Способ определения профиля восприимчивости матки, профиль восприимчивости матки, способ увеличения степени успеха репродуктивной технологии, способ оценки пациента для репродуктивной технологии, система анализа данных при репродуктивной технологии, набор Российский патент 2020 года по МПК G01N33/68 

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу определения профиля восприимчивости (имплантационной готовности) матки во время имплантационного окна у субъекта женского пола, что позволяет подобрать индивидуальное лечение для данной пациентки для повышения возможности удачной имплантации.

Предпосылки создания изобретения

Искусственное оплодотворение, например, экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО), успешно используется у пациенток с бесплодием уже на протяжении трех десятилетий. Несмотря на широкомасштабные исследования в этой области, это до сих пор очень непростая и дорогостоящая процедура. На самом деле, менее чем 5% отобранных яйцеклеток и в последующем только 20-25% перенесенных эмбрионов приживаются, и процедура заканчивается рождением ребенка. Оптимизация "компетентности" эмбриона, а также имплантационной готовности матки - абсолютное требование для повышения эффективности вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Успешная имплантация - это процесс, включающий синхронизированное взаимовлияние восприимчивого эндометрия и функциональной бластоцисты. Этот феномен наблюдается только во время имплантационного окна, самоограничивающегося периода восприимчивости эндометрия между 19 и 23 днем менструального цикла (женщины). При нормальных менструальных циклах это достигается за счет местных эффектов эстрогенов, синтезируемых яичниками, и прогестерона, которые запускают серию событий на клеточном и молекулярном уровнях в эндометрии, что обеспечивает адекватную имплантационную готовность.

Способы определения имплантационной готовности эндометрия известны из области техники: например, в патенте США 7,175,990 раскрывается способ, основанный на определении уровня L-селектина, продуцируемого эпителиальными клетками матки, при этом увеличение уровня L-селектина по сравнению с контролем, свидетельствует о повышенной вероятности успешной имплантации. Другой способ определения имплантационной готовности эндометрия описан в EP 2348318 и основан на определении уровня простагландина Е2 и F2 альфа в эндометриальной среде. Другой перспективный подход - это ERA тест (Endometrial Receptive Array), позволяющий определить 238 генов, которые специфически экспрессируются в период "имплантационного окна" (PCT/ES2009/000386). Указанные способы являются полезными только для определения имплантационной готовности эндометрия в отношении имплантации эмбриона.

Однако, при определении недостаточной имплантационной готовности указанные способы являются бесполезными поскольку не позволяют восстановить нарушенную имплантационную готовность.

Авторы изобретения сделали открытие, что недостаточная имплантационная готовность эндометрия может быть объяснена с двух разных позиций: состояния недостаточной активации и состояния гиперактивации эндометрия. Таким образом, определяя состояние эндометрия можно объяснить причину его невосприимчивости и, следовательно, подобрать индивидуальное лечение для восстановления его рецептивных свойств.

Следовательно, разработка нового способа, позволяющего определить состояние эндометрия женщины, позволила бы оптимизировать ее лечение в отношении восстановления имплантационной готовности эндометрия.

Краткое описание изобретения

Одним из объектов настоящего изобретения является способ определения у субъекта женского пола профиля восприимчивости (готовности) матки во время имплантационного окна, включающий определение состояния эндометрия путем измерения в образце эндометрия следующих маркеров:

а) биомаркеров состояния активности NK-клеток (uNK) матки, и

б) биомаркеров состояния рекрутинга и созревания NK-клеток матки, и сравнения полученных величин с контрольными величинами, что позволяет установить состояние эндометрия, характерное для адекватной или неадекватной имплантационной готовности.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, состояние активности uNK клеток определяется путем измерения экспрессии, по крайней мере, одного из следующих белков: IL-18, IL-6 и IL-12.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, состояние активности uNK клеток определяется путем измерения экспрессии IL-18 и Tweak и расчета соотношения IL18/Tweak.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, состояние рекрутинга uNK клеток определяется путем подсчета количества CD56+ uNK клеток или путем измерения экспрессии CD56.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, состояние созревания uNK клеток определяется путем измерения экспрессии IL-15.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, состояние созревания uNK клеток определяется путем измерения экспрессии IL-15 и Fn14 и расчета соотношения IL-15/Fn14.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, контрольные величины определяют у фертильного субъекта женского пола.

Другим объектом настоящего изобретения является профиль восприимчивости (имплантационной готовности) матки, основанный на количественном определении биомаркеров, специфичных для а) состояния активности uNK клеток и б) состояния рекрутинга и созревания uNK клеток.

Согласно одному варианту осуществления изобретения, профиль имплантационной готовности матки основан на экспрессии а) по крайней мере, одного из следующих белков, IL-18, IL-6 и IL-12, и б) CD56 и IL-15.

Согласно другому варианту осуществления, настоящее изобретение относится к профилю имплантационной активности матки, определяемому при помощи способа, описанного выше.

Другим объектом настоящего изобретения является способ повышения возможности удачной имплантации при использовании процедуры вспомогательной репродуктивной технологии (ВРТ) у субъекта женского пола, включающий:

определение профиля имплантационной готовности матки у указанного субъекта по время имплантационного окна, как описано выше, и

разработку индивидуальных рекомендаций для указанного субъекта в зависимости от полученного профиля имплантационной готовности матки.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ обследования субъекта женского пола в отношении возможности осуществления процедуры вспомогательной репродуктивной технологии (ВРТ), включающий:

- получение элементов информации от субъекта женского пола для составления профиля для указанного субъекта женского пола, при этом каждый элемент информации относится к предварительно отобранной переменной, при этом одной из указанных переменных является профиль имплантационной готовности матки, как описано выше,

- сравнение полученного профиля указанного субъекта женского пола с библиотекой известных профилей, характеризующих наличие восприимчивости к процедуре искусственного оплодотворения с использованием алгоритма, основанного на указанных предварительно отобранных переменных для данного субъекта,

- при этом указанное сравнение позволяет оценить возможность осуществления у данного субъекта женского пола процедуры ВРТ.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, указанные предварительно отобранные переменные включают гистологические данные (определение окна имплантационной готовности); свойства эндометрия (такие как толщина эндометрия, объем эндометрия, васкуляризация эндометрия, данные допплеровского исследования маточных артерий); возраст; причину бесплодия; данные по бесплодию, такие как краткий анамнез и количество и качество перенесенных эмбрионов; оценку резерва яичников с помощью гормональных исследований (антимюллеров гормон (АМН), ФСГ, количество антральных фолликулов); тип ВРТ (ЭКО, ИКСИ, ИМСИ, инсеминация).

Еще одним объектом настоящего изобретения является система для анализа данных, позволяющих оценить возможность осуществления у субъекта женского пола процедуры вспомогательной репродуктивной технологии, включающая:

- информационная система;

- устройство ввода, соединенное с основным программным обеспечением, для получения данных от пользователя, при этом полученные данные включают элементы информации, полученные от субъекта женского пола и обеспечивающие создание профиля для указанного субъекта, при этом каждый элемент информации относится к предварительно отобранной переменной, при этом одной из указанных переменных является профиль имплантационной готовности матки, как описано выше,

- устройство вывода, соединенное с основным программным обеспечением, обеспечивающее поступление информации пользователю, и

- машиночитаемый носитель информации, на котором хранится, по крайней мере, один алгоритм, позволяющий сравнить полученный профиль для субъекта женского пола с библиотекой известных профилей, характеризующих наличие восприимчивости к процедуре искусственного оплодотворения, при этом система позволяет получить результаты, которые могут быть использованы для создания отчета, содержащего полный анализ данных, позволяющих оценить возможность осуществления у субъекта женского пола процедуры вспомогательной репродуктивной технологии.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, указанные предварительно отобранные переменные включают гистологические данные (определение окна имплантационной готовности); свойства эндометрия (такие как толщина эндометрия, объем артерий); возраст; причину бесплодия; данные по бесплодию, такие как краткий анамнез и количество и качество перенесенных эмбрионов; гормональную оценку резерва яичников (антимюллеров гормон АМН), ФСГ, подсчет антральных фолликулов); тип ВРТ (ЭКО, ИКСИ, ИМСИ, инсеминация).

Еще одним объектом настоящего изобретения является набор для осуществления способа, описанного выше, включающий:

- реагенты для измерения экспрессии, по крайней мере, одного из следующих белков IL-18, IL-6, IL-12, а также экспрессии IL-15 и CD56;

- необязательно реагенты для измерения экспрессии Tweak и Fn-14;

- необязательно реагенты для измерения экспрессии GCSF-R;

- необязательно реагенты для измерения экспрессии референсных генов, и

- инструкции по осуществлению способа, описанного выше.

Определения.

В описании настоящего изобретения следующие термины имеют следующие значения:

Термин "искусственное оплодотворение" объединяет клинические и лабораторные технологии, используемые для повышения фертильности у животных и людей, включая, без ограничений указанными, экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО, или IVF, или оплодотворение в пробирке), перенос замороженных эмбрионов (FET), интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида в яйцеклетку (IMSI), перенос половых клеток в маточную трубу (GIFT), внутриматочная инсеминация (IUI) и перенос зиготы в маточную трубу (ZIFT).

Термин "неудачная имплантация" означает безуспешную имплантацию нескольких эмбрионов, полученных в результате искусственного оплодотворения или вспомогательной инсеминации или неправильную их имплантацию в матке реципиента. Примерами случаев неудачной имплантации являются, без ограничений указанными, неудачная имплантация после переноса 8 эмбрионов, неудачная имплантация после переноса 4 эмбрионов, неудачная имплантация после переноса 2 эмбрионов на День-5, или неудачная имплантация после переноса 2 эмбрионов после экзогенного донорства яйцеклеток. Согласно одному варианту осуществления изобретения, для подтверждения неудачной имплантации минимальное количество перенесенных эмбрионов, составляет, по крайней мере, 4 эмбриона с оптимальной морфологией на День-2 или -3, шесть эмбрионов со средней морфологией на День-2 или -3 или 2 эмбриона на День-5.

Термин "истощение яичников" означает потерю функции яичников у женщины моложе 40 лет. У субъектов, страдающих от данной патологии, также наблюдается физиологическое отторжение эмбриона. К указанным заболеваниям относятся, без ограничений указанными, преждевременная яичниковая недостаточность, гипергонадотропный гипогонадизм, дисгенезия гонад, преждевременная менопауза или ранняя менопауза.

Термин "маточное имплантационное окно" относится к очень короткому промежутку времени, начинающемуся приблизительно через 4-5 дней после овуляции и продолжающемуся приблизительно 4 дня. Указанный временной промежуток, обозначаемый как имплантационное окно, характеризует период менструального цикла, когда матка наиболее восприимчива к эмбриону. В середине лютеиновой фазы, в матке перед имплантацией начинаются процессы ремоделирования, необходимые для успешной беременности и включающие децидуализацию эндометрия, которая происходит даже при отсутствии оплодотворенной яйцеклетки.

Термин "субъект" относится к млекопитающему, предпочтительно, к млекопитающему женского пола, более предпочтительно, к человеку женского пола. Согласно одному варианту осуществления изобретения, термин субъект относится к женщине, имевшей в анамнезе неудачные имплантации. Согласно другому варианту осуществления изобретения, термин субъект относится к женщине, страдающей от синдрома истощения яичников.

Термин "контрольная величина", используемый в настоящем описании, в широком понимании объединяет все подходящие величины, которые могут использоваться как основы для сравнения с соответствующей измеряемой величиной. Предпочтительно, контрольные величины - это величины, характерные для фертильной женщины.

Термин "экспрессия" относится взаимозаменяемо к экспрессии гена, включая транскрипты гена, мРНК, полипептидные трансляционные продукты РНК транскриптов независимо от того, подвергается ли такой продукт посттранскрипционным изменениям или нет, или к экспрессии генного продукта, включая кодируемый полипептид или белок. Экспрессия генного продукта может определяться, например, при помощи иммунологических исследований с использованием одного или более антитела, связывающегося с полипептидом. Альтернативно, экспрессия гена может определяться путем измерения уровней мРНК, например, при помощи ПЦР в реальном времени или количественной ПЦР.

Термин "нормализованный уровень" относится к уровню экспрессии гена по отношению к уровню экспрессии контрольного гена.

Детальное описание изобретения

Как показано в разделе "Примеры", только с помощью измерения одного из следующих показателей (1) биомаркеров состояния активности NK клеток матки или состояния активности цитокинов в эндометриальной среде, (2) биомаркеров состояния созревания NK клеток или (3) биомаркеров состояния рекрутинга NK клеток, было выявлено что более 40% обследованных женщин можно классифицировать как имеющих нормальное состояние эндометрия или адекватный профиль восприимчивости (имплантационной готовности) матки.

При применении способа в соответствии с настоящим изобретением, обнаружено, что среди 42% женщин, классифицируемых, как имеющие нормальное состояние эндометрия, что устанавливалось путем определения состояния активности NK клеток матки или состояния активности цитокинов в эндометриальной среде, у 25% по факту не наблюдается нормального состояния эндометрия.

Кроме того, среди 43% женщин, классифицируемых, как имеющие нормальное состояние эндометрия, что устанавливалось путем определения состояния созревания NK клеток матки, фактически у 75% не наблюдается нормального состояния эндометрия.

Более того, среди 47% женщин, классифицируемых, как имеющие нормальное состояние эндометрия, что устанавливалось путем определения состояния созревания NK клеток матки или состояния активности цитокинов в эндометриальной среде, у 80% по факту не наблюдается нормального состояния эндометрия.

Таким образом, существует необходимость в способе, который обеспечивал бы более точное определение состояния эндометрия, позволяя тем самым женщинам, которые классифицировались бы как имеющие "нормальное" состояние эндометрия успешно пройти индивидуальное и оптимизированное лечение по восстановлению имплантационной готовности матки и увеличить их шансы на последующую развивающуюся беременность и рождение живого ребенка.

Настоящее изобретение направлено на выявление имплантационной готовности матки/эндометрия путем определения состояния эндометрия для оптимизации лечения по восстановлению имплантационной готовности.

Одним объектом настоящего изобретения является способ определения профиля имплантационной готовности у субъекта женского пола в течение имплантационного окна, включающий: определение состояния эндометрия путем измерения в образце эндометрия следующих маркеров:

а) биомаркеров состояния активности NK-клеток (uNK) матки, или состояния активности цитокинов в эндометриальной среде;

б) биомаркеров состояния рекрутинга и созревания NK-клеток матки, и сравнения полученных величин с контрольными величинами,

что позволяет определить состояние эндометрия, характерное для достаточной или недостаточной имплантационной готовности матки.

Различают три специфических состояния эндометрия у субъекта: (1) состояние недостаточной активации, (2) нормальное состояние и (3) состояние гиперактивации эндометрия, в соответствии с этим субъекты женского пола разделяют на две категории: адекватная имплантационная готовность матки (нормальное состояние эндометрия) и неадекватная имплантационная готовность матки, последняя категория подразделяется на два подтипа: отсутствие имплантационной готовности (состояние недостаточной активации эндометрия) и аномальная имплантационная готовность (состояние гиперактивации эндометрия).

Разделение субъектов на указанные три категории позволяет мониторировать их лечение для восстановления адекватной имплантационной готовности эндометрия, и в свою очередь, оптимизировать процедуру ВРТ и увеличить шансы на успех.

Следовательно, еще одним объектом изобретения является способ определения у субъекта женского пола профиля имплантационной готовности матки во время имплантационного окна, включающий определение состояния эндометрия путем измерения в образце эндометрия следующих маркеров:

а) биомаркеров состояния активности NK-клеток (uNK) матки или состояния активности цитокинов в эндометриальной среде;

б) биомаркеров состояния рекрутинга и созревания NK-клеток матки, и

с) сравнение полученных величин с контрольными величинами,

что позволяет определить одно из трех специфических состояний эндометрия у субъекта женского пола: (1) состояние недостаточной активации, (2) нормальное состояние эндометрия и (3) состояние гиперактивации, что позволяет разделить субъекты женского пола на две категории: адекватная имплантационная готовность матки (нормальное состояние эндометрия) и неадекватная имплантационная готовность матки, последняя категория подразделяется на два подтипа: отсутствие имплантационной готовности (состояние недостаточной активации эндометрия) и аномальная имплантационная готовность (состояние гиперактивации эндометрия).

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, указанный образец эндометрия получают путем биопсии эндометрия.

Используемый в настоящем изобретении термин "статус активности uNK клеток" относится к статусу активности внешних uNK клеток по отношению к окружающим клеткам эндометрия.

Используемый в настоящем изобретении термин "состояние активности цитокинов в эндометриальной среде" относится к состоянию активности иммунных клеток по отношению к окружающим клеткам эндометрия.

Согласно одному варианту осуществления изобретения, состояние активности uNK клеток или состояние активности цитокинов эндометриальной среды определяется путем измерения уровня экспрессии по крайней мере, одного из следующих биомаркеров: IL-18, IL-6 и IL-12.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, уровень экспрессии IL-18, IL-6 или IL-12 может быть измерен путем количественной оценки уровня белка или нуклеиновой кислоты, соответствующей гену, кодирующему IL-18, IL-6 или IL-12 (например, путем подсчета количества мРНК). Согласно другому варианту осуществления изобретения, указанный уровень может быть нормализован по уровню продукта контрольного гена, такого, как например, RPL-13A, бета-2 микроглобулин или татабокс протеин ТВР. Согласно другому варианту осуществления изобретения, указанный уровень может быть нормализован по среднему геометрическому значению, по крайней мере, двух продуктов контрольных генов. Согласно другому варианту осуществления изобретения, указанные контрольные гены - это не ген актина или GAPDH.

Используемое здесь обозначение "IL-6" относится к интерлейкину 6; обозначение "IL-12" относится к интерлейкину 12, а обозначение "IL-18" относится к интерлейкину 18.

Способы измерения экспрессии уровня IL-6, IL-12 или IL-18 в образце хорошо известны специалистам в данной области, к ним относятся, без ограничений указанными, биологические методы, такие, как, например, ELISA, анализ на платформе Luminex (такой, как например, Luminex анализ с использованием детекционного набора компании Biorad (Bioplex pro Human cytokines), ПЦР в реальном времени, количественная ПЦР в реальном времени, ПЦР, количественная ПЦР, количественная ПЦР в реальном времени, использование ДНК чипов и подобные способы; а также иммунологические методы, такие, как, например, технология FloCytomix (Biosource) или BD Cytometric Beads Array (BD Bioscience).

Согласно другому варианту осуществления изобретения, состояние активности uNK клеток или состояние активности цитокинов эндометриальной среды определяется путем измерения уровня экспрессии биомаркеров IL-18 и Tweak и расчета соотношения IL-18/ Tweak.

Используемый в настоящем описании термин "Tweak" относится к белку, кодируемому геном TNFSF12. Способы измерения уровня экспрессии Tweak в образце хорошо известны специалистам в данной области, к ним относятся, без ограничений указанными, биологические методы, такие, как, например, ELISA, RT-PCR, RT-qPCR, PCR, qPCR, ПЦР в реальном времени, количественная ПЦР в реальном времени, использование ДНК чипов и подобные способы; а также иммунологические методы, такие, как, например, технология FloCytomix (Biosource) или BD Cytometric Beads Array (BD Bioscience).

Согласно одному варианту осуществления изобретения, состояние рекрутинга uNK клеток определяется путем подсчета количества uNK клеток.

Количество uNK клеток может быть подсчитано путем определения количества CD56+ клеток матки. Определить указанное количество можно путем использования иммуногистохимического исследования замороженных или фиксированных в парафине срезов с антителами анти-CD56+ для идентификации окрашивания NK клеток. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, CD56+ клетки подсчитывают в 40Х поле. Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, CD56+ клетки подсчитывают в четырех 40Х полях и затем рассчитывают среднюю величину.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, состояние рекрутинга uNK клеток определяется путем измерения экспрессии уровня CD56.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, измерение уровня экспрессии CD56 является необязательным.

Способы измерения уровня экспрессии CD56 в образце хорошо известны специалистам в данной области, к ним относятся, без ограничений указанными, биологические методы, такие, как, например, ELISA, RT-PCR, RT-qPCR, PCR, qPCR, ПЦР в реальном времени, количественная ПЦР в реальном времени, использование ДНК чипов и подобные способы; а также иммунологические методы, такие, как, например, технология FloCytomix (Biosource) или BD Cytometric Beads Array (BD Bioscience).

Используемый в настоящем описании термин "CD56+ клетки" относится к клеткам, экспрессирующим CD56, который также обозначается как NCAM (нейрональная молекула клеточной адгезии).

Согласно одному варианту осуществления изобретения, состояние созревания uNK клеток определяется путем измерения уровня экспрессии следующего биомаркера: IL-15.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, уровень IL-15 может быть измерен путем оценки количества белка или нуклеиновой кислоты, соответствующей гену, кодирующему IL-15 (например, путем определения количества РНК). Согласно другому варианту осуществления изобретения, указанный уровень может быть нормализован по уровню продукта контрольных генов, таких, как, например, RPL-13A, бета-2 микроглобулин или татбокс протеин ТВР. Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, указанный уровень может быть по среднему геометрическому значению, по крайней мере, двух продуктов контрольных генов. Согласно другому варианту осуществления изобретения, указанные контрольные гены - это не ген актина или GAPDH.

Используемое в настоящем описании обозначение "IL-15" относится к интерлейкину 15.

Способы измерения уровня экспрессии IL-15 в образце хорошо известны специалистам в данной области, к ним относятся, без ограничений указанными, биологические методы, такие, как, например, ELISA, RT-PCR, RT-qPCR, PCR, qPCR, ПЦР в реальном времени, количественная ПЦР в реальном времени, использование ДНК чипов и подобные способы; а также иммунологические методы, такие, как, например, технология FloCytomix (Biosource) или BD Cytometric Beads Array (BD Bioscience).

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, состояние созревания uNK клеток определяется путем измерения уровня экспрессии следующих биомаркеров: IL-15 и Fn-14 и расчета соотношения IL-15/Fn14.

Используемое в настоящем описании обозначение "Fn14" относится к фактору роста фибробластов индуцибельному рецептору 14, который является рецептором для Tweak.

Способы измерения уровня экспрессии Fn14 в образце хорошо известны специалистам в данной области, к ним относятся, без ограничений указанными, биологические методы, такие, как, например, ELISA, RT-PCR, RT-qPCR, PCR, qPCR, ПЦР в реальном времени, количественная ПЦР в реальном времени, использование ДНК чипов и подобные способы; а также иммунологические методы, такие, как, например, технология FloCytomix (Biosource) или BD Cytometric Beads Array (BD Bioscience).

Согласно одному варианту осуществления изобретения, контрольная величина рассматривается по отношению к значению или величине, полученной в результате популяционных исследований, включающих, без ограничений указанными, субъектов той же возрастной группы, такой же или аналогичной этнической группы, а также субъектов, переживших неудачные имплантации эмбрионов или субъектов, страдающих от истощения яичников.

Одним из объектом настоящего изобретения является способ определения профиля имплантационной готовности у субъекта женского пола во время имплантационного окна, включающий определение состояния эндометрия путем

а) измерения: биомаркеров состояния активности естественных киллеров матки (uNK) или состояния активности цитокинов эндометриальной среды, а также биомаркеров состояния рекрутинга или созревания NK клеток матки;

б) классификации состояния эндометрия на основании определения соотношения IL-18/Tweak и сравнения полученной величины с контрольной величиной;

в) если состояние эндометрия классифицируется как нормальное на этапе б), далее его классифицируют на основании определения соотношения IL-15/Fn14 и, необязательно, на основании определения CD56 с последующим сравнением полученных величин с контрольными величинами,

что позволяет определить состояние эндометрия, характерное для адекватной или неадекватной имплантационной готовности.

Как показано в Примерах, если для классификации состояния эндометрия первым рассматривается соотношение IL15/Fn14, то в 14% случаев диагноз является неправильным.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, контрольная величина может быть получена путем измерения уровня следующих биомаркеров: IL-18, IL-6, IL-12, IL-15, G-CSF рецептора или путем расчета соотношения IL-18/Tweak или IL-15/Fn-14 или путем определения количества uNK клеток по крайней мере в одном контрольном образце, полученном от одного или более практически здорового субъекта. Используемый в описании термин "практически здоровый субъект" относится к субъекту, у которого в анамнезе не было неудачных имплантаций или к субъекту женского пола, который считается фертильным, или к субъекту, имеющему нормальное состояние эндометрия.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, контрольная величина может быть получена путем измерения уровня следующих биомаркеров: IL-18, IL-6, IL-12, IL-15, G-CSF рецептора или путем расчета соотношения IL-18/Tweak или IL-15/Fn-14 или путем определения количества uNK клеток, по крайней мере, в одном контрольном образце, полученном одного или более субъекта с состоянием недостаточной активации или гиперактивации эндометрия.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, способ настоящего изобретения включает следующие этапы:

а) классификацию состояния эндометрия, основанную на определении состояния активности uNK клеток или состояния активности цитокинов эндометриальной среды;

б) если состояние эндометрия не может быть классифицировано как состояние недостаточной активации или состояние гиперактивации на этапе а), тогда проводят классификацию состояния эндометрия на основании определения состояния рекрутинга uNK клеток;

в) если состояние эндометрия не может быть классифицировано как состояние недостаточной активации или состояние гиперактивации на этапе б), тогда проводят классификацию состояния эндометрия на основании определения состояния рекрутинга и созревания uNK клеток.

Одним из объектов настоящего изобретения является способ определения у субъекта женского пола профиля имплантационной готовности во время имплантационного окна, включающий определение в образце эндометрия состояния эндометрия путем:

а) измерения уровня биомаркеров состояния активности естественных киллеров матки (uNK) или состояния активности цитокинов эндометриальной среды;

б) классификации состояния эндометрия как состояние недостаточной или гиперактивации путем сравнения указанных величин с контрольными величинами;

в) если состояние эндометрия не может быть классифицировано как состояние недостаточной активации или состояние гиперактивации на этапе б) тогда измеряют уровень биомаркеров состояния рекрутинга и/или созревания uNK матки;

г) классификации состояния эндометрия на основании определения состояния рекрутинга и/или созревания uNK матки и сравнения полученных величин с контрольными величинами.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, заявленный способ включает следующие этапы:

а) классификацию состояния эндометрия на основании определения соотношения IL-18/Tweak;

б) если состояние эндометрия не может быть классифицировано как состояние недостаточной активации или состояние гиперактивации на этапе а), тогда осуществляют классификацию состояния эндометрия на основании определения количества CD56+ uNK клеток или уровня экспрессии CD56;

в) если состояние эндометрия не может быть классифицировано как состояние недостаточной активации или состояние гиперактивации на этапе б), тогда осуществляют классификацию состояния эндометрия на основании определения нескольких показателей, включающих количество CD56+ uNK клеток или уровень экспрессии CD56 и соотношение IL-15/Fn-14.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, заявленный способ включает следующие этапы:

а) измерение соотношения IL-18/Tweak как биомаркера состояния активности естественных киллеров матки (uNK) или состояния активности цитокинов эндометриальной среды;

б) классификацию состояния эндометрия как состояние недостаточной или гиперактивации путем сравнения указанных величин с контрольными величинами;

в) если состояние эндометрия не может быть классифицировано как состояние недостаточной активации или состояние гиперактивации на этапе б), тогда осуществляют измерение соотношения IL-15/Fn-14 как биомаркера состояния рекрутинга и/или созревания NK клеток матки;

г) классификацию состояния эндометрия как состояние недостаточной или гиперактивации путем сравнения указанных величин с контрольными величинами.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, заявленный способ включает следующие этапы:

а) классификацию состояния эндометрия на основании определения состояния созревания uNK клеток;

б) если состояние эндометрия не может быть классифицировано как состояние недостаточной активации или состояние гиперактивации на этапе а), тогда осуществляют классификацию состояния эндометрия на основании определения состояния рекрутинга uNK клеток;

в) если состояние эндометрия не может быть классифицировано как состояние недостаточной активации или состояние гиперактивации на этапе б), тогда осуществляют классификацию состояния эндометрия на основании определения состояния активации uNK клеток или состояния активации цитокинов эндометриальной среды.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, заявленный способ включает следующие этапы:

а) классификацию состояния эндометрия на основании определения соотношения IL-15/Fn-14;

б) если состояние эндометрия не может быть классифицировано как состояние недостаточной активации или состояние гиперактивации на этапе а) тогда осуществляют классификацию состояния эндометрия на основании определения количества CD56+ uNK клеток или уровня экспрессии CD56;

в) если состояние эндометрия не может быть классифицировано как состояние недостаточной активации или состояние гиперактивации на этапе б) тогда осуществляют классификацию состояния эндометрия на основании определения соотношения IL-18/Tweak.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, заявленный способ включает следующие этапы:

а) классификацию состояния эндометрия на основании определения состояния созревания uNK клеток;

б) если состояние эндометрия не может быть классифицировано как состояние недостаточной активации или состояние гиперактивации на этапе а) тогда проводят классификацию состояния эндометрия на основании определения состояния активации uNK клеток или состояния активации цитокинов эндометриальной среды;

в) если состояние эндометрия не может быть классифицировано как состояние недостаточной активации или состояние гиперактивации на этапе б), тогда проводят классификацию состояния эндометрия на основании определения состояния рекрутинга uNK клеток.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, заявленный способ включает следующие этапы:

а) классификацию состояния эндометрия на основании определения соотношения IL-15/Fn-14;

б) если состояние эндометрия не может быть классифицировано как состояние недостаточной активации или состояние гиперактивации на этапе а), тогда осуществляют классификацию состояния эндометрия на основании определения соотношения IL-18/Tweak;

в) если состояние эндометрия не может быть классифицировано как состояние недостаточной активации или состояние гиперактивации на этапе б), тогда осуществляют классификацию состояния эндометрия на основании определения количества CD56+ uNK клеток или уровня экспрессии CD56.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, может определяться также уровень экспрессии G-CSF рецептора в эндометрии.

Используемый в настоящем изобретении термин "G-CSF рецептор" относится к рецептору гранулоцитарного колониестимулирующего фактора.

Способы измерения уровня экспрессии Fn14 в образце хорошо известны специалистам в данной области, к ним относятся, без ограничений указанными, биологические методы, такие, как, например, ELISA, анализ на платформе Luminex, RT-PCR, RT-qPCR, PCR, qPCR, ПЦР в реальном времени, количественная ПЦР в реальном времени, использование ДНК чипов и подобные способы; а также иммунологические методы, такие, как, например, технология FloCytomix (Biosource) или BD Cytometric Beads Array (BD Bioscience).

Определение уровня G-CSF рецептора позволяет классифицировать субъектов на две категории: субъекты, отвечающие на лечение кортикостероидами, и субъекты, не отвечающие на лечение кортикостероидами.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, способы, описанные в тексте, также могут включать этап определения восприимчивости субъекта к лечению кортикостероидами, на основании определения экспрессии G-CSF рецептора. Предпочтительно, субъект классифицируется как принадлежащий к одной из указанных двух групп, когда у него имеется состояние гиперактивации эндометрия.

Согласно одному варианту осуществления изобретения, если величина, характеризующая состояние активности uNK клеток или состояние активности цитокинов эндометриальной среды, предпочтительно, величина соотношения IL-18/Tweak, в 0,5 раз ниже, чем контрольная величина состояния активности uNK клеток или состояние активности цитокинов эндометриальной среды, предпочтительно, чем контрольная величина соотношения IL-18/Tweak, это свидетельствует о состоянии недостаточной активации эндометрия.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, если величина, характеризующая состояние активности uNK клеток или состояние активности цитокинов эндометриальной среды, предпочтительно, величина соотношения IL-18/Tweak, в 0,45, 0,4, 0,35, 0,3, 0,25, 0,2, 0,15, 0,1 раз ниже, чем контрольная величина, характеризующая состояние активности uNK клеток или состояние активности цитокинов эндометриальной среды, предпочтительно, чем контрольная величина соотношения IL-18/Tweak, это свидетельствует о состоянии недостаточной активации эндометрия.

Согласно указанным вариантам осуществления изобретения, контрольные величины получают на основании данных практически здорового субъекта.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, величина, характеризующая состояние активности uNK клеток или состояние активности цитокинов эндометриальной среды, предпочтительно, величина соотношения IL-18/Tweak, в 1,8 раз превышающая контрольную величину, характеризующую состояние активности uNK клеток, предпочтительно, величина соотношения IL-18/Tweak, свидетельствует о состоянии гиперактивации эндометрия.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, величина, характеризующая состояние активности uNK клеток или состояние активности цитокинов эндометриальной среды, предпочтительно, величина соотношения IL-18/Tweak, в 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100 раз превышающая контрольную величину, характеризующую состояние активности uNK клеток, предпочтительно, величину соотношения IL-18/Tweak, свидетельствует о состоянии гиперактивации эндометрия.

Согласно указанным вариантам осуществления изобретения, контрольные величины получают на основании данных практически здорового субъекта.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, величина, характеризующая состояние активности uNK клеток или состояние активности цитокинов эндометриальной среды, предпочтительно, величина соотношения IL-18/Tweak, в размере контрольной величины, характеризующей состояние активности uNK клеток, предпочтительно, величины соотношения IL-18/Tweak, умноженной на коэффициент от 0,5 до 1,8, а также количество CD56+ uNK клеток менее 10 в поле зрения свидетельствует о состоянии недостаточной активации эндометрия.

Согласно указанному варианту осуществления изобретения, контрольные величины получают на основании данных практически здорового субъекта.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, величина, характеризующая состояние активности uNK клеток или состояние активности цитокинов эндометриальной среды, предпочтительно, величина соотношения IL-18/Tweak, в размере контрольной величины, характеризующей состояние активности uNK клеток, предпочтительно, величины соотношения IL-18/Tweak, умноженной на коэффициент 0,5-1,8, а также количество CD56+ uNK клеток от 10 до 70 в поле зрения, а также величина, характеризующая состояние созревания uNK клеток, предпочтительно, величина соотношения IL-15/Fn-14 в 0,3 раза ниже, чем контрольная величина состояния созревания uNK клеток, свидетельствуют о состоянии недостаточной активации эндометрия.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, величина, характеризующая состояние созревания uNK клеток, предпочтительно, величина соотношения IL-15/Fn-14, в 0,25, 0,2, 0,15, 0,1 раз ниже, чем контрольная величина, характеризующая состояние созревания uNK клеток, предпочтительно, контрольная величина соотношения IL-15/Fn-14, свидетельствует о состоянии недостаточной активации эндометрия.

Согласно указанным вариантам осуществления изобретения, контрольные величины получают на основании данных практически здорового субъекта.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, величина, характеризующая состояние активности uNK клеток или состояние активности цитокинов эндометриальной среды, предпочтительно, величина соотношения IL-18/Tweak, в размере контрольной величины, характеризующей состояние активности uNK клеток, предпочтительно, величины соотношения IL-18/Tweak, умноженной на коэффициент от 0,5 до 1,8, а также количество CD56+ uNK клеток от 10 до 70 в поле зрения, а также величина, характеризующая состояние созревания uNK клеток, предпочтительно, величина соотношения IL-15/Fn-14 в 2 раза выше, чем контрольная величина состояния созревания uNK клеток, предпочтительно, контрольная величина соотношения IL-15/Fn-14, свидетельствуют о состоянии гиперактивации эндометрия за счет гиперактивации uNK клеток.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, величина, характеризующая состояние созревания uNK клеток, предпочтительно, величина соотношения IL-15/Fn-14, в 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100 раз превышающая контрольную величину, характеризующую состояние созревания uNK клеток, предпочтительно, контрольную величину соотношения IL-15/Fn-14, свидетельствует о состоянии гиперактивации эндометрия.

Согласно указанным вариантам осуществления изобретения, контрольные величины получают на основании данных практически здорового субъекта.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, величина, характеризующая состояние активности uNK клеток или состояние активности цитокинов эндометриальной среды, предпочтительно, величина соотношения IL-18/Tweak, в размере контрольной величины, характеризующей состояние активности uNK клеток, предпочтительно, величины соотношения IL-18/Tweak, умноженной на коэффициент от 0,8 до 1,5, а также количество CD56+ uNK больше 70 в поле зрения, а также величина, характеризующая состояние созревания uNK клеток, предпочтительно, величина соотношения IL-15/Fn-14 в 2 раза выше, чем контрольная величина состояния созревания uNK клеток, предпочтительно, контрольная величина соотношения IL-15/Fn-14, свидетельствуют о состоянии гиперактивации эндометрия за счет гиперактивации uNK клеток.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, величина, характеризующая состояние созревания uNK клеток, предпочтительно, величина соотношения IL-15/Fn-14, в 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100 раз превышающая контрольную величину, характеризующую состояние созревания uNK клеток, предпочтительно, контрольную величину соотношения IL-15/Fn-14, свидетельствует о состоянии гиперактивации эндометрия.

Согласно указанным вариантам осуществления изобретения, контрольные величины получают на основании данных практически здорового субъекта.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, величина, характеризующая состояние активности uNK клеток или состояние активности цитокинов эндометриальной среды, предпочтительно, величина соотношения IL-18/Tweak, менее 0,03 свидетельствует о состоянии недостаточной активации эндометрия.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, величина, характеризующая состояние активности uNK клеток или состояние активности цитокинов эндометриальной среды, предпочтительно, величина соотношения IL-18/Tweak, ниже 0,025, 0,02, 0,015, 0,01, 0,005 свидетельствует о состоянии недостаточной активации эндометрия.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, величина, характеризующая состояние активности uNK клеток или состояние активности цитокинов эндометриальной среды, предпочтительно, величина соотношения IL-18/Tweak, выше 0,11 свидетельствует о состоянии недостаточной активации эндометрия.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, величина, характеризующая состояние активности uNK клеток или состояние активности цитокинов эндометриальной среды, предпочтительно, величина соотношения IL-18/Tweak, выше 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5 свидетельствует о состоянии недостаточной активации эндометрия.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, величина, характеризующая состояние рекрутинга uNK клеток, предпочтительно, количество CD56+ uNK клеток, менее 10 в поле зрения свидетельствует о состоянии недостаточной активации эндометрия.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, величина, характеризующая состояние рекрутинга uNK клеток, предпочтительно, количество CD56+ uNK клеток, менее 9, 8, 7, 6, 3, 2, 1 в поле зрения свидетельствует о состоянии недостаточной активации эндометрия.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, величина, характеризующая состояние рекрутинга uNK клеток, предпочтительно, количество CD56+ uNK клеток, составляющее от 10 до 70 клеток в поле зрения, а также величина, характеризующая состояние созревания uNK клеток, предпочтительно, величина соотношения IL-15/Fn-14, менее 0,3, свидетельствуют о состоянии недостаточной активации эндометрия.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, величина, характеризующая состояние рекрутинга uNK клеток, предпочтительно, количество CD56+ uNK клеток, составляющее от 10 до 70 клеток в поле зрения, а также величина, характеризующая состояние созревания uNK клеток, предпочтительно, величина соотношения IL-15/Fn-14, менее 0,25, 0,2, 0,15, 0,1, 0,05, свидетельствуют о состоянии недостаточной активации эндометрия.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, величина, характеризующая состояние рекрутинга uNK клеток, предпочтительно, количество CD56+ uNK клеток, составляющее от 10 до 70 клеток в поле зрения, а также величина, характеризующая состояние созревания uNK клеток, предпочтительно, величина соотношения IL-15/Fn-14, выше 2 свидетельствуют о состоянии гиперактивации эндометрия.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, величина, характеризующая состояние рекрутинга uNK клеток, предпочтительно, количество CD56+ uNK клеток, составляющее от 10 до 70 клеток в поле зрения, а также величина, характеризующая состояние созревания uNK клеток, предпочтительно, величина соотношения IL-15/Fn-14, выше 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 свидетельствуют о состоянии гиперактивации эндометрия.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, величина, характеризующая состояние рекрутинга uNK клеток, предпочтительно, количество CD56+ uNK клеток, составляющее более 70 клеток в поле зрения, а также величина, характеризующая состояние созревания uNK клеток, предпочтительно, величина соотношения IL-15/Fn-14, выше 2 свидетельствуют о состоянии гиперактивации эндометрия.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, величина, характеризующая состояние рекрутинга uNK клеток, предпочтительно, количество CD56+ uNK клеток, составляющее более 70 клеток в поле зрения, а также величина, характеризующая состояние созревания uNK клеток, предпочтительно, величина соотношения IL-15/Fn-14, выше 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 свидетельствуют о состоянии гиперактивации эндометрия.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, величина, характеризующая уровень экспрессии рецептора G-CSF, выше 0,7, свидетельствует о невосприимчивости субъекта к кортикостероидам.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, величина, характеризующая уровень экспрессии рецептора G-CSF, ниже или равная 0,7, свидетельствует о восприимчивости субъекта к кортикостероидам.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, величина, характеризующая уровень экспрессии рецептора G-CSF, не отражает восприимчивость субъекта к кортикостероидам.

Другим объектом настоящего изобретения является профиль восприимчивости (имплантационной готовности) матки, при этом указанный профиль основан на определении а) состояния активности uNK клеток матки или состояния активности цитокинов эндометриальной среды и б) состояния рекрутинга или созревания uNK клеток матки, в образце эндометрия, полученном во время имплантационного окна.

Согласно одному варианту осуществления изобретения, указанный профиль имплантационной готовности матки основан на определении уровня экспрессии, по крайней мере, одного из следующих белков, IL-18, IL-16 или IL-12, предпочтительно, IL-18, а также уровня экспрессии IL-15 и CD56.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, указанный профиль имплантационной готовности матки основан на определении уровня экспрессии, по крайней мере, одного из следующих белков, IL-18, IL-16 или IL-12, предпочтительно, IL-18, а также уровня экспрессии IL-15 и количества CD56+ uNK клеток.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, указанный профиль имплантационной готовности матки основан на определении величины соотношения IL-18/Tweak и IL-15/Fn14 и уровня экспрессии CD56.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, указанный профиль имплантационной готовности матки основан на определении величины соотношения IL-18/Tweak и IL-15/Fn14 и количества CD56+ uNK клеток.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, указанный профиль имплантационной готовности основан на последовательном определении состояния эндометрия путем измерения сначала величины соотношения IL-18/Tweak и затем величины соотношения IL-15/Fn14.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, указанный профиль имплантационной готовности матки определяют в соответствии со способом, описанным выше.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, указанный профиль имплантационной готовности матки классифицируется как адекватный или неадекватный (отсутствие имплантационной готовности или неадекватная имплантационная готовность) профиль имплантационной готовности и основан на определении состояния эндометрия (нормальное, состояние недостаточной активации или состояние гиперактивации).

Другим объектом настоящего изобретения является способ повышения возможности удачной имплантации посредством процедуры вспомогательной репродуктивной технологии (ВРТ) у субъекта женского пола, включающий:

- определение профиля имплантационной готовности матки, как описано выше, и

- разработку персональных рекомендаций для указанного субъекта женского пола, основываясь на данных, полученных о профиле имплантационной готовности матки.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ повышения возможности удачной имплантации посредством процедуры вспомогательной репродуктивной технологии (ВРТ) у субъекта женского пола, включающий:

- определение профиля имплантационной готовности матки во время имплантационного окна, как описано выше, и

- разработку персональных рекомендаций для указанного субъекта женского пола, основываясь на данных, полученных о профиле имплантационной готовности матки.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, в том случае, когда состояние эндометрия, определено (как описано выше), как состояние недостаточной активации, или профиль имплантационной готовности матки является неадекватным по причине отсутствия восприимчивости, рекомендации могут заключаться в механической стимуляции эндометрия в лютиновую фазу перед ЭКО-циклом путем создания местного повреждения посредством биопсии. Без привязки к какой-либо теории, указанное местное повреждение тканей может индуцировать иммунные клетки и про-воспалительные цитокины для подготовки "почвы" для последующей имплантации посредством лучшей адгезии.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, в том случае, когда состояние эндометрия, определено (как описано выше) как состояние недостаточной активации, или профиль имплантационной готовности матки является неадекватным по причине отсутствия восприимчивости, рекомендации могут заключаться в снижении уровня гормональной стимуляции для уменьшения воздействия на клетки эндометрия высоких концентраций эстрадиола. Это, например, означает, уменьшение количества единиц ФСГ для запуска овуляции в случае ЭКО (уровень эстрадиола в крови на момент запуска овуляции должен быть менее 1500 пг/мл) или переноса замороженного эмбриона после оттаивания в мониторируемых естественных циклах (а не как обычно в заместительных циклах с эстрогенами и прогестеронами). Без привязки к какой-либо теории, минимальная стимуляция или перенос в естественном цикле будет приводить к ухудшению имеющегося состояния местной недостаточной активации. Эстрогены не будут включены в поддерживающую программу на протяжении лютеиновой фазы с последующей подсадкой эмбриона по тем же причинам.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, в том случае, когда состояние эндометрия; определено (как описано выше), как состояние недостаточной активации, или профиль имплантационной готовности матки является неадекватным по причине отсутствия восприимчивости, рекомендации могут заключаться в стимуляции иммунной толерантности, ангиогенеза и пролиферации uNK клеток посредством введения гормона - хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) в течение имплантационного окна. Например, 1500 ME ХЧГ могут вводиться на 4,6 и 8 день после забора яйцеклеток (ЭКО) или на 6-8-10 день после овуляторной волны (перенос замороженного эмбриона в естественном цикле). Без привязки к какой-либо теории, ХГЧ существенным образом влияет на иммунологическую толерантность, ангиогенез в трансплантацентарном барьере и может участвовать в процессе мобилизации uNK клеток посредством связывания рецепторов маннозы. В частности, продукция ХГЧ эпителиальными клетками эндометрия приводит к усилению пролиферации эндотелиальных клеток и миграции гладкомышечных клеток, что приводит к созреванию сосудов.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, в том случае, когда состояние эндометрия, определено (как описано выше) как состояние недостаточной активации, или профиль имплантационной готовности матки является неадекватным по причине отсутствия восприимчивости, после переноса эмбриона рекомендуют регулярную половую жизнь. Без привязки к какой-либо теории, плазма семенной жидкости может играть определенную роль в подготовке "почвы" для имплантации путем регулирования процессов рекрутинга и активации Т-регуляторных клеток.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, в том случае, когда состояние эндометрия, определено (как описано выше) как состояние гиперактивации или профиль имплантационной готовности матки является неадекватным по причине аномальной восприимчивости, во время цикла, предшествующего переносу эмбриона, не рекомендуется механическое повреждение эндометрия посредством местного повреждения.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, в том случае, когда состояние эндометрия, определено (как описано выше) как состояние гиперактивации или профиль имплантационной готовности матки является неадекватным по причине аномальной восприимчивости, рекомендации могут включать сильную стимуляцию яичников для обеспечения воздействия высоких концентраций эстрадиола на клетки эндометрия.

Например, в случае ЭКО, используются стандартные дозы ФСГ для запуска овуляции с целью последующего отбора 9-12 яйцеклеток (начальная доза ФСГ составляет от 225 до 400 ME). В случае переноса замороженного эмбриона, используется заместительная терапия эстрогенами и прогестероном. Для увеличения местной концентрации эстрогенов, рекомендуется вагинальный способ введения (эстрадиол 2 мг, 1 пилюля три раза в день вагинально). Наконец, в лютеиновую фазу, после переноса эмбриона, введение эстрадиола может быть продолжено (эстрадиол 2 мг, 1 пилюля три раза в день перорально или вагинально).

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, в том случае, когда состояние эндометрия, определено (как описано выше) как состояние гиперактивации или профиль имплантационной готовности матки является неадекватным по причине аномальной восприимчивости, рекомендации могут включать применение прогестерона в высоких дозах после забора яйцеклеток (например, 400 мг три раза в день, вагинально).

Согласно другому варианту осуществления изобретения, в том случае, когда состояние эндометрия, определено (как описано выше) как состояние гиперактивации или профиль имплантационной готовности матки является неадекватным по причине аномальной восприимчивости, рекомендации могут включать применение лекарственных препаратов, предназначенных для регуляции местной воспалительной реакции, начиная от момента начала стимуляции. Выбор лекарственного препарата будет зависеть от определения восприимчивости пациента к кортикостероидам на основании определения уровня экспрессии G-CSF рецептора, как описано выше.

Например, в том случае, если субъект восприимчив к лечению кортикостероидами, их начинают вводить с первого дня цикла в течение ЭКО-циклов до теста на наличие беременности (примером кортикостероида, который может использоваться в этих целях, является Преднизолон в дозе 20 мг в день, начиная с первого дня цикла до теста на наличие беременности). Если субъект не восприимчив к лечению кортикостероидами, используется комбинация ацетилсалициловой кислоты в низких дозах и гепаринов в низких дозах (таких, как Ловенокс 0,4, начиная с дня забора яйцеклеток до теста на наличие беременности). Другой способ лечения в случае невосприимчивости субъекта к кортикостероидам заключается в применении интралипидов. Интралипиды главным образом изучались как препараты, контролирующие цитотоксичность uNK клеток периферической крови и в качестве иммунорегуляторов регуляторных Т-клеток. Согласно одному варианту осуществления изобретения, 100 мл Интралипида в концентрации 20%, растворенного в 500 мл физиологического раствора, начинают вводить за 7-14 дней до переноса эмбриона. Предпочтительно, время инфузии препарата в объеме 500 мл не должно быть менее 2 часов. Лечение можно повторить после положительного теста на беременность, при этом препарат вводят ежемесячно до 12 недели беременности.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, в том случае, когда состояние эндометрия, определено (как описано выше) как состояние гиперактивации или профиль имплантационной готовности матки является неадекватным по причине аномальной восприимчивости, рекомендации могут заключаться во введении терапевтически эффективного количества антиоксиданта. Примером антиоксиданта, который может использоваться в данном случае, является ТОСО, в дозе 500 мг, 2 пилюли, начиная с первого дня D1 до дня проведения теста на наличие беременности.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, в том случае, когда состояние эндометрия, определено (как описано выше) как состояние гиперактивации или профиль имплантационной готовности матки является неадекватным по причине аномальной восприимчивости, после переноса эмбриона рекомендуют активную половую жизнь.

Настоящее изобретение также относится к способам и компьютерным системам для улучшения диагностики клинического бесплодия. Указанные способы и системы могут внедряться в практику для облегчения обследования пациента перед последующим лечением бесплодия посредством методик оплодотворения in vitro или посредством вспомогательных репродуктивных технологий. В частности, заявленные системы и способы могут внедряться в практику для облегчения оценки профиля имплантационной готовности матки у субъекта и последующей разработки индивидуального лечения для осуществления процедуры оплодотворения in vitro.

Согласно одному варианту осуществления изобретения, указанный способ включает получение элементов информации от субъекта женского пола для составления профиля для указанного субъекта женского пола, при этом каждый элемент информации относится к предварительно отобранной переменной; сравнение полученного профиля указанного субъекта женского пола с библиотекой известных профилей, характеризующих наличие восприимчивости к процедуре искусственного оплодотворения с использованием алгоритма, основанного на указанных предварительно отобранных переменных для данного субъекта, при этом указанное сравнение позволяет оценить возможность осуществления у данного субъекта женского пола процедуры ВРТ, в частности, оценивается профиль имплантационной готовности матки для данного субъекта женского пола для последующей разработки индивидуального лечения для последующего осуществления процедуры оплодотворения in vitro. Согласно одному варианту осуществления изобретения, одной из указанных переменных является профиль имплантационной готовности матки, как определено выше. Согласно другому варианту осуществления изобретения, одной из указанных переменных является состояние эндометрия, как определено выше.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, элементы информации могут быть получены от субъекта женского пола при помощи письменной или электронной анкеты или могут быть запрошены, записаны или иным образом зарегистрированы медицинским персоналом, таким, как врач, медсестра, медицинский регистратор и т.п.

Примерами элементов информации, которые имеют отношение к предварительно отобранным переменным, являются, без ограничений указанными, гистологические данные (для определения окна имплантационной готовности); характеристики субъекта, такие, как возраст, анамнез бесплодия, клинический диагноз; свойства эндометрия, такие, как толщина эндометрия, объем эндометрия, васкуляризация эндометрия, данные допплеровского исследования маточных артерий; причина бесплодия, информация о проводимом лечении, в частности, о назначенных лекарственных препаратах, количестве дней стимуляции, количестве яйцеклеток и т.д.; стандартные данные о морфологии эмбриона, такие, как количество и качество подсаженных эмбрионов, стадия их развития, качество и т.п.; данные оценки яичникового резерва, такие как уровень ФСГ на 3-й день цикла, уровень антимюллерова гормона на 3-й день цикла, количество антральных фолликулов на 3-й день цикла; индекс массы тела; наличие поликистоза яичников; данные спермограммы со спермоцитограммой; женское бесплодие с неустановленной причиной; число спонтанных выкидышей; причины женского бесплодия; количество предыдущих беременностей; количество предыдущих срочных родов; наличие эндометриоза; заболевания маточных труб; перевязка маточных труб; мужское бесплодие; наличие миомы матки; гидросальпинкс, а также причины мужского бесплодия.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, заявленный способ включает получение элементов информации, касающихся, как минимум тех переменных, которые необходимы для определения состояния эндометрия, как описано выше, или большего количества переменных. Так, например, согласно другим вариантам осуществления изобретения, заявленный способ включает получение элементов информации, касающихся указанных выше переменных и, по крайней мере, еще одной, или еще двух или более, или трех или более, четырех или более, пяти или более, десяти или более и т.д. переменных.

Предпочтительно, помимо получения данных о состоянии эндометрия и/или профиле имплантационной готовности матки, заявленный способ включает получение следующих элементов информации: данные гистологических исследований (определение имплантационного окна; характеристики эндометрия (такие, как, например, толщина эндометрия, объем эндометрия, васкуляризация эндометрия, данные допплеровского исследования маточных артерий); возраст субъекта; причина бесплодия; данные по бесплодию, такие, как краткий анамнез и количество и качество перенесенных эмбрионов; оценка яичникового резерва с помощью гормональных исследований (антимюллеров гормон, ФСГ, количество антральных фолликулов); тип ВРТ (ЭКО, ИКСИ, ИМСИ, инсеминация).

Согласно другому варианту осуществления изобретения, заявленный способ включает взвешенное определение относительной значимости каждой предварительно отобранной переменной по отношению к другим предварительно отобранным переменным.

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения, этап сравнения включает применение правила принятия решения. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения, алгоритм анализа данных включает использование дерева классификации. Согласно другим вариантам осуществления изобретения, алгоритм анализа данных является непараметрическим, например, таким, как использование критерия знаковых рангов Уилкоксона. Согласно определенным вариантам осуществления изобретения, алгоритм анализа данных определяет различия в распределении отличительных величин. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения, алгоритм анализа данных включает использование множественного аддитивного дерева регрессии. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения, алгоритм анализа данных представляет собой логистическую регрессию.

Один из подходов к анализу этих данных состоит в использовании алгоритма дерева классификации, который выполняет поиск критериев и взаимосвязей в больших наборах данных. "Дерево классификации" - это рекурсивный раздельный анализ для оценки субъекта женского пола на возможность осуществления процедуры оплодотворения in vitro с использованием серии анкет, разработанных специально для того, чтобы отнести субъект к одному из классов. Каждый вопрос определяет, соответствует ли состояние субъекта заданному параметру, при этом каждый ответ используется для последующего направления анкетируемого вниз по дереву классификации до тех пор, пока не будет определен класс, под который попадает данный субъект. Используемый в настоящем описании термин "параметр" - это разброс величин показателей, таких, как, например, состояние активности uNK клеток матки или состояние активности цитокинов эндометриальной среды, или состояние созревания или рекрутинга uNK клеток матки.

Как обсуждалось выше, оценка возможности осуществления у субъекта женского пола процедуры оплодотворения in vitro, включая определение профиля имплантационной готовности матки, проводится путем получения от субъекта элементов информации и последующего их сравнения с библиотекой известных профилей, характеризующих наличие восприимчивости к процедуре искусственного оплодотворения, с использованием алгоритма, основанного на указанных предварительно отобранных переменных для данного субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения, оценка субъекта женского пола предоставляется в форме отчета. Таким образом, согласно некоторым определенным вариантам осуществления изобретения, заявленный способ дополнительно включает этап подготовки и создания отчета, который включает информацию, касающуюся вероятности проведения успешной процедуры искусственного оплодотворения in vitro у субъекта, а также рекомендации по индивидуальному лечению, как описано выше. Например, заявленный способ также может включать этап создания или получения отчета, предоставляющего оценку состояния субъекта, при этом указанный отчет может быть в представлен в электронной форме (например, на дисплее или мониторе компьютера), или в материальной форме (например, в форме печатного или иного документа). Отчет также может включать информацию об оборудовании, на котором проводилось обследование; указанная информация касается больницы, клиники или лаборатории, в которых происходил забор образцов и/или получение данных. Указанная информация также может включать один или более пункт, касающийся, например, названия и расположения места проведения обследования, данные о лаборанте, проводившем исследование и/или вносившем входящие данные, дату и время исследования и/или анализа, место хранения образца и/или полученных результатов, номер партии реагентов (например, наборов и т.д.), использовавшихся для анализа, и подобные данные. Указанный отчет также может включать информацию, касающуюся поставщика услуг, данных пациента и данных, касающихся полученного образца.

Интерпретируемая часть отчета включает информацию, получаемую после обработки всех данных, как описано в тексте. Интерпретируемая часть отчета может включать оценку состояния субъекта на предмет возможности проведения процедуры искусственного оплодотворения in vitro. Интерпретируемая часть отчета может включать, например, интерпретацию восприимчивости эндометрия, сделанную на основании данных, полученных, как описано выше и, возможно, рекомендации по последующему индивидуальному лечению и подготовке к процедуре искусственного оплодотворения in vitro.

Способы и системы, описанные в тексте, могут реализовываться различным образом. Согласно одному варианту осуществления изобретения, представляющему особый интерес, способы включают использование коммуникационных инфраструктур, например, сети интернет. Несколько вариантов осуществления изобретения описаны ниже. Также должно быть понятно, что настоящее изобретение может реализовываться посредством различных форм аппаратного обеспечения, программного обеспечения, встроенного программного обеспечения, процессоров или их комбинации. Способы и системы, описанные в тексте, могут реализовываться посредством сочетания аппаратных средств и программного обеспечения. Программное обеспечение может быть реализовано в виде приложения, размещаться на устройствах хранения данных или различных частей программного обеспечения, реализованного в пользовательской вычислительной среде (например, как апплет) и вычислительной среде рецензента, при этом рецензент может находиться в удаленном доступе и связываться через сайт (например, обслуживая объект заказчика).

Различные элементы вычислительного устройства, такого, как устройство для ввода данных, могут быть связаны между собой и с другими элементами системы посредством проводного или беспроводного соединения, включая, например, беспроводное LAN соединение, Bluetooth соединение, ZigBee соединение, протокол частотного соединения или мобильное соединение, включая связи на основе многостанционного доступа с кодовым разделением каналов (CDMA) или посредством глобальной системы мобильной связи (GSM).

Прикладная программа для исполнения алгоритмов, описанных в тексте, может быть загружена и исполнена, например, посредством машины, имеющей любую подходящую архитектуру. В целом, машина включает компьютерную платформу, имеющую аппаратные средства, такие, как один или более процессор (CPU), оперативная память (RAM) и интерфейс для введения/выведения данных (I/O). Компьютерная платформа также включает операционную систему и код микрокоманд. Различные процессы и функции, описанные в тексте, могут быть либо частью кода микрокоманд, либо частью прикладной программы (или их комбинации), которая выполняется с помощью операционной системы. Кроме того, различные другие внешние устройства могут быть подключены к компьютерной платформе, такие как дополнительное устройство хранения данных и печатающее устройство.

Часть или все входные и выходные данные также могут быть отправлены в электронном виде; определенные выходные данные (например, отчеты) могут быть отправлены в электронном виде или по телефону (например, посредством факсимильной связи, например, с использованием устройств, таких как факс). Примерные приемные устройства для вывода данных могут включать дисплей, принтер, факсимильный аппарат и подобные устройства. Электронные формы передачи данных и/или дисплей могут включать электронную почту, интерактивное телевидение, и тому подобное. Согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления изобретения, все или часть входящих данных и/или все или часть выходящих данных (например, как минимум, заключительный отчет) сохраняются на веб-сервере в доступе, предпочтительно, для конфиденциального доступа, который может быть осуществлен из типовых браузеров. Данные могут быть доступны и отправлены медицинским работникам, при необходимости. Входящие и выходящие данные, включая весь или часть заключительного отчета, могут быть использованы для заполнения медицинской документации субъекта, которая может находиться в конфиденциальной базе данных в медицинском учреждении.

Система, предназначенная для использования в соответствии с заявленными способами, как правило, включает, по крайней мере, один компьютерный процессор (например, на котором в одном месте в полном объеме реализуется заявленный способ) или, по крайней мере, два связанных между собой процессора (например, при этом данные вводятся пользователем и переносятся на удаленный узел процессора второго компьютера для анализа, при этом процессоры первого и второго компьютера соединены сетью, например, посредством интранета или интернета). Система также может включать компонент(ы) для ввода данных; и компоненты)контроля для анализа данных, создания отчетов, и вмешательства оператора. Дополнительные компоненты системы могут включать компонент(ы) сервера; базы данных для хранения информации. Компьютерные процессоры могут представлять собой стандартные процессоры персональных настольных компьютеров (например, IBM, Dell, Macintosh), портативных компьютеров, мейнфреймов, миникомпьютеров или других вычислительных устройств, таких, как смартфоны, включая, например, Apple®iPhone®.

По желанию может быть выбрана сетевая клиент-серверная архитектура, например, двух или трехуровневая классическая клиент-серверная модель. Реляционная система управления базами данных (СУБД), или как часть компонента сервера приложений, или в качестве отдельного компонента (RDB машина) обеспечивает работу интерфейса базы данных.

Согласно одному варианту осуществления изобретения, архитектура представлена в формате базы данных, ориентированной на клиент-серверную архитектуру, в которой приложение клиента обычно запрашивает услуги от сервера приложений, который в свою очередь отправляет запросы в базу данных (или сервер базы данных) для заполнения отчета различными элементами, как это требуется, в частности, интерпретируемыми элементами, в особенности интерпретируемым текстом или предупреждениями. Сервер(ы) (например, как часть сервера приложений или отдельного компонента RDB машины/реляционной машины базы данных) обрабатывает запрос клиента.

Настоящее изобретение также включает носитель информации, считываемый компьютером (например, компакт-диск, ключ памяти, флэш-карту, дискету и т.п.), на который записана программа, которая при выполнении на компьютере, обеспечивает реализацию алгоритмов для выполнения всех способов или части способов обследования субъекта на предмет возможности проведения процедуры искусственного оплодотворения in vitro как описано выше. В случае, если считываемый компьютером носитель содержит полную программу для выполнения способов, описанных в настоящем изобретении, указанная программа включает в себя программные инструкции по сбору, анализу и генерации выходных данных, и, как правило, также включает в себя считываемые компьютером кодовые устройства для взаимодействия с пользователем, как описано в тексте, обработки данных в соответствии с аналитической информацией и последующего создания уникальной печатной или электронной среды для конкретного пользователя.

В том случае, если считываемый компьютером носитель содержит программу, которая обеспечивает реализацию только части способов, описанных в тексте (например, ту часть, которая относится к пользователю (например, внесение данных, возможность выведения отчета) программа предусматривает передачу введенных пользователем данных (например, через Интернет, через интранет и т.д.) в компьютерную среду на удаленном узле. Обработка или завершение обработки данных осуществляется на удаленном узле для создания отчета. После проверки отчета и завершения любого необходимого вмешательства оператора, для обеспечения полного отчета, завершенный полный отчет затем передается обратно пользователю в виде электронного документа или печатного документа (например, по факсу или по почте на бумажном носителе). Носитель информации, содержащий программу, в соответствии с изобретением, может быть снабжен инструкциями (например, инструкциями по установке программы, ее использованию и т.д.), записанными на соответствующей подложке, или веб-адресом, по которому могут быть получены такие инструкции. Носитель данных считываемый компьютером также может быть представлен в комбинации с одним или несколькими реагентами для установления данных о субъекте, например, материалом для определения состояния эндометрия, как описано здесь выше.

Материалы, используемые в соответствии с заявленными способами, подходят для создания наборов, которые производят по доступным методикам. Таким образом, настоящее изобретение также относится к наборам, включающим реагенты, подходящие для анализа экспрессии генов, указанных в тексте настоящей заявки, а также для анализа состояния эндометрия у обследуемого субъекта.

Например, заявленный набор может содержать один или более нуклеотидный зонд, который гибридизуется специфическим образом с продуктом гена, как описано выше, таким, как CD56, IL-18, IL-6, IL-12, Tweak, IL-15, G-CSF рецептор и Fn14.

В некоторых случаях, набор будет включать, помимо зонда, который специфическим образом гибридизуется с продуктом нуклеиновой кислоты, как описано выше, один или более зонд, который специфическим образом гибридизуется с продуктом контрольного гена, таким, как RPL-13A, бета-2-микроглобулин и татабокс протеин ТВР. Такие зонды могут использоваться для определения нормализованных уровней экспрессии генов, представляющих интерес.

Наборы могут необязательно содержать реагент(ы) с описанием процедуры идентификации, или метку, или инструкции, касающиеся использования этих наборов в соответствии с заявленными в настоящем изобретении способами.

Наборы также могут включать контейнеры (включая микропланшеты, подходящие для использования при автоматическом осуществлении способа), в каждом из которых находится один или более реагент (обычно в концентрированной форме), используемый в соответствии с заявленным способом, включая, например, готовые микрочипы, буферы, подходящие трифосфаты нуклеотидов (например, дАТФ, дЦТФ, дГТФ и дТТФ; или рАТФ, рЦТФ, гГТФ и УТФ), обратные транскриптазы, ДНК полимеразы, РНК полимеразы, или один или более зонд или праймер, заявленный в соответствии с настоящим изобретением (например, подходящей длины поли(Т) или случайные праймеры, связанные с промотором, реагирующим с РНК полимеразой).

Инструкции по использованию математических алгоритмов, используемых для оценки возможности проведения у субъекта женского пола процедуры искусственного оплодотворения in vitro в лечебном цикле, могут также входить в состав заявленного набора. Согласно данным вариантам осуществления изобретения, заявленные наборы также могут включать письменную или электронную среду, или инструкции по оценке удаленной базы данных, как описано выше, для обеспечения и/или получения информации, которая содержит данные о субъекте для осуществления способов, описанных выше.

Краткое описание фигур

Фиг. 1. Экспертная система для оценки профиля имплантационной готовности матки.

Фиг. 2. (А) Корреляция экспрессии IL-15 мРНК на протяжении двух разных циклов (n=37 субъектов), (В) Корреляция экспрессии мРНК IL-18 на протяжении двух разных циклов (n=37 субъектов), (С) Корреляция экспрессии мРНК TWEAK на протяжении двух разных циклов (n=15 субъектов).

Фиг. 3. Корреляция экспрессии рецептора GCSFh ответ на кортикостероиды.

Фиг. 4. Изменение IL-15/Fn-14 до начала лечения кортикостеродами и во время лечения. (А) показана экспрессия мРНК IL-15/Fn-14 в 14 случаях неудачной имплантации, диагностированной, как при помощи гиперэкспрессии IL-18/Tweak и гиперэкспрессии IL-15/Fn-14. (B) показана экспрессии мРНК IL-15/Fn-14 у 10 пациенток с гиперэкспрессией IL-8/Tweak и низкой экспрессией IL-15/Fn-14.

Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируют представленные ниже примеры.

Примеры

Материалы и методы

Обследование субъектов женского пола, имевших в анамнезе беспричинные и повторные неудачные имплантации, проводили в середине лютеиновой фазы цикла без оплодотворения.

Забор образцов эндометрия осуществляют следующим образом:

- в течение мониторируемого естественного цикла через 7-9 дней после овуляторной волны (LH), если у пациентки регулярные циклы;

- после заместительной терапии эстрогеном/прогестином, которая применяется для переноса оттаянных эмбрионов при нерегулярных циклах или при наличии у субъекта аменореи. Затем ежедневно вводят микронизированный эстрадиол (Provames, Cassenne, Paris, France) в дозе 2 мг начиная с 1-го дня цикла и по 21 день перорально, и микронизированный прогестерон (Utrogestan; Besins-Iscovesco Pharmaceuticals, Paris, France) 200 мг ежедневно, интравагинально с 14-го по 21 день цикла.

Биопсию осуществляют при помощи стандартной пипетки Корнье (CCD Laboratories, Paris, France). Одну часть образца заливают в парафин для гистологического датирования в соответствии с имеющимися критериями и для иммунокрашивания и подсчета CD56+ клеток (Ventana, 760-2625). Датирование и CD56+ иммунокрашивание осуществляют для подтверждения середины лютеиновой фазы и определения среднего числа uNK в поле зрения. Другую часть образца немедленно переносят в РНК стабилизирующий раствор (RNA Later, QIAGEN, Courtabeuf, France) и хранят при температуре -80°C до заключительного анализа. Экстракцию РНК осуществляют через несколько дней (после подтверждения лютеиновой фазы).

Иммуногистохимия

Срезы получают на микротоме (5 мкм толщиной), помещают на предметные стекла Superfrost (CML, Nemours, France). В день эксперимента срезы освобождают от парафина в растворе Histolemon и регидратируют спиртом. Эндогенные пероксидазы и активность биотина ингибируют путем инкубации срезов в специфическом растворе (Peroxydase Blocking solution, Dako, Trappes, France and Avidin/Biotin Blocking Vector kit, Abcys, Paris, France). Блокирование белков достигается 20-ти минутной инкубацией в PBS (Phosphate Buffer Saline) с 1% кроличьей сывороткой (или козлиной сывороткой на CD56 окрашивание) и 5% нормальной сыворотки человека (блокирующей сывороткой). Срезы инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре с моноклональным мышиным античеловеческим антителом в случае CD56 окрашивания (Immunotech, Marseille, France). Концентрация составляет 1 мкг/мл для анти-CD56 антител. Антитело разводят в блокирующей сыворотке. Перед каждым следующим этапом срезы трижды промывают PBS. Иммунокрашивание осуществляют при помощи вторичного антитела (кроличьего антикозлиного антитела или козлиного антимышиного антитела из набора Vector ABC, Abcys, Paris, France) в течение 20 минут с последующей инкубацией со стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой, в течение 30 минут и затем путем использования субстратного буфера, обогащенного жидким DAB и субстратным раствором перекиси водорода (Dako, Trappes, France). Затем срезы инкубируют в течение 5 минут с гематоксилином Маейра (Interchim, Montlucon, France). Наконец, срезы промывают дистиллированной водой, обогащенной 1% аммониевой водой, и заключают в среду Ultramount (Dako, Trappes, France).

В каждом образце подсчитывают количество CD56+ клеток в четырех 40Х полях и затем рассчитывают среднее значение.

Экстракция общей РНК и обратная транскрипция

Фрагмент каждой биопсии эндометрия непосредственно разрушают в лизирующем буфере из набора RNeasy (QIAGEN, Courtabeuf, France) с использованием Ultra Turrax Т15 (IKA-WERKE). Общую РНК экстрагируют при помощи набора RNeasy в соответствии с инструкциями производителя. Дополнительное расщепление ДНКазой осуществляют во время процесса экстракции (RNase-free DNase set, QIAGEN, Courtabeuf, France). Целостность РНК и ее копийность определяют при помощи системы Expertion (Experion RNA StdSens kit, Bio-Rad, Hercules, CA), выделенную РНК хранят при температуре -80°C до заключительного анализа.

Общую РНК (1 мкг) обратно транскрибируют в кДНК с использованием случайных праймеров и Superscript III (Invitrogen, Carlsbad, CA) в соответствии с инструкциями производителя. Для определения контаминации молекулами геномной ДНК систематически создают контрольные образцы без обратной транскриптазы. кДНК хранят при температуре -20°C до последующего использования.

ПЦР в реальном времени

Были синтезированы известные пары праймеров, специфические для TWEAK ((Tweak-S TGCACCTAAAGGCCGGAAAACACG (SEQ ID NO: 1) и Tweak-AS CAGCGCAGGGCCAGCACACCATCC (SEQ ID NO: 2)), IL-18 (IL-18-S ATAAAGATGGCTGCTGAACC (SEQ ID NO: 3) и IL-18-AS TCAAATAGAGGCCGATTTCC (SEQ ID NO: 4)), Бета-2 микроглобулина (β2М) (b2M-S TGCTGTCTCCATGTTTGATGTATCT (SEQ ID NO: 5) и b2M-AS TCTCTGCTCCCCACCTCTAAGT (SEQ ID NO: 6)), рибосомального протеина L13A (RPL13A) (RPL13A-S CCTGGAGGAGAAGAGGAAAGAGA (SEQ ID NO: 7) и RPL13-AS TTGAGGACCTCTGTGTATTTGTCAA (SEQ ID NO: 8). Fn14-специфичные праймеры (Fn14-S TTTCTGGCTTTTTGGTCTGG (SEQ ID NO: 9) и Fn14-AS GGCACATTGTCACTGGATCA (SEQ ID NO: 10)), IL-15 (IL-15-S CTAGAGCCAACTGGGTGAATG (SEQ ID NO: 11) и IL-15 AS CATCTCCGGACTCAAGTGAAA (SEQ ID NO: 12)) и G-CSF рецептор (G-CSFR-S GTCCAAGATCACAAAGCTGGT (SEQ ID NO: 13) и G-CSFR-AS CCGCACTCCTCCAGACTTC (SEQ ID NO: 14)) были синтезированы при помощи центра по созданию библиотек универсальных праймеров и матриц (www.roche-applied-science.com). Последовательности Fn-14, IL-15 и G-CSFR были найдены среди последовательностей GenBank при помощи программы BLAST для обеспечения специфичности праймеров.

ПЦР в реальном времени проводят при помощи аппарата LightCycler 480 (Roche, Meylan, France). Реакции осуществляют с использованием следующих конечных концентраций: 0,5 мкМ смыслового и антисмыслового праймера, 1X 480 SYBR Green Master смеси и 4 мкл 1/20 разведенной кДНК. Условия циклов были следующими: денатурация (95°C в течение 5 мин), амплификация и подсчет (95°C в течение 10 с, 60°C в течение 10 с и 72°C в течение 15 с), повторение 40 раз, программа создания кривой плавления (65-95°C со скоростью изменения 2,22,2°C/сек) и этапом охлаждения до 4°C.Исследование также включал в себя нематричный контроль, калибратор и каждую тестируемую кДНК. Каждый анализ дублировали.

Эффективность амплификации оценивали путем серийных разведений каждого специфического ампликона. Данные анализировали при помощи программного обеспечения LightCycler 480 Relative Quantification с использованием стратегии нормализации по среднему геометрическому для двух выбранных внутренних контролей.

Два внутренних контроля (β2M, RPL13A), были выбраны программой geNorm (данные не представлены). Эффективность каждой специфичной амплификации составляла >1.8.

Результаты 1

Каждая девятая пара в Европе и США страдает от нарушений имплантации и невынашивания беременности, при этом большая часть потерей беременности происходит до или во время имплантации. Таким образом, понимание взаимосвязей между фетальным и материнским компонентами до, вовремя и после их соприкосновения остается сложной задачей.

Процесс имплантации у человека может быть описан как трехэтапный процесс, начинающийся с аппозиции и адгезии компенетной бластоцисты к эпителию эндометрия, с последующей интенсивной инвазией в восприимчивый эндометрий на протяжении первого триместра беременности. Комплексный, очень сложно организованный реципрокный процесс имплантации у человека обеспечивает впоследствии так необходимое создание гемохориальной плаценты.

События, происходящие во время ремоделирования матки и необходимые для удачной беременности, начинаются до имплантации и проявляются децидуализацией эндометрия, которая происходит даже при отсутствии оплодотворенной яйцеклетки. Эти процессы определяют имплантационное окно, которое продолжается 5 дней, с 4-го по 9-й день после овуляции и соответствует максимально восприимчивому эндометрию. Децидуализация у человека характеризуется притоком популяций различных лимфоцитов, включающих, главным образом, зрелые естественные киллеры матки. Инвазия трофобласта регулируется естественными киллерами матки (uNK) посредством организованного и регулируемого выброса цитокинов и проангиогенных факторов, которые усиливают ремоделирование сосудов.

Децидуализация - это жизненно важный процесс, необходимый для успешной беременности у человека, он обеспечивает иммунную толерантность матери, защиту плода и регулирование плацентации. Местная среда матки и иммунный баланс играют ключевую роль.

С точки зрения иммунной системы, имплантационное окно характеризуется выключением определенной категории иммунных клеток. В то время как в пролиферативную фазу большая часть иммунных клеток обеспечивает местный адаптивный иммунитет и защищают репродуктивную систему от инфекции, в середине лютеиновой фазы большая часть иммунных клеток обеспечивают врожденный иммунитет. Такое переключение является фундаментальным механизмом, обеспечивающим феномен местной толерантности к "семиаллогенному" плоду.

Таким образом, в момент имплантации, основными действующими иммунными клетками являются естественные киллеры матки(65-70%), антиген-презентирующие клетки, такие, как макрофаги (10-20%), Т-регулирующие клетки (<20%) и дендритные клетки (<2%). NK матки отличаются от их периферических аналогов не только фенотипом, но и функцией. NK клетки матки обычно имеют фенотип CD56-яркие/CD16-, в то время как периферические NK клетки являются CD56-тусклыми/CD16+. CD16 непосредственно участвует в запуске лизиса клеток-мишеней. Система активирующих и ингибирующих рецепторов, которые регулируют NK-опосредованную активность, различается, если сравнивать ее с CD56-яркими клетками, происходящими из крови. Отсутствие экспрессии CD16 на uNK приводит к уменьшению цитотоксичности указанных клеток, выключению функции продукции цитокинов. Однако, NK клетки матки являются потенциально цитотоксичными и если активизируются местной средой сохраняют способность удалять инфицированные вирусами клетки или трофобластные клетки или эмбрион, при активации посредством избыточного количества провоспалительных цитокинов.

Нокаутированные по IL-15 мыши являются фертильными, но у них отмечается нарушение децидуальной целостности, модификации спиральных артерий и дефицит uNK клеток на момент имплантации. IL-15 непосредственно участвует в постовуляторном рекрутинге NK клеток. Сообщается, что IL-15 необходим для продукции цитокинов 2 типа uNK клетками. В отличие от его эффектов на uNK клетки крови, IL-15 не приводит к трансформации uNK в потенциальные цитолитические клетки, если только не присутствует в избыточном количестве и не участвует в их созревании. Это ключевой момент для клетки, которая участвует в трансцплацентарном барьере, поскольку цитолитическая активность будет приводить к разрушению трофобласта. У людей, экспрессия мРНК IL-15 в эндометрии коррелирует с местным рекрутингом маточных NK клеток и местным ангиогенезом. Кроме того, известно, что у женщин, имеющих в анамнезе беспричинные неудачные имплантации после ЭКО-ПЭ, отмечается как недостаточная, так и избыточная экспрессия IL-15 в эндометрии во время середины лютеиновой фазы. Таким образом, является целесообразным принять во внимание, что в человеческой матке IL-15 может играть роль в усилении выживаемости и экспансии uNK а также направлять их дифференцировку в нетоксичный фенотип. Однако, при гиперэкспресии, IL-15 может запускать местную цитотоксичность.

Что касается экспрессии IL-18 в эндометрии, IL-18 сам по себе является Th-2 промоторным цитокином, с положительным эффектом на важный процесс дестабилизации спиральных артерий посредством влияния на ангиопоетин-2. Его основная роль заключается в ремоделировании васкуляризации со стороны матери. Однако, интерлейкин-18 является бивалентным цитокином, способным работать как провоспалительный Th1 цитокин в присутствии интерлейкина-12. При стимуляции IL-12, IL-18 усиливает местную продукцию IFN-гамма и TNF и стимулирует превращение NK клеток матки в цитотоксичные киллерные клетки. IL-18 является ярким примером важности баланса цитокинов в эндометрии, при его недостатке, подготовка спиральных артерий к инвазии является неэффективной и имплантация оказывается неудачной. В случае его избытка он работает как Th-1 цитокин и запускает цитотоксическую активность окружающих иммунных клеток.

Понимая местные функции IL-15 и IL-18, необходимо также принимать во внимание местную экспрессию иммунорегулирующих факторов, таких, как TWEAK, который обладает способностью модулировать эффекты цитокинов. TWEAK (TNF-подобный слабый индуктор апоптоза) запускает множественные клеточные ответы, начиная от пролиферации, заканчивая гибелью клеток, включая контроль ангиогенеза. Было показано, что TWEAK является "партнером" TNF (фактор некроза опухолей), вместе они представляют собой "инь и янь" иммунитета. Как было показано, экспрессия мРНК и белка TWEAK не подвергается изменениям на протяжении менструального цикла. Однако базальный уровень его экспрессии влияет на опосредованный IL-18 рекрутинг uNK и местную цитотоксичность. TWEAK влияет на цитотоксичность uNK, индуцируемую гиперэкспрессией IL-18, путем изменения экспрессии одного из цитотоксических рецепторов uNK, NKp46, что усиливает активность указанных клеток против эмбриона. По всей видимости, является модулятором, препятствующим развитию цитотоксичности uNK, индуцируемой гиперэкспрессией IL-18. IL-18 и TWEAK как два независимых белка возможно действуют синергично для поддержания ангиогенного/цитотоксичного баланса в активности uNK клеток.

Таким образом, оценка состояния имплантационной готовности матки путем определения состояния эндометрия, может представлять интерес в процессе обследования женщины на предмет возможности проведения процедуры вспомогательной репродуктивной технологии.

Обследование 225 женщин позволило сделать следующие наблюдения:

Способ, основанный на оценке состояния эндометрия путем определения состояния активности uNK при помощи определения соотношения IL-15/TWEAK, позволил установить, что приблизительно 42% обследованных женщин имеют нормальное состояние эндометрия. Однако, среди указанных 42%, почти у 25% состояние эндометрия по факту не было нормальным.

Аналогично, способ, основанный на оценке состояния эндометрия путем определения состояния созревания uNK при помощи определения соотношения IL-15/Fn-14 позволил установить, что приблизительно 43% обследованных женщин имеют нормальное состояние эндометрия. Однако, среди указанных 43%, почти у 75% состояние эндометрия по факту не было нормальным.

Дополнительно, способ, основанный на оценке состояния эндометрия путем определения состояния рекрутинга uNK при помощи подсчета количества CD56+клеток, позволил установить, что приблизительно 47% обследованных женщин имеют нормальное состояние эндометрия. Однако, среди указанных 47%, почти у 80% состояние эндометрия по факту не было нормальным.

Затем была разработана экспертная система для более точной диагностики состояния эндометрия у женщин (Фиг. 1).

В зависимости от состояния эндометрия затем разрабатываются индивидуальные рекомендации.

Указанная методика была применена к 255 женщинам, имевшим а анамнезе беспричинные неудачные имплантации после процедуры ЭКО/ИКСИ или повторяющиеся невынашивания беременности необъяснимые генетикой, тромбофилией или аутоиммунными причинами.

Для женщин, перенесших имплантационные неудачи, среднее количество предыдущих попыток ЭКО/ИКСИ было равно трем неудачным попыткам (от 1 до 8) со средним количеством перенесенных эмбрионов равным 7 (от 3-25) без развития последующей беременности. Средний возраст пациенток составлял 36 лет.

Диагностика профиля имплантационной готовности матки при помощи способа, описанного выше

У 48,5% (125/255) женщин было выявлено состояние гиперактивации эндометрия (отторжение эмбриона). У 35,5% (91/255) было выявлено состояние недостаточной активации эндометрия (отсутствие адгезии эмбриона). У 15,5% (40/255) эндометрий был нормальным.

Оптимизация попытки ЭКО/ИКСИ посредством индивидуальной подготовки эндометрия

В популяции, у которой в анамнезе были неудачные попытки имплантации, ожидаемая частота наступления беременности при следующей попытке ЭКО/ИКСИ составляет 15-20% перенесенных эмбрионов. Во Франции, четыре попытки (забора яйцеклеток) покрывается общей медицинской страховкой.

Осуществлялась оценка исхода процедуры у 75 пациенток после определения их профиля имплантационной готовности и оптимизации и индивидуализации их лечения для последующего оплодотворения in vitro.

Регистрировали следующие исходы:

- частота наступления беременности в течение 5 недель аменореи (визуализация плодного яйца);

- частота наступления беременности в течение 12 недель аменореи (развивающаяся беременность с присутствием, по крайней мере, одного плодного яйца и наличием сердцебиения).

После первой процедуры переноса эмбриона (свежего или замороженного-оттаянного) проводили оценку состояния эндометрия. Врачи, ответственные за процедуру, выполняли рекомендации по оптимизации имплантационной готовности матки.

Для указанной когорты 75 пациентов:

У 38% (28/75) женщин было выявлено состояние гиперактивации эндометрия (тенденция к отторжению эмбриона). У 42,6% (32/75) было выявлено состояние недостаточной активации эндометрия (проблемы с адгезией эмбриона). У 20% (15/75) эндометрий был нормальным.

Женщинам, у которых было выявлено состояние гиперактивации эндометрия, было рекомендовано осуществить попытку ЭКО:

- без активного вмешательства в матку в предшествующем цикле;

- Кортикостероиды;

- Высокие дозы прогестерона в лютиеновую фазу.

Женщинам, у которых было выявлено состояние недостаточной активации эндометрия, осуществляли биопсию эндометрия в середине лютеиновой фазы цикла, предшествующего процедуре ЭКО, проводили минимальную стимуляцию яичников и введение дополнительного хорионического гонадотропина человека в лютиновую фазу цикла после переноса эмбриона.

Частота наступления и развития беременности после индивидуального лечения и первой попытки переноса эмбриона составляла:

- В случае состояния гиперактивации эндометрия:

Частота наступления беременности в течение 5 недель аменореи составила 46% (13/28);

Частота наступления беременности в течение 12 недель аменореи составила 39% (11/28).

- В случае состояния недостаточной активации эндометрия:

Частота наступления беременности в течение 5 недель аменореи составила 53% (17/32);

Частота наступления беременности в течение 12 недель аменореи составила 43,7% (14/32).

- В случае нормального состояния эндометрия:

Частота наступления беременности в течение 5 недель аменореи составила 26% (4/15);

Частота наступления беременности в течение 12 недель аменореи составила 20% (3/15).

Полученные результаты позволяют предположить, что определение профиля имплантационной готовности матки для оптимизации ее состояния представляет собой оптимальный подход при осуществлении процедуры имплантации у субъектов, имевших в анамнезе неудачные имплантации. Действительно, процент развивающейся беременности около 40% считается хорошим показателем и, как ожидается, будет достигаться у молодых женщин уже при первой или второй попытке ЭКО/ИКСИ.

В данном клиническом контексте (третья попытка, предыдущие беспричинные и повторяющиеся неудачные имплантации) частота наступления беременности составляла 20% в группе, у которой наблюдалось нормальное состояние эндометрия, неудачи, по всей видимости, были связаны с проблемами с яйцеклетками или сперматозоидами.

Кроме того, ожидаемая частота невынашивания беременности составляла более 25% для женщин, у которых определялось состояние гиперактивации эндометрия или состояние недостаточной активации эндометрия.

При использовании способа, описанного выше, частота невынашивания беременности снизилась до 10% (5/50) в указанной группе высокого риска, предположительно благодаря контролю над местными гормональными нарушениями.

Результаты 2

Корреляция профиля имплантационной готовности в течение двух циклов.

Сначала подсчитали и нормализовали экспрессию мРНК IL-15, IL-18 среди 39 и 37 женщин, соответственно, и экспрессию мРНК TWEAK среди 15 женщин.

Нормализованая количественная экспрессия мРНК IL-15, IL-18 и TWEAK была высокой и существенно коррелировала на протяжении двух циклов.

Ранговая корреляция для IL-15 составляла 0,59 р=0,0001 (Фиг. 2А).

Ранговая корреляция для IL-18 составляла 0,55 р=0,0004 (Фиг. 2B).

Ранговая корреляция для TWEAK составляла 0,72 р=0,0023 (Фиг. 2C).

Для того, чтобы подтвердить, что ангиогенные каскады реакций, в которых участвует IL-18, и его эффект на дестабилизацию спиральных артерий, были одинаковыми на протяжении двух циклов, авторы у десяти женщин определяли соотношение IL-18/TWEAK, а также нормализованную экспрессию ангиопоетина-2.

Для соотношения IL-18/TWEAK была выявлена высокая корреляция на протяжении двух циклов (r=0.77, p=0.01), также как и экспрессия мРНК ангиопоетина-2 (r=0.93, р=0.0001) и Tie-2.

На основании полученных результатов можно утверждать, что изучаемый цикл является репрезентативным в отношении нарушений, происходящих в каждом цикле. Нарушения обусловлены не циклом как таковым, а местным иммунным профилем женщины.

Результаты 3

В случае состояния гиперактивации эндометрия, в процессе участвуют множественные молекулярные и иммунные каскады реакций, результатом которых и является состояние гипериммунной активации.

Прямым следствием является то, что лечение, позволяющее эффективно контролировать состояние гипериммунной активации, должно быть направлено на контроль специфических реакций, участвующих в этом процессе.

Таким образом, в случае состояния гиперактивации, потенциально эффективными являются следующие лекарственные препараты:

- Кортикостероиды (благодаря их противовоспалительной активности);

- Гепарины в низких дозировках (для контроля системы комплемента и благодаря их антитромботическому действию);

- Аспирин в низких дозировках (благодаря антитромботическому и антипростагландиновому эффекту);

- Интралипиды (контроль баланса Th1/Th2).

В данном случае препаратами первого выбора являются кортикостероиды; оценивался иммунный молекулярный профиль эндометрия у 27 пациенток в течение двух менструальных циклов до и после лечения кортикостероидами.

Наличие ответа на лечение оценивали как посредством определения нормализации соотношения IL-18/TWEAK, IL-15/Fn-14 под воздействием кортикостероидов, так и по наличию развивающейся беременности, если не было возможности провести исследование во время приема кортикостероидов.

Наблюдали эффективный ответ на лечение кортикостероидами у 15/27 (55%) женщин с гипериммунной активацией эндометрия.

У всех пациенток, отвечавших на лечение кортикостероидами, была выявлена экспрессия рецептора G-CSF ниже порогового значения (0,7), а у пациенток, не отвечавших на лечение, величина экспрессии рецептора G-CSF была выше 0,7 (p>0.0001) (Фиг. 3).

Результаты 4

Для того чтобы оптимизировать процесс имплантации у пациенток, имеющих в анамнезе повторяющиеся и беспричинные неудачные имплантации после процедуры ЭКО-ПЭ (RIF, повторяющиеся неудачные имплантации), в соответствии с их иммунным эндометриальным профилем, было проведено проспективное обсервационное исследование когорты из 299 пациенток с RIF. Осуществляли предварительную проверку иммунного статуса матки после чего разрабатывали индивидуальные рекомендации в зависимости от состояния эндометрия (недостаточной активации или гиперактивации). Результат оценивали по частоте наступления беременности после первого переноса свежего или оттаянного эмбриона.

Биопсию эндометрия проводили в лютеиновую фазу цикла, в который не проводилось оплодотворение, при помощи стандартной пипетки Корнье ®. В каждом образце после гистологического датирования подсчитывали количество естественных киллеров матки (uNK) (иммунокрашивание на CD56+), определяли экспрессию мРНК IL-15 (отражающую состояние созревания uNK), IL-18 (отражающую состояние Th1/Th2 цитокиновой среды) и соотношение TWEAK/Fn-14 (отражающее TNF-обусловленную местную иммунную регуляцию) при помощи ПЦР в реальном времени.

Заключительная диагностика, позволяющая установить причину повторяющихся неудачных имплантаций, заключалась в поэтапном обследовании, включавшем на первом этапе определение иммунной цитокиновой среды (IL-18/TWEAK), а на втором этапе состояния мобилизации и созревания uNK клеток.

- Низкий уровень экспрессии мРНК IL-18/TWEAK вместе с низким уровнем экспрессии мРНК IL-15/Fn-14 или без него, и/или вместе с низким уровнем мобилизации uNK клеток, независимо от того, понижены они или нет, свидетельствует о слабой иммунной активации и, гипотетически, о недостаточной адгезии как причине RIF.

- Нормальный уровень экспрессии мРНК IL-18/TWEAK вместе с низким уровнем экспрессии мРНК IL-15/Fn-14 и/или вместе с низким уровнем мобилизации uNK клеток свидетельствует о слабой иммунной активации и, гипотетически, о нарушении адгезии как причине RIF.

- Только высокий уровень экспрессии мРНК IL-18/TWEAK свидетельствует о состоянии гипериммунной активации эндометрия.

- Нормальный уровень экспрессии мРНК IL-18/TWEAK вместе с высокой экспрессией мРНК IL-15/Fn-15 или/и высокий уровень мобилизации uNK свидетельствует о состоянии гипериммунной активации эндометрия и, гипотетически, об отторжении эмбриона как причине RIF.

В случае слабой иммунной активации, рекомендации заключались в осуществлении местного повреждения эндометрия в цикле, предшествующем попытке ЭКО, применении минимальной стимуляции яичников, поддержании лютеиновой фазы путем введения хорионического гонадотропина человека и в регулярной половой жизни. В противоположном случае, в случае гипериммунной активации, рекомендации включали: отсутствие местного повреждения эндометрия в предшествующем цикле, Преднизолон в дозе 20 мг и витамин Е, начиная с -1 дня ЭКО-цикла, высокие дозы прогестерона (1200 мг вагинально) в комбинации с эстрогенами в лютеиновую фазу и отсутствие половой жизни.

Средний возраст когорты (37 лет) принимали во внимание вместе с показателем среднего количества предыдущих попыток (среднее количество - 3 попытки), средним количеством перенесенных ранее эмбрионов (более 6 эмбрионов), в таком случае ожидаемая частота развивающейся беременности при следующей попытке без применения заявленной стратегии будет составлять 20%.

Заключение: У 299 пациенток, имевших в анамнезе повторяющиеся неудачные имплантации, оценка иммунного статуса матки перед оплодотворением (при помощи способа в соответствии с настоящим изобретением) подтвердила наличие дерегуляторных процессов в матке у 77% пациенток. В группе, в которой отмечалась иммунная дерегуляция эндометрия, оптимизация восприимчивости эндометрия в соответствии с профилем имплантационной готовности (при помощи специфического лечения) существенно увеличивала частоту наступления беременности (см. Таблицу 1). Ожидаемая частота развивающейся беременности составляла приблизительно 20%. Затем авторы изобретения отмечали относительное увеличение более чем на 100% между наблюдаемой и ожидаемой частотой продолжающейся беременности, в том случае, когда пациенток разделяли на группы в зависимости от состояния эндометрия и адекватно лечили.

Результаты 5

Для того чтобы определить, насколько помимо оценки других показателей является необходимым установить механизм имплантационных неудач, для исследования отбирали пациенток с удачной беременностью после попытки ЭКО и индивидуально подобранного лечения в зависимости от их цитокинового профиля эндометрия. Порядок обследования включал сначала определение иммунной цитокиновой среды при помощи соотношения IL-18/TWEAK, затем оценку состояния рекрутинга или созревания uNK клеток: определение соотношения IL-15/Fn-14 и подсчет количества CD56 клеток.

Затем отобрали пациенток с высоким уровнем экспрессии IL-18/TWEAK (состояние гиперактивации эндометрия), которых обследовали на фоне лечения кортикостероидами, как препаратами первого выбора, при этом они могли иметь как высокий, так и низкий уровень экспрессии IL-15/Fn-14. Цель заключалась в анализе последующих изменений соотношения IL-15/Fn-14 на фоне лечения.

Между тем, наблюдалось существенное снижение, когда уровень базальной экспрессии IL-15/Fn-14 был высоким или нормальным (>3) (Рисунок 4). Среди 10 образцов с низким уровнем экспрессии IL-15/Fn-14 (Рисунок 4B) наблюдалась нормализация соотношения IL-15/Fn-14 в 5 случаях, а парадоксальный ответ наблюдался как следствие гиперэкспрессии в двух случаях. Это может быть следствием действия кортикостероидов на транскрипцию самого IL-15. Более того, в последовательности IL-15 присутствует кортико-рилизинг участок. Таким образом, в указанных случаях низкой экспрессии мРНК IL-15 в цитокиновой среде, стимуляция CRE при помощи кортикостероидов нарушает местную регуляцию. Экспрессия IL-18/TWEAK должна учитываться в первую очередь при назначении индивидуального лечения. Следовательно, экспрессия IL-15/Fn-14 должна учитываться на втором этапе, если экспрессия IL-18/TWEAK является нормальной.

Более того, ретроспективно изучили 109 пациенток с удачной беременностью, на первом этапе определяли экспрессию мРНК IL-15/Fn-14 с мобилизацией CD56 клеток, на втором этапе анализировали экспрессию IL-18/TWEAK. В 12 случаях из 109, экспрессия мРНК IL-15/Fn-14 была низкой (что соответствует незрелому состоянию uNK) в то время как экспрессия IL-18/TWEAK была высокой, что свидетельствует, по-видимому, об избытке Th-1 цитокинов в эндометриальной среде. В таком случае, если изначально учитывать только показатель IL-15/Fn-14, это приведет к противоположному диагнозу и рекомендациям.

В четырех случаях из 109, экспрессия мРНК IL-15/Fn-14 была высокой (что соответствует состоянию гиперактивации uNK) в то время как экспрессия IL-18/TWEAK была низкой, что позволяет предположить обратное: истощение Th-2 цитокинов в эндометриальной среде. В таком случае, если изначально учитывать только показатель IL-15/Fn-14, это приведет к противоположному диагнозу.

В целом, установлено, что у 14% женщин было неправильно определено состояние эндометрия и проводилось неправильное лечение. Показатель IL-18/TWEAK, отражающий цитокиновую иммунную среду эндометрия в целом, и также цитокиновую среду иммунных клеток (включая Т-регулирующие и дендритные клетки) должен обязательно учитываться до этапа определения состояния рекрутинга или созревания uNK клеток (Фиг. 1).

--->

Список последовательностей

<110> МАТРИСЕЛАБ ИННОВЕ (FR)

<120> Способ определения профиля восприимчивости матки

<140> RU 2016106004

<160> 14

<170> BiSSAP 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNK

<213> искусственные последовательности

<220>

<221> источник

<222> 1..24

<223> /тип молекулы="ДНК"

/примечание="Tweak-S"

/организм="искусственные последовательности"

<400> 1

tgcacctaaa ggccggaaaa cacg 24

<210> 2

<211> 24

<212> ДНК

<213> искусственные последовательности

<220>

<221> истойник

<222> 1..24

<223> /тип молекулы="ДНК"

/примечание="Tweak-AS"

/организм="искусственные последовательности"

<400> 2

cagcgcaggg ccagcacacc atcc 24

<210> 3

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственные последовательности

<220>

<221> источник

<222> 1..20

<223> /тип молекулы="ДНК"

/примечание="IL-18-S"

/организм="искусственные последовательности"

<400> 3

ataaagatgg ctgctgaacc 20

<210> 4

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственные последовательности

<220>

<221> источник

<222> 1..20

<223> /тип молекулы="ДНК"

/примечание="IL-18-AS"

/организм="искусственные последовательности"

<400> 4

tcaaatagag gccgatttcc 20

<210> 5

<211> 25

<212> ДНК

<213> искусственные последовательности

<220>

<221> источник

<222> 1..25

<223> /тип молекулы="ДНК"

/примечание="b2M-S"

/организм="ислусственные последовательности"

<400> 5

tgctgtctcc atgtttgatg tatct 25

<210> 6

<211> 22

<212> ДНК

<213> искусственные последовательности

<220>

<221> источник

<222> 1..22

<223> /тип молекулы="ДНК"

/примечание="b2M-AS"

/организм="искусственные последовательности"

<400> 6

tctctgctcc ccacctctaa gt 22

<210> 7

<211> 23

<212> ДНК

<213> искусственные последовательности

<220>

<221> источник

<222> 1..23

<223> /тип молекулы="ДНК"

/примечание="RPL13A-S"

/организм="искусственные последовательности"

<400> 7

cctggaggag aagaggaaag aga 23

<210> 8

<211> 25

<212> ДНК

<213> искусственные последовательности

<220>

<221> источник

<222> 1..25

<223> /тип молекулы="ДНК"

/примечание="RPL13A-AS"

/организм="искусственные последовательности"

<400> 8

ttgaggacct ctgtgtattt gtcaa 25

<210> 9

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственные последовательности

<220>

<221> источник

<222> 1..20

<223> /тип молекулы="ДНК"

/примечание="Fn14-S"

/организм="искусственные последовательности"

<400> 9

tttctggctt tttggtctgg 20

<210> 10

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственные последовательности

<220>

<221> источник

<222> 1..20

<223> /тип молекулы="ДНК"

/примечание="Fn14-AS"

/организм="искусственные последовательности"

<400> 10

ggcacattgt cactggatca 20

<210> 11

<211> 21

<212> ДНК

<213> искусственные последовательности

<220>

<221> источник

<222> 1..21

<223> /тип молекулы="ДНК"

/примечание="IL-15-S"

/организм="искусственные последовательности"

<400> 11

ctagagccaa ctgggtgaat g 21

<210> 12

<211> 21

<212> ДНК

<213> искусственные последовательности

<220>

<221> источник

<222> 1..21

<223> /тип молекулы="ДНК"

/примечание="IL-15-AS"

/организм="искусственные последовательности"

<400> 12

catctccgga ctcaagtgaa a 21

<210> 13

<211> 21

<212> ДНК

<213> искусственные последовательности

<220>

<221> источник

<222> 1..21

<223> /тип молекулы="DNA"

/примечание="G-CSFR-S"

/организм="искусственные последовательности"

<400> 13

gtccaagatc acaaagctgg t 21

<210> 14

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственные последовательности

<220>

<221> источник

<222> 1..19

<223> /тип молекулы="ДНК"

/примечание="G-CSFR-AS"

/организм="искусственные последовательности"

<400> 14

ccgcactcct ccagacttc 19

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ определения профиля восприимчивости матки у субъекта женского пола во время имплантационного окна. Определяют в образце эндометрия состояние эндометрия путем измерения на первой стадии состояния активности NK клеток матки (uNK), где состояние активности uNK определяют путем измерения экспрессии IL-18 и TWEAK, определения соотношения IL-18/Tweak и сравнения полученного значения с соотношением IL-18/Tweak фертильного субъекта женского пола; где значение соотношения IL-18/Tweak, сниженное до 0,45 раз относительно значения соотношения IL-18/Tweak, полученного от фертильного субъекта женского пола, может указывать на гипоактивное состояние эндометрия, и значение соотношения IL-18/Tweak, повышенное до 2 раз относительно значения соотношения IL-18/Tweak, полученного от фертильного субъекта женского пола, может указывать на гиперактивное состояние эндометрия; определения на второй стадии состояния рекрутинга и созревания uNK клеток, где состояние рекрутинга определяют путем количественного определения CD56+ uNK и сравнения указанного количества с количеством CD56+ uNK клеток, полученных от фертильного субъекта женского пола, где количество CD56+ uNK клеток, уменьшенное до 10 раз при подсчете в поле зрения, может указывать на гипоактивное состояние эндометрия; и состояние созревания uNK клеток определяют путем измерения экспрессии IL-15 и Fn-14, определения соотношения IL-15/Fn-14. Сравненивают полученные значения с соотношением IL-15/Fn-14 у фертильного субъекта женского пола, где значение соотношения IL-15/Fn14, пониженное до 0,25 раз относительно соотношения IL-15/Fn14, полученного от фертильного субъекта женского пола, может указывать на гипоактивное состояние эндометрия, и значение соотношения IL-15/Fn14, повышенное до 2,1 раза относительно соотношения IL-15/Fn14, полученного от фертильного субъекта женского пола, может указывать на гиперактивное состояние эндометрия. Таким образом, устанавливают состояние эндометрия, которое характерно для адекватной или неадекватной имплантационной готовности, где неадекватная имплантационная готовность может быть обусловлена отсутствием восприимчивости, сответствующей гипоактивному состоянию эндометрия или аномальной восприимчивостью, сответствующей гиперактивному состоянию эндометрия. Описан способ увеличения степени успеха репродуктивной технологии у субъекта женского пола и способ оценки пациента для репродуктивной технологии, включающие использование описанного способа определения профиля восприимчивости матки. Также представлен набор для осуществления способа определения профиля восприимчивости матки. Изобретение позволяет определять профиль восприимчивости (имплантационной готовности) матки для повышения успеха трансплантации при искусственном оплодотворении. 4 н. и 5 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл.

1. Способ определения профиля восприимчивости матки у субъекта женского пола во время имплантационного окна, включающий определение в образце эндометрия состояния эндометрия путем измерения:

а) на первой стадии, состояния активности NK клеток матки (uNK), где состояние активности uNK определяют путем измерения экспрессии IL-18 и TWEAK, определения соотношения IL-18/Tweak и сравнения полученного значения с соотношением IL-18/Tweak фертильного субъекта женского пола; где значение соотношения IL-18/Tweak, сниженное до 0,45 раз относительно значения соотношения IL-18/Tweak, полученного от фертильного субъекта женского пола, может указывать на гипоактивное состояние эндометрия, и значение соотношения IL-18/Tweak, повышенное до 2 раз относительно значения соотношения IL-18/Tweak, полученного от фертильного субъекта женского пола, может указывать на гиперактивное состояние эндометрия; и

б) на второй стадии, состояния рекрутинга и созревания uNK клеток, где состояние рекрутинга определяют путем количественного определения CD56+ uNK и сравнения указанного количества с количеством CD56+ uNK клеток, полученных от фертильного субъекта женского пола, где количество CD56+ uNK клеток, уменьшенное до 10 раз при подсчете в поле зрения, может указывать на гипоактивное состояние эндометрия; и состояние созревания uNK клеток определяют путем измерения экспрессии IL-15 и Fn-14, определения соотношения IL-15/Fn-14 и сравнения полученного значения с соотношением IL-15/Fn-14 у фертильного субъекта женского пола, где значение соотношения IL-15/Fn14, пониженное до 0,25 раз относительно соотношения IL-15/Fn14, полученного от фертильного субъекта женского пола, может указывать на гипоактивное состояние эндометрия, и значение соотношения IL-15/Fn14, повышенное до 2,1 раза относительно соотношения IL-15/Fn14, полученного от фертильного субъекта женского пола, может указывать на гиперактивное состояние эндометрия,

посредством чего устанавливают состояние эндометрия, которое характерно для адекватной или неадекватной имплантационной готовности, где неадекватная имплантационная готовность может быть обусловлена отсутствием восприимчивости, сответствующей гипоактивному состоянию эндометрия или аномальной восприимчивостью, сответствующей гиперактивному состоянию эндометрия.

2. Способ по п. 1, где субъект женского пола с пониженным значением соотношения IL-18/Tweak при сравнении со значением, полученным у фертильного субъекта женского пола, и

- со значением соотношения IL-15/Fn14 независимо от того, понижено оно или нет, по сравнению со значением, полученным у фертильного субъекта женского пола, или

- с количеством CD56+ uNK клеток независимо от того, понижено оно или нет, при сравнении со значением, полученным у фертильного субъекта женского пола, или

- со значением соотношения IL-15/Fn14 и значением количества CD56+ uNK, независимо от того, понижены они или нет, при сравнении со значением, полученным у фертильного субъекта женского пола, имеет гипоактивное состояние эндометрия, которое указывает на неадекватную имплантационную готовность.

3. Способ по п. 1, где субъект женского пола с нормальным значением соотношения IL-18/Tweak при сравнении со значением, полученным у фертильного субъекта женского пола, и

- с пониженным значением соотношения IL-15/Fn14 при сравнении со значением, полученным у фертильного субъекта женского пола, или

- с пониженным количеством CD56+ uNK клеток при сравнении со значением, полученным у фертильного субъекта женского пола, или

- с пониженным значением соотношения IL-15/Fn14 и пониженным количеством CD56+ uNK клеток при сравнении со значениями, полученными у фертильного субъекта женского пола,

имеет гипоактивное состояние эндометрия, которое указывает на неадекватную имплантационную готовность.

4. Способ по п. 1, где субъект женского пола с нормальным значением соотношения IL-18/Tweak при сравнении со значением, полученным у фертильного субъекта женского пола, и

- с нормальным или повышенным количеством CD56+ uNK клеток при сравнении со значением, полученным у фертильного субъекта женского пола, и

- с пониженным значением соотношения IL-15/Fn14 при сравнении со значением, полученным у фертильного субъекта женского пола,

имеет гипоактивное состояние эндометрия, которое указывает на неадекватную имплантационную готовность.

5. Способ по п. 1, где субъект женского пола с нормальным значением соотношения IL-18/Tweak при сравнении со значением, полученным у фертильного субъекта женского пола, и

- с нормальным или повышенным количеством CD56+ uNK клеток при сравнении со значением, полученным у фертильного субъекта женского пола, и

- с повышенным значением соотношения IL-15/Fn14 при сравнении со значением, полученным у фертильного субъекта женского пола,

имеет гиперактивное состояние эндометрия, которое указывает на неадекватную имплантационную готовность.

6. Способ по п. 1, где субъект женского пола с повышенным значением соотношения IL 18/Tweak при сравнении со значением, полученным у фертильного субъекта женского пола, и

- со значением соотношения IL-15/Fn14 независимо от того, повышено оно или нет, при сравнении со значением, полученным у фертильного субъекта женского пола, или

- с количеством CD56+ uNK клеток независимо от того, повышено оно или нет, при сравнении со значением, полученным у фертильного субъекта женского пола, или

- со значением соотношения IL-15/Fn14 и количеством CD56+ uNK клеток, независимо от того, повышены они или нет, при сравнении со значениями, полученными у фертильного субъекта женского пола,

имеет гиперактивное состояние эндометрия, которое указывает на неадекватную имплантационную готовность.

7. Способ увеличения степени успеха репродуктивной технологии у субъекта женского пола, включающий:

- определение профиля восприимчивости матки у указанного субъекта во время имплантационного окна способом по любому из пп. 1-6; и

- составление индивидуальных рекомендаций для указанного субъекта в зависимости от профиля восприимчивости матки, определенного способом по любому из пп. 1-6, где профиль восприимчивости матки является неадекватным вследствие отсутствия восприимчивости, что соответствует неактивированному состоянию эндометрия, или неадекватным вследствие аномальной восприимчивости, соответствующей гиперактивированному состоянию эндометрия, причем

- профиль восприимчивости матки является неадекватным вследствие отсутствия восприимчивости, что соответствует неактивированному состоянию эндометрия, и рекомендации включают механическую стимуляцию эндометрия в лютеиновой фазе, предшествующую циклу фертилизации in vitro; уменьшение уровня гормональной стимуляции; или введение хорионического гонадотропиина в течение имплантационного окна;

- профиль восприимчивости матки является неадекватным вследствие аномальной восприимчивости, соответствующей гиперактивированному состоянию эндометрия, и рекомендации включают высокой уровень стимуляции яичников; высокие дозы прогестерона после восстановления ооцитов; применение лекарственных препаратов, предназначенных для регуляции местной воспалительной реакции, начиная от момента начала стимуляции, выбранных из группы, включающей кортикостероиды, комбинацию ацетилсалициловой кислоты и гепарина в низких дозах, и интралипиды; или антиоксиданты в терапевтически эффективных количествах.

8. Способ оценки пациента для репродуктивной технологии, включающий:

- определение профиля восприимчивости матки у субъекта женского пола согласно способу по любому из пп. 1-6;

- получение элементов информации от субъекта женского пола, где указанные элементы информации включают гистологические данные, характеристики эндометрия, возраст, этиологию бесплодия, данные бесплодия, гормональную оценку резерва яичников и типа репродуктивной технологии;

- обеспечение профиля для субъекта женского пола, основанного на профиле восприимчивости матки для указанного субъекта женского пола и элементах информации, полученных от указанного субъекта женского пола; и

- сравнение полученного профиля указанного субъекта женского пола с библиотекой известных профилей, характеризующих наличие восприимчивости к процедуре искусственного оплодотворения с использованием алгоритма, основанного на указанных элементах информации и профиле восприимчивости матки;

посредством чего оценивают возможность осуществления у данного субъекта женского пола процедуры репродуктивной технологии на основании сравнения профиля указанного субъекта женского пола с библиотекой известных профилей образцов, для которых известно, что они характеризуются восприимчивостью к процедуре искусственного оплодотворения.

9. Набор для осуществления способа определения профиля восприимчивости матки по любому из пп. 1-6, включающий:

- реагенты для измерения экспрессии IL-18, а также экспрессии IL-15 и CD56;

- реагенты для измерения экспрессии Tweak и Fn-14;

- необязательно реагенты для измерения экспрессии GCSF-R;

- необязательно реагенты для измерения экспрессии референсных генов; и

- инструкции по осуществлению способа по любому из пп. 1-6.