СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ИММУННОГО СТАТУСА ЭНДОМЕТРИЯ У ПАЦИЕНТОК С ПОВТОРНЫМИ ПОТЕРЯМИ БЕРЕМЕННОСТИ ПОСЛЕ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ Российский патент 2022 года по МПК A61B5/00 G01N33/50 

Изобретение относится к области медицины, а именно к патологической анатомии и репродуктологии, может быть использовано для диагностики иммунного статуса эндометрия у пациенток с повторными потерями беременности после вспомогательных репродуктивных технологий.

Общепризнанным и единственным способом преодоления, как женского, так и мужского бесплодия, являются вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ). Основными компонентами эффективных протоколов ВРТ являются морфологически полноценный эмбрион, оптимальные структурно-функциональные характеристики эндометрия и адекватная прегравидарная и посттрансферная гормональная терапия.

На протяжении последних лет были достигнуты значимые успехи в эмбриологии с проведением предимплантационной генетической диагностики для снижения частоты переноса генетически неполноценных эмбрионов, создания бластоидов и эмбриоидов из стволовых клеток для изучения процессов развития и имплантации, при этом изучение эндометрия, как главного компонента наступления и развития беременности происходит недостаточными темпами [1, 2].

Эндометрий продолжает оставаться недооцененным звеном репродуктивных неудач маточного генеза, и, к сожалению, обеспечивает неэффективность протоколов ВРТ и высокий уровень выкидышей на ранних сроках [3, 4]. Полноценность циклической трансформации эндометрия и формирования полноценных имплантационных механизмов основана на балансе иммунологического, микробиологического и биохимического компонентов для создания микроокружения бластоцисты в зоне имплантации [5, 6].

Иммунологический профиль эндометрия один из значимых компонентов прегравидарного и гравидарного эндометрия. Баланс иммунологических компонентов эндометрия является основополагающим фактором имплантационного потенциала эндометрия и иммунной толерантности на границе матери и плода. PIBF - прогестерон индуцированный блокирующий фактор (PIBF - progesterone-induced-blocking factor), индуцируемый прогестероном под влиянием активированных лимфоцитов является одним из ведущих звеньев оптимальной секреторной и последующей имплантационной трансформации эндометрия, доказанный in vivo и in vitro [7].

PIBF обеспечивает регуляторные механизмы инвазии трофобласта, блокирует синтез простогландинов и перфорина в клетках эндометрия и инактивирует токсическое влияние NK-клеток на развитие эмбриона, а также служит предиктором ранних репродуктивных потерь по уровню маркера в моче и крови беременных [8, 9].

Несмотря на актуальность проблемы, в настоящее время роли PIBF в циклической трансформации эндометрия и его имплантационному потенциалу иммунологического генеза уделяется недостаточное внимание.

Среди известных в научно-медицинской и патентной литературе существует множество способов диагностики рецептивности эндометрия, но отсутствуют исследования основного иммунологического фактора (хемокина) - прогестерон-индуцированного блокирующего фактора (PIBF), оказывающего влияние на микроокружение эмбриона в месте имплантации. PIBF помимо непосредственного иммунологического баланса оказывает свое влияние и на циклическую трансформацию эндометрия. Соответственно обеспечивая не только иммунный контроль, но и подготовку желез и стромы эндометрия для имплантации путем обеспечения оптимальной рецептивности, то есть оказывает комплексное влияние на эндометрий.

Известен способ оценки рецептивности эндометрия у женщин с первичным бесплодием и миомой матки (патент RU2732430C1, заявка 2020112723, 30.03.2020), который охватывает изучение только маркеров VEGFr3 и PTEN с определением количества H-score баллов в строме эндометрия и не учитывает состояние железистого компонента эндометрия, как необходимого для полноценной секреторной трансформации стромы. Является специфичным только для пациенток, имеющих миому матки и только первичное бесплодие. Оценивает только сосудистое русло и апоптоз, патология которых, зачастую является вторичной и не позволяет оценить имплантационную восприимчивость.

Известен способ прогнозирования успеха имплантации в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции (патент RU2670450C1, заявка 2017145663 от 25.12.2017 г), который выявляет уровень экспрессии прогестерон-индуцированного блокирующего фактора (PIBF) в клетках мононуклеарной фракции периферической крови пациенток с бесплодием и определяет уровень мРНК.

Недостатком данного способа является оценка PIBF в периферической крови биохимическим методом, что не служит отражением его экспрессии в ткани эндометрия.

Известен способ оценки рецептивности эндометрия в период "имплантационного окна" (патент РФ 2651762С1, 23.04.2018). В данном изобретении оценены многие показатели рецептивности эндометрия на 20-23 день менструального цикла с использованием метода иммуногистохимии и набором антител при оценке состояния стромы (ERα, PR, bcl 2, CD95, Ki67) и отдельно в железах (р53, LIF). В результате полученных данных исследования авторы рассчитали прогноз рецептивности эндометрия по формуле: d=-1,389x1+0,022x2-0,044x3-0,019x4+0,041x5+0,006x6+0,015x7-3,248, где x1 - индекс ER/PR в строме эндометрия (баллы H-score для определения ядерной экспрессии ER и PR), х2 - р53 в железах эндометрия (% окрашенных ядер в поле зрения), х3 - bcl 2 в строме эндометрия (% окрашенных ядер в поле зрения), х4 - CD95+ в строме эндометрия (% окрашенных клеток), х5 - Ki67 в строме эндометрия (% окрашенных ядер в поле зрения), х6 - LIF-R в железах эндометрия (баллы H-score), х7 - LIF в железах эндометрия (баллы H-score). При значениях d > 0 эндометрий характеризовали как рецептивный, при d ≤ 0 эндометрий характеризуется как нерецептивный. Этот способ выбран в качестве ближайшего аналога.

Недостатком ближайшего аналога является разобщенность исследования маркеров в железах и строме эндометрия с применением большого набора антител, что не позволяет выявить единую картину состояния основных структурных компонентов эндометрия и данная методика достаточно сложна в восприятии и затратна для практических врачей. Кроме того, в изобретении не учитывается гистологическая характеристика биопатов эндометрия.

Техническим результатом изобретения является снижение частоты выкидышей ранних сроков, выявление единой картины состояния основных структурных компонентов эндометрия в железах и строме, определение референсных значений экспрессии PIBF в эндометрии здоровых пациенток и у пациенток с бесплодием, планирующих повторные программы ВРТ; простота применения в практической медицине; возможность использования для широкого круга пациенток с различной гинекологической патологией, приводящей к бесплодию и невынашиванию беременности при ВРТ; повышение эффективности диагностики за счет определения иммунного статуса эндометрия путем иммунногистохимического исследования биоптатов эндометрия при подтвержденном гистологическом исследовании у пациенток с повторными потерями беременности после ВРТ.

Указанный технический результат достигается в способе диагностики иммунного статуса эндометрия у пациенток с повторными потерями беременности после ВРТ, включающем исследование структурных компонентов эндометрия, в котором в биоптатах эндометрия средней стадии фазы секреции определяют уровень экспрессии прогестерон-индуцированного блокирующего фактора (PIBF) путем иммуногистохимического исследования с использованием авидин-биотинового комплекса и при PIBF ≥ 63% диагностируют иммунный статус эндометрия в норме, при 50 < PIBF < 62% - умеренный, при PIBF ≤ 49% -низкий.

Способ иллюстрируется фиг. 1-6, где:

на фиг. 1 - эндометрий средней стадии фазы секреции у фертильных женщин. Г-Э, х200.

на фиг. 2 - нарушение секреторной трансформации эндометрия у женщин с повторными репродуктивными потерями после программ ВРТ: слабо выраженная секреторная трансформация эндометрия. Г-Э х400;

на фиг. 3 - нарушение секреторной трансформации эндометрия у женщин с повторными репродуктивными потерями после программ ВРТ: слабо выраженная средняя стадия фазы секреции. Г-Э х200;

на фиг. 4 - экспрессия прогестерон индуцированного блокирующего фактора (PIBF) в эндометрии фертильных женщин. ИГХ х400;

на фиг. 5, 6 - экспрессия прогестерон индуцированного блокирующего фактора (PIBF) в эндометрии женщин с повторными репродуктивными потерями после программ ВРТ; фиг. 5 - слабо выраженная секреторная трансформация эндометрия. ИГХ х400; фиг. 6 - слабо выраженная средняя стадия фазы секреции. ИГХ х400.

Способ основан на исследовании 20 биоптатов эндометрия от фертильных пациенток и 28 биоптатов эндометрия от пациенток с бесплодием и репродуктивными потерями после программ ВРТ, взятых на 20-21 день менструального цикла, в том числе моделированного цикла, при длительности цикла 28 дней.

Данные гистологического исследования биоптатов эндометрия от фертильных пациенток (n=20) показали, что эндометрий соответствует средней стадии фазы секреции («окну имплантации»). Железы эндометрия имели извитые черты с высоким призматическим эпителием, неровным апикальным краем с наличием апокриновой секреции. Ядра желез располагались на базальной мембране, имели округлую форму, светло базофильное окрашивание. Строма эндометрия с умеренным диффузным отеком, фибробласты стромы с четко дифференцируемым ободком цитоплазмы, наличием светло базофильного округлого или овального ядра. Клубки спиральных артерий достигали люминального эпителия, имели хорошо выраженную интиму (фиг. 1).

В биоптатах эндометрия от пациенток с повторными репродуктивными потерями после программ ВРТ (n=28) при гистологическом исследовании отмечалось нарушение секреторной трансформации эндометрия, представленной слабо выраженной секреторной трансформацией в 14 случаях и слабо выраженной средней стадией фазы секреции в 14 случаях. В эндометрии со слабо выраженной секреторной трансформацией выявлялись железы со слабо извитыми очертаниями, наличием неравномерно сформированных полиморфных субнуклеарных вакуолей. Ядра желез большей частью гиперхромные, преимущественно овоидной формы с промежуточным или парабазальным расположением. В строме слабо выраженный отек, фибробласты стромы с пикнотическими ядрами, слабо выраженным ободком цитоплазмы, наличием неравномерно выраженной смешанноклеточной инфильтрации. Клубки спиральных артерий единичные с парабазальной локализацией. Под люминальным эпителием капилляры синусоидального типа (фиг. 2).

Гистологическое исследование биоптатов эндометрия со слабо выраженной средней стадией фазы секреции показало, что железы такого эндометрия представлены неравномерно выраженной извитостью, низким эпителием гландулоциов и слабовыраженными признаками апокриновой секреции. Ядра желез слабо просветлены, в отдельных железах определяются мелкие субнуклеарные вакуоли с оттесненным к центральной части преимущественно овоидных гиперхромным ядром. Строма с очаговым, большей частью слабым отеком. Фибробласты с неравномерно выраженным ободком цитоплазмы, преимущественно гиперхромными ядрами. Клубки спиральных артерий мелкие, неравномерно распределены по объему биоптата, не достигают люминального эпителия (фиг. 3).

Результаты иммуногистохимического исследования (ИГХ) прогестерон-индуцированного блокирующего фактора (PIBF) выявили наличие экспрессии маркера в строме и железах эндометрия, как у фертильных пациенток, так и у пациенток с репродуктивными потерями после программ ВРТ.

Экспрессия PIBF в эндометрии фертильных женщин в среднюю стадию фазы секреции (фиг. 4) была распределена равномерно и имела достоверно высокие значения по сравнению с биоптатами эндометрия от пациенток с бесплодием - со слабо выраженной секреторной трансформацией и слабо выраженной средней стадией фазы секреции. Данные представлены в табл. 1.

Результаты, представленные в табл. 1, демонстрируют, что в эндометрии со слабо выраженной секреторной трансформацией эндометрия (фиг. 6) значение экспрессии PIBF достоверно ниже по сравнению с эндометрием со слабо выраженной средней стадией фазы секреции (фиг. 5).

Таким образом, критериями диагностики иммунного статуса эндометрия у пациенток с повторными потерями беременности после ВРТ были определены следующие значения PIBF:

иммунный статус эндометрия в норме - PIBF ≥ 63%

иммунный статус эндометрия умеренный - PIBF от 50 до 62%

иммунный статус эндометрия низкий - PIBF ≤ 49%.

Способ осуществляют следующим образом.

Биоптаты эндометрия средней стадии фазы секреции подвергают гистологическому исследованию с первоначальной 24-часовой фиксацией в растворе 10% формальдегида. Затем проводят гистологическую проводку биоптатов в гистологическом процессоре Histo-Tek VP1 для вакуумной инфильтрации, полученный материал заливают в парафин. Материал подвергают микротомированию с целью получения срезов тканей толщиной 3-4 мкм и последующей гистологической окраской гематоксилином и эозином. Готовые микропрепараты исследуют при помощи светового микроскопа OlympusCX31 (Япония) при увеличении ×100, ×200, ×400.

Иммуногистохимическое исследование проводят в ручном режиме на срезах толщиной 4-6 мкм. Для выявления иммуногистохимической реакции используют непрямой метод с использованием авидин-биотинового комплекса и последующей визуализацией реакции применяют abcam Mouse and Rabbit Specific HRP Plus (ABC) Detection IHC Kit (RTU)[ab93697], (Abcam, Великобритания). Далее используют первичные поликлональные кроличьи антитела к рецептору Anti-PIBF производства Abcam (Великобритания).

Количественную оценку результатов иммуногистохимической реакции проводят на микроскопе Olympus ВХ46 с помощью программного обеспечения "CellSens 47 Entry" Nikon Eclipse E400. Из фотосъемки исключают поля зрения, содержащие дефекты ткани, дефекты окрашивания и артефакты. Фотосъемку производят на увеличении 400× (окуляр 10×, объектив 40×) в формате изображения JPEG (normal). Долю занимаемой экспрессии изучаемого маркера рассчитывают с помощью программы ВидеоТест-Морфология 5.0 (ВИДЕОТЕСТ, Россия).

В каждом срезе в 10 полях зрения оценивают площадь экспрессии PIBF, которую вычисляют как отношение площади иммуннопозитивных клеток к общей площади препарата:

Способ подтверждается следующими клиническими примерами.

Пример 1. Пациентка М., 36 лет с жалобами на отсутствие наступления беременности в течение 4 лет регулярной половой жизни без контрацепции. Соматически не отягощена. Супруг обследован, мужской фактор бесплодия исключен. Из гинекологического анамнеза менархе с 12 лет, менструации по 5-7 дней через 28 дней, умеренно болезненные. Половая жизнь с 18 лет. В анамнезе первичное бесплодие неуточненного генеза с 28 лет. После протокола ЭКО в стимулированном цикле 1 самопроизвольный выкидыш на раннем сроке с выскабливанием полости матки и последующим острым эндометритом. Реабилитационную терапию получала. С целью преодоления бесплодия было проведено ЭКО и криоконсервация остальных полученных эмбрионов. После 3 неудачных попыток в криоциклах с переносом эмбрионов высокого качества (4АВ, 4АА) проведена гистероскопия и пайпель-биопсия эндометрия на 21 день цикла для комплексного морфологического исследования. Гистологическое исследование выявило слабо секреторную трансформацию эндометрия. Иммуногистохимическим исследованием верифицирован выраженный хронический эндометрит. Экспрессия рецепторов эстрогена и прогестерона в железах соответствовала морфологической картине. Экспрессия рецепторов эстрогена и прогестерона в стромальном компоненте была снижена. Исследование на PIBF диагностировало снижение общей площади экспрессии в железах и стромальном компоненте эндометрия. Экспрессия составила 44,5% - низкий иммунный статус эндометрия.

Пример 2. Пациентка А., 34 лет с жалобами на отсутствие наступления беременности в течение 5 лет регулярной половой жизни без контрацепции. Супруг обследован, мужской фактор бесплодия исключен. Менархе в 14 лет. Половая жизнь с 19 лет. Менструальный цикл регулярный, через 27-28 дней по 4-5 дней. Менструации безболезненные. Соматическая патология: хронический гастродуоденит с редкими эпизодами обострения (1 раз в год), хронический калькулезный холецистит в стадии ремиссии. Гинекологические заболевания: острый двусторонний сальпингоофрит в 20 лет, госпитализация в гинекологическое отделение с последующим лечением. В дальнейшем эпизодов сальпингоофорита и другой гинекологической патологии со слов пациентки не было. С целью преодоления бесплодия был проведен цикл ЭКО с собственным эмбрионом высокого качества (5АВ), наступила беременность, которая закончилась неразвивающейся беременностью на 7-8 неделе гестации. При следующей попытке протокола ЭКО беременность также наступила, но прекратила свое развитие на 6-7 неделе. В обоих случаях проведено опорожнение полости матки медикаментозным путем. Далее проведена пайпель биопсия эндометрия на 22 день цикла через 2 месяца после неразвивающейся беременности. Результаты гистологического исследования биоптата - эндометрий средней стадии фазы секреции. Результаты иммуногистохимического исследования диагностировали умеренно выраженный хронический эндометрит. Экспрессия рецепторов эстрогена и прогестерона в железах и стромальном компоненте соответствовала морфологической картине. Экспрессия PIBF составила 58% - умеренный иммунный статус эндометрия. Проведена терапия хронического эндометрита в соответствии с клиническими рекомендациями. По окончании лечения проведена прегравидарная подготовка гестагенами. Проведен протокол ЭКО с переносом эмбриона высокого качества (4АВ) в криоцикле, наступила клинически подтвержденная прогрессирующая беременность.

Пример 3. Пациентка 28 лет обратилась для планирования беременности. Гинекологические данные: менархе с 13 лет, через 27 дней по 4-5 дней, безболезненные. Из анамнеза эктопия шейки матки в 21 год, пролечена, искусственный аборт на раннем сроке медикаментозным методом в 22 года. В браке с 25 лет, способ предохранения барьерный. Проведена пайпель-биопсия эндометрия на 21 день менструального цикла. По результатам гистологического исследования диагностирована средняя стадия фазы секреции. Площадь экспрессии PIBF при иммуногистохимическом исследовании составила 72% - иммунный статус эндометрия в норме. После прегравидарной подготовки через 3 наступила планированная спонтанная прогрессирующая беременность.

Полученные результаты могут быть применены в рутинной патологоанатомической практике для установления патологии секреторной трансформации эндометрия и изменения его иммунологического профиля с использованием референсных значений.

Заявляемый способ позволяет снизить частоту выкидышей ранних сроков, диагностировать иммуннологические нарушения эндометрия в период предполагаемого окна имплантации, прогнозировать репродуктивные потери после программ ВРТ, выявить единую картину состояния основных структурных компонентов эндометрия в железах и строме, определение референсных значений экспрессии PIBF в эндометрии здоровых пациенток и у пациенток с бесплодием, планирующих повторные программы ВРТ; простота применения в практической медицине; возможность использования для широкого круга пациенток с различной гинекологической патологией, приводящей к бесплодию и невынашиванию беременности при ВРТ; повышение эффективности диагностики при подтвержденном гистологическом исследовании биоптатов эндометрия.

Источники информации:

1. Yanagida A, Spindlow D, Nichols J. et al. Naive stem cell blastocyst model captures human embryo lineage segregation. Cell Stem Cell. 2021;28(6):1016-1022.

2. Fu J, Warmflash A, Lutolf MP. Stem-cell-based embryo models for fundamental research and translation. Nat Mater. 2021;20(2):132-144. DOI: 10.1038/s41563-020-00829-9.

3. Salker M, Teklenburg G, Molokhia M, et al. Natural selection of human embryos: Impaired decidualization of endometrium disables embryo-maternal interactions and causes recurrent pregnancy loss. PLoS One. 2010;5(4):e10287.

4. Малышкина А.И., Батрак H.B., Перетятко Л.П. и др. Клинико-лабораторные и морфологические различия неразвивающейся беременности и самопроизвольного аборта в ранние сроки беременности. Российский вестник акушера-гинеколога. 2021;21(1):31-37.

5. Богданова И.М., Артемьева К.А., Болтовская М.Н. Развитие и функция регуляторных В-клеток и их роль в поддержании беременности. Иммунология. 2021;42(4):415-425.

6. Shah NM, Lai PF, Imami N. et al. Progesterone-related immune modulation of pregnancy and labor. Front. Endocrinol. 2019;10:198.

7. Szekeres-Bartho J, Šućurović S, Mulac-Jeričević B. The Role of Extracellular Vesicles and PIBF in Embryo-Maternal Immune-Interactions. Front Immunol. 2018;9:2890.

8. Miko E, Halasz M, Jericevic-Mulac B. Et al. Progesterone-induced blocking factor (PIBF) and trophoblast invasiveness. J Reprod Immunol. 2011;90(1):50-57.

9. Hudic I, Szekeres-Bartho J, Vrtacnik EB et al. Progesterone induced blocking factor (PIBF) taken in early pregnancy predicts the pregnancy outcome in women undergoing in vitro fertilization procedure. J Reprod Immunol. 2020; 140:103150.

Изобретение относится к области медицины, а именно к патологической анатомии и репродуктологии, может быть использовано для диагностики иммунного статуса эндометрия у пациенток с повторными потерями беременности после вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). В биоптатах эндометрия средней стадии фазы секреции определяют уровень экспрессии прогестерон-индуцированного блокирующего фактора (PIBF) путем иммуногистохимического исследования с использованием авидин-биотинового комплекса. При значениях PIBF ≥ 63% диагностируют иммунный статус эндометрия в норме, при 50 < PIBF < 62% - умеренный, при PIBF ≤ 49% - низкий. Способ снижает частоту выкидышей ранних сроков, диагностирует иммуннологические нарушения эндометрия в период предполагаемого окна имплантации, позволяет прогнозировать репродуктивные потери после программ ВРТ, выявить единую картину состояния основных структурных компонентов эндометрия в железах и строме; удобен для применения в практической медицине; имеет гистологическое подтверждение, может быть использован для пациенток с различной гинекологической патологией, приводящей к бесплодию и невынашиванию беременности при ВРТ. 3 пр., 1 табл., 6 ил.

Способ диагностики иммунного статуса эндометрия у пациенток с повторными потерями беременности после вспомогательных репродуктивных технологий, включающий исследование структурных компонентов эндометрия, отличающийся тем, что в биоптатах эндометрия средней стадии фазы секреции определяют уровень экспрессии прогестерон-индуцированного блокирующего фактора (PIBF) путем иммуногистохимического исследования с использованием авидин-биотинового комплекса и при PIBF ≥ 63% диагностируют иммунный статус эндометрия в норме, при 50 < PIBF < 62% - умеренный, при PIBF ≤ 49% - низкий.