ПРОТИВОЭНТЕРОВИРУСНОЕ И ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕЕ СРЕДСТВО Российский патент 2015 года по МПК A61K9/48 A61K38/21 A61K47/48 A61P31/12 A61P37/02 

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается средств, подавляющих размножение энтеровирусов и стимулирующих иммунную систему.

В последние годы в мире наметилась четкая тенденция активизации энтеровирусной инфекции, о чем свидетельствуют постоянно регистрируемые в разных странах эпидемиологические подъемы заболеваемости и вспышки. Энтеровирусная инфекция остается малоконтролируемой в практике здравоохранения и занимает одно из ведущих мест среди инфекционных заболеваний, протекающих с поражением ЦНС. Одной из основных особенностей этих инфекций является вирусоносительство, постоянно обусловливающее возникновение спорадических форм и массовых заболеваний, которое, как и заболеваемость, наблюдается не только среди детей младшего и старшего возраста, но и среди взрослых.

В качестве специфической терапии энтеровирусной инфекции применяют: лейкоцитарный интерферон, рекомбинантные интерфероны (виферон, реаферон, роферон), интерфероногены (циклоферон, неовир), иммуноглобулины для внутривенного введения (сандоглобулин, пентаглобин).

Наряду с высокой клинической эффективностью интерферонов (ИФН) при их применении часто наблюдаются побочные эффекты в виде гриппоподобного синдрома, артралгии, депрессивных состояний, диареи, галлюцинаций, кожных высыпаний, аллергии, заболеваний кроветворной системы, выпадения волос [1, 2]. У 30% больных при длительном применении больших доз рекомбинантных интерферонов образовывались нейтрализующие антивирусную активность препарата антитела, что сопровождалось развитием резистентности к рекомбинантным интерферонам [3].

Поэтому актуальной задачей является разработка новых подходов к терапии вирусных, и, в частности, энтеровирусных инфекций с целью уменьшения побочных эффектов. Одним из таких подходов является иммобилизация интерферонов на веществе-матрице, что позволяет уменьшить дозы и частоту введения лекарственных препаратов, защищает ткани от их раздражающего действия. Получил известность способ присоединения молекул полиэтиленгликоля (ПЭГ) к интерферону химическим путем (пегилирование). В настоящее время во всем мире, в том числе и в России, применяется два вида пегилированного интерферона:

1. Пегилированный интерферон альфа-2b (ПегИнтрон, фирма «Schering-Plough», США).

2. Пегилированный интерферон альфа-2а (Пегасис, фирма «Roche», Швейцария).

Оба пегилированных интерферона (патент №5951974 USA от 14.09.1999 «Interferon polymer conjugates» - препарат «ПегИнтрон» и патент № ЕР 0809996 В1 от 02.04.2003 «Interferon-alpha polypeptides and conjugates» - препарат «Пегасис») используются для лечения хронического гепатита С. Однако применение пегилированных интерферонов имеет ряд недостатков: парентеральный путь введения препаратов; побочные эффекты в виде повышения температуры тела, слабости, головных болей, артралгий и др.; невозможность точно контролировать концентрацию интерферона в крови, т.к. препарат вводится раз в неделю. Немаловажен тот факт, что стоимость лекарства весьма высока. Кроме того, производство пегилированных препаратов многоэтапное, на некоторых стадиях используются токсические вещества, полная очистка от которых влечет снижение активности препарата, что приводит к увеличению дозировки.

Вместе с тем известна технология иммобилизации белков с помощью ионизирующего излучения, так называемый, физический способ (патент RU №2409669, «Способ иммобилизации биологически активного вещества (БАВ) на носитель (варианты) и конъюгат БАВ-носитель, полученный данными способами», опубл. 27.02.2010). По этому способу в качестве БАВ использовали вещества, выбранные из группы: инсулин, проинсулин, Г-КСФ, гиалуронидаза, тирозил-2-аланил-глицил-фенилаланил-лейцил-аргинина диацетат, соматотропин.

Физический способ связывания рекомбинантного интерферона с веществом-матрицей позволит защитить белковую молекулу интерферона от действия протеолитических ферментов и тем самым обеспечит возможность его перорального применения без потери фармакологической активности и терапевтической эффективности.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка препарата интерферона для лечения энтеровирусной инфекции при пероральном способе применения. Использование препарата позволит: 1) адресно доставлять иммобилизированный интерферон непосредственно к вирусинфицированным клеткам слизистой оболочки кишечника; 2) влиять на клетки лимфоидной ткани (макрофаги, нейтрофилы), ассоциированной со слизистой кишечника; 3) снизить дозировку интерферона при однократном его введении; 4) устранить побочные эффекты, характерные для парентерального введения препаратов интерферонов, что обеспечит возможность применения препаратов интерферона не только для лечения взрослых, но и в педиатрической и акушерской практике.

Поставленная задача достигается использованием иммобилизированного интерферона альфа-2b в качестве противоэнтеровирусного и иммуностимулирующего средства, полученного путем смешивания облученного потоком ускоренных электронов водного раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ), молекулярной массы 1,5 кДа и раствора интерферона альфа-2b до конечной концентрации 10 мг в 1 мл. Смесь перемешивают до получения опалесцирующего раствора.

Применение полиэтиленгликоля в качестве основы позволяет защитить белковую молекулу интерферона от действия протеолитических ферментов и тем самым обеспечивает возможность его перорального применения. Выход готового продукта составляет 98%, активность препарата не менее 1×10⁶ международных единиц (МЕ)/мл, молекулярная масса не менее 19,5±0,5кДа. Лекарственная форма иммобилизированного интерферона альфа-2b - твердая желатиновая капсула с крышечкой, размера «00».

Состав на 1 капсулу:

Активное вещество:

интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный иммобилизированный - 1000000 МЕ/капс.

Вспомогательные вещества:

Мальтодекстрин 75-90% 0,3-0,36 г Декстран 8,98-22,45% 0,03592-0,0898 г Полиэтиленгликоль 1-2,5% 0,004-0,01 г ЭДТА 0,02%-0,05% 0,08-0,2 мг

Новым в предлагаемом изобретении является то, что иммобилизированный на ПЭГ интерферон альфа-2b впервые предложен для применения в качестве противоэнтеровирусного и иммуностимулирующего средства для перорального введения.

Из отечественных препаратов интерферонов применяемых внутрь единственным препаратом является «Реаферон-ЕС-липинт» (прототип) (ЗАО «Вектор-Медика», Новосибирск) - липосомальный препарат интерферона альфа-2b (патент RU №2123328, «Липосомальное противовирусное лекарственное средство для перорального применения», опубл. 20.12.1998). Указанное липосомальное лекарственное средство имеет недостаточный срок хранения (активность интерферона альфа-2 практически на постоянном уровне сохраняется не более 12 месяцев) и при его применении отмечается ряд побочных эффектов: гриппоподобное состояние; тошнота, рвота, поносы; нарушение картины крови и функции печени; головокружение, сонливость; снижение или повышение артериального давления, аритмии.

Сходным действием обладает препарат «Виферон» (ООО «Ферон», Москва) - суппозитории, в состав которых помимо рекомбинантного интерферона альфа-2b входят витамины Е и С (патент RU №2024253, «Ректальные свечи и устройство для введения ректальных свечей в полость организма» опубл. 15.12.1994). Ректальное применение «Виферона» способствует более длительной циркуляции интерферона в крови, чем при внутривенном или внутримышечном введении препаратов рекомбинантных интерферонов. Однако применение ректальных свечей неудобно, негигиенично, интерферон в свечах «Виферон» содержится в небольшой дозировке, использование свечей «Виферон» может приводить к местному раздражению при применении препарата у маленьких детей.

Применение иммобилизированного на ПЭГ интерферона стало возможным благодаря обнаружению у него способности подавлять репликацию энтеровирусов различных штаммов in vitro. Выявлено наличие иммунотропных свойств, а именно стимуляция гуморального иммунного ответа и фагоцитарных реакций при пероральном введении лабораторным животным, а также усиление спонтанной и стимулированной выработки интерлейкина 2 (ИЛ-2) и ИФН-γ без дополнительной стимуляции митогеном при добавлении иммобилизированного интерферона in vitro. Применение иммобилизированного на ПЭГ интерферона для перорального введения в качестве противоэнтеровирусного и иммуностимулирующего средства в литературе не описано и явным образом не вытекает из уровня техники для специалиста. Иммобилизированный интерферон можно будет использовать для применения у больных с энтеровирусной инфекцией, в том числе ассоциированной с иммунной недостаточностью.

Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения: «новизна», «изобретательский уровень», «промышленная применимость».

Противовирусные свойства иммобилизированного на ПЭГ интерферона альфа-2b были обнаружены благодаря экспериментальным исследованиям. Было проведено изучение противовирусной активности лекарственного средства на основе иммобилизированного интерферона альфа-2b в отношении вируса Коксаки А7 (штамм ЖЭВ-8) и вируса Коксаки В6 (штамм ЖЭВ-15) на культуре клеток RD (рабдомиосаркома человека). Культура клеток RD является адекватной моделью для исследования противовирусной активности интерферона [9]. Для исследования противовирусной активности была использована схема с преинкубацией клеток RD с различными концентрациями рекомбинантного интерферона альфа-2b и исследуемого лекарственного средства основе иммобилизированного интерферона альфа-2b (оба производства ЗАО «Сибирский центр фармакологии и биотехнологии», Новосибирск). Разведения препаратов интерферона на культуральной среде Игла-ДМЕМ добавляли к клеткам культивированным в стандартных 96-луночных культуральных микропланшетах за 6 часов до инфицирования [9].

Результаты, подтверждающие противовирусные свойства иммобилизированного на ПЭГ рекомбинантного интерферона альфа-2b.

Пример 1. При добавлении рекомбинантного интерферона альфа-2b и исследуемого лекарственного средства основе иммобилизированного интерферона альфа-2b in vitro исследуемые препараты не оказывали токсического воздействия на культуру клеток RD во всем диапазоне используемых концентраций (разведения 1:30-1:93750). Инфицирование осуществляли дозой 100 ТЦД₅₀ вируса Коксаки А7. Результаты представлены в таблице 1 (указан процент жизнеспособных клеток через 30 часов после инфицирования).

В контролях вируса (к клеткам вместо исследуемого лекарственного средства добавляли равные объемы культуральной среды) к этому сроку наблюдалась 100%-ая вирусиндуцированная гибель клеточного монослоя. Как видно из табл. 1, добавление in vitro как рекомбинантного человеческого ИФН альфа-2b, так и лекарственного средства на основе иммобилизированного ИФН альфа-2b в концентрации 2000 МЕ/мл и выше в культуру клеток RD, зараженных вирусом Коксаки А7 (штамм ЖЭВ-8), приводило к 100% защите от вирусиндуцированной гибели.

Пример 2. Инфицирование клеток RD осуществляли дозой 100 ТЦД₅₀ вируса Коксаки В6 (штамм ЖЭВ-15). К культуре клеток RD добавляли различные концентрации рекомбинантного интерферона альфа-2b и исследуемого лекарственного средства основе иммобилизированного интерферона альфа-2b за 6 ч до инфицирования. Результаты исследования представлены в таблице 2 (указан процент жизнеспособных клеток через 30 часов после инфицирования). В контролях вируса (к клеткам вместо исследуемого лекарственного средства добавляли равные объемы культуральной среды) к этому сроку наблюдалась 100%-ая вирусиндуцированная гибель клеточного монослоя.

Как видно из табл. 2, добавление in vitro как рекомбинантного человеческого ИФН альфа-2b, так и лекарственного средства на основе иммобилизированного ИФН альфа-2b в концентрации 2000 МЕ/мл и выше в культуру клеток RD, зараженных вирусом Коксаки В6 (штамм ЖЭВ-15), приводило к 100% защите от вирусиндуцированной гибели. Достоверных отличий противовирусной активности лекарственного средства на основе иммобилизированного интерферона альфа-2b в отношении двух используемых энтеровирусных штаммов не отмечено.

Эффективность подавления репликации вируса Коксаки А7 (штамм ЖЭВ-8) исследуемым лекарственным средством на основе иммобилизированного интерферона альфа-2b в инфицированных клетках RD также была исследована посредством количественного анализа с использованием полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией в режиме реального времени (ОТ-ПЦР). Монослой клеток RD с различными концентрациями лекарственного средства на основе иммобилизированного интерферона альфа-2b инкубировали в течение 6 часов, после чего клетки инфицировали дозой 100 ТЦД₅₀ вируса Коксаки А7, через 30 часов после инфицирования в клеточных лизатах определяли количества вирусной РНК. Количественный ОТ-ПЦР анализ выполняли согласно методологии, изложенной Lu J., Yi L., Zhao J. et al. (2012). Количества вирусной РНК в клетках, проинкубированных с препаратами интерферона, нормализовали относительно контроля вируса (KB, инфицированные вирусом клетки RD без преинкубации с интерфероном). Результаты представлены в таблице 3.

Таким образом, исследование противовирусной активности лекарственного средства на основе иммобилизированного интерферона альфа-2b показало, что данное лекарственное средство обладает сравнимой специфической активностью с исходным неиммобилизированным рекомбинантным человеческим интерфероном альфа-2b (производство ЗАО «СЦФБ»). Так, методом количественного ОТ-ПЦР, было показано, что лекарственное средство на основе иммобилизированного интерферона альфа-2b приблизительно в 5 раз менее активно в сравнении с неиммобилизированным интерфероном альфа-2b. Эти данные хорошо согласуются с результатами для пегилированных белков (цитокинов) на in vitro моделях [10, 11, 12].

Иммунотропные свойства иммобилизированного на ПЭГ интерферона были обнаружены благодаря экспериментальным исследованиям.

Для установления иммунотропной активности иммобилизированного рекомбинантного интерферона альфа-2b (имИФН-α2b) было изучено его влияние на фагоцитоз перитонеальных макрофагов и нейтрофилов, гуморальный иммунный ответ лабораторных животных при пероральном способе применения исследуемого препарата. Оценку иммунотропной активности изучаемого препарата проводили также в системе in vitro на культуре мононуклеаров периферической крови здоровых доноров. При этом проводилось изучение влияния имИФН-α2b на синтез ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4 и ИФН-γ мононуклеарами периферической крови здоровых доноров спонтанно и при их стимуляции полисахаридом энтеробактерий и фитогемагглютинином.

В качестве препарата сравнения использовали реаферон-ЕС-липинт (ЗАО «Вектор-Медика», п. Кольцове, Новосибирской обл., рег. уд. PN000821/01). Этот препарат является рекомбинантным интерфероном альфа-2 для перорального применения, заключенным в липосомы, что защищает интерферон от разрушения в пищеварительном тракте. В качестве препарата сравнения в опытах in vitro при добавлении в культуру мононуклеарных клеток здоровых доноров использовали вместо реаферона-ЕС-липинта его аналог для парентерального введения - реаферон-ЕС (ЗАО «Вектор-Медика», п. Кольцове, Новосибирской обл., per. уд. PN000642/01).

Изучение иммунотропной активности иммобилизированного на ПЭГ интерферона альфа-2b (имИФН-α2b) и реаферона-ЕС-липинт (РФН-ЕС-л) проводилось согласно «Методическим рекомендациям по доклиническому изучению иммунотропной активности лекарственных средств» [13].

В исследовании было использовано 160 мышей-самцов линии CBA/CaLac 6-8-недельного возраста с массой тела 18-22 г. Мыши конвенциональные 1-й категории (сертификат здоровья лабораторных животных, выданный «НЦБМТ» РАМН от 17.10.12 г.). Содержание: в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986). Мыши находились согласно нормам рассадки животных в пластиковых клетках фирмы VELAZ на подстилке из мелкой древесной стружки. Температура воздуха в виварии 18-24°С, влажность - 50±20%, объем воздухообмена (вытяжка/приток) - 8:10, световой режим (день/ночь) - 1:1. Мыши имели постоянный доступ к воде и пище. Корм - полнорационный экструдированный комбикорм Рецепт ПК-120 (содержание) для лабораторных животных (мышей, крыс, хомяков), сбалансированный по аминокислотному составу, минеральным веществам и витаминам, производство ООО «Лабороторкорм», г. Москва. В качестве питьевой воды использовалась дистиллированная вода. Работы с животными проводились в соответствии с регламентирующим документом на содержание животных: «Лабораторные животные». - М., 2003 [14]. Содержание животных соответствует правилам лабораторной практики (GLP) и Приказу МЗ РФ №708 от 23.08.2010 г. «Об утверждении правил лабораторной практики».

При проведении опытов in vitro в качестве источника материала была использована периферическая кровь 10 здоровых доноров в возрасте от 22 до 36 лет.

Мышам иммобилизированный интерферон альфа-2b и реаферон-ЕС-липинт вводили перорально курсом в течение 5-ти суток один раз в день в терапевтической дозе (1,8×10⁵ МЕ/кг), которая была пересчитана, исходя из средней терапевтической дозы интерферона альфа-2b для человека (1000000 ME), в объеме 0,2 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) («МР Biomedicals», США), контрольные животные получали в эквивалентном объеме растворитель. В опытах in vitro иммобилизированный интерферон альфа-2b и реаферон-ЕС добавлялись в культуру клеток в дозах 15 МЕ/мл, 150 МЕ/мл и 1500 МЕ/мл. При изучении влияния препаратов на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов и нейтрофилов в качестве фона использовали интактных животных соответствующего пола и возраста. При исследовании влияния препаратов на гуморальный иммунный ответ в качестве фона использовали мышей, получивших антиген, но без курсового введения растворителя. Забивали животных декапитацией после СО₂-камеры либо передозировкой хлороформа.

Фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов и нейтрофилов оценивалась через 24 ч после окончания 5-дневного курса введения иммобилизированного интерферона альфа-2b и реаферона-ЕС-липинт по способности фагоцитов поглощать суточную культуру Staph. aureus, штамм 209. На мазках содержимого перитонеальной полости учитывали процент макрофагов или нейтрофилов, поглотивших микробы (фагоцитарный индекс - ФИ) и среднее число стафилококков, поглощенное одной клеткой (фагоцитарное число - ФЧ) [13].

Влияние иммобилизированного интерферона альфа-2b и реаферона-ЕС-липинт на гуморальный иммунный ответ оценивали путем определения числа антителообразующих клеток (АОК) в селезенке и титров антител в сыворотке крови после иммунизации мышей эритроцитами барана (ЗАО «ЭКОлаб», Россия). Иммунизацию животных осуществляли после окончания 5-дневного курса введения иммобилизированного интерферона альфа-2b и реаферона-ЕС-липинт минимальной дозой эритроцитов барана - 5×10⁶ на мышь внутрибрюшинно. Определение АОК осуществляли на 4-е и 7-е сутки после иммунизации методом локального гемолиза [15] с предварительным подсчетом общего количества спленоцитов (ОКС), а уровень специфических антител (IgM и IgG-гемагглютинины), содержащихся в сыворотке крови иммунизированных животных, определяли с помощью реакции гемагглютинации (РГА) [16]. Количество антителообразующих клеток выражали в относительных (%) и абсолютных (10⁶/орган) единицах, а титр антител - величиной log₂T.

В опытах in vitro изучали влияние иммобилизированного интерферона альфа-2b и реаферона-ЕС при их добавлении в культуру мононкуларов периферической крови здоровых доноров на продукцию ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4 и ИФН-γ. Для этого в качестве материала использовали супернатанты культур мононуклеаров, полученные на первые сутки их культивирования in vitro при температуре 37°С в СО₂-инкубаторе, содержащего 5% СО₂. Для выделения мононуклеаров кровь разводили 1:2 средой 199 (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», Россия), затем наслаивали на градиент фиколл-пака («Pharmacia», Швеция) с плотностью 1,077 и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 40 мин. Белое кольцо, образующееся на разделе фаз и содержащее мононуклеары, аккуратно отсасывали пипеткой и 2 раза отмывали средой 199 с помощью центрифугирования 10 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендировали в полной ростовой среде (ПРС), состоящей из среды RPMI-1640 («HyClone», США), 10% эмбриональной телячьей сыворотки («HyClone», США), 10 мМ HEPES («Sigma», США), 2 мМ L-глютамина («Sigma», США) и 40 мкг/мл гентамицина (ОАО «Дальхимфарм», Россия), и мононуклеары доводили до концентрации 2 млн/мл и культивировали сутки. Получали 4 вида супернатанта: 1) от клеток, стимулированных липополисахаридом (ЛПС, 10 мкг/мл) («Sigma», США) - для индукции продукции ИЛ-1β, либо фитогемагглютинином (ФГА, 10 мкг/мл) («Sigma», США) - для индукции продукции ИЛ-2, ИЛ-4 и ИФН-γ в присутствии исследуемых препаратов в конечной концентрации 15 МЕ/мл, 150 МЕ/мл и 1500 МЕ/мл; 2) от клеток, стимулированных ЛПС, либо ФГА; 3) от клеток, культивируемых в присутствии исследуемых препаратов в конечной концентрации 15 МЕ/мл, 150 МЕ/мл и 1500 МЕ/мл; 4) от клеток, культивируемых только в ПРС. Цитокины (ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4 и ИФН-γ) в супернатантах культур мононуклеаров определяли с помощью иммуноферментного метода, используя соответствующие наборы производства ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск) и ООО «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург). Оценивали способность исследуемых препаратов усиливать (мононуклеары, стимулированные ЛПС или ФГА + препарат) и индуцировать (мононуклеары, стимулированные только препаратом) выработку цитокинов.

Статистическая обработка результатов осуществлялась с применением пакета статистических программ Statistica for Windows (версия 5.0) с предварительной оценкой нормальности распределения и использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты, подтверждающие иммунотропные свойства иммобилизированного на ПЭГ рекомбинантного интерферона альфа-2b, при пероральном способе применения, проиллюстрированы следующими примерами.

Пример 3. Изучение фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов и нейтрофилов оценивалась через 24 ч после окончания 5-дневного курса введения иммобилизированного интерферона альфа-2b (группа 4), реаферона-ЕС-липинт (группа 3) или растворителя (группа 2) по способности фагоцитов поглощать суточную культуру Staph. aureus, штамм 209. Курсовое введение РФН-ЕС-л не приводило к достоверным изменениям фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа перитонеальных макрофагов экспериментальных животных по сравнению с контрольной группой, лишь относительно фона наблюдалось статистически значимое увеличение фагоцитарной активности макрофагов (ФЧ) (табл. 4).

Курсовое введение имИФН-α2b не приводило к достоверным изменениям фагоцитарного индекса перитонеальных макрофагов экспериментальных животных как по сравнению с контрольной группой, так и с фоновой, но при этом статистически значимо повышалось среднее количество поглощенных одной клеткой бактерий (ФЧ). У мышей, получавших имИФН-α2b, отмечалось достоверное повышение фагоцитарного числа перитонеальных макрофагов по сравнению с группой животных с применением РФН-ЕС-л.

Курсовое введение РФН-ЕС-л не приводило к достоверным изменениям фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа нейтрофилов экспериментальных животных по сравнению с контрольной группой, лишь относительно фона наблюдалось статистически значимое увеличение количества поглощенных бактерий (ФЧ) (табл. 5). Курсовое введение имИФН-α2b приводило к достоверному повышению относительного количества фагоцитирующих нейтрофилов экспериментальных животных как по сравнению с контрольной группой, так и с фоновой. При этом число поглощенных бактерий (ФЧ) статистически значимо не изменялось. У мышей, получавших имИФН-α2b, отмечалось достоверное повышение относительного числа фагоцитирующих нейтрофилов по сравнению с группой животных с применением РФН-ЕС-л в такой же дозе.

Пример 4. Влияние иммобилизированного ИФН альфа-2b и реаферона-ЕС-липинт на гуморальный иммунный ответ оценивали путем определения числа антителообразующих клеток (АОК) в селезенке и титров антител в сыворотке крови после иммунизации мышей эритроцитами барана (табл. 6). Курсовое введение РФН-ЕС-л приводило к достоверному повышению числа спленоцитов, относительного и абсолютного количества АОК в селезенках, титра IgM в сыворотке крови на 4-е сутки после иммунизации, но лишь относительно фоновых значений, а по сравнению с контрольной группой наблюдалось статистически значимое снижение относительного количества АОК и титров IgG, хотя титр IgM был достоверно выше.

Курсовое введение имИФН-α2b приводило к достоверному повышению числа спленоцитов, относительного и абсолютного количества АОК в селезенках экспериментальных животных на 4-е сутки после иммунизации как по сравнению с контрольной группой, так и с фоновой, но при этом активность АОК, судя по титрам специфических гемагглютининов в сыворотке крови, увеличивалась незначительно. У мышей, получавших имИФН-α2b, отмечалось статистически значимое повышение абсолютного и относительного числа антителообразующих клеток, титров IgG и суммарных антител по сравнению с группой животных с применением РФН-ЕС-л.

Курсовое введение РФН-ЕС-л приводило к достоверному повышению числа спленоцитов и абсолютного количества АОК в селезенках как по сравнению с контролем, так и с фоновой группой (табл. 7), а также относительно этой группы увеличивалось процентное содержание антителообразующих клеток и титр IgG в сыворотке крови на 7-е сутки после иммунизации.

Курсовое введение имИФН-α2b приводило к достоверному повышению числа спленоцитов, абсолютного количества АОК в селезенках экспериментальных животных и титра специфических гемагглютининов в сыворотке крови на 7-е сутки после иммунизации как по сравнению с контрольной группой, так и с фоновой, а также относительно этой группы увеличивался титр IgG. Изученные показатели в группе мышей, получавших имИФН-α2b, статистически значимо не отличались по сравнению с группой животных с применением РФН-ЕС-л.

Пример 5. Влияние иммобилизированного интерферона альфа-2b и реаферона-ЕС при их добавлении в культуру мононуклеаров периферической крови здоровых доноров на продукцию ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4 и ИФН-γ. Для этого в качестве материала использовали супернатанты культур мононуклеаров, полученные на первые сутки их культивирования in vitro.

При добавлении в культуру мононуклеаров имИФН-α2b и РФН-ЕС в различных концентрациях (15 МЕ/мл, 150 МЕ/мл и 1500 МЕ/мл) спонтанная и стимулированная продукция ИЛ-1β и ИЛ-4 достоверно не изменялась по сравнению с контрольной группой (без добавления препарата) (табл. 8, 9). Не отмечалось статистически значимых различий в выработке указанных цитокинов и при сравнении соответствующих по вносимым дозам препаратов групп.

Как при добавлении в культуру мононуклеаров имИФН-α2b, так и РФН-ЕС повышалась продукция ИЛ-2 при всех исследованных дозах препаратов (15 МЕ/мл, 150 МЕ/мл и 1500 МЕ/мл) по сравнению с контролем. При внесении имИФН-α2b в дозе 150 МЕ/мл наблюдалось достоверное усиление спонтанной выработки ИФН-γ. Добавление РФН-ЕС в культуру мононуклеаров в дозах 15 МЕ/мл и 150 МЕ/мл без митогена статистически значимо повышало продукцию изучаемого цитокина как по сравнению с контролем, так и в дозе 15 МЕ/мл с группой с внесением имИФН-α2b в такой же концентрации.

При добавлении в культуру мононуклеаров имИФН-α2b совместно с ФГА повышалась продукция ИЛ-2 при всех исследованных дозах препарата (15 МЕ/мл, 150 МЕ/мл и 1500 МЕ/мл) по сравнению с контролем (табл. 9). Максимальная выработка изученного цитокина отмечалась при внесении им-ИФН-α2b в концентрации 15 МЕ/мл. При добавлении РФН-ЕС статистически значимое усиление продукции ИЛ-2 наблюдалось лишь при дозе вносимого препарата 150 МЕ/мл. При сравнении соответствующих по дозам групп препаратов не отмечалось статистически значимых различий в выработке исследованного цитокина.

При добавлении в культуру мононуклеаров имИФН-α2b и РФН-ЕС совместно с ФГА повышение продукции ИФН-γ наблюдалось при вносимых дозах препаратов 15 МЕ/мл и 1500 МЕ/мл, но статистически незначимо.

Таким образом, использование предложенного способа физической иммобилизации рекомбинантного интерферона альфа-2b на полиэтиленгликоле, массой 1,5 кДа, позволяет получить препарат для перорального применения, который проявляет противоэнтеровирусную активность in vitro и существенную иммуностимулирующую активность в условиях in vivo, что выражается в усилении фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов и нейтрофилов и гуморального иммунного ответа, сравнимых или превосходящих таковые при воздействии реаферона-ЕС-липинт, и in vitro, что выражается в повышении спонтанной и стимулированной выработки ИЛ-2, более эффективно, чем препарат сравнения РФН-ЕС, а также и ИФН-γ без дополнительной стимуляции митогеном.

Пример 6. Изготовление капсулированного лекарственного средства. Приготовление композиции для лиофильной сушки:

Состав композиции для лиофильной сушки приведен в таблице 10.

Таблица 10 Состав компонентов композиции для лиофильной сушки Название компонента Количество 1. Интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный иммобилизированный 2×10⁷ МЕ/мл 60,0 мл 2. Декстран-40 50,00 г 3. Фосфатно-солевой буфер (10 mM NaH₂PO₄, рН 7.4±0,2) 450,0 мл 3. ЭДТА 1,00 г 4. ПЭГ-1500 2,00 г

Навеску декстрана-40 50,00±0,01 г растворили в 450,0 мл стандартного фосфатно-солевого буфера (10 mM NaH₂PO₄, рН 7,4±0,2). На электронных весах «Ohaus Adventurer RV 313» в химическом стакане на 1000 мл взвесили 449,0±0,1 г раствора декстрана-40 10% в фосфатно-солевом буфере и растворили в нем навески веществ: 1,00±0,01 г ЭДТА и 2,00±0,01 г ПЭГ-1500. К полученному раствору добавили 60,0 мл раствора субстанции иммобилизированного интерферона альфа-2b с активностью 2×10⁷ МЕ/мл и перемешали. Полученный раствор профильтровали через фильтр 0,2 мкм с использованием вакуумной стерилизационной системы «Stericup» Millipore для снижения контаминации продукта, стерильно разлили в поддоны для сушки и подвергли глубокой заморозке при -70°С в гибернаторе «UTLF-80» в течение суток.

Лиофильная сушка композиции для сушки:

Лиофильную сушку замороженной композиции для сушки производили на лабораторной лиофильной сушилке «MLW LGA 05» при температуре -50°С и давлении в сушильной камере не более 0,4 мм рт.ст. в течение суток. Сухой лиофилизат пересыпали в полиэтиленовый пакет.

Приготовление лекарственной смеси для заполнения капсул:

Навески лиофилизата композиции для сушки (45,0±0,1 г) и мальтодекстрина (405,0±0,1 г) перенесли в емкость для смешивания, и полученную лекарственную смесь перемешивали на комбайне в течение 30 мин до получения однородной, равномерно перемешанной и рассыпчатой смеси.

Капсулирование и упаковка лекарственной смеси:

Капсулирование лекарственной смеси массой 420,0±0,1 г в желатиновые капсулы №00 желтого цвета (масса содержимого капсулы 0,4 г) осуществляли на полуавтоматической машине для заполнения капсул «CGN-208» согласно технологической инструкции. Для очистки капсул от пыли использовали машину для полировки и обеспыливания капсул «С&С-100». Обеспыленные капсулы (950 шт.) упаковали в прозрачные полиэтиленовые пакеты на машине для подсчета и упаковки капсул «РА2000» и герметично запаяли.

Источники литературы

1. Patten S.B. What is the best approach to treating interferon-induced depression in people with multiple sclerosis? // J. Neurosci. - 2001. - V. 26. - P. 66.

2. Wills R.J. Clinical pharmacokinetics of interferons // Clin. Pharmacokinet. - 1990. - Vol. 19. - №5. - Р. 390-399.

3. Prummer O., Streichan U., Porzsolt F. Treatment-induced interferon (IFN)-α antibodies: Differential neutralisation of the antiviral and antiproliferative IFN-α activity in vitro // J. Interferon Res. - 1991. - №11. - P. 265.

4. US Pat. №5951974 A «Interferon polymer conjugates», опубл. 14.09.1999.

5. EP Pat. №0809996 B1 «Interferon-alpha polypeptides and conjugates», опубл. 02.04.2003.

6. Патент (RU) на изобретение №2409669 «Способ иммобилизации биологически активного вещества (БАВ) на носитель (варианты) и конъюгат БАВ-носитель, полученный данными способами», опубл. 27.02.2010.

7. Патент (RU) на изобретение №2123328 «Липосомальное противовирусное лекарственное средство для перорального применения», опубл. 20.12.1998.

8. Патент (RU) №2024253 «Ректальные свечи и устройство для введения ректальных свечей в полость организма» опубл. 15.12.1994.

9. Lu J., Yi L., Zhao J., Yu J., Chen Y., Lin M. C., Kung H.F., Hea M.L. Enterovirus 71 Disrupts Interferon Signaling by Reducing the Level of Interferon Receptor 1 // Journal of Virology. - 2012. - V. 86, №7. - P. 3767-3776.

10. Pasut G. PEGylated a Interferons: two different strategies to achieve increased effi cacy. In: PEGylated protein drugs: basic science and clinical applications (ed. Veronese FM) // Birkhauser Verlag, Basel, 2009.

11. Pasut G., Vemose F. PEGylation of proteins as tailored chemistry for optimized bioconju-gates // Adv Polym Sci. - 2006. -Vol. 192. - P. 95-134.

12. Veronese F.M. Pasut G. Protein PEGylation In: Long Acting Injections and Implants (Eds: Wright J.C., Burgess D.J.) // Springer, - New York, Dordrecht, Heidelberg, London, - 2012. - P. 295-314.

13. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - M.: Гриф и К, 2013. - 944 с.

14. Лабораторные животные (Положение и руководство) // под ред. чл.-корр. РАМН И.Н. Каркищенко. - M.: изд-во «ВПК». - 2003. - 138 с.

15. Cunningham A.I. A method of increased sensitivity for detecting single antibody-forming cells // Nature. - 1965. - V. 207, №5001. - P. 1106-1107.

16. Линг Н. Р., Кэтти Д. Темагглютинация и реакции антителозависимого гемолиза. Антитела. Методы / Под ред. Д. Кэтти. кн. 1. M.: Мир, 1991. - С.238-243.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой противоэнтеровирусное и иммуностимулирующее средство для перорального применения в виде капсул, содержащее интерферон и вспомогательные вещества, отличающееся тем, что в качестве лекарственного вещества содержит интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный, иммобилизированный на полиэтиленгликоле молекулярной массой 1,5 кДа с помощью физического способа связывания потоком ускоренных электронов в дозе 1,5 Мрад, причем компоненты в средстве находятся в определенном соотношении. Изобретение обеспечивает расширение арсенала противоэнтеровирусных средств, обладающих иммуностимулирующими свойствами. 6 пр., 10 табл.

Противоэнтеровирусное и иммуностимулирующее средство для перорального применения в виде капсул, содержащее интерферон и вспомогательные вещества, отличающееся тем, что в качестве лекарственного вещества содержит интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный, иммобилизированный на полиэтиленгликоле молекулярной массой 1,5 кДа с помощью физического способа связывания потоком ускоренных электронов в дозе 1,5 Мрад при следующем соотношении компонентов на капсулу:
интерферон альфа-2b человеческий   рекомбинантный иммобилизированный 1000000 ME вспомогательные вещества:   мальтодекстрин 0,3-0,36 г декстран 0,03592-0,0898 г полиэтиленгликоль 0,004-0,01 г эдта 0,08-0,2 мг