СПОСОБ СКРИНИНГА АНТИМИКРОБНЫХ СРЕДСТВ Российский патент 2020 года по МПК C12Q1/02 C12N1/20 A61L9/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу скрининга антимикробных средств для борьбы с вырабатывающими запах микроорганизмами в системе кондиционирования воздуха и способу устранения неприятных запахов в системе кондиционирования воздуха.

Предыдущий уровень техники

Чистый воздух признан важным для человеческого здоровья и хорошего самочувствия, и воздух, включающий неприятные запахи или загрязненный воздух, является главной причиной, которая мешает приятной окружающей среде. Например, качество неудовлетворительного воздуха в помещении в закрытых условиях вызвано следующими двумя важными факторами: одним является загрязнение воздуха в помещении, которое создает непосредственно сам материал (здание, транспортное средство и т.д.), образующий замкнутую окружающую среду (здание, транспортное средство и т.д.), и другим фактором является запах, который вызван человеческой активностью или веществом, поступающим снаружи.

Системы кондиционирования воздуха представляют собой системы, которые снижают температуру внутри помещения и оптимизируют внутреннюю среду, для кондиционирования, включая улучшение температуры, влажности, потока воздуха и чистоты воздуха в зданиях, транспортных средствах, поездах, кораблях, воздушных судах и т.п. С улучшением уровня жизни эти системы кондиционирования воздуха становятся более популярными. Однако, несмотря на то, что распространенность систем кондиционирования воздуха привнесла большое развитие основных функций, многие экологические проблемы улучшения качества воздуха в помещении остаются нерешенными.

Несмотря на то, что известно, что причиной запаха кондиционеров в системах кондиционирования воздуха являются продукты метаболизма грибков и бактерий, отсутствует точная информация касательно типов грибков и бактерий и количества продуктов метаболизма, выделенных соответствующими микроорганизмами.

Благодаря конструкции системы кондиционирования воздуха весь воздух, проходя через вентилятор, пропускается через ядро испарителя (eva core). Когда между охлаждающим веществом и воздухом осуществляется теплообмен, на поверхности ядра испарителя вследствие разницы температур конденсируется водный конденсат. Непрерывная конденсация водного конденсата предоставляет благоприятную среду для распространения грибков и бактерий. Когда грибки и бактерии размножаются в ядре испарителя, подвергающемся воздействию наружного воздуха, из продуктов метаболизма бактерий, проникающих на поверхность ядра испарителя, выделяются летучие органические соединения (mVOC) микроорганизмов. Когда воздух, проходящий через ядро испарителя, выдувается в комнату, комната может подвергаться воздействию запаха грибков и бактерий после использования в течение длительного периода времени вследствие летучих органических соединений, вырабатываемых микроорганизмами.

Поскольку система кондиционирования воздуха используется в течение длительного периода времени, поверхность ядра испарителя, из которого испускаются запахи, покрывается биопленкой. Биопленки состоят из бактерий, скоплений клеток и EPS. EPS содержит множество элементов, включая белки, полисахариды, полиуроновую кислоту, нуклеиновые кислоты, липиды и тому подобное. На поверхности ядра испарителя множество бактерий грибков размножаются, используя биопленки в качестве питательных веществ, чтобы выделить органические вещества (mVOC) в качестве продуктов метаболизма микроорганизмов. В это время из органических соединений (mVOC) исходит запах, известный как прогорклый среди множества факторов неприятных запахов кондиционеров.

Хотя на рынке имеется множество типов отдушек для устранения неприятных запахов, такие отдушки не могут основательно вывести грибки и бактерии, растущие на ядре испарителя, и служат только для того, чтобы временно ослабить неприятные запахи. На данный момент коммерчески доступные антимикробные средства продаются только потому, что они обладают антибактериальной активностью по отношению к общим патогенам, даже если их не разработали для целевых конкретных грибков или бактерий.

Соответственно, имеется срочная необходимость в разработке антимикробных средств, которые способны создавать приятную воздушную среду внутри помещения, и технологий, которые способны устранять неприятные запахи, используя антибактериальные средства, посредством точной идентификации видов грибков и бактерий, растущих на ядре испарителя, и конкретно блокирования или предотвращения распространения грибков и бактерий.

Описание выше предшествующего уровня техники предназначено только для улучшения понимания предшествующего уровня настоящего раскрытия и не должно истолковываться, как признание того, что вышеописанные технологии известны специалистам в области техники, к которой относится настоящее раскрытие.

Раскрытие

Технические Задачи

Авторы настоящего изобретения пытались найти способы эффективной борьбы с выделяющими запах микроорганизмами, используя микроорганизмы, не выделяющие запах. В результате они успешно выделили четыре вида микроорганизмов, которые не вырабатывают запахи в системе кондиционирования воздуха, и выполнили настоящее раскрытие, основываясь на данных, что при образовании биопленки с этими микроорганизмами или их комбинацией можно предотвратить рост микроорганизмов, выделяющих неприятный запах, и в результате этого можно предотвратить образование неприятного запаха.

Следовательно, настоящее раскрытие было сделано с учетом вышеуказанных задач, и это является одной целью настоящего раскрытия для предоставления способа скрининга антимикробных средств против по меньшей мере одного организма, вызывающего неприятный запах в системе кондиционирования воздуха, в которой микроорганизм выбирают из группы, состоящей из Pelomonas puraquae, Spirosoma radiotolerans, Fibrella aestuarina, Chryseobacterium geocarposphaerae, Spirosoma linguale и Geobacillus toebii.

Другая цель настоящего раскрытия состоит в предоставлении вызывающих запах микроорганизмов в системе кондиционирования воздуха.

Еще одна цель настоящего раскрытия состоит в предоставлении способа подавления роста вызывающих запах микроорганизмов в системе кондиционирования воздуха, включая нанесение или распыление антимикробных средств на систему кондиционирования воздуха.

Еще одна цель настоящего раскрытия состоит в предоставлении способа устранения неприятных запахов в системе кондиционирования воздуха, включая выделение или устранение вызывающих запах микроорганизмов из системы кондиционирования воздуха.

Еще одна цель настоящего раскрытия состоит в предоставлении способа устранения неприятных запахов в системе кондиционирования воздуха, включая подавление роста вызывающих запах микроорганизмов в системе кондиционирования воздуха.

Другие особенности и аспекты настоящего раскрытия будут очевидны из следующего подробного описания, фигур и формулы изобретения.

Техническое решение

В одном аспекте настоящее раскрытие предоставляет способ скрининга антимикробных средств для уменьшения неприятных запахов в системе кондиционирования воздуха, включая следующие стадии:

конкретно, способ представляет собой способ скрининга антимикробных средств в системе кондиционирования воздуха для устранения запахов, вырабатываемых по меньшей мере одним микроорганизмом, выбираемым из группы, состоящей из Pelomonas puraquae, Spirosoma radiotolerans, Fibrella aestuarina, Chryseobacterium geocarposphaerae, Spirosoma linguale и Geobacillus toebii,

(a) получение микроорганизма или раствора его культуры;

(b) введение микроорганизм или раствора его культуры в контакт с образцом;

(c) измерение подавления роста микроорганизма; и

(d) признание образца, обладающим антибактериальной активностью для уменьшения неприятных запахов в системе кондиционирования воздуха при подавлении роста микроорганизма.

Авторы настоящего изобретения предприняли попытки идентифицировать микроорганизмы, вызывающие неприятные запахи, и нашли способы, способные эффективно бороться с микроорганизмами. В результате они успешно выделили шесть видов микроорганизмов, которые создают и выращивают биопленку в системе кондиционирования воздуха, и обнаружили, что неприятные запахи, вырабатываемые системой кондиционирования воздуха, можно в значительной степени предотвратить за счет борьбы с этими микроорганизмами.

В рамках изобретения термин «система кондиционирования воздуха» в целом относится к системе, которая может поддерживать температуру, влажность, чистоту, поток или т.п. воздуха приятными в помещении, часть которого или которое полностью изолировано от внешней среды. Предпочтительно, например, изолированное помещение может представлять собой закрытое помещение, часть которого или которое изолировано от внешней среды, например, внутри здания или внутри транспортного средства, поезда, корабля, воздушного судна или тому подобного. Предпочтительно, система кондиционирования воздуха, представляет собой, например, кондиционер воздуха.

Исходя из конструкции системы кондиционирования воздуха, весь воздух, проходя через вентилятор, проходит через ядро испарителя, и на поверхности ядра испарителя вследствие разницы температур непрерывно конденсируется водный конденсат, обеспечивая среду, благоприятную для роста микроорганизмов. После длительного времени образуется биопленка. В это время микроорганизмы метаболизируют различные материалы внутренней и внешней среды в качестве питательных веществ, присутствующих в воздухе, вырабатывая запахи, производные летучих органических соединений (mVOC), вырабатываемых в результате метаболизма.

Биопленки представляют собой форму микробных сообществ, в которых микроорганизмы живут в виде кластеров, имеют структуру, в которой слой окружен одной мембраной, и служат для защиты микроорганизмов от внешней среды и для обеспечения питательными веществами. В качестве ингредиента, образующего пленку, присутствуют экзополимерные вещества (EPS), которые включают ряд ингредиентов, таких как белки, полисахариды, полиуроновые кислоты, нуклеиновые кислоты и липиды. На поверхности ядра испарителя различные микроорганизмы пролиферируют в веществах в качестве питательных веществ и выделяют неприятные запахи вследствие продуктов метаболизма.

Авторы настоящего изобретения выделили микроорганизмы, которые выделяют запахи, из ядра испарителя и, в результате культивирования микроорганизмов, разделили и культивировали доминирующие штаммы среди микроорганизмов, образующих колонии. Способ разделения и культивирования доминирующих штаммов можно осуществить, используя ряд способов, хорошо известных специалистам в данной области техники. Например, доминирующие микроорганизмы можно выбирать с помощью морфологических подходов, таких как степень разбавления, и цвет, размер или форма колоний.

Доминирующий микроорганизм включает роды Fibrella, Chryseobacterium, Spirosoma, Geobacillus или Pelomonas, предпочтительно, Fibrella aestuarina, Chryseobacterium geocarposphaerae, Spirosoma linguale, Spirosoma radiotolerans, Geobacillus toebii или Pelomonas puraquae.

Микроорганизмы были депонированы в Корейском Центре Культур Микроорганизмов 17 апреля 2015 года, и им были даны следующие номера доступа: Fibrella aestuarina HKMC-115 (номер доступа: KCCM 11691P), Chryseobacterium geocarposphaerae HKMC-116 (номер доступа: KCCM 11692P), Spirosoma linguale HKMC-117 (номер доступа: KCCM 11693P), Spirosoma radiotolerans HKMC-114 (номер доступа: KCCM 11690P), Geobacillus toebii HKMC-118 (номер доступа: KCCM 11694P) и Pelomonas puraquae HKMC-113 (номер доступа: KCCM 11689P).

Вызывающие запах микроорганизмы имеют разнообразную промышленную применимость. Например, вызывающие запах микроорганизмы можно применять в разработке новых антибактериальных средств, замедляющих рост микроорганизмов, и разработке освежителя воздуха для устранения неприятных запахов путем определения химических свойств продуктов обмена микроорганизмов. Кроме того, вызывающие запах микроорганизмы можно применять, чтобы основательно устранять причину неприятного запаха, обеспечивая систему кондиционирования воздуха средой, в которой микроорганизмы не могут жить.

Образец, используемый в способе скрининга антимикробных средств настоящего раскрытия, используется для определения того, обладает ли он противомикробной активностью против микроорганизмов. Например, когда конкретный образец обладает противомикробной активностью против Pelomonas puraquae, образец можно подвергнуть скринингу в качестве антимикробного средства против Pelomonas puraquae.

Предпочтительно, антимикробное средство, подвергнутое скринингу посредством способа скрининга настоящего раскрытия, может обладать противомикробной активностью против Pelomonas puraquae, более предпочтительно, против других видов микроорганизмов.

Например, некоторые антибактериальные средства могут обладать противомикробной активностью против всех шести видов микроорганизмов, а другое антимикробное средство может вообще не обладать противомикробной активностью против одного или более видов. В дополнение, антимикробное средство, обладающее противомикробной активностью против всех шести видов микроорганизмов, может иметь различную противомикробную активность против различных микроорганизмов (см. таблицу 8).

В одном предпочтительном иллюстративном варианте осуществления настоящего раскрытия образец, подлежащий скринингу, содержит отдельное соединение, смесь соединений, экстракт животного или растительного происхождения, биологическое средство, содержащее генетическую информацию, такую как нуклеотид, полипептид и тому подобное, и смесь соединения и биологического средства.

В другом аспекте настоящее раскрытие предоставляет микроорганизм, вызывающий неприятные запахи в системе кондиционирования воздуха.

Предпочтительно, микроорганизм, вызывающий неприятный запах, включает один или более, выбираемых из группы, состоящей из Pelomonas puraquae, Spirosoma radiotolerans, Fibrella aestuarina, Chryseobacterium geocarposphaerae, Spirosoma linguale и Geobacillus toebii.

В другом аспекте настоящее раскрытие предоставляет способ подавления роста микроорганизма, вызывающего неприятные запахи в системе кондиционирования воздуха, включая покрытие или распыление антимикробных средств на систему кондиционирования воздуха.

Антимикробное средство, которое можно применять в настоящем раскрытии, может представлять собой любое антимикробное средство, которое, как определено или может быть определено, обладает противомикробной активностью против одного или более микроорганизмов, выбираемых из группы, состоящей из Pelomonas puraquae, Spirosoma radiotolerans, Fibrella aestuarina, Chryseobacterium geocarposphaerae, Spirosoma linguale и Geobacillus toebii.

Антимикробное средство можно покрывать или распылять в систему кондиционирования воздуха для подавления роста вызывающих запах микроорганизмов и микроорганизмов, включая перечисленные, а покрытие или распыление можно осуществлять в различных формах, известных в данной области, таких как газ, жидкость, гель или суспензия твердого вещества.

В дополнение, покрытие или распыление можно осуществлять частично или полностью на внутреннюю поверхность или внутренние компоненты системы кондиционирования воздуха. Предпочтительно, покрытие или распыление можно осуществлять на ядро испарителя в системе кондиционирования воздуха. Подавление роста можно осуществлять посредством нанесения или распыления антимикробных средств после того, как вызывающие запах микроорганизмы сформировали биопленку, или посредством нанесения или распыления антимикробных средств для предотвращения роста микроорганизмов перед тем, как вызывающие запах микроорганизмы сформировали биопленку.

В другом аспекте настоящее раскрытие предоставляет способ устранения неприятного запаха в системе кондиционирования воздуха, включая выделение или устранение микроорганизма, вызывающего неприятные запахи, из системы кондиционирования воздуха.

Устранение неприятных запахов включает все или некоторые неприятные запахи, и покрытие или распыление можно осуществлять для предотвращения неприятных запахов до того, как неприятные запахи выработались.

В системе кондиционирования воздуха размножается ряд микроорганизмов. Эти микроорганизмы можно ориентировочно классифицировать на микроорганизмы, вызывающие неприятные запахи, и микроорганизмы, не вызывающие неприятные запахи. Соответственно, когда антимикробный агент конкретно действует только на микроорганизмы, вызывающие неприятные запахи, или обладает подавляющей активностью против роста всех или некоторых из доминирующих видов микроорганизмов, вызывающих неприятные запахи, неприятные запахи системы кондиционирования воздуха могут быть частично или полностью устранены или улучшены.

В другом аспекте настоящее раскрытие предоставляет способ устранения неприятных запахов в системе кондиционирования воздуха, включая выделение или устранение микроорганизмов, вызывающих неприятные запахи, из системы кондиционирования воздуха.

Микроорганизмы, описанные выше, или микроорганизмы, включающие перечисленные, можно частично или полностью выделить или устранить посредством физического, химического или биологического способа. Физическим способом может быть искусственное выделение или удаление вышеупомянутого микроорганизма или микроорганизма, включающего по меньшей мере один из них, с использованием физического устройства. Химическим способом может быть один из способов выделения или удаления вышеупомянутого микроорганизма или микроорганизма, включающего по меньшей мере один из них, с использованием противомикробного средства или стерилизатора против микроорганизма. Биологическим методом может быть выделение или удаление микроорганизмов с использованием биологического средства, которое токсично для микроорганизмов, или используя другой микроорганизм, который конкурирует с микроорганизмом для выживания. Однако настоящее изобретение не ограничено этими примерами.

В другом аспекте настоящее раскрытие предоставляет способ устранения неприятных запахов в системе кондиционирования воздуха, включая подавление роста вызывающих запах микроорганизмов в системе кондиционирования воздуха.

Преимущественные результаты

Настоящее раскрытие предоставляет микроорганизм, вызывающий неприятные запахи в системе кондиционирования воздуха. В дополнение, настоящее раскрытие предоставляет способ скрининга антибактериального средства для борьбы с микроорганизмами. Более того, настоящее раскрытие предоставляет способ устранения неприятных запахов в системе кондиционирования воздуха посредством борьбы с микроорганизмами.

Вызывающие запах микроорганизмы в системе кондиционирования воздуха можно применять для разработки новых антибактериальных средств или для разработки освежителя воздуха для блокирования неприятных запахов посредством идентификации химических свойств продуктов обмена микроорганизмов. Кроме того, вызывающие запах микроорганизмы имеют разнообразную промышленную применимость фундаментального устранения причины запахов посредством предварительного создания окружающей среды для предотвращения роста микроорганизмов в системе кондиционирования воздуха.

Описание чертежей

ФИГ. 1 представляет собой изображение, показывающее экземпляр, взятый из ядра испарителя в вызывающем запах подержанном транспортном средстве;

ФИГ. 2 представляет собой изображение, показывающее способ тестирования антибактериальной активности согласно настоящему раскрытию; и

ФИГ. 3 представляет собой изображение, показывающее культивируемые комбинации доминирующих микроорганизмов, не выделяющих запах, с использованием алюминиевого ребра, который является материалом для ядра испарителя.

Наилучший вариант

Далее настоящее описание будет описано более подробно со ссылкой на примеры. Эти примеры приведены только для иллюстрирования настоящего раскрытия, и специалистам в данной области должно быть очевидно, что объем настоящего раскрытия не ограничен примерами в зависимости от предмета настоящего раскрытия.

Пример 1: Отбор вызывающих запах доминирующих микроорганизмов

1. Приобретение транспортных средств с запахом и отделение системы кондиционирования

Чтобы идентифицировать причину неприятных запахов, возникающих в замкнутой среде, например, внутри транспортного средства, авторы настоящего изобретения получили десять видов подержанных транспортных средств, генерирующих неприятные запахи в зависимости от сезона (зима: с февраля по март, лето: с июня по июль), изолировали систему кондиционирования воздуха, установленную на соответствующих транспортных средствах, и для проведения отбора проб (таблица 1) отсоединили ядро испарителя, где, по предположениям, вызывающие запах микроорганизмы формируют биопленку.

[ТАБЛИЦА 1]

№ Пройденное транспортным средством расстояние в милях Время года 1 Зима (фев-мар) 2 3 4 5 6 Лето (июнь-июль) 7 8 9 10

Пример 2: отбор образцов ядра испарителя

Образцы ядра испарителя, полученные из пахучих подержанных транспортных средств с 1 по 10, герметично запечатали в полиэтиленовый пакет и охлаждали при температуре 4°C перед использованием. Для выделения и культивирования микроорганизмов собирали 5 г образцов из любых пятен, включая переднюю и заднюю части в соответствующих ядрах испарителя, с использованием стерилизованных длинноносых плоскогубцев, а затем их смешивали перед использованием (ФИГ. 1).

Пример 3: Отделение микроорганизмов

Микроорганизмы были отделены от образцов, полученных из ядер испарителя, в соответствии со следующим процессом.

1. Образцы, выделенные из ядер испарителей, смешивали и подавали в мешалку.

2. Стерилизованный 1× фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) подавали в 200 мл мешалку.

3. Смешанный образец перемешивали с PBS в течение 30 секунд.

4. Мешалку помещали на лед в течение одной минуты.

5. Стадии 3 и 4 повторяли дважды.

6. Суспензию центрифугировали при 4°С и 13000 об/мин в течение 3 минут.

7. Собирали только супернатант и переносили его в новую пробирку.

8. Стерилизованный тампон пропитывали супернатантом, и поверхность ядра испарителя, из которого брали образец, несколько раз очищали тампоном.

9. В супернатант погружали только головку очищенного тампона и проводили перемешивание вихревым способом.

10. Осадок, полученный на стадии 6, смешивали со смесью стадии 9 и полученную смесь использовали в качестве инокуляционного материала.

После этапов 1-10 микроорганизмы отделяли посредством физического отделения от ядер испарителя, установленных на моделях транспортных средств 1-10.

Пример 4: Отделение вызывающих запах микроорганизмов и отбор доминирующих видов

Отделение бактерий от кондиционера обычно осуществляют путем проведения культивирования на гетеротрофных планшетах аэробных гетеротрофных бактерий, которые называются основными бактериями. Отделение бактерий проводят при 28-30°C в течение 14 дней, используя две сложные питательные среды, включая агаровую среду PTYG и агаровую среду R2A. В случае агаровой среды PTYG к 980 мл дистиллированной воды добавляли пептон 0,25 г (Difco), триптон 0,25 г (Difco), экстракт дрожжей 0,5 г (Difco), глюкозу 0,5 г (Difco), мгSO₄ 30 мг (Sigma), CaCl₂ 3 мг (Sigma) и бактоагар 15 г (Difco), pH регулировали до 7,0 и полученную смесь автоклавировали при 121°С в течение 15 минут. В случае агаровой среды R2A к 980 мл дистиллированной воды добавляли экстракт дрожжей 0,5 г (Difco), протеозопептон № 3 0,5 г (Difco), казаминовые кислоты 0,5 г (Difco), декстрозу 0,5 г (Difco), растворимый крахмал 0,5 г (Difco), натрия пируват 0,3 г (Difco), дикалия сульфат 0,3 г (Difco), магния сульфат 0,05 г (Difco) и бактоагар 15 г (Difco), pH регулировали до 7,2 (в итоге: 1000 мл) и полученную смесь автоклавировали при 121°С в течение 15 минут. Для выделения недоминирующих бактерий после стерилизации фильтра для получения антибиотических сред, когда температура среды достигала 50°С, добавляли канамицин, ампициллин и хлорамфеникол в концентрации 100 м.д.

Для отдельного культивирования доминирующих штаммов сначала следует выбирать различные доминирующие штаммы с помощью морфологического подхода степени разбавления и цвета, размера и формы колоний и тому подобного.

1. Грибы и бактерии отдельно выделяли из отдельно культивируемых сред.

2. Ряд бактерий, имеющих разную морфологию, инокулировали в сложную среду с использованием петли, и целиком выделяли.

3. Из инокулированных сред выбирали дающую наибольший рост среду, и проводили пассаж культуры.

4. Конец мицелия грибов выделяли скальпелем и инокулировали в сложную среду.

5. Также в случае штаммов грибов из инокулированных сред выбирали дающую наибольший рост среду, и проводили пассаж культуры.

5. Идентификация доминирующих штаммов

Чтобы точно идентифицировать выделенные микроорганизмы, была выполнена идентификация рРНК 16s, включающая следующие стадии.

a) Исследование «отпечатков пальцев» с помощью анализа картины Rep-ПЦР

Rep-ПЦР представляет собой молекулярный биологический способ анализа структуры хромосом бактерий и представляет собой метод «отпечатков пальцев», который способен дифференцировать конкретные штаммы бактерий от других бактерий. Генетические характеристики анализировали в соответствии с соответствующими процессами для проведения Rep-ПЦР.

(1) Процесс лизиса клеток

1. 2,5 мкл реагента для ПЦР Lyse-N-Go (Thermo) поместили в пробирку для ПЦР.

2. Колонии собирали с помощью пипетки на чистом столе, помещали в пробирку и дозировали с помощью пипетки. Количество собранных колоний следует определять так, чтобы не замутнить раствор даже слегка.

3. Согласно инструкциям производителя, культивирование проводили на оборудовании для ПЦР.

(2) Реакция ПЦР

Подходящее количество ингредиентов, необходимых для реакции ПЦР, описанных в последующей Таблице 2, смешивали для получения реакционной смеси и, как показано в Таблице 3, проводили предварительную денатурацию при 93°С в течение 7 мин, денатурацию при 92°С в течение 1 минуты, отжиг при 51,5°С в течение 1 минуты и элонгацию при 65°С в течение 8 минут, и процессы денатурации, отжига и расширения повторяли 33 раза, чтобы выполнить ПЦР-амплификацию.

[Таблица 2]

1. dNTP (2,5 мМ каждый) 12,5 мкл 2. буфер Gitschier 5,0 мкл 3. DMSO (100%) 2,5 мкл 4. Автоклаированный 3^oD.W. 0,3 мкл 5. праймер BOXA1R (50 пмоль/мкл) 5'CTACGGCAAGGCGACGCTGACG 1,0 мкл 6. BSA (10 мг/мл) 0,4 мкл 7. бактериальная ДНК 2,5 мкл 8. Taq-полимераза(Roche) (5 Ед/мкл) 0,8 мкл

[ТАБЛИЦА 3]

стадия 1 93°C 7 мин стадия 2 92°C 1 мин стадия 3 51,5°C 1 мин стадия 4 65°C 8 мин стадия 2,3,4: дополнительные 33 цикла стадия 6 65°C 16 мин стадия 7 4°C

(3) Гель-электрофорез

Фрагменты ДНК, амплифицированные посредством ПЦР, собрали, использовали 1,2-1,5% агарозный гель, обогащенный EtBr, и смесь 6x красителя и образца в соотношении 1 к 5 загружали в максимально возможном количестве. Поскольку большинство продуктов ПЦР составляло от 100 до 1000 пар оснований, их загружали лестницей по 100 пар оснований, и проводили электрофорез как можно медленнее, так что середина (50 V) красителей бромфенолового синего и ксиленцианола доходила до середины всего геля. Штаммы, которые имеют идентичные образцы ДНК на геле, считаются одинаковыми штаммами.

(b) Идентификация доминирующих бактерий системы кондиционирования посредством генетического анализа 16S рРНК

Гены 16S рРНК (рибосомальная рибонуклеиновая кислота) используют для идентификации генетических классов бактерий, и их можно идентифицировать на уровне родов и видов бактерий, классифицированных посредством Rep-ПЦР.

(1) Процесс лизиса клеток

1. 5 мкл реагента для ПЦР Lyse-N-Go (Thermo) поместили в пробирку для ПЦР.

2. Колонии собирали с помощью пипетки на чистом столе, помещали в пробирку и дозировали с помощью пипетки. Количество собранных колоний следует определять так, чтобы даже слегка не замутнить раствор.

3. Согласно инструкциям производителя, культивирование проводили на оборудовании для ПЦР (Таблица 4).

[Таблица 4]

цикл Температура (°C) Время (секунды) 1 65 30 2 8 30 3 65 90 4 97 180 5 8 60 6 65 180

(2) Генетическая ПЦР 16S рРНК

Условия проведения ПЦР (всего 50 мкл): ингредиенты для раствора, за исключением ДНК и Taq, смешивали в предварительно заданных количествах, как показано в следующей таблице 5, и полученную смесь добавляли к 44,5 мкл лизирующего раствора. Затем, как показано в следующей таблице 6, проводили предварительную денатурацию при 94°C в течение 5 минут, денатурацию при 94°C в течение 1 минуты, отжиг при 55°C в течение 1 минуты и элонгацию при 72°C в течение 1 мин 30 секунд, и для выполнения ПЦР-амплификации стадии денатурации, отжига и элонгации проводили 29 раз.

[Таблица 5]

Автоклавированный 3°D.W. 22 мкл 10x буфер (Roche) 5 мкл dNTP (Roche, 2,5 мМ) 5 мкл DMSO 5 мкл BSA (10 мг/мл) 2,5 мкл 27mf (20 пмоль/мкл) 2,5 мкл 1492r (20 пмоль/мкл) 2,5 мкл ДНК 5 мкл Taq (Roche) 0,5 мкл

[Таблица 6]

стадия 1 94°C 5 мин стадия 2 94°C 1 мин стадия 3 55°C 1 мин стадия 4 72°C 1 мин 30 сек Перейти к стадии 2: дополнительные 29 циклов стадия 6 72°C 10 мин стадия 7 4°C выдерживание

(3) ПЦР очистка

Продукты, амплифицированные посредством генетической ПЦР 16S-рРНК, очищали с использованием набора для ПЦР очистки Qiaquick в соответствии со следующим процессом.

1. Добавили 5x объем PB буфера продукта ПЦР.

2. Смешанный раствор высевали на колонку QIAquick.

3. Для связывания ДНК центрифугирование проводили в течение одной минуты, а супернатант удаляли.

4. Для промывки 750 мкл PE буфера помещали в колонку QIAquick, центрифугирование проводили в течение одной минуты, а супернатант удаляли.

5. Вновь проводили центрифугирование в течение одной минуты.

6. Колонку QIAquick переносили в новую пробирку.

7. Для извлечения ДНК добавляли 30 мкл EB буфера и оставляли стоять в течение одной минуты.

8. Центрифугирование выполняли в течение одной минуты, чтобы обеспечить возможность собрать в пробирке ДНК, растворенные в EB.

В результате теста, с целью проверки, вырабатывают или нет чисто выделенные микроорганизмы запахи, чисто выделенные микроорганизмы культивировали следующим способом и проводили сенсорную оценку.

1. Чистые отдельно культивируемые микроорганизмы инокулировали в жидкую питательную среду.

2. Инокулированную среду культивировали при 28°С в течение 5-7 дней.

3. 100 мкл бактерий, культивируемых в жидкой среде, инокулировали в твердую питательную среду.

4. Инокулированные бактерии равномерно распределяли с использованием распылителя.

5. Чашку Петри запечатывали и культивировали при 28°С в течение 10 дней.

Сенсорную оценку проводили на основе 5-балльного способа с использованием семи панелей, вызывающие запах микроорганизмы выбирали с использованием среднего значения после оценки интенсивности запаха, шесть доминирующих штаммов идентифицировали посредством идентификации генетического анализа 16S рРНК, и эти доминирующие штаммы депонировали в Корейском Центре Культур Микроорганизмов 17 апреля 2015 г.

[Таблица 7]

№ Идентификационный № Название микроорганизма № доступа 1 HKMC-113 Pelomonas puraquae KCCM
11689P 2 HKMC-114 Spirosoma radiotolerans KCCM
11690P 3 HKMC-115 Fibrella aestuarina KCCM
11691P 4 HKMC-116 Chryseobacterium
geocarposphaerae KCCM
11692P 5 HKMC-117 Spirosoma linguale KCCM
11693P 6 HKMC-118 Geobacillus toebii KCCM
11694P

Пример 2: Оценка антибактериальной активности выбираемых вызывающих запах микроорганизмов в зависимости от антибактериального агента

1. Процесс тестирования

Авторы настоящего изобретения оценивали антибактериальную активность доминирующих микроорганизмов, выбираемых в Примере 1, используя ряд коммерчески доступных антибактериальных средств. Антибактериальные средства, применяемые в настоящем раскрытии, будут приведены ниже:

Антибактериальный агент A: Kimcare (Yuhan Kimberly, Ltd.)

Антибактериальный агент B: Febreze (P&G)

Антибактериальный агент C: антибактериальный агент массового производства, содержащий метиловый спирт 45~50%, сульфат хрома (CAS 10101-53-8) 1~5%, бром 1~5% и воду.

Оценку антибактериальной активности проводили посредством следующих стадий:

1. Подготовка стерильной фильтровальной бумаги

2. Получение трех видов антибактериальных средств (контрольная группа: группа, не обработанная антибактериальным агентом, тестируемые группы: антибактериальный агент А, антибактериальный агент В, антибактериальный агент С)

3. Подведение фильтровальной бумаги к антибактериальному агенту

4. Нанесение соответствующих микроорганизмов, вызывающих запах, в питательную среду

5. Размещение фильтровальной бумаги, содержащей антибактериальный агент, в питательной среде, покрытой микроорганизмами, вызывающими запах

6. Культивирование при 28-30°C в течение 5 дней

7. Измерение зоны подавления роста.

Измерение зоны подавления роста проводили путем измерения диаметра зоны торможения роста с помощью штангенциркулей Вернье, и этот способ будет подробно показан на фиг. 2.

2. Результат теста

Среднее трех диаметров зоны подавления роста, полученное путем трехкратного тестирования каждого из шести штаммов вызывающих запах микроорганизмов, показано в таблице 8.

[Таблица 8]

№ Название микроорганизма
(Наименование при депонировании) Нет бактериального агента A B C 1 Pelomonas puraquae HKMC-113 0 1,17 2,07 3,93 2 Spirosoma radiotolerans HKMC-114 0 2,03 2,17 4,57 3 Fibrella aestuarina HKMC-115 0 2,13 2,63 4,30 4 Chryseobacterium geocarposphaerae HKMC-116 0 0,97 1,57 2,70 5 Spirosoma linguale HKMC-117 0 1,83 2,10 4,83 6 Geobacillus toebii strain R-35642HKMC-118 0 1,73 1,93 2,20

(единица измерения: см)

Как показано в таблице 8, антибактериальный агент A демонстрирует более слабую антибактериальную активность против Chryseobacterium geocarposphaerae, а антибактериальный агент B демонстрирует сильную антибактериальную активность против Fibrella aestuarina, но более слабую антибактериальную активность против Chryseobacterium geocarposphaerae.

В дополнение, антибактериальный агент C демонстрирует слабую антибактериальную активность против Geobacillus toebii, но демонстрирует более сильную суммарную антибактериальную активность против шести штаммов микроорганизмов, чем антибактериальные средства A и B.

Пример 3: Оценка запахов ядра испарителя, из которого удалены вызывающие запах микроорганизмы.

С целью воспроизведения ядра испарителя, из которого были удалены или отделены вызывающие запах микроорганизмы, авторы настоящего изобретения культивировали комбинацию не вызывающих запах микроорганизмов за исключением вызывающий запах микроорганизм из примера 1, среди доминирующих микроорганизмов, выращенных в ядре испарителя, с использованием алюминиевого ребра, который является материалом для ядра испарителя (Таблица 9, ФИГ. 3).

Не вызывающие запах микроорганизмы выбрали в качестве доминирующих микроорганизмов, которые росли в ядре испарителя, образовывали колонии во время культивирования и не вырабатывали неприятного запаха, а способ культивирования будет приведен ниже:

1. Чисто выделенные и культивированные не вызывающие запах микроорганизмы инокулировали в жидкой среде R2A.

2. Инокулированную среду культивировали при 28°С в течение 5-7 дней.

3. Было подготовлено алюминиевое ребро, стерилизованное при высоком давлении при 121°С в течение 20 минут.

4. Ребро погружали в каждый антибактериальный агент, чтобы он равномерно покрывал поверхность ребра.

5. Покрытое алюминиевое ребро помещали в чашку Петри.

6. 1 мл инокуляционного раствора культивированных не вызывающих запах микроорганизмов центрифугировали, а супернатант удаляли.

7. Добавляли 1 мл стерилизованного 1× PBS и снова проводили центрифугирование.

8. Способ по 7 повторяли дважды.

9. 100 мкл не вызывающих запах микроорганизмов, промытые 100 мкл PBS, наносили каплями на середину алюминиевого ребра.

10. Подготовленное алюминиевое ребро инокулировали микроорганизмами и высушивали при комнатной температуре.

11. Чашку Петри герметично запечатывали и хранили при 28°С в течение одного месяца.

В результате все комбинации следующей таблицы 9 (результат анализа запаха культур микроорганизмов, выращенных в ядре испарителя, из которого удалены вызывающие запах микроорганизмы) не вырабатывали запахов после одного месяца.

[Таблица 9]

Комбинация Микроорганизм Оценка запаха после одного месяца 1 Methylobacterium brachiatum не вызывает запах 2 Methylobacterium platani не вызывает запах 3 Methylobacterium aquaticum+Methylobacterium platani не вызывает запах 4 Methylobacterium platani+Methylobacterium brachiatum не вызывает запах 5 Methylobacterium aquaticum+Methylobacterium platani+Methylobacterium brachiatum не вызывает запах 6 Methylobacterium aquaticum+Methylobacterium platani+Methylobacterium brachiatum+Acinetobacter johnsonii не вызывает запах 7 Methylobacterium aquaticum+Methylobacterium platani+Methylobacterium brachiatum+Bacillus vietnamensis не вызывает запах 8 Methylobacterium aquaticum+Methylobacterium platani+Methylobacterium brachiatum+Brevibacillus invocatus не вызывает запах 9 Methylobacterium aquaticum+Methylobacterium platani+Methylobacterium brachiatum+Deinococcus ficus не вызывает запах 10 Methylobacterium aquaticum+Methylobacterium platani+Methylobacterium brachiatum+Leifsonia soli не вызывает запах 11 Methylobacterium aquaticum+Methylobacterium platani+Methylobacterium brachiatum+Methylobacterium komagatae не вызывает запах 12 Methylobacterium aquaticum+Methylobacterium platani+Methylobacterium brachiatum+Pseudomonas nitroreducens не вызывает запах 13 Methylobacterium aquaticum+Methylobacterium platani+Methylobacterium brachiatum+Sphingomonas aquatilis не вызывает запах 14 Sphingomonas aquatilis+Brevibacillus invocatus не вызывает запах 15 Leifsonia soli+Methylobacterium komagatae не вызывает запах 16 Acinetobacter johnsonii+Sphingomonas aquatilis+Methylobacterium komagatae не вызывает запах 17 Pseudomonas nitroreducens не вызывает запах 18 Acinetobacter johnsonii+Pseudomonas nitroreducens не вызывает запах 19 Brevibacillus invocatus+Acinetobacter johnsonii+Pseudomonas nitroreducens не вызывает запах 20 Leifsonia soli+Pseudomonas nitroreducens не вызывает запах 21 Brevibacillus invocatus+Sphingomonas aquatilis+Pseudomonas nitroreducens не вызывает запах 22 Acinetobacter johnsonii+Sphingomonas aquatilis+Pseudomonas nitroreducens не вызывает запах 23 Methylobacterium aquaticum+Methylobacterium komagatae+Bacillus vietnamensis+Deinococcus ficus не вызывает запах 24 Methylobacterium aquaticum+Methylobacterium komagatae+Curtobacterium flaccumfaciens+Deinococcus apachensis+Bacillus subtilis subsp. subtilis не вызывает запах 25 Methylobacterium aquaticum+Methylobacterium komagatae+Spirosoma linguale+Sphingomonas dokdonensis+Leifsoniasoli не вызывает запах

Как показано в результате теста, описанного выше, когда комбинацию микроорганизмов, не вырабатывающих запахи, создают путем удаления вызывающих запах микроорганизмов, выращенных в системе кондиционирования воздуха химическим или физическим способом, запахи, образующиеся в системе кондиционирования воздуха, можно в значительной степени устранить.

Хотя предпочтительные варианты осуществления настоящего раскрытия были раскрыты для иллюстративных целей, специалистам в данной области будет понятно, что возможны различные модификации, дополнения и замены, не выходящие за объем и сущность раскрытия, как раскрыто в сопровождающей формуле изобретения.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ скрининга антимикробных средств в системе кондиционирования воздуха транспортного средства, включающий измерение подавления роста микроорганизма, вызывающего неприятный запах, образцом, обладающим антимикробной активностью против этого микроорганизма; способ подавления роста вызывающего запах микроорганизма и способ устранения запахов в системе кондиционирования воздуха, предусматривающие покрытие или распыление антибактериального средства на систему кондиционирования воздуха для уменьшения запахов, произведенных микроорганизмами. Изобретения обеспечивают устранение неприятного запаха посредством подавления роста вызывающих запах микроорганизмов в системе кондиционирования воздуха транспортных средств. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 3 ил., 9 табл., 3 пр.

1. Способ скрининга антимикробных средств против микроорганизма, вызывающего неприятный запах в системе кондиционирования воздуха транспортного средства, где способ включает:

(a) получение одного или более микроорганизмов, которые вызывают неприятный запах в системе кондиционирования воздуха транспортного средства и выбираются из группы, состоящей из Pelomonas puraquae HKMC-113 номер доступа: KCCM11689P, Spirosoma radiotolerans HKMC-114 номер доступа: KCCM11690P, Fibrella aestuarina HKMC-115 номер доступа: KCCM11691P, Chryseobacterium geocarposphaerae HKMC-116 номер доступа: KCCM11692P, Spirosoma linguale HKMC-117 номер доступа: KCCM11693P и Geobacillus toebii HKMC-118 номер доступа: KCCM11694P или раствора его культуры;

(b) контактирование образца для анализа с микроорганизмом;

(c) измерение подавления роста микроорганизма; и

(d) определение того, что образец обладает антимикробной активностью против микроорганизма, если рост микроорганизма подавлен, причем антимикробное средство обладает антибактериальной активностью в отношении Pelomonas puraquae HKMC-113 номер доступа: KCCM11689P, Spirosoma radiotolerans HKMC-114 номер доступа: KCCM11690P, Fibrella aestuarina HKMC-115 номер доступа: KCCM11691P, Chryseobacterium geocarposphaerae HKMC-116 номер доступа: KCCM11692P, Spirosoma linguale HKMC-117 номер доступа: KCCM11693P и Geobacillus toebii HKMC-118 номер доступа: KCCM11694P.

2. Способ по п. 1, в котором системой кондиционирования воздуха является кондиционер воздуха.

3. Способ по п. 1, в котором микроорганизм образует биопленку в ядре испарителя в системе кондиционирования воздуха для выработки запаха.

4. Способ по п. 3, в котором материалом для ядра испарителя является алюминий, сплав алюминия, медь или сплав меди.

5. Способ подавления роста вызывающего запах микроорганизма в системе кондиционирования воздуха, предусматривающий покрытие или распыление антибактериального средства для уменьшения запахов на систему кондиционирования воздуха,

где антибактериальное средство обладает антибактериальной активностью в отношении Pelomonas puraquae HKMC-113 номер доступа: KCCM11689P, Spirosoma radiotolerans HKMC-114 номер доступа: KCCM11690P, Fibrella aestuarina HKMC-115 номер доступа: KCCM11691P, Chryseobacterium geocarposphaerae HKMC-116 номер доступа: KCCM11692P, Spirosoma linguale HKMC-117 номер доступа: KCCM11693P и Geobacillus toebii HKMC-118 номер доступа: KCCM11694P,

где микроорганизмы содержат один или более элементов, выбранных из группы, состоящей из Pelomonas puraquae HKMC-113 номер доступа: KCCM11689P, Spirosoma radiotolerans HKMC-114 номер доступа: KCCM11690P, Fibrella aestuarina HKMC-115 номер доступа: KCCM11691P, Chryseobacterium geocarposphaerae HKMC-116 номер доступа: KCCM11692P, Spirosoma linguale HKMC-117 номер доступа: KCCM11693P и Geobacillus toebii HKMC-118 номер доступа: KCCM11694P.

6. Способ устранения запахов в системе кондиционирования воздуха, предусматривающий покрытие или распыление антибактериального средства для уменьшения запахов, произведенных микроорганизмами, на систему кондиционирования воздуха,

где антибактериальное средство обладает антибактериальной активностью в отношении Pelomonas puraquae HKMC-113 номер доступа: KCCM11689P, Spirosoma radiotolerans HKMC-114 номер доступа: KCCM11690P, Fibrella aestuarina HKMC-115 номер доступа: KCCM11691P, Chryseobacterium geocarposphaerae HKMC-116 номер доступа: KCCM11692P, Spirosoma linguale HKMC-117 номер доступа: KCCM11693P и Geobacillus toebii HKMC-118 номер доступа: KCCM11694P,

где микроорганизмы содержат один или более элементов, выбранных из группы, состоящей из Pelomonas puraquae HKMC-113 номер доступа: KCCM11689P, Spirosoma radiotolerans HKMC-114 номер доступа: KCCM11690P, Fibrella aestuarina HKMC-115 номер доступа: KCCM11691P, Chryseobacterium geocarposphaerae HKMC-116 номер доступа: KCCM11692P, Spirosoma linguale HKMC-117 номер доступа: KCCM11693P и Geobacillus toebii HKMC-118 номер доступа: KCCM11694P.