому результату является способ лечения туберкулеза, изложенный в статье Туркебаевой К. А. и соавторов. Однако, в указанной работе пролонгация действия лекарственного препарата решена за счет депонирования действующего начала на организменном уровне.

Этим, по-видимому, следует объяснить и выбор в качестве пролонгирующей матрицы водорастворимое производное декстранакарбоксиметилсефадекс (КМС), образующее в водной фазе гидрогель со значительным увеличением исходных размеров микрочастиц КМС. При парентеральном введении подобных веществ вполне закономерно образование гранулем (что и зарегистрировано при гистологическом исследовании в данной работе), которые сами по себе пролонгируют действие вызвавших их образование чужеродных соединений за счет реакции отграничения.

Таким образом, в этом исследовании пролонгация действия препарата реализуется за счет депонирования на организменном уровне, когда происходит медленное высвобождение действующего начала из созданного (в приведенном случае внутримышечно или подкожно) депо; дальнейший путь его поступления к возбудителю заболевания не отличается от такового при использовании свободного лекарственного препарата.

В нашем же случае использован водорастворимый пролонгированный препарат, который в силу лизосомотропности использованной матрицы накапливается в лизосомах макрофагов (в том числе и в инфицированных микобактериями туберкулеза макрофагах гранулем), то есть на внутриклеточном уровне, в непосредственной близости от находящегося там возбудителя заболевания. В этом случае есть все основания говорить не только о куммуляции, но и о частичной адресации лекарственного препарата, т.е. об избирательной доставке действующего начала непосредственно в определенную популяцию клеток (макрофаги), являющихся местом локализации инфекта. В связи с повышенной кислотностью лизосомального содержимого происходит гидролиз пролонгированного препарата с высвобождением изониазида в активной форме и созданием вследствие этого высоких концентраций изониазида на внутриклеточном уровне, т.е. в микроокружении микобактерий туберкулеза. Этим и объясняется увеличение терапевтической эффективности. Снижение же токсичности обусловлено замедленным высвобождением продуктов метаболизма изониазида из внутриклеточного депо и, главным образом, снижением курсовой дозы туберкулостатика.

Таким образом, существенным отличием заявляемого препарата является уровень депонирования: в прототипе на организменном уровне, в нашем же случае а на внутриклеточном, в непосредственной близости от возбудителя заболевания.

Существенным отличием является также то, что в качестве лекарственного препарата применен изоникотиноилгидразон диальдегиддекстран, где в качестве пролонгирующей матрицы использован выделенный из коммерческого фармакологического препарата "Реополиглюкин" декстран с ММ 20000-40000, а в качестве действующего начала изониазид.

Синтез пролонгированного препарата осуществлен с использованием принципиальной схемы получения подобных соединений, описанной в исследованиях К.П. Хомякова и соавторов, в два этапа:
1. Декстран + окислитель ____→ диальдегиддекстран.

2. Диальдегиддекстран + изониазид ----L изоникотиноилгидразон диальдегиддекстран.

Нами предлагаются модификации технологического характера:
а) использование в качестве окислителя перйодата натрия вместо йодной кислоты; б) остановка реакции окисления 1000% этиленгликолем вместо KJ и HCl; в) упрочнение связи матрица изониазид путем дополнительного восстановления боргидратом натрия. В результате этого существенно упрощается процедура синтеза пролонгированного препарата, а также увеличивается его стойкость к гидролизу в физиологических условиях, что особенно важно для решения поставленных нами задач.

Полученное полимерное соединение хорошо растворимо в воде и в кислой среде способно к диссоциации на исходные продукты с сохранением противомикробной активности изониазида.

1. Получение диальдегиддекстрана осуществляли путем перйодатного окисления декстрана с ММ 20000-40000, осажденного из коммерческого препарата "Реополиглюкин" десятикратным объемом охлажденного до -10^oC этанола. Остановку реакции введения реакционоспособных альдегидных групп в макромолекулу декстрана осуществляли путем связывания избытка окислителя 100% раствором этиленгликоля. Образовавшийся диальдегиддекстран осаждали путем добавления десятикратного объема охлажденного до -10^oC этанола и последующего центрифугирования при 10000 оборотов в минуту в течение 20 минут.

2. Конъюгацию диальдегиддекстрана с изониазидом, заключающуюся в ковалентном связывании гидрозидной группы изониазида с альдегидными группами диальдегиддекстрана, осуществляли при комнатной температуре смешиванием водных растворов диальдегиддекстрана и изониазида. Гидролиз полученного конъюгата в физиологических условиях предотвращали обработкой водного раствора боргидрата натрия. Продукт конъюгации (изоникотиноилгидразон диальдегиддекстрана) выделяли из раствора путем добавления охлажденного этанола и последующего центрифугирования. Проводили качественный анализ полученного соединения. В случае наличия низкомолекулярной фракции осуществляли диализ против 50 объемов дистиллированной воды и конечный продукт лиофильно высушивали. Содержание изониазида в конъюгате определяли спектрофотометрически на длине 265 нм и по методу Wollenberg в модификации Гребенника Л.И. с использованием ванадиевокислого аммония на длине волны 430 нм.

Пример 1. Получение пролонгированной лекарственной формы изониазида (изоникотиноилгидразон диальдегиддекстрана):
1. 100 мг декстрана, содержащегося в 5 мл воды, + 1,08 мл 0,2М NaJO, перемешивали 45 минут при 25^oC.

2. + 1,3 мл 100% этиленгликоля, перемешиваем 20 мин при комнатной температуре.

3. + 40 мл охлажденного этанола, перемешиваем, формируем осадок в течение 15 минут.

4. Центрифугируем 20 минут при 10000 об/мин. Супернатант отбрасываем.

5. Осадок растворяем в 1 мл воды.

6. + 170 мкл 5% CH₃COOH + 170 мкл 15% тубазида + 660 мкл H₂O, перемешиваем 20 минут при 25^oC.

7. + каплю фенолфталеина + 0,5 N NaOH до появления розовой окраски.

8. + 40 мкл 1 М трис-HC1 pH 7,5 перемешиваем 30 минут при 25^oC.

9. + 1 мл NaBH₄ (2мг/мл), перемешиваем 30 минут.

10. + 10 объемов охлажденного до -10^oC этанола, перемешиваем, формируем осадок в течение 15 минут.

11. Центрифугируем 20 минут при 10000 об/мин.

12. Растворение в минимальном объеме воды, анализ. В случае наличия низкомолекулярной фракции диализуем против 50 объемов воды.

13. Лиофильная сушка.

Выход конечного препарата 100-110 мг порошка светложелтого цвета, легко растворимого в воде. Содержание изониазида 25% по весу. Растворимость в воде не уступает растворимости исходных продуктов (изониазида и декстрана). Хорошо переносится лабораторными животными при внутривенном, внутрибрюшинном и внутримышечном способах введения 10% водного раствора. В хроническом эксперименте обнаружено снижение гепатотоксичности по сравнению с чистым изониазидом (пример 2). Стерилизация с помощью миллипоровых фильтров или УФ-облучения.

Декстран относится к классу лизосомотропных препаратов, обусловливает его повышенный захват (вместе с конъюгированным изониазидом) макрофагами местом персистенции микобактерий и транспорт в гранулемы, где происходит постоянная смена популяций макрофагов путем продвижения малодифференцированных к центру гранулемы. В процессе продвижения предшественники макрофагов дифференцируются в зрелые макрофаги эпителиоидные клетки, обладающие фагоцитарной активностью. По нашем данным следствием введения реополиглюкина является активация пластических процессов в макрофагах и гепатоцитах, что должно способствовать повышению фагоцитарной и переваривающей способности макрофагов, образующих гранулему. Это является фактором, повышающим резистентность организма к микобактериальной инфекции и позволяющим достичь лечебного эффекта при меньшей дозе противотуберкулезных препаратов.

В процессе лизосомального гидролиза комплексный препарат разлагается на исходные продукты: изониазид и диальдегиддекстран. В связи с этим на основании данных кинетики биоградации комплекса реополиглюкин-изониазид нами выбран режим его введения 2 раза в неделю и интервалом между инъекциями в 3 суток.

Пример 2. У мышей линии BALB/c вызывали экспериментальный туберкулез путем интраперитонеального введения вакцины БЦЖ в дозе 2 мг на одно животное (масса мышей 18-20г).

Печень была выбрана в качестве объекта исследования из тех соображений, что характер гранулематозного процесса в ней в принципе не отличается от такового в других органах и, в то же время, печень является органом, где наиболее ярко проявляется повреждающий эффект изониазида.

Животные были разделены на четыре группы по 15 мышей в каждой. Первая - интактные мыши (контроль). Вторая ежедневно внутрибрюшинно получала изониазид в дозе 14 мг на 1 кг массы тела. Третьей в интермиттирующем режиме (с интервалом в 3 суток) вводили комплекс декстрана и изониазида, с содержанием последнего в той же дозе. Четвертая группа животных получала комплексный препарат в той же дозе ежедневно. Лечение продолжали в течение месяца. В качестве морфологических критериев динамики гранулематозного процесса использовали изменения количества и диаметра гранулем, а также клеточный состав последних.

Через месяц в печени наблюдали типичные гранулемы. У мышей третьей группы, получавших комплексный препарат в интермиттирующем режиме, количество гранулем было на 28% меньше, чем у животных, получавших чистый изониазид. Количество эпителлиоидных клеток в гранулеме мышей, леченных комплексным препаратом в интермиттирующем режиме было на 26% больше по сравнению с этим показателем у второй группы. Этот показатель свидетельствует, видимо, об ускорении дифференцировки макрофагов, т.к. наряду с увеличением количества эпителиоидных клеток на ту же величину снижалось количество макрофагов и моноцитов. В той же (третьей) группе, где комплексный препарат применяли в интермиттирующем режиме, количество клеток фибробластического ряда было на 41% больше, чем в группе животных, леченных чистым изониазидом, что свидетельствует о большей выраженности репаративных процессов в органе.

Количество дистрофически измененных гепатоцитов у животных этой группы, где применяли комплексный препарат изониазида в интермиттирующем режиме, было на 60% меньше, чем у мышей, леченных чистым изониазидом.

Обоснование. Таким образом, интермиттирующий режим лечения комплексным препаратом был выбран в качестве рекомендуемого на основании того, что при снижении курсовой дозы изониазида уменьшалась его токсичность (в частности, гепатотоксичность).

В то же время предполагалось, что интермиттирующий режим будет способствовать созданию повышенной активности макрофагов в промежутках между введениями, т. к. после введения декстрана через 3 суток в макрофагах отмечены явления усиления пластических процессов, что сопряжено с "метаболическим взрывом", усилением синтеза лизосомальных гидролаз, повышением фагоцитарной и переваривающей способности макрофагов.

Кроме того, известно, что противотуберкулезные препараты эффективны в отношении микобактерий, находящихся в состоянии деления. Поэтому интервал между введениями препарата в 3 дня необходим для побуждения к делению находящихся в покое микобактерий.

Способ лечения генерализованного туберкулезного процесса относится к области экспериментальной медицины, а именно, к лечению генерализованного туберкулезного процесса. Способ заключается в том, что подопытному животному вводят внутрибрюшинно в инермиттирующем режиме (с интервалом 3 суток) комплексное соединение изониазида и диальдегиддекстрана (изоникотиноилгидразон диальдегиддекстран) в дозе 14 мг на 1 кг массы тела, причем комплексное соединение изоникотиноилгидразон диальдегиддекстран получают путем перйодатного окисления декстрана перйодатом натрий до диальдегиддекстрана с остановкой реакции 100% этиленгликолем и последующей стабилизацией основания Шиффа в конечном продукте боргидратом натрия. Предлагаемый способ позволяет повысить эффективность лечения и снизить токсические поражения печени противотуберкулезными препаратами.

Способ лечения генерализованного туберкулезного процесса в эксперименте путем введения туберкулостатиков на пролонгирующей матрице, отличающийся тем, что подопытному животному вводят внутрибрюшинно в интермиттирующем режиме с интервалом 3 сут в дозе 14 мг на 1 кг массы тела комплексное соединение изониазида и диальдегиддекстрана изоникотиноилгидразон диальдегиддекстрон, полученный путем перйодатного окисления декстрана перйодатом натрия до диальдегиддекстрана с остановкой реакции 100% этиленгликолем и последующей стабилизацией оснований Шиффа в конечном продукте боргидратом натрия.