СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АУТОИММУННОГО ТИРЕОИДИТА У ЖИТЕЛЕЙ АРКТИЧЕСКОГО РЕГИОНА ПО УРОВНЮ СОДЕРЖАНИЯ АУТОАНТИТЕЛ К КАТЕПСИНУ G И ЛАКТОФЕРРИНУ Российский патент 2024 года по МПК G01N33/68 G01N33/543 

Изобретение относится к области лабораторной диагностики, физиологии, иммунологии и касается способа диагностики аутоиммунного тиреоидита у жителей Арктического региона по уровню содержания аутоантител к катепсину G и лактоферрину.

Аутоиммунные заболевания щитовидной железы (ЩЖ) составляют 30% среди всей аутоиммунной патологии, включая два основных клинических подтипа: болезнь Грейвса (БГ) и аутоиммунный тиреоидит (АИТ) [Аналитический обзор по результатам мониторинга основных эпидемиологических характеристик йододефицитных заболеваний у населения Российской Федерации за период 2009-2015 гг. / Е.А. Трошина, Н.М. Платонова, Е.А. Панфилова и др. // Проблемы эндокринологии. - 2018. - Т. 64(1). - С. 21-37; Alamino V.A. Dendritic cells exposed to triiodothyronine deliver pro-inflammatory signals and amplify IL-17-driven immune responses / V.A. Alamino, M.D. Montesinos, M.F. Soler, et al. // Cell Physiol. Biochem. - 2019. - Vol. 52(2). - P. 354-367; Nowak K. Immunomodulatory effects of synthetic endocrine disrupting chemicals on the development and functions of human immune cells / K. Nowak, E. Jablonska, W. Ratajczak-Wrona // Environ Int. - 2019. - Vol. 125. - P. 350-364; Гарднер Д. Базисная и клиническая эндокринология / Д. Гарднер, Д. Шобек. - Кн. 1. М.: БИНОМ. - 2019]. Иммунопатологические механизмы этих заболеваний в последние годы интенсивно изучаются. Пусковые процессы при АИТ до конца не ясны. В крови пациентов, как правило, обнаруживают антитела (AT) к различным антигенам ЩЖ, наиболее часто определяются AT к тиреопероксидазе (АТ-ТПО), тиреоглобулину, реже - блокирующие AT к рецептору тиреотропного гормона (ТТГ). Кроме того, в начале заболевания могут транзиторно определяться и стимулирующие AT к рецептору ТТГ. Тем не менее, у ряда пациентов с АИТ (около 10-15%) AT в сыворотке крови могут не выявляться [Тиреоидиты. Методические рекомендации (в помощь практическому врачу) / Е.А. Трошина, Е.А. Панфилова, М.С. Михина и др. // Consilium Medicum. - 2019. - Т. 21(12). - С. 10-22]. Спектр аутоантител при АИТ не ограничивается антителами к ТПО. Ранее нами установлено, что у больных АИТ, проживающих на Европейском Севере, кроме повышенных концентраций антител к тиреоидной пероксидазе в 69,44% случаев, регистрируется высокая частота выявления повышенных уровней антител к РНК (RNP), ДНК (ds-DNA), антифосфолипидам (аФЛ) классов IgM и IgG у 60,18; 51,85 и 15,74% обследованных соответственно [Верещагина К.В. Особенности иммунных реакций при аутоиммунном тиреоидите у жителей северного региона / К.В. Верещагина, А.В. Самодова, Л.К. Добродеева // Якутский медицинский журнал. - 2021. - Т. 75, №3. - С. 30-33].

Общепринято, что в патогенезе аутоиммунных заболеваний щитовидной железы взаимодействуют генетические и средовые факторы. Однако ни природа, ни точная роль тех и других не известны. Одна из наиболее распространенных точек зрения заключается в том, что предрасположенность к аутоиммунной реакции на тиреоидные антигены обусловлена генетической недостаточностью специфических Т-супрессоров. Ослабление ограничивающего действия этих клеток на активность специфических аутореактивных Т-хелперов сопровождается продукцией В-лимфоцитами антитиреоидных аутоантител и реализацией антитиреоидных эффектов цитотоксических Т-клеток [Вольпе Р. // Болезни щитовидной железы / Под ред. Л.И. Бравермана: Пер. с англ. - М. - 2000. - С. 140-172].

В общем анализе крови больных АИТ возможны лимфоцитоз, моноцитоз, лейкопения и увеличение СОЭ. Иммунологическое исследование крови позволяет выявить повышение количества и активности Т-хелперов и Т-киллеров при снижении количества Т-супрессоров, повышение уровня иммуноглобулинов [Intercellular interactions in peripheral venous blood in practically healthy residents of high latitudes / L.K. Dobrodeeva, A.V. Samodova, S.N. Balashova, et al. // BioMed Research International. - 2021. - Vol. 2021. - P. 7086108].

Показано, что при АИТ выявляют дисбаланс субпопуляций Т-лимфоцитов, провоспалительных и противовоспалительных цитокинов и увеличение количества активированных поликлональных В-лимфоцитов и плазматических клеток, синтезирующих широкий спектр аутоантител [Грязнова М.А. Особенности цитокиновой регуляции при аутоиммунной патологии щитовидной железы / М.А. Грязнова, Л.Ю. Хамнуева // Журнал научных статей «Здоровье и образование в XXI веке». - 2017. - Т. 19(7). - С. 33-39.; Современные аспекты этиологии и патогенеза хронического аутоиммунного тиреоидита / О.И. Иванова, М.С. Соломина, С.В. Логвинов и др. // Сибирский онкологический журнал. - 2006. - Т. 17(1). - С. 55-60.; Colin M.D. Chronic autoimmune thyroiditis / M.D. Colin, H.D. Gilbert // New. Engl. J. Med. - 2016. Vol. 335. - P. 99-107].

Аутоантителообразование является физиологической реакцией до определенного момента, когда высокие концентрации аутоантител приводят к разрушению и соответственно к патологии. При этом расширение спектра повышенных концентраций аутоантител значительно увеличивает количество поражаемых систем с формированием многочисленной и разнообразной патологии. Таким образом, повышенный уровень содержании лимфоцитов CD71+ менее 0,3×10⁹ кл/л и концентрации IL-2 более 25 пг/мл прогнозируют неблагоприятное течение АИТ. Недостатком способа является длительная пробоподготовка с выделением лимфоцитарной взвеси и сыворотки крови.

Способ оценки риска развития и предрасположенности к развитию патологии, ассоциированной с присутствием аутоантител против epcr [Патент РФ №2375716, опубл. 20.03.2018] предусматривает определение уровня аутоантител против эндотелиального рецептора белка С/активированного белка С (EPCR) в образце. Присутствие высоких уровней аутоантител против EPCR ассоциировано с повышенным риском или восприимчивостью индивидуума к развитию аутоиммунных заболеваний, сосудистых заболеваний или осложнений беременности.

Способ диагностики аутоиммунной патологии [Патент РФ №2146371 от 10.03.2000], включающий определение уровней аутоантител к эластину, коллагену, антигенам тканей легкого в крови, числа нейтрофилов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа, активность эластазы и уровень а 1-ингибитора протеиназ в жидкости бронхоальвеолярного лаважа с дальнейшим расчетом диагностического коэффициента К. При К>70% диагностируют наличие аутоиммунного компонента хронического воспалительного процесса; к >70% и величине суммарного уровня аутоантител к эластину, коллагену и к антигенам ткани легкого (А+В+С)>10 усл. ед. диагностируют обострение идиопатического фиброзирующего альвеолита. Заявленный способ является очень трудоемким, предполагает сложную пробоподготовку с дальнейшим применением иммуноферментного анализа, спектрофотометрии и ракетного электрофореза.

Известны методы диагностики аутоиммунных процессов с изучением биологических или физико-химических параметров организма инструментальными методами [патент. РФ №2059245, опубл. 27.04.1996; патент РФ №2012887, опубл. 15.05.1994], отличающиеся длительностью и сложностью проведения исследования.

Близким по достигаемому техническому результату можно считать способ определения аутоантител и диагностики аутоиммунного тиреоидита [Патент РФ №2315313, опубл. 20.01.2008], включающий определение аутоантител по изменению частоты колебаний пьезокварцевого резонатора на основе объемно-акустических волн до и после поэтапной иммобилизации на твердой поверхности электродов пьезокварцевого резонатора L-полилизина, антигена-ДНК и последующей инкубации пьезокварцевого резонатора в сыворотке крови. При показателе сдвига частоты колебаний пьезокварцевого резонатора в пределах Δf=124,50±13,84 Гц диагностируют аутоантителообразования представляет серьезный риск инициации очень многих болезней, затрагивающих различные системы и органы.

В регуляции баланса между физиологическим состоянием и патологическим воспалением принимает участие катепсин G - сериновая протеаза, обладающая необычной двойной трипсино- и химотрипсиноподобной специфичностью, синтезирующейся в нейтрофилах, моноцитах и тучных клетках. Катепсин G регулирует функциональное состояние иммунных клеток, способствует миграции нейтрофилов и нейтрализации антигенов [Meyer-Hoffert U. Neutrophil-derived serine proteases modulate innate immune responses / U. Meyer-Hoffert // Front. Biosci. (Landmark Ed). - 2009. - Vol. 14. - P. 3409]. Лактоферрин является полифункциональным железосвязывающим белком, присутствующим в высоких концентрациях в секретах слизистых оболочек, слезной жидкости и молоке, а также в гранулах полиморфноядерных нейтрофильных лейкоцитов, откуда выделяется экзоцитозом при их активации [Lactoferrin a multiple bioactive protein: an overview / I.A. Garcia-Montoya, T.S. Cendon, S. Arevalo-Gallegos, et al. // Biochim. Biophys. Acta. - 2012. - 1820(3). - 226-236].

Аутоантитела к катепсину G и лактоферрину относятся к антинейтрофильным цитоплазматическим аутоантителам (ANCA) и обнаруживаются при коллагенозах, воспалительных заболеваниях, ревматизме, системной красной волчанки, синдроме Шегрена и синдроме Фелти [Kyriakidi K.S. Neutrophil anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody proteins: bactericidal increasing protein, lactoferrin, cathepsin, and elastase as serological markers of inflammatory bowel and other diseases / K.S. Kyriakidi, V.E. Tsianos, E. Karvounis et al. // Ann. Gastroenterol. - 2016. - Vol. 29, N 3. -P. 25 -267; Gajic-Veljic M. Level and avidity of antineutrophil cytoplasmic antibodies specific to lactoferrin are useful biomarkers in systemic lupus erythematosus / M. Gajic-Veljic, B. Lekic, M. Nikolic et al. // Clin. Rheumatol. - 2022. - Vol. 41, N 3. - P. 709-720].

Известно, что неблагоприятные климатогеографические условия Севера влияют на повышение концентраций и многообразие продуктов тканевого обмена со свойствами аутоантигенов [Добродеева Л.К. Аутоантитела у практически здоровых людей / Л.К. Добродеева, Г.А. Суслонова // Иммунология. - 1990. - №2. - С. 52-55., Содержание аутоантител у практически здоровых людей / Л.К. Добродеева, Л.В. Сенькова, Г.Т. Лютфалиева [и др.] // Физиология человека. - 2006. - №1. - С. 99-107].

При прогнозировании характера течения аутоиммунного тиреоидита [Патент РФ №2456612, опубл. 20.07.2012 Способ прогнозирования характера течения аутоиммунного тиреоидита] в периферической венозной крови определяют абсолютное содержание Т-лимфоцитов с рецептором к трансферрину (CD71+) и концентрацию интерлейкина-2 (IL-2). При содержании лимфоцитов CD71+ более 0,3×10⁹ кл/л и концентрации IL-2 менее 25 пг/мл прогнозируют благоприятное течение заболевания, а при аутоиммунный тиреоидит. Заявленный способ является сложным, длительным и дорогим в диагностике аутоимунного тиреоидита.

Задачей изобретения является разработка способа диагностики аутоиммунного тиреоидита у жителей Арктического региона по уровню содержания аутоантител к катепсину G и аутоантител к лактоферрину. Изобретение позволяет в обычных условиях без дополнительных трудозатрат на выделение клеточной взвеси выявить одновременное повышение концентраций аутоантител к катепсину G и аутоантител к лактоферрину, как в сыворотке крови, так и в межтканевой жидкости, транссудатах, экссудатах, моче и слюне. Использование данного способа позволит повысить точность и объективность диагностики аутоиммунного тиреоидита, используя при этом материалы, реактивы и методы исследования, широко применяемые в стандартной клинико-лабораторной практике.

Заявленный способ осуществляется следующим образом. Объектом исследования может быть сыворотка крови или другая биологическая жидкость (до 0,5 мл), в которой иммуноферментным способом с диагностическими наборами на автоматическом анализаторе определяются концентрации аутоантител к катепсину G и лактоферрину.

Указанным способом были обследованы 379 человек, из них 236 практически здоровых на момент обследования людей, в том числе 99 человек (84,85% женщин и 15,15% мужчин в возрасте 48,19±1,66 лет), проживающих в пос. Ревда Мурманской области и 137 жителей (80,81% женщин и 19,19% мужчин в возрасте 48,56±2,68 лет) Архангельской области, а также 143 больных аутоиммунным тиреоидитом, из них 35 больных, проживающих в Арктике (Мурманской области) и 108 человек, больных АИТ, обратившихся в центр профессиональной диагностики «Биолам», проживающих на Европейском Севере РФ (Архангельской области). Средний возраст обследованных составил 37,62±1,53 лет. Обследование проводили с соблюдением основных норм биомедицинской этики. Результаты обработаны с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0» («StatSoft», США).

Проведенные нами исследования показали, что у 141 из 143 больных аутоиммунным тиреоидитом по сравнению с практически здоровыми лицами патологические реакции сопровождаются резким увеличением концентраций аутоантител к катепсину G (с 2191,55±156,51 до 4715,56±926,01 нг/мл; р<0,001) и аутоантител лактоферрину (с 12,42±0,43 до 17,04±1,63; р<0,01). Итак, при одновременном повышении концентраций аутоантител к катепсину G>3500 нг/мл и аутоантител к лактоферрину >15 Ед/мл в периферической венозной крови у жителей Арктического региона диагностируют аутоиммунный тиреоидит.

Частные примеры использования заявленного способа:

1. Больной К., возраст 36 лет. Диагноз: Аутоиммунный тиреоидит. При лабораторном обследовании выявлено, что концентрация аутоантител к катепсину G в крови составила 7708,44 нг/мл, аутоантител к лактоферрину - 19,962 Ед/мл. Поставленный диагноз аутоимунный тиреоидит у больного К. подтверждается высоким уровнем антител к тиреоидной пероксидазе 93,57 МЕ/мл и результатами УЗИ щитовидной железы с выявлением особенностей неоднородности ткани с участками пониженной эхогенности. Выявленная закономерность подтверждена.

2. Практически здоровая женщина Ш., возраст 45 лет. При лабораторном обследовании периферической крови выявлено, что концентрация аутоантител к катепсину G составила 1004,25 нг/мл, аутоантител к лактоферрину - 8,952 Ед/мл. Сделан вывод об отсутствии аутоиммунного тиреоидита, что подтверждается в пределах физиологической нормы содержанием антител к тиреоидной пероксидазе 22,34 MЕ/мл и результатами УЗИ щитовидной железы. Выявленная закономерность подтверждена.

3. Больная Л., возраст 35 лет. Диагноз: Аутоиммунный тиреоидит. При лабораторном обследовании выявлено, что концентрация аутоантител к катепсину G в крови составила 3793,22 нг/мл, аутоантител к лактоферрину - 15,56 Ед/мл. Поставленный диагноз аутоимунный тиреоидит у больной Л. подтверждается высоким уровнем антител к тиреоидной пероксидазе 122,64 МЕ/мл и результатами УЗИ щитовидной железы с выявлением особенностей неоднородности ткани с участками пониженной эхогенности. Выявленная закономерность подтверждена.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, физиологии, иммунологии, и может быть использовано для диагностики аутоиммунного тиреоидита у жителей Арктического региона. В периферической венозной крови обследуемых лиц определяют концентрации аутоантител к катепсину G и лактоферрину. При одновременном повышении концентраций аутоантител к катепсину G >3500 нг/мл и аутоантител к лактоферрину >15 Ед/мл диагностируют аутоиммунный тиреоидит. Способ обеспечивает повышение точности и объективности диагностики аутоиммунного тиреоидита за счет определения содержания аутоантител к катепсину G и лактоферрину в периферической крови жителей Арктического региона. 3 пр.

Способ диагностики аутоиммунного тиреоидита у жителей Арктического региона по уровню содержания аутоантител к катепсину G и лактоферрину, характеризующийся тем, что в периферической венозной крови обследуемых лиц определяют концентрации аутоантител к катепсину G и лактоферрину; при одновременном повышении концентраций аутоантител к катепсину G >3500 нг/мл и аутоантител к лактоферрину >15 Ед/мл диагностируют аутоиммунный тиреоидит.