Способ профотбора для работы в условиях возможного общего охлаждения по содержанию ирисина в периферической крови Российский патент 2020 года по МПК G01N33/48 A61K38/16 

Изобретение относится к области медицины, в частности, физиологии труда, иммунологии и касается способа профотбора для работы в условиях влияния низких температур по определению содержания ирисина в крови.

Дефицит тепла и общее охлаждение являются основной причиной формирования экологически зависимых северных вариантов вторичных иммунодефицитов, обусловливающих повышенные уровни заболеваемости, хронической патологии и инвалидизации на Севере. Недостаток тепла является основным фактором, провоцирующим болезни, связанные с изменением тонуса сосудов, болезни органов дыхания и сердечно-сосудистой системы. При влиянии общего охлаждения на организм человека основную роль составляют системные реакции с нарушениями микроциркуляции, рециркуляции и миграции клеток крови, приводящие к внезапным сердечнососудистым катастрофам. В системной сердечно-сосудистой реакции основное значение имеют реакции эндотелиоцитов. Известно, что дефицит тепла и холодовой стресс ассоциированы с недостатком содержания в крови тимус зависимых лимфоцитов, активных фагоцитов, натуральных киллеров, IgA на фоне повышения концентрации катехоламинов и продуктов повреждения клеток, в том числе апоптоза [Козырева, Т.В. Иммунный ответ и содержание кортикостероидов при различных режимах охлаждения / Т.В. Козырева, Л.С. Елисеева // Бюлл. экспер. биол. и мед, 2002 - Т. 133 - №4 - С. 384-387; Козырева, Т.В. Функциональные изменения при адаптации организма к холоду / Т.В. Козырева, Е.Я. Ткаченко, Т.Г. Симонова // Успехи физиол. Наук, 2003. - Т. 34. - №2. - С. 94-102; Kozyreva T.V., Eliseeva L.S., Tsoi L.V., Khramova G.M. Effect of rapid slight cooling of the skin in various phases of immunogenesis on the immune response // Bulletin of experimental biology and medicine, 2006. - Vol. 142(4). - P. 409-112; Kozyreva T.V. Central and peripheral thermoreceptors. Comparative analysis of the effects of prolonged adaptation to cold and noradrenaline // Neuroscience and behavioral physiology, 2007. - Vol. 37(2). - P. 191-198; Antipruritic and thermal sensation effects of hydrocortisone creams in human skin / Zhai H., Frisch S., Pelosi A., Neibart S., Maibach H.I. // Skin. Pharmacol. Appl. Skin. Physiol, 2000. - №13. - P. 352-357]. Охлаждение вызывает дегрануляцию тканевых базофилов и отек дермы за счет действия медиаторов, что приводит к инфильтрации ткани мононуклеарами, нейтрофилами, эозинофилами и повреждению эндотелия с отложением иммунных комплексов [Local effects of synthetic leukotriens (LTC4, LTD4, LTE4, and LTB4) in human skin / N.A. Soter, R.A. Lewis, Corey E.J., Austen K.F. // J. Invest Dermatol, 1993. - Vol. 80 (2). - P. 115-119].

При холодовом воздействии основными механизмами наращивания теплопродукции в организме являются несократительный и сократительный термогенез [Ажаев А.Н. Физиолого-гигиенические аспекты действия высоких и низких температур. Проблемы космической биологии. М., 1979. Т. 38. 264 с.; Деряпа Н.Р., Матусов А.Л., Рябинин И.Ф. Человек в Антарктиде. Л., 1975. 184 с.; Иванов К.П. Мышечная система и химическая терморегуляция. М., 1965. 127 с. 4; Иванов К.П. Основы энергетики организма // Современные проблемы, загадки и парадоксы регуляции энергетического баланса. СПб., 2001. Т. 3. 278 с.; Казначеев В.П. Современные аспекты адаптации. Новосибирск, 1980. 192 с.]. Считается, что результатом адаптации человека к холоду является повышение порога возникновения холодовой дрожи и теплотворной функции сократительного термогенеза [Ажаев А.Н. Физиолого-гигиенические аспекты действия высоких и низких температур. Проблемы космической биологии. М., 1979. Т. 38. 264 с.; Кандрор И.С. Очерки по физиологии и гигиене человека на Крайнем Севере. М., 1968. 280 с.]. При температурной дрожи в мышечные клетки вырабатывают пептид ирисин, который способствует активации определенных геномных комплексов жировых клеток, благодаря чему клетки белого жира преобразуются в бурые [Bostrom P., Wu J., Jedrychowski М.Р. et al. A PGC1-a-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis // Nature. 2012. V. 481. P463; Spiegelman B.M. Banting Lecture 2012: Regulation of adipogenesis: toward new therapeutics for metabolic disease // Diabetes. 2013. V. 62 (6). P. 1774; Virtanen K.A., van Marken Lichtenbelt W.D., Nuutila P. Brown adipose tissue functions in humans // Biochim. Biophys. Acta. 2013. V. 183 (5). P. 1004].

Известен способ определения степени магниточувствительности человека, предложенный авторами Макеева Б.Л., Кидалова В.И. [Патент РФ №2108581, опубл. 10.04.1998] путем исследования сыворотки капиллярной крови, которую смешивают с раствором Лизеганга и определяют время формирования колец преципитата коллоидных структур до и после 30 минутного воздействия постоянным магнитным полем индукцией 3 мТл. При сокращении времени формирования колец относительно исходного уровня до 30% определяют чувствительность слабой, от 31 до 50% - средней, более 50% - высокой. В указанном аналоге изобретения не рассматривается задача определения индивидуальной чувствительности человека к общему охлаждению, в то время как в нашем изобретении предложен простой и понятный способ решения этой задачи.

Существует способ оценки in vitro индивидуальной реакции организма пациента на действие фармакологического препарата авторов Тычинского В.П., Кретушева А.В., Вышенская Т.В., Клемяшова И.В. [Патент РФ №2526134, опубл. 10.05.2014]. Способ включает исследование лимфоцитов периферической крови пациента методом интерференционной микроскопии до и после воздействия препарата. Анализируется изображение лимфоцита в виде зон оптической плотности с последовательным учетом цитоплазматического индекса, значения фазовой толщины, площади, эквивалентных диаметров, фазового объема, рефрактерности ядра, ядрышек, цитоплазмы и хондриома. Оценку индивидуальной иммунной реакции организма на действие фармацевтического препарата осуществляют по количественным изменениям указанных параметров. Хотя в предложенном нами изобретении оценка индивидуальной чувствительности человека к общему охлаждению также дается относительно состояния лимфоцитов (уровня их активированности), однако сравниваемые способы имеют различные области применения. Аналог может использоваться для медицинской диагностики в области аллергии, токсикологии, фармакологии. Предложенный нами способ направлен на профотбор практически здоровых людей, наиболее пригодных к работе в суровых условиях Арктики.

При анализе отечественных технических решений, относящихся к способу, мы не нашли изобретений, включающих в качестве существенного признака определение содержания белка ирисина. В сфере зарубежного патентования использование ирисина осуществляется в основном в способах профилактики и лечения различных заболеваний: при ишемическом и реперфузионном повреждении миокарда [Chunyu Zeng,Yu Han, Zhen Wang, Ken Chen, Yu Li Application of irisin in myocardial ischemia reperfusion // Патент №09682121 от 20.06.2017, КНР], остеопорозе [Maria Grano, Graziana Colaianni,Concetta Cuscito, Giacomina Brunetti, Silvia Colucci, Saverio Cinti, Giorgio Mori Irisin for care and prevention of osteoporosis //Заявка №20170028018 от 02.02.2017, Италия], онкологических заболеваниях [Kristina Trujillo, Nicholas Patrick, Gannon Roger, Alan Vaughan Irisin-related cancer treatments // Заявка №20170312339 от 02.11.2017, США]. В указанных способах ирисин вводится в качестве лекарственного препарата согласно запатентованной терапевтической схеме в объеме от 0,1 до 500 мкг/кг, предлагается использовать ирисин в составе биологически активной добавки к пище в целях повышения скорости метаболизма и снижения массы тела [Shane Е. Durkee, Gabriel Wilson Nutritional supplement for the enhancement of muscle irisin and enhancement of brown fat, metabolic rate, and weigh loss, and methods of use thereof // Заявка №20170151300 от 01.06.2017, США]. Таким образом, описываемые аналоги изобретения ставят своей целью увеличить уровень ирисина в организме человека путем введения экзогенного, рекомбинантного белка. Предложенный нами способ не предполагает подобных действий, происходит лишь регистрация уже существующего уровня содержания эндогенного ирисина.

Поставленная цель достигается путем изучения содержания ирисина в крови до и после нахождения человека в холодовой камере в течение 5 мин. при температуре -25°С. При отсутствии изменений содержания ирисина или снижении его концентраций менее чем 25% от исходного уровня делается заключение об устойчивости (слабой чувствительности) к общему охлаждению, при снижении концентрации ирисина на 30 и более % обследуемого человека относят к чувствительным к общему охлаждению, что ассоциируется со снижением содержания циркулирующих в крови ядросодержащих клеток на 20 и более % от исходного значения. Способ позволяет выявить лиц, способных выдерживать дефицит тепла и общее охлаждение без риска формирования вторичного экологически зависимого иммунодефицита.

Заявленный способ осуществляется следующим образом. Кровь для исследования берется из локтевой вены в минимальном объеме (1 мл) до 10 часов утра, натощак, до и после нахождения в холодовой камере в течение 5 минут при температуре -25°С. Для количественного изучения ирисина используется сыворотка крови, анализируемая иммуноферментным методом с применением диагностического набора для ИФА. Результаты реакции оцениваются на спектрофотометре с длиной волны 450 нм.

Указанным способом были обследованы 73 практически здоровых человека, из них 63 женщины и 10 мужчин, в возрасте от 21 до 50 лет, до и после пребывания в климатической камере, давших добровольное согласие на участие в исследовании. Обследование проводили с соблюдением основных норм биомедицинской этики. Результаты обработаны с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0» («StatSoft», США). Тип исследования ретроспективный, выборки случайные, одномоментные. Генеральная совокупность - жители г. Архангельска. Достоверность различий между группами оценивали с помощью параметрического t-критерия Стьюдента для независимых выборок и непараметрического критерия U-Манна-Уитни. Статистическая достоверность присваивалась при значении р<0,05.

Проведенные нами исследования показали, что в результате кратковременного холодового воздействия после нахождения в холодовой камере в течение 5 минут при температуре -25°С можно выделить три группы лиц с изменением содержания ирисина в сыворотке крови: снижение концентрации, зарегистрированное у 28,77% обследованных, увеличение - 21,92% лиц и отсутствие изменения содержания - у 49,32%. После пребывания в холодовой камере при снижении содержания ирисина не менее чем на 30% от исходного значения у 26,09% обследуемых отмечается снижение общего содержания лейкоцитов от исходного уровня на 30-50% за счет снижения уровня лимфоцитов на 20-60%, преимущественно активированных Т-лимфоцитов с рецептором к трансферрину CD71+, к рецептору IL-2 - CD25+ и молекулам Главного комплекса гистосовместимости класса II HLA DR, а также у 30,44% лиц за счет снижения нейтрофильных лейкоцитов на 20-45%. Столь быстрое снижение содержания иммунокомпетентных клеток, вероятнее всего, происходит из-за перераспределения клеток крови из циркулирующего в маргинальный пул в результате реакции эндотелий зависимой вазодилатации. Ингибиция вазодилатации подавляет микроциркуляцию и провоцирует нарушение метаболических процессов с развитием окислительного стресса и снижением биодоступности оксида азота [Marchiol R., Schweiger С., Levantesi G. et al. Antioxidant vitamins and prevention of cardiovascular disease: epidemiological and clinical trial data // Lipid. 2001. V. 36. P. 53; Maxwell S., Greig L. Antioxidants - protective role in cardiovascular disease? // Expert. Opin. Pharmacother. 2001. V. 2(11). P. 1737; Sun J., Pich E., Ginsburg K.S. et al. Hypercontractile female hearts exhibit increased S-nitrosylation of the L-type Ca2+ channel alpha lsubinit and reduced ischemia/reperfusion injury // Circ. Res. 2006. V. 98 (3). P. 403; Madigan M., Zuckerbraun B. Therapeutic potential of the nitrite-generated NO pathway in vascular dysfunction // Front. Immunol. 2013. V. 2(4). P. 174.]. При отсутствии восстановления метаболизма в тканях местными реакциями вступает в регуляцию системный механизм изменения артериального давления и регуляции церебрального кровотока [Lind-Holst М., Cotter J.D., Helge J.W. et al. Cerebral autoregulation dynamics in endurance-trained individuals // J. Appl. Physiol. 2011. V. 110. P. 1327; Stadeager C., Hess В., Henrikksen O. Effects of angiotensin blockade on the splanchnic circulation in normotensive humans // J. Appl. Physiol. 1989. V. 67. P. 786.]. Сигналом из сосудодвигательного центра продолговатого мозга повышается давление в проксимальном отделе сосудистого русла для исправления нарушений микроциркуляции в дистальном отделе артериального русла. Нами установлено, что уровень снижения содержания лимфоцитов при общем охлаждении зависит от концентрации эндотелина-1: у лиц с высоким исходным уровнем эндотелина-1 (1,56±0,39 фмоль/мл) снижение концентрации лимфоцитов после экспозиции холодом более выражено (с 1,80±0,07 до 1,51±0,08 х10⁹ кл/л; р<0,05), низкие концентрации эндотелина-1 (0,32±0,04 фмоль/мл) ассоциированы с отсутствием реакции со стороны содержания лимфоцитов (1,47±0,08 и 1,52±0,09×10⁹ кл/л).

Частные примеры использования способа.

1. Практически здоровый мужчина Ф., возраст 20 лет. Вес 78 кг, рост 1,76 м, индекс массы тела 25,2 кг/м². При лабораторном исследовании периферической крови выявлено, что содержание ирисина до нахождения в холодовой камере составило 3,622 мкг/мл, после воздействия холодом - 2,372 мкг/мл. Таким образом, произошло снижение уровня ирисина на 34,51 % (в абсолютном выражении на 1,25 мкг/мл). Сделан вывод о чувствительности обследуемого к общему охлаждению, что доказывается результатами иммунологического исследования лимфоцитов. Установлено сокращение общей популяции лимфоцитов с 2,47 до 1,85X10⁹ кл/л (в относительном выражении на 25,1%), что подтверждается снижением содержания фенотипов активированных, дифференцированных лимфоцитов: CD4+ с 0,57 до 0,28; CD8+ с 0,79 до 0,31; CD19+ с 0,57 до 0,31; CD54+ с 0,72 до 0,52; CD25+ с 0,79 до 0,35; CD71+ с 0,47 до 0,25Х10⁹; HLA DR II с 0,46 до 0,26X10⁹ кл/л.

2. Практически здоровая женщина О., возраст 22 года. Вес 51 кг, рост 1,67 м, индекс массы тела 18,29 кг/м². При лабораторном исследовании периферической крови выявлено, что содержание ирисина до нахождения в холодовой камере составило 8,972 мкг/мл, после воздействия холодом - 4,248 мкг/мл. Таким образом, произошло снижение содержания ирисина на 52,65% (в абсолютном выражении на 4,724 мкг/мл). Сделан вывод о чувствительности обследуемой к общему охлаждению, что доказывается результатами иммунологического обследования нейтрофилов. Установлено сокращение общей популяции нейтрофилов с 1,80 до 1,35X10⁹ кл/л (в относительном выражении на 25%).

3. Практически здоровая женщина С., возраст 32 года. Вес 56 кг, рост 1,67 м., индекс массы тела 20,08 кг/м². При лабораторном исследовании крови выявлено, что содержание ирисина до нахождения в холодовой камере ставило 1,301 мкг/мл, после - 1,399 мкг/мл. Таким образом, концентрация ирисина практически не изменилась от исходного уровня. Сделан вывод о слабой чувствительности обследуемой к общему охлаждению, что доказывается результатами иммунологического исследования лимфоцитов. После абсолютного подсчета клеток до и после кратковременного холодового воздействия установлено, что уровень лимфоцитов, нейтрофилов, активированных лимфоцитов с фенотипами CD25+, CD71+и HLA DRII не изменялся: соответственно (2,08 и 2,16X10⁹ кл/л), (1,92 и 2,2X10⁹ кл/л), (0,42 и 0,38Х10⁹ кл/л), (0,43 и 0,41Х10⁹ кл/л), (0,56 и 0,49Х10⁹ кл/л).

4. Практически здоровый мужчина Л., возраст 28 лет. Вес 73 кг, рост 1,74 м., индекс массы тела 24,11 кг/м². При лабораторном исследовании крови выявлено, что концентрация ирисина в крови до нахождения в холодовой камере составила 1,266 мкг/мл, после - 2,79 мкг/мл. Таким образом, произошло увеличение уровня ирисина на 120,38% (в абсолютном выражении на 1,524 мкг/мл) от исходного значения. Сделан вывод о слабой чувствительности обследуемого к общему охлаждению, что доказывается результатами иммунологического исследования лимфоцитов, нейтрофилов. Установлено увеличение общей популяции лимфоцитов с 1,31 до 1,62 X10⁹ кл/л (в относительном выражении на 23,66%), что подтверждается увеличением содержания фенотипов активированных и дифференцированных лимфоцитов: CD4+ с 0,30 до 0,36; CD8+ с 0,45 до 0,50; CD19+ с 0,26 до 0,29, CD25+ с 0,28 и 0,37, CD71+ с 0,22 и 0,28; HLA DRII с 0,31 до 0,35 X10⁹ кл/л, а также нейтрофилов с 2,78 до 3,19X10⁹ кл/л (в относительном выражении на 14,75%).

Изобретение относится к области медицины, в частности физиологии труда, иммунологии, и касается способа профотбора для работы в условиях влияния низких температур по определению содержания ирисина в крови. Способ характеризуется тем, что в периферической крови обследуемых лиц определяют содержание ирисина до и после нахождения человека в холодовой камере в течение 5 мин при температуре -25°С. При отсутствии изменений содержания ирисина или снижении его концентраций менее чем 25% от исходного уровня делается заключение об устойчивости (слабой чувствительности) к общему охлаждению, при снижении концентрации ирисина на 30 и более % обследуемого человека относят к чувствительным к общему охлаждению, что ассоциируется со снижением содержания циркулирующих в крови ядросодержащих клеток на 20 и более процентов от исходного значения. Способ позволяет выявить лиц, способных выдерживать дефицит тепла и общее охлаждение без риска формирования вторичного экологически зависимого иммунодефицита. 4 пр.

Способ профотбора для работы в условиях влияния низких температур по определению содержания ирисина в крови, отличающийся тем, что определяется индивидуальная чувствительность к общему охлаждению и критерии риска формирования вторичного экологически зависимого иммунодефицита по изменению содержания ирисина в крови до и после нахождения человека в холодовой камере в течение 5 мин при температуре -25°С, определяют уровень ирисина в периферической крови: при отсутствии изменений содержания ирисина или снижении его концентраций менее чем 25% от исходного уровня делается заключение об устойчивости (слабой чувствительности) к общему охлаждению, при снижении концентрации ирисина на 30 и более % обследуемого человека относят к чувствительным к общему охлаждению, что ассоциируется со снижением содержания циркулирующих в крови ядросодержащих клеток на 20 и более % от исходного значения.