Способ определения степени выраженности хронического эндометрита Российский патент 2024 года по МПК A61B5/00 G01N33/53 G01N1/30 

Область техники

Изобретение относится к области медицины, а именно к патологической анатомии, репродуктологии, акушерству и гинекологии и может быть использовано для выявления хронического эндометрита (ХЭ) у женщин с аномальным маточным кровотечением в анамнезе, расстройством впоследствии менструального цикла маточного генеза на основании оценки маркеров хронического персистирующего воспаления эндометрия с наличием плазматических клеток.

Уровень техники

В последнее время принят всеобъемлющий термин аномальное маточное кровотечение (АМК), подразумевающий любое маточное кровотечение, выходящее за рамки нормальной менструации женщины репродуктивного возраста. По данным ряда популяционных исследований распространенность АМК достигает 35% и более [19, 20, 21, 23]. Такие различия в частоте встречаемости обусловлены определенными особенностями патогенеза маточных кровотечений в репродуктивном периоде жизни женщины. Более чем половина женщин репродуктивного возраста сталкивается с АМКхотя бы один раз в жизни, в то время как, только четверть из них обращаются за врачебной помощью.

Одной из причин аномального маточного кровотечения является ХЭ, по классификации FIGO (PALM-COEN) - АМК-Е. Предиктором АМК-Е следует считать хронический эндометрит. Распространенность данного заболевания у женщин репродуктивного возраста колеблется в широких пределах, что связано с определенными трудностями диагностики, латентным течением и скрытой клинической картиной [2,10-14].

Распространенность ХЭ в женской популяции соответствует 24,4% [1-4]. У пациенток репродуктивного периода этот показатель варьирует от 8% до 72% случаев, а у бесплодных пациенток достигает 55,7% [2,15-16,24]. В России хроническое воспаление слизистой оболочки матки встречается от 15 - 80% наблюдений. Большую часть пациенток с хроническим эндометритом составляют женщины в фертильном периоде (88%).

Следует признать, что ХЭ является наиболее частой причиной аномальных маточных кровотечений и других расстройств менструации. Об этом достоверно свидетельствует высокая распространенность ХЭ среди пациенток с АМК, достигающая от 3-10% и до 72%, или других ВЗОМТ, вызванных инфекциями, передаваемыми половым путем (ИППП) [5,19,20].

Необходимо отметить то, что персистирующее воспаление эндометрия с аномальными маточными кровотечениями и нарушениями менструального цикла эндометриального генеза остается неизвестным, а частота встречаемости варьирует в различных публикациях.

В мировой литературе представлено множество патогенетических сценариев АМК на фоне ХЭ и ассоциированных сним негативных репродуктивных исходов: персистирующее воспаление базально-эндометриального компартмента; изменения в популяциях иммунокомпетентных клеток в эндометрии на фоне высокой экспрессии провоспалительных цитокинов; негативное влияние на децидуализацию эндометрия [2-3]. Особое значение отводят изменению локального гемостаза, рецепции к половым стероидным гормонам, нарушению паттерна паракринных факторов и нарушению адгезии [17-18]. Таким образом, ХЭ нарушает децидуализацию, инициирует резистентность к прогестерону, в то же время нарушая баланс факторов адгезии [6-9]. Перечисленные аномалии эндометриальной среды становятся причиной повышенного пролиферативного потенциала при сниженной способности к дифференцировке, асинхронной перистальтики матки, что является причиной аномальных маточных кровотечений, а также вызывая дальнейшие нарушения менструального цикла. На сегодняшний день методы диагностики АМК у пациенток с верифицированным ХЭ далеки от идеала, поскольку не имеют специфичных маркеров. Все вышеизложенное определяет актуальность выбранной темы, свидетельствует о необходимости разработки новых способов диагностики и прогнозирования исходов нарушения менструального цикла у пациенток, страдающими АМК.

Известно, что васкулоэндотелиальный фактор роста (VEGF) - гетеродимерный гликопротеиновый ростовой фактор, продуцируемый различными типами клеток. Это потенциальный митоген для эпителиальных клеток сосудов. Он оказывает сильное влияние на проницаемость сосудов, является мощным ангиогенным белком, а также принимает участие в неоваскуляризации при патологических процессах [27].

Функциональный слой эндометрия под воздействием факторов роста трансформируется в течение каждого менструального цикла за счет изменения его структуры и особенностей васкуляризации, что является необходимым для регуляции менструального цикла и полноценной инвазии трофобласта. Значение роли VEGF в эндометрии установлено в исследованиях как на моделях животных, так и у человека [28].

Согласно современным исследованиям VEGF является одним из ключевых факторов, участвующих в дисфункции сосудов при хроническом эндометрите и привычном невынашивании беременности [29]. Снижение его экспрессии связано с нарушением оксигенации в эндометрии, что нарушает дифференцировку функционального слоя эндометрия, тем самым вызывая последующие нарушения менструального цикла и приводит к ранней потери беременности [30]. Уровень VEGF является основным индикатором хронической эндометриальной дисфункцией [31-33].

Существует способ диагностики ХЭ, описанный в патенте РФ 2236013 от 10.09.2004 года, сущность которого заключается в том, что с помощью иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания срезов эндометриальной ткани определяют показатели местного иммунитета: количество лимфоцитов, экспрессирующих маркеры естественных киллерных клеток, CD56+, CD16+ и маркеры активации HLA-DR(II)+, и тем самым диагностируют различные варианты течения ХЭ.

Недостатком данного метода является отсутствие комплекса ИГХ оценки ХЭ, отсутствие данных об аномальных маточных кровотечениях и нарушениях менструального цикла эндометриального генеза.

Известен способ диагностики ХЭ у пациенток после прерывания неразвивающейся беременности и с неблагоприятными потерями беременности в анамнезе (патент РФ 2697195 от 18.05.2018 г.). Суть метода заключается в исследовании менструальной крови на содержание в ней эндометриального белка гликоделина. Исследование проводится на 1-2 день менструального цикла. Полученный материал исследуется методом ИФА. Уровень эндометриального гликоделина менее 22,2 мкг/мл говорит о ХЭ.

Недостатком данного метода является отсутствие комплексного определения специфических маркеров, присущих персистирующему воспалительному процессу в эндометрии, а также отсутствие данных об аномальных маточных кровотечениях и последующих нарушениях менструального цикла.

Известен способ диагностики и прогнозирования развития ХЭ у пациенток (патент РФ 2587325 от 20.06.2016 г.). У женщин репродуктивного возраста посредством ИГХ исследования срезов эндометрия, по проценту позитивно окрашенных клеток эндометрия в баллах, определяют показатели локального врожденного иммунитета TLR2, TLR4, TLR9. Полученная ИГХ картина экспрессии TLR2, TLR4, TLR9 совместно с морфологическими данными позволяет диагностировать либо отсутствие ХЭ, либо наличие факторов риска и предрасположенности к его развитию, а также либо наличие и прогрессирование заболевания, либо стадию ремиссии данного состояния; либо наличие длительно персистирующего воспаления эндометрия, течение которого характеризуется развитием склеротических изменений сосудов и фиброзом стромы эндометрия различной степени выраженности.

Недостатком данного метода является отсутствие комплексной ИГХ оценки ХЭ, отсутствие данных об аномальных маточных кровотечениях и нарушениях менструального цикла.

Существует способ определения стадии клинического течения ХЭ, степени активности воспаления и выраженности фиброза с установлением прогноза имплантации и нарушения рецептивности эндометрия, описанный в патенте РФ 2674155 от 27.09.2017 года. Сущность метода заключается в оценке наличия воспалительной лимфоцитарной инфильтрации и определении выраженности фиброза, по количественной оценке, распространенности и наличию его в основных топографических зонах эндометрия в баллах, по сумме которых определяют индексы активности ХЭ и выраженности фиброза, по величине которых выделяют по три стадии активности и клинического течения ХЭ.

Недостатком данного метода является отсутствие системного определения маркеров, присутствующих при хроническом воспалительном процессе в эндометрии, а также ориентация на наличие одного только фиброза, в отсутствие других надежных маркеров, отсутствие данных об аномальных маточных кровотечениях и нарушениях менструального цикла.

Известен способ оценки рецептивности эндометрия в период “имплантационного окна” (патент РФ 2651762, 23.04.2018 г. ). Для достижения этой цели исследователи методом пайпель-биопсии эндометрия на 20-23 день менструального цикла проанализировали на основании метода ИГХ с использованием двухэтапного стрептавидин-биотин-пероксидазного метода с демаскировкой антигена и с применением ключевых биомолекул, отвечающих за имплантацию: стандартный набор моноклональных и поликлональных антител ERα в строме, PR в строме, р53 в железах, bc12 в строме, CD95 в строме, Ki67 в строме, LIFR в железах, LIF в железах эндометрия. На основании полученных результатов исследования авторы рассчитали прогноз рецептивности эндометрия по формуле: d=-l,389x1+0,022x2 - 0,044x3 - 0,019x4+0,041x5+0,006x6+0,015x7 - 3,248, где x1 - индекс ER/PR в строме эндометрия (баллы H-score для определения ядерной экспрессии ER и PR), х2 - р53 в железах эндометрия (% окрашенных ядер в поле зрения), х3 - bcl 2 в строме эндометрия (% окрашенных ядер в поле зрения), х4 - CD95+в строме эндометрия (% окрашенных клеток), х5 - Ki67 в строме эндометрия (% окрашенных ядер в поле зрения), х6 - LIF-R в железах эндометрия (баллы H-score), х7 - LIF в железах эндометрия (баллы H-score). При значениях d>0 эндометрий характеризовали как рецептивный, при d≤0 эндометрий характеризуется как нерецептивный.

Недостатками данного метода являлось отсутствие данных об аномальных маточных кровотечениях и нарушениях менструального цикла.

Существует способ определения степени выраженности хронического эндометрита у женщин с маточным фактором бесплодия после неудачного экстракорпорального оплодотворения в анамнезе, описанный в патенте РФ 2748191 от 21.01.2021 года. Сущность метода заключается в разработке двух способов, основанных на комплексном патоморфологическом исследовании эндометрия в среднюю стадию фазы пролиферации, включающем в первом способе гистологическую окраску гематоксилином и эозином, ИГХ исследование с антителами к CD138, CD56, а во втором способе - гистологическая окраска гематоксилином и эозином, ИГХ исследование с антителами к CD 138, CD56 игистохимическую окраску по Маллори на определение выраженности фиброза.

Недостатком данного метода является отсутствие данных о связи хронического эндометрита и аномальных маточных кровотечениях и нарушениях менструального цикла.

Раскрытие сущности изобретения

Сущностью изобретения является разработка способа повышение точности патологоанатомической диагностики степени выраженности ХЭ и оценки полноценности кровоснабжения эндометрия у женщин с аномальным маточным кровотечением в анамнезе и последующими расстройствами менструации.

Вследствие отсутствия высокоспецифичных и чувствительных способов диагностики ХЭ у пациенток с АМК в анамнезе, последующим нарушением менструального цикла эндометриального генеза, характеризующееся как хроническое маточное кровотечение, предлагаемый нами способ, основанный на комплексном патологоанатомическом анализе параметров неполноценного функционирования эндометрия и кровоснабжения функционального слоя эндометрия, расширяет возможности диагностики степени выраженности ХЭ у пациенток, что позволяет выявить причину хронического аномального маточного кровотечения, а так же прогнозировать положительный исход беременности.

Было проведено собственное исследование, в котором продемонстрирована высокая специфичность предлагаемого нами комплексного патологоанатомического метода в диагностике выраженности ХЭ с аномальными маточными кровотечениями в анамнезе, нарушения менструального цикла эндометриального генеза, основанном на оценке изменений в системе кровоснабжения функционального слоя эндометрия. Комплексное изучение состояло из гистологических, гистохимических, иммуногистохимических и морфометрических методов исследований образцов. Полученные результаты позволили достоверно выявить степень выраженности ХЭ у пациенток с аномальными маточными кровотечениями.

Предлагаемый способ основан на комплексном патологоанатомическом исследовании эндометрия в среднюю стадию фазы пролиферации, включающем гистологическую окраску гематоксилином и эозином, гистохимическую окраску по Маллори с последующим ИГХ применением моноклональных антител к CD138, к рецепторам сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF, а также определение фактора Виллебранда (VWF). Проводится анализ наличия фиброза, подсчет числа CD138+плазматических клеток в расчете на 1 поле зрения при увеличении 400. После чего все пациентки на первом этапе были разделены на три группы в зависимости от степени выраженности ХЭ по критериям, указанным в таблица №1. На основании полученных данных о числе CD138+плазматических клеток и наличию фиброза были выделены три степени выраженности ХЭ: выраженный ХЭ (ВХЭ), умеренно-выраженный ХЭ (УВХЭ), слабо-выраженный ХЭ (СВХЭ).

Уровень экспрессии VEGF оценивался как полуколичественным методом - число окрашенных клеток к неокрашенным в железах эндометрия и поверхностном эпителии с расчетом на 1 поле зрения при увеличении 400, так и качественным (слабая, умеренная и выраженная цитоплазматическая экспрессия). Положительная реакция с фактором фон Виллебранда (VWF) расценивалась как интенсивное коричневое окрашивание в кровеносных сосудах: артериолах, венулах и капиллярах, с дальнейшим подсчетом количества артериальных кровеносных сосудов (артериол и капилляров) в расчете на 1 поле зрения при увеличении 400.

Комплекс ИГХ исследований включает анализ уровней экспрессии ключевых белков: CD138+ - маркер плазматической клетки, VWF - обеспечивающий адгезию клеток между собой, связываясь с цитоадгезинами подсемейства β3-интегринов [7-8] -оценка состояния эндотелия и расположение сосудов. В норме сосуды имеют тонкую стенку синусоидного типа, располагаются в базальном отделе, при персистирующем воспалительном процессе наблюдается повышение клубков сосудов выше базального слоя иотмечается утолщение кровеносных сосудов. А также эндотелиальный фактор роста VEGF.

VEGF - активно экспрессируется поверхностным эпителием и эпителием желез нормального эндометрия Циклическое обновление эндометрия в физиологических условиях невозможно без активного участия эндотелиальных факторов роста [25]. Являясь мощным модулятором роста и трансформации кровеносных сосудов, VEGF принимает участие в обеспечении адекватной васкуляризации эндометрия [26].

CD138 (так же известный как синдекан-1) - трансмембранный гепарансульфат протеогликан, участвующий в модуляции воспалительных заболеваний, рака и инфекций. Так же он участвует в регуляции цикличных изменений эндометрия и используется для прогнозирования репродуктивных исходов в качестве специфического и чувствительного антигена плазмоцитов. Кроме того, было высказано мнение о том, что подсчет плазмоцитов CD138+ может повысить точность диагностики ХЭ и репродуктивных исходов у бесплодных пациенток с высоким числом CD138+ клеток. Соответствующие исследования показали, что ИГХ окрашивание с данным маркером относится к наиболее чувствительному методу диагностики ХЭ [9, 10].

Таким образом, предлагаемый способ диагностики степени выраженности ХЭ и оценки кровоснабжения функционального слоя у женщин с аномальным маточным кровотечением в анамнезе и нарушением менструального цикла в последствии, основанный на определении специфичных маркеров, обусловливающих патогенетические особенности заболевания и дисфункции функционального аппарата эндометрия, следует рассматривать как дополненный вариант диагностики у данной группы пациенток.

Технический результат, достигаемый с помощью изобретения - повышение чувствительности верификации степени выраженности ХЭ и оценки кровоснабжения функционального слоя у женщин для прогнозирования тактики лечения ХЭ и положительного исхода беременности, у пациенток с аномальным маточным кровотечением в анамнезе и нарушение менструального цикла, обусловленными ХЭ.

Для достижения указанного технического результата в способе определения разной степени выраженности хронического эндометрита, включающим забор биопсии эндометрия на 7-11 дни менструального цикла, получение срезов для гистологического исследования с окраской гематоксилином и эозином, с последующей гистохимической окраской по Маллори для диагностики фиброза стромы и иммуногистохимической реакцией с моноклональными антителами к CD138, фактору Виллебранда, VWF, VEGF, предлагается степень выраженности ХЭ определять на основе наличия фиброза в строме функционального слоя эндометрия и морфометрических данных: подсчет числа окрашенных плазматических клеток CD138, оценки экспрессии экспрессии VEGF, определяемой качественным - слабая, умеренная и выраженная цитоплазматическая экспрессия и полуколичественным методами - процент окрашенных клеток ко всем клеткам в железах эндометрия и поверхностном эпителии с расчетом на 1 поле зрения при увеличении 400; подсчет количества на 1 поле зрения, кровеносных сосудов с выраженной экспрессией маркера Фактора Виллебранда, VWF; и оценивают полученные данные в баллах: наличие фиброза – 1 балл, его отсутствие – 0 баллов; число CD138 положительно окрашенных клеток 0-1 – 1 балл, 2-3 клетки – 2 балла, 4 клетки и более – 3 балла; проявление экспрессии маркера VEGF, определяемой качественным методом, слабо-выраженным окрашиванием –2 балла, умеренно-выраженным окрашиванием – 1 балл, выраженным окрашиванием – 0 баллов; проявление экспрессии маркера VEGF, определяемой полуколичественным методом, меньше или равное 30% - 3 балла, 31-47% - 2 балла, 48-94% - 1 балл; выявление кровеносных сосудов с выраженной экспрессией маркера Фактора Виллебранда, VWF, меньше или равное 5 на 1 поле зрения - 3 балла, 6-8 на 1 поле зрения – 2 балла, 9-10 на 1 поле зрения – 1 балл; проводят подсчет полученных баллов и при сумме 10-12 баллов определяют наличие хронического эндометрита выраженной степени, при сумме 6-9 баллов определяют наличие хронического эндометрита умеренно-выраженной степени, при сумме 2-5 баллов определяют наличие хронического эндометрита слабой степени выраженности, при сумме 0-1 балл, определяют, что хронический эндометрит маловероятен.

В данное исследование были включены 95 пациенток в возрасте от 21 до 40 лет (средний возраст составил 29±9,1 год).

Основную группу (n=60) составили пациентки с аномальным маточным кровотечением в анамнезе и другим нарушением менструального цикла (код по МКБ10 N 92.0), имеющие хронические маточные кровотечения в анамнезе и подозрением на наличие ХЭ. Средняя продолжительность хронического маточного кровотечения 2,5±0,5 года.

Группу сравнения (n=35) составили женщины, проходившие плановое диспансерное наблюдение, не имеющие в анамнезе аномального маточного кровотечения и хронических маточных кровотечений, давшие добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Гистологический материал получен методом пайпель - биопсии эндометрия в среднюю стадию фазы пролиферации менструального цикла (на 7-11 дни 28-дневного менструального цикла). После стандартной гистологической обработки материала и гистохимического окрашивания по Маллори приготовленные гистологические препараты были изучены под световым бинокулярным микроскопом DLMB с цифровой камерой и анализатором изображения Leica DM 2500 (Германия). Морфометрический анализ экспрессии ИГХ маркеровпроводили на микрофотографиях с помощью программного обеспечения Image Scope М.

Полученные при морфометрическом исследовании результаты обрабатывали стандартными статистическими методами с использованием программы Statistica 10 for Windows (Stat Soft, США). Статистическую обработку результатов проводили с оценкой вида распределения, определением среднего Me, стандартной ошибки ±se, минимальных и максимальных значений в группах. Попарное сравнение групп проводили с помощью критерия Манна Уитни. Критический уровень значимости принимался равным 0,05.

ИГХ исследование биоптатов эндометрия, взятых методом пайпель - биопсии в среднюю стадию фазы пролиферации менструального цикла (на 7-11 дни 28-дневного цикла), проводилось с использованием двухэтапного стрептавидин-биотин-пероксидазного метода с демаскировкой антигена. ИГХ окрашивание производилось в иммуностейнере Ventana BenchMark ULTRA IHCASH (США) на парафиновых срезах по стандартной методике с использованием антител CD138 - CD138/syndecan-1 (В-A38) «Cell-Marque» (США), с использованием соответствующих стандартных антител выявляли маркеры VEGF (Abeam) и фактор Виллебранда (VWF) «Cell-Marque» (США) (таблица 2).

Был проведен анализ экспрессии маркеров CD 138, VEGF и фактором Виллебранда (VWF). Наличие фиброза оценивалась как синее окрашивание на микропрепаратах с окраской по Маллори в эндометрии у женщин с аномальным маточным кровотечением в анамнезе и нарушением менструального цикла эндометриального генеза впоследствии, и у пациенток без аномального маточного кровотечения в анамнезе и нарушения менструального цикла, проходившие диспансерное наблюдение, давшие добровольное информированное согласие на участие в исследовании, последние составили группу сравнения. Результаты представлены в таблица 3.

Таким образом, по результатам проведенного комплексного паталогоанатомического исследования в среднюю стадию фазы пролиферации 28-дневного менструального цикла ХЭ был верифицирован у пациенток основной группы по совокупности наличия плазматических клеток, наличия фиброза в строме эндометрия, количество кровеносных сосудов с выраженной экспрессией маркера Фактора Виллебранда (VWF) и маркера эндотелиального фактора роста кровеносных сосудов VEGF -полуколичественным и качественными методами.

Учитывая полученные данные, следует заключить, что нарушения в функциональном эндометриальном компартменте является принципиально важным для регуляции репродуктивной и менструальной функции, соответственно выявленный дисбаланс маркеров в эндометрии в фазе пролиферации у пациенток с ХЭ может быть одним из ведущих патогенетических механизмов развития функциональной несостоятельности эндометрия и как следствие -бесплодие маточного фактора.

В эндометрии в среднюю стадию фазы пролиферации с 28-дневным меструальным циклом у пациенток с аномальным маточным кровотечением в анамнезе и нарушением менструального цикла эндометриального генеза впоследствии (основная группа) и у пациенток без аномального маточного кровотечения в анамнезе и нарушения менструального цикла, проходившие диспансерное наблюдение (группа сравнения) установлены достоверные ИГХ и гистохимические детерминанты. На фоне нарушений в функциональном эндометриальном компартменте эпителиально-мезенхимального компонента определяется статистически значимое снижение плотности кровеносных сосудов, определенном по сниженному числу положительно окрашенных сосудов с маркером Фактора Виллебранда (VWF), и снижению активности ангиогенеза, в связи с снижением числа клеток, вырабатываемых VEGF, и уровня экспрессии маркера эндотелиального фактора роста кровеносных сосудов, в основной группе относительно группы сравнения.

На основании полученных результатов, мы сделали вывод, что при увеличении степени выраженности ХЭ уменьшается число клеток, вырабатываемых VEGF и снижается активность ангиогенеза и число новых артериальных сосудов. Поэтому по процентному соотношению числа клеток экспрессирующих VEGF можно определить степени выраженности ХЭ у женщин с АМК. Дополнительно необходимо обратить внимание на число новых сосудов с помощью ИГХ с VWF (Таблица 4).

Осуществление изобретения

Проводится биопсия эндометрия в среднюю стадию фазы пролиферации (на 7-11 дни 28-дневного менструального цикла) в спонтанном цикле с помощью одноразового аспирационного зонда -Rampipella. Полученный материал после гистологической проводки в автоматическом гистопроцессоре Leica ASP 30 заливают в парафин на станции Leica EG 1150 (Германия). ИГХ окрашивание с антителом к CD138 - CD138/syndecan-1 (В-А38) «Cell-Marque» (США), VEGF (Abcam) и VWF«Cell-Marque» (США) производят в иммуностейнере Ventana BenchMark ULTRA IHC/ISH (США) на депарафинизированных и дегидратированных срезах толщиной 4-6 мкм с использованием авидин - биотинового иммунопероксидазного метода. Производится подсчет числа позитивно - окрашенных плазматических клеток маркером CD138 на одно поле зрения при увеличении 400. Экспрессия маркера VEGF оценивается: полуколичественным методом - процент окрашенных клеток ко всем клеткам в железах эндометрия и поверхностном эпителии с расчетом на 1 поле зрения при увеличении 400; и качественным методом (слабая, умеренная и выраженная цитоплазматическая экспрессия). На срезах, окрашенных по Маллори, проводится оценка наличия фиброза в строме эндометрия. Трактовка результатов проводится путем сравнения со следующими параметрами в баллах:

• если число CD138+ клеток равно 0-1 позитивно-окрашенные клетки - ХЭ слабо выражен - 1 балл, если встречается от 2 до 3 позитивно-окрашенных клеток, то ХЭ умеренно выражен - 2 балла, если 4 и более позитивно-окрашенных клеток - ХЭ выражен - 3 балла;

• если фиброз есть - 1 балл, если нет - 0 баллов;

• если количество кровеносных сосудов с выраженной экспрессией маркера Фактора Виллебранда (VWF) составляет ≤5 - ХЭ выражен - 3 балла, если количество кровеносных сосудов с выраженной экспрессией маркера Фактора Виллебранда (VWF) составляет 6-8 - ХЭ умеренно выражен - 2 балла, если количество кровеносных сосудов с выраженной экспрессией маркера Фактора Виллебранда (VWF) составляет 9-10 - ХЭ слабо выражен - 1 балл;

• если экспрессия маркера VEGF, определяемая полуколичественным методом выявляется ≤30% - ХЭ выражен - 3 балла, если экспрессия маркера VEGF составляет 31-47% - ХЭ умеренно выражен - 2 балла, если экспрессия маркера VEGF составляет 48-94% - ХЭ слабо выражен - 1 балл;

• если экспрессия маркера VEGF, определяемая качественным методом проявляется слабо-выраженным окрашиванием (СВЭ) - 2 балла, если экспрессия маркера VEGF, определяемая качественным методом проявляется умеренно-выраженным окрашиванием (УВЭ) - 1 балл, если экспрессия маркера VEGF, определяемая качественным методом проявляется выраженным окрашиванием (ВЭ) - 0 баллов.

Таким образом, для определения выраженности ХЭ проводят подсчет полученных баллов CD138, Фактора Виллебранда (VWF), маркера VEGF и делаются следующие заключения:

• 10-12- выраженный ХЭ;

• 6-9 баллов - умеренно выраженный ХЭ;

• 2-5 баллов - слабо выраженный ХЭ;

• 0-1 баллов - ХЭ маловероятен.

Клинический пример 1.

Пациентка А., 25 лет, обратилась с жалобами на обильные и болезненные менструации со сгустками до 8 дней в течение года, из анамнеза - эпизод аномального маточного кровотечения 4 месяца назад. Хламидиоз, Гарднеррелез, Микоплазмоз - пролечен в 2018 г. Беременностей не было. Диагноз: Аномальное маточное кровотечение в анамнезе, нарушение менструального цикла. С целью дифференциальной диагностики был проведен ряд исследований -гормональные исследования крови - в пределах референсных значений, в генетическом исследовании крови на мутации системы гемостаза нарушений не выявлено, по данным УЗИ органов малого таза патологии в полости матки не выявлено. Произведена пайпель-биопсия эндометрия на 8 день 2 8-дневного менструального цикла.

На основании проведенного комплексного патологоанатомического исследования, включавшего гистологическую окраску гематоксилином и эозином, окраску по Маллори с последующим ИГХ исследованием, были получены следующие данные: CD138+=9 клеток - 3 балла; сосудистая плотность составила 4-3 балла, при полуколичественном методе маркер VEGF составил 21% - 3 балла, при качественном методе экспрессия маркера VEGF выявилось слабо-выраженное окрашивание маточных желез и поверхностного эпителия -2 балла. Выявлен фиброз эндометрия при окрашивании по Маллори - 1 балл.

Сумма баллов составила 12, что свидетельствует о выраженном ХЭ.

Клинический пример 2.

Пациентка А., 26 лет, обратилась с жалобами на обильные и болезненные менструации со сгустками до 11 дней в течение 6 месяцев, из анамнеза - эпизод аномального маточного кровотечения 2 месяца назад. Гарднеррелез, Микоплазмоз, Уреаплазмоз - пролечен в 2018 г, рецидивы в 2021 г,2022 г - пролечены. Беременностей не было. Диагноз: Аномальное маточное кровотечение в анамнезе, нарушение менструального цикла. С целью дифференциальной диагностики был проведен ряд исследований - гормональные исследования крови - в пределах референсных значений, в генетическом исследовании крови на мутации системы гемостаза нарушений не выявлено, по данным УЗИ органов малого таза патологии в полости матки не выявлено. Произведена пайпель-биопсия эндометрия на 8 день 28-дневного менструального цикла.

На основании проведенного комплексного патологоанатомического исследования, включавшего гистологическую окраску гематоксилином и эозином, окраску по Маллори с последующим ИГХ исследованием, были получены следующие данные: CD138+=3 клетки - 2 балла; сосудистая плотность составила 7-2 балла, при полуколичественном методе маркер VEGF составил 39% - 2 балла, при качественном методе экспрессия маркера VEGF выявилось умеренно-выраженное окрашивание маточных желез и поверхностного эпителия - 1 балл. Выявлен фиброз эндометрия при окрашивании по Маллори - 1 балл.

Сумма баллов составила 8, что свидетельствует о умеренновыраженном ХЭ.

Клинический пример 3.

Пациентка А., 22 лет, обратилась с жалобами на межменструальные кровяные выделения и длительные менструации до 13 дней в течение 4 месяцев, из анамнеза - эпизод аномального маточного кровотечения 1 месяц назад. Гарднеррелез, Уреаплазмоз -пролечен в 2020 г, рецидивы в 2021 г, 2022 г - пролечены. Беременностей не было. Диагноз: Аномальное маточное кровотечение в анамнезе, нарушение менструального цикла. С целью дифференциальной диагностики был проведен ряд исследований - гормональные исследования крови - в пределах референсных значений, в генетическом исследовании крови на мутации системы гемостаза нарушений не выявлено, по данным УЗИ органов малого таза патологии в полости матки не выявлено. Произведена пайпель-биопсия эндометрия на 8 день 28-дневного менструального цикла.

На основании проведенного комплексного патологоанатомического исследования, включавшего гистологическую окраску гематоксилином и эозином, окраску по Маллори с последующим ИГХ исследованием, были получены следующие данные: CD138+=1 клетка - 1 балл; сосудистая плотность составила 9 - 1 балл, при полуколичественном методе маркер VEGF составил 78% - 1 балл, при качественном методе экспрессия маркера VEGF выявилось умеренно-выраженное окрашивание маточных желез и поверхностного эпителия - 1 балл. Выявлен фиброз эндометрия при окрашивании по Маллори - 1 балл.

Сумма баллов составила 5, что свидетельствует о слабовыраженном ХЭ.

Клинический пример 4.

Пациентка М., 27 лет, обратилась с жалобами на посткоитальные кровотечения в течение года, ранее в анамнезе аномальное маточное кровотечение в 25 лет. Гинекологические заболевания: РВ-коагуляция 2018 г. Операции - ручное исследование матки во время родов 2017 г. С целью дифференциальной диагностики был проведен ряд исследований - гормональные исследования крови - в пределах референсных значений, в генетическом исследовании крови на мутации системы гемостаза нарушений не выявлено, по данным УЗИ органов малого таза патологии в полости матки не выявлено. Жидкостная цитология NILM. Произведена пайпель-биопсия эндометрия на 9 день 28-дневного менструального цикла. На основании проведенного комплексного патологоанатомического исследования, включавшего гистологическую окраску гематоксилином и эозином, окраску по Маллори, ИГХ исследование, были получены следующие данные: CD138+=0 клеток - 0 баллов; сосудистая плотность составила 11 - 0 баллов, при полуколичественном методе маркер VEGF составил 98% - 0 балл, при качественном методе экспрессии маркера VEGF выявилось выраженное окрашивание маточных желез и поверхностного эпителия - 0 балл. Выявлен фиброз эндометрия при окрашивании по Маллори -1 балл.

Сумма баллов составила 1, что свидетельствует о том, что ХЭ маловероятен.

Источники информации:

1. Толибова Г.Х., Траль Т.Г., Клещев М.А. и др. Эндометриальная дисфункция: алгоритм гистологического и иммуногистохимического исследования. Журн. акушерства и женских болезней.- 2015; 64 (4): 69-77.

2. Радзинский В.Е., Петров Ю.А., Полина М.Л. Хронический эндометрит: современные аспекты // Кубанский научный медицинский вестник. - 2017; No 24 (5). С. 69-74

3. Оразов М.Р., Михалева Л.М., Семенов П.А. Хронический эндометрит: патогенез, диагностика, лечение и его связь с бесплодием//Клиническая и экспериментальная морфология. - 2020; 9(2): 16-25. DOI: 10.31088/СЕМ2020.9.2.16-25.

4. Puente Е, Alonso L, Lagana AS, Ghezzi F, Casarin J, Carugno// J. Chronic endometritis: old problem, novel insights and future challenges. Int JFertil Steril. -2020; 13(4):250-6. DOI: 10.22074/ijfs.2020.5779.

5. Cherng Sh., Young J., Ma H. // The Journal of AmericanTScience. - 2008; Vol. 4 (4). - P. 7-9.

6. Kimura F, Takebayashi A, Ishida M, et al. Review: Chronic endometritis and its effect on reproduction// J Obstet Gynaecol Res. -2019, May; 45(5):951-960. doi: 10.1111/jog. 13937. Epub 2019 Mar 6.

7. Creus M., Ordi J. The effect of different hormone therapies on integrin expression and pinopode formation in the human endometrium: a controlled study //Hum. Reprod. - 2003; Vol. 18. - P. 683-693.

8. Haouzi D., Mahmoud K., Fourar M. Identification of new biomarkers of human endometrial receptivity in the natural cycle // Hum. Reprod. - 2009; Vol. 24, №1. - P. 198-205.

9. Толибова Г.Х., Траль Т.Г., Айламазян Э.К., Коган И.Ю. Молекулярные механизмы циклической трансформации эндометрия// Журн. акушерства и женских болезней. - 2019; 68 (1): 5-12.

10. Song D, Feng X, Zhang Q, et al. Prevalence and confounders of chronic endometritis in premenopausal women with abnormal bleeding or reproductive failure// Reprod Biomed Online-2018; 36:78-83. DOI: 10.1016/j.rbmo.2017.09.008.

11. Zargar M, Ghafourian M Nikbakht R, et al. Evaluating Chronic Endometritis in Women with Recurrent Implantation Failure and Recurrent Pregnancy Loss by Hysteroscopy and Immunohistochemistry// J Minim Invasive Gynecol. - 2020; 27(1): 116-121. DOI: 10.1016/j.jmig.2019.02.016.

12. Kitaya K, Matsubayashi H, Yamaguchi K, Nishiyama R, Takaya Y, Ishikawa T et al. Chronic endometritis: potential cause of infertility and obstetric and neonatal complications// Am J Reprod Immunol. - 2016; 75(1): 13-22. DOI: 10.111 l/aji.12438.

13. Wu D, Kimura F, Zheng L et al. Chronic endometritis modifies decidualization in human endometrial stromal cells// Reprod Biol Endocrinol - 2017; 15: 16.

14. Fan X, Li X, Li Y, Liao J, Chen H, Li Y, Lu GX, Lin G, Gong F. Endometrial CD138 count appears to be a negative prognostic indicator for patients who have experienced previous embryo transfer failure// Fertil Steril. - 2019 Dec;l 12(6):1103-1111. DOI: 10.1016/j.fertnstert.2019.08.006.

15. Xu Y, Mei J, Diao L, Li Y, Ding L. Chronic endometritis and reproductive failure: Role of syndecan-1// Am J Reprod Immunol. - 2020 Sep;84(3):el3255.DOI: 10.111 l/aji.13255. Epub 2020 Jun 26.

16. Серебренникова К.Г., Арутюнян H.A., Алехин А.И. Диагностика и клинические критерии хронического эндометрита// Гинекология. - 2018; 20 (6):53-59. DOI: 10.26442/20795696.2018.6.180070.

17. Uchida H, Maruyama T, Nishikawa-Uchida S, Miyazaki K, Masuda H, Yoshimura Y. Glycodelin in reproduction// Reprod Med Biol. - 2013 Mar; 14;12(3):79-84. DOI: 10.1007/sl2522-013-0144-2.

18. Старосветская H.A., Степанов A.A., Степанова И.И., Назимова СВ., Болтовская М.Н. Исследование роли альфа2-микроглобулина фертильности (гликоделина) в репродукции человека//Клиническая и экспериментальная морфология. - 2012; Т.1.-Ш.- С. 8-13.

19. Тамазян Г.В., Серова О.Ф., Лазарев А.П., Болтовская М.Н.,Милованов А.П., Седая Л.В., Шутикова Н.В. Оптимизация тактики ведения пациенток в программе экстракорпорального оплодотворения// Эффективная фармакотерапия.- 2014; №38.- С.18-23.

20. Mikhaleva L., Mikhalev S., Boltovskay M., Starosvetskaya N. Evalyation of cyclic glicodelin production in endometrium of patients with chronic endometritis /. //27th European Congress of Pathology, 5-9 September 2015, Sava Centar, Belgrad, Serbia, Virkhows Archiv, European Journal of Pathology. - 2015; Vol.467, Supplement 1. - P.134.

21. Савельева Г.М., Михалев С.А., Коноплянников А.Г., Михалева Л.М., Бабиченко И.И., Болтовская М.Н. Хронический эндометрит - показание для прегравидарной подготовки //Клиническая практика. - 2018; Т.9. - №2. - С.36-41.

22. Автандилов Г.Г., Морфометрия в патологии / Г.Г. Автандилов. - М.: «Медицина», 1973. - 248 с.

23. Автандилов Г.Г., Медицинская морфометрия: Руководство / Г.Г. Автандилов. - М.: Медицина, 1990. - 384 с.

24. Михалева Л.М., Болтовская М.Н., Михалев С.А., Бабиченко И.И., Вандышева Р. А., Клинико-морфологические аспекты эндометриальной дисфункции, обусловленной хроническимэндометритом// Архив патологии. - 2017; 6, с. 22-29 https://doi.org/l 0.17116/patol201779622-29

25. Praderio R. G. et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF) expression in histological endometritis in the bitch: An immunohistochemical study //Reproduction in Domestic Animals. - 2022. -T. 57. - №. 9.-C. 1088-1092.

26. Нефедова H.A., Харлова O.A., Данилова H.B.,Мальков П.Г., Гайфуллин Н.М. Маркеры ангиогенеза при опухолевом росте. Архив патологии.2016; 2: 55-62. DOI: 10.17116/patol201678255-62

27. Сухих Г.Т., Шуршалина А.В. Хронический эндометрит: руководство. - М.: ГЭОТАР - Медиа. - 2013. - 64 с.

28. Binder N.K., Evans J., Gardner D.K., Salamonsen L.A., Hannan N.J. Endometrial signals improve embryo outcome: functional role of vascular endothelial growth factor isoforms on embryo development and implantation in mice //Human Reproduction and Embryology. 2014. Vol.29. №10. P. 2278-2286.

29. Banerjee P., Ghosh S., Dutta M., Subramani E., Khalpada J., Roychoudhury S., Chakravarty В., Chaudhury K. Identification of key contributory factors responsible for vascular dysfunction in idiopathic recurrent spontaneous miscarriage //PLoS One. 2013. Vol. 8. №11: e80940. - Doi: 10.1371/journal.pone.0080940.

30. Таболова B.K., Корнеева И.Е., Донников A.E., Бурменская О.В., Маслова М.А., Смольникова В.Ю. Профиль локальной экспрессии генов ростовых факторов и цитокинов в эндометрии периода «имплантационного окна» при хроническом эндометрите //Акушерство и гинекология. - 2014. - №12.

31. Рашидов Т.Н. Генетические детерминанты привычного невынашивания беременности: факторы ангиогенеза, гемостаза, ремоделирования экстрацеллюлярного матрикса в эндометрии ссиндромом привычной потери беременности I триместра: автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. -М. - 2012. - С. 18-19.

32. Amirchaghmaghi Е., Rezaei A., Moini A., Roghaei М.А., Hafezi М., Aflatoonian R. Gene expression analysis of VEGF and its receptors and assessment of its serum level in unexplained recurrent spontaneous abortion. //Cell. J. 2015. №16. Vol. 4. P. 538-545.

Изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии, репродуктологии, акушерству и гинекологии, и может быть использовано для определения степени выраженности хронического эндометрита (ХЭ). Для этого выполняют забор биопсии эндометрия на 7-11 день менструального цикла. Получают срезы для гистологического исследования, окрашивают гематоксилином и эозином с последующей гистохимической окраской по Маллори для диагностики фиброза стромы и иммуногистохимической реакцией с моноклональными антителами к CD138, Фактору Виллебранда, VWF и VEGF. Степень выраженности хронического эндометрита определяют по наличию фиброза в строме функционального слоя эндометрия и морфометрических данных: подсчета числа окрашенных плазматических клеток CD138, оценки экспрессии VEGF, определяемой качественным - слабая, умеренная и выраженная цитоплазматическая экспрессия - и полуколичественным методами - процент окрашенных клеток ко всем клеткам в железах эндометрия и поверхностном эпителии с расчетом на 1 поле зрения при увеличении 400, подсчета количества на 1 поле зрения кровеносных сосудов с выраженной экспрессией маркера Фактора Виллебранда, VWF. Затем оценивают полученные данные в баллах. Полученные баллы суммируют. При сумме 10-12 баллов определяют наличие хронического эндометрита выраженной степени. При сумме 6-9 баллов определяют наличие хронического эндометрита умеренно выраженной степени, при сумме 2-5 баллов определяют наличие хронического эндометрита слабой степени выраженности, при сумме 0-1 балл определяют, что хронический эндометрит маловероятен. Изобретение обеспечивает повышение чувствительности верификации степени выраженности ХЭ и оценки кровоснабжения функционального слоя у женщин для прогнозирования тактики лечения ХЭ и положительного исхода беременности у пациенток с аномальным маточным кровотечением в анамнезе и нарушением менструального цикла, обусловленными ХЭ. 4 пр., 4 табл.

Способ определения разной степени выраженности хронического эндометрита, включающий забор биопсии эндометрия на 7-11 день менструального цикла, получение срезов для гистологического исследования с окраской гематоксилином и эозином с последующей гистохимической окраской по Маллори для диагностики фиброза стромы и иммуногистохимической реакцией с моноклональными антителами к CD138, Фактору Виллебранда, VWF и VEGF, отличающийся тем, что степень выраженности хронического эндометрита определяют на основе наличия фиброза в строме функционального слоя эндометрия и морфометрических данных: подсчета числа окрашенных плазматических клеток CD138, оценки экспрессии VEGF, определяемой качественным - слабая, умеренная и выраженная цитоплазматическая экспрессия - и полуколичественным методами - процент окрашенных клеток ко всем клеткам в железах эндометрия и поверхностном эпителии с расчетом на 1 поле зрения при увеличении 400; подсчета количества на 1 поле зрения кровеносных сосудов с выраженной экспрессией маркера Фактора Виллебранда, VWF; и оценивают полученные данные в баллах: наличие фиброза – 1 балл, его отсутствие – 0 баллов; число CD138 положительно окрашенных клеток 0-1 – 1 балл, 2-3 клетки – 2 балла, 4 клетки и более – 3 балла; проявление экспрессии маркера VEGF, определяемой качественным методом, слабо выраженным окрашиванием – 2 балла, умеренно выраженным окрашиванием – 1 балл, выраженным окрашиванием – 0 баллов; проявление экспрессии маркера VEGF, определяемой полуколичественным методом, меньше или равное 30% - 3 балла, 31-47% - 2 балла, 48-94% - 1 балл; выявление кровеносных сосудов с выраженной экспрессией маркера Фактора Виллебранда, VWF, меньше или равное 5 на 1 поле зрения - 3 балла, 6-8 на 1 поле зрения – 2 балла, 9-10 на 1 поле зрения – 1 балл; проводят подсчет полученных баллов и при сумме 10-12 баллов определяют наличие хронического эндометрита выраженной степени, при сумме 6-9 баллов определяют наличие хронического эндометрита умеренно выраженной степени, при сумме 2-5 баллов определяют наличие хронического эндометрита слабой степени выраженности, при сумме 0-1 балл определяют, что хронический эндометрит маловероятен.