СУБЛИМАЦИОННО-ВЫСУШЕННАЯ ГЕМОСТАТИЧЕСКАЯ ГУБКА С АНТИМИКРОБНЫМ (БАКТЕРИЦИДНЫМ) ЭФФЕКТОМ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2020 года по МПК A61L15/18 A61L15/28 A61P7/04 A61P31/04 

Изобретение относится к области медицины и представляет собой сублимационно-высушенную гемостатическую губку с выраженным бактерицидным эффектом, достигаемым за счет включения в состав хитозана и покрытых белковой оболочкой наночастиц серебра, полученных микробиологическим синтезом с использованием грибных культур-продуцентов восстановительных биологически активных соединений, и может быть использовано в качестве материала медицинского назначения для изготовления кровоостанавливающих перевязочных средств промышленными предприятиями, либо непосредственно применяться в данном качестве медицинским персоналом и конечными потребителями.

Известен способ получения гидрогеля лечебного назначения (патент РФ №2432954 С1). Гидрогель получают, например, путем совмещения водных растворов альгината натрия и хитозана с добавлением солей двухосновных кислот, позволяющих за счет образования сетчатого полимерного каркаса, получать формоустойчивые мягкие гидрогелевые изделия для адресного пролонгированного высвобождения лекарственных препаратов. Отличием данного изобретения является то, что данная композиция не проявляет выраженные сорбирующие свойства, также сроки хранения гидрогеля в не сухом виде намного меньше.

Известен способ получения лекарственных ранозаживляющих губок (патент РФ №2104008 С1), который включает смешивание солей альгиновой кислоты с хитозаном, каррагинаном и биологически активных веществ, сублимационную сушку смеси с получением пористых губок. Данный лекарственный препарат может быть использован для ускорения рассасывания свежих наружных рубцов и гематом, а также применяется для ускорения заживления гнойно-некротических ран и ожогов I и II степеней. К недостатку данного способа можно отнести то, что процесс получения пористых материалов является достаточно сложным, полученные материалы не проявляют выраженных гемостатических свойств, так как растворимы или слабы растворимы в жидкой среде. Также материал не проявляет антибактериальной активности.

Известен способ получения коллоидного раствора наночастиц серебра и на его основе бактерицидного состава, биодеградирующего композитного пленочного материала и бактерицидной пленки на его основе, содержащей наночастицы серебра, однородные по форме и размеру, использование которых в хирургии при лечении ран и ожогов (патент РФ 2474471 С2). Данный способ включает гамма-облучение в инертной атмосфере водного раствора нитрата серебра, содержащего в качестве стабилизатора карбоксиметилхитин без дополнительных восстанавливающих агентов. Процесс осложнен необходимостью использования инертного газа и вредного для персонала гамма-облучения, что является недостатком данного изобретения.

Известно перевязочное средство на биополимерной основе для профилактики и лечения инфекций при ожогах, трофических язвах и некрозе мягких тканей (патент РФ №2666012 С1) в форме антибактериальной повязки, которое содержит хитозан, полиэтиленоксид, поливинилпирролидон, оливинилкапролактам, коллаген, альгинат, стабилизированные золи наночастиц серебра и меди, синтезированные электрохимически. Недостатком указанного средства является необходимость применения ультразвукового сопла, высокой температуры и ударных волн, рождаемых струей несущего газа, для иммобилизации наночастиц металлов в смеси полимеров.

Прототипом предлагаемого изобретения является способ получения антимикробной гемостатической губки на основе коллагена и альгината кальция (патент РФ №2396984 С2). Для усиления антимикробных свойств в ее состав вводят антимикробные вещества такие, как борная кислота и фурацилин в заданном соотношении. Существенным недостатком таких губок является структурирование губок в парах летучих альдегидов, а именно формальдегида и глутарового альдегида.

Технической задачей предлагаемого изобретения является получение сублимационно-высушенной гемостатической губки с выраженным бактерицидным эффектом.

Поставленная задача решается введением в состав гемостатической губки хитозана и наночастиц серебра, выделенных биологическим путем с использованием грибных культур-продуцентов восстановительных биологически активных соединений, что придает губке бактерицидный эффект. При этом гемостатическую губку получают путем совмещения технологических приемов, включающих криоструктурирование, ионотропное гелирование и сшивку методом ионного замещения, что обеспечивает гемостатическую активность за счет формирования развитой макропористой структуры.

Объекты данного изобретения могут быть описаны следующим образом:

1. Сублимационно-высушенная гемостатическая губка с бактерицидным эффектом, отличающаяся тем, что она содержит альгинат, хитозан и покрытые белковой оболочкой наночастицы серебра, полученные микробным синтезом с использованием грибных культур-продуцентов восстановительных биологически активных соединений, в соотношениях (0,5-1,5):(0,5-1,0):10^-3.

2. Способ получения гемостатической губки путем совмещения следующих технологических приемов: криоструктурирование, ионотропное гелирование и сшивку методом ионного замещения, проводится в четыре стадии:

Стадия 1. Приготовление раствора альгината натрия на основе коллоидного раствора наночастиц серебра с концентрацией 10 мг/л, выделенного грибной культурой. Коллоидный раствор наночастиц серебра получали с помощью устройства и метода, описанного в патенте РФ №2518246 С2. Предлагаемое устройство для биотехнологического получения наноразмерных частиц металлов с заданными параметрами обеспечивает проведение реакций формирования нанокристаллов металлов в ферментере непосредственно в процессе выращивания культуры-продуцента восстановительных биологически активных соединений. В качестве культур-продуцентов использовались культуры грибов Fusarium nivale - (FN); Fusarium oxysporum - (FO); Penicillium glabrum - (PG).

Стабилизация частиц серебра происходит за счет наличия белковой оболочки. Для приготовления раствора требуемое количество альгината натрия (от 0,5 до 1,5 мас. %) всыпают постепенно в коллоидный раствор серебра при постоянном перемешивании. Перемешивание продолжают до полного растворения альгината натрия. Поддерживают рН раствора равный 5,5.

Стадия 2. Криоструктурирование полученного раствора замораживанием в холодильной камере при -20°С в течение суток с формированием первичной псевдоструктуры. Предварительно раствор разливают по формам требуемого размера. Формы заполняют не более, чем на 40% от общего объема.

Стадия 3. Фиксация первичной псевдоструктуры путем постепенного оттаивания массива при околонулевых температурах (3-5°С) с одновременным диффундированием молекул хитозана или одновременно хитозана и хлорида кальция (CaCl₂) при рН≈1-2, вступающих в реакцию с молекулами альгината путем ионотропного гелирования (за счет образования нерастворимого полиионного комплекса при взаимодействии карбоксильных групп альгината натрия и аминогрупп хитозана) или ионотропного гелирования одновременно с ионным замещением ионов Na⁺ на ионы Са²⁺ соответственно. Для этого в форму с криоструктурированным раствором доливают в свободный объем над монолитом подкисленный до рН≈1-2 раствор хитозана или хитозана в смеси с хлоридом кальция (CaCl₂). Концентрация хитозана в растворе составляет 1,0 мас. %, CaCl₂ - 0,05 мас. %. Объем добавляемого раствора равен 0,5-1,0 от объема первичного раствора альгината натрия. Форму помещают в холодильную камеру и оставляют на 48 ч при температуре 3-5°С.

Стадия 4. Замораживание полученного гидрогеля при -20°С в течение 48 часов с последующим удалением растворителя сублимационной сушкой. Получают сухой материал с макропористой структурой, которая обеспечивает гемостатическую способность губки.

Схема получения сублимационно-высушенной гемостатической губки с выраженным антимикробным (бактерицидным) эффектом приведена на Фиг. 1.

Пример.

Готовят 20 мл 1,5% раствора альгината натрия на основе коллоидного раствора наночастиц серебра с концентрацией 10 мг/л. Для обозначения вида коллоидного серебра в номере образца в конце в скобках указывают индекс культуры гриба: Fusarium nivale - (FN);

Fusarium oxysporum - (FO); Penicillium glabrum - (PG). Раствор делят на равные 4 части по 5 мл, каждый образец разливают по чашкам Петри и нумеруют «1», «2», «3», «4». Чашки с полученным раствором отправляют на заморозку при -20°С на 24 часа.

Отдельно готовят 90 мл 1% раствора низкомолекулярного хитозана (LowChitosan), который делят на 2 равные части по 45 мл (а, б). В образцы с названием «а» добавляют 0,05% CaCl₂, в «б» - дополнительных реагентов не вводят.

Спустя 24 часа замороженные образцы с альгинатом натрия заливают, раннее приготовленным, хитозаном в следующих соотношениях:

• в образец «1» добавляют «а» в соотношении 1:1 (образец I-1а);

• в образец «2» добавляют «а» в соотношении 1:0,5 (образец I-2а);

• в образец «3» добавляют «б» в соотношении 1:1 (образец I-3б);

• в образец «4» добавляют «б» в соотношении 1:0,5 (образец I-4б).

Аналогично получают образцы с содержанием альгината натрия 1% (первый символ в нумерации образца II) и 0,5% (первый символ в нумерации образца III) соответственно.

Полученные образцы помещают в холодильную камеру на 48 часов при 5°С. По истечению 2 суток чашки Петри с гелем выдерживают при -20°С в течение 48 часов для полной заморозки слоя геля. Удаление растворителя проводят путем лиофильного высушивания.

Полученный материал представляет собой мягкие пористые губки белого цвета не растворимые в воде. Полученные губки могут быть использованы в качестве сорбентов различных физиологических жидкостей, в том числе и крови. При этом полученные губки имеют выраженный антимикробный (бактерицидный) эффект.

Основной функциональной характеристикой сорбционных покрытий является способность поглощать экссудат из раны, количество которого может быть большим. Сорбционная емкость при отсутствии давления определяют количеством жидкости, которой 1 г сухого сорбента способен поглотить при погружении в воду. Скорость поглощения жидкости главным образом зависит от природы полимера, а сорбционная способность зависит от объема пор. Сорбционную активность губок проверяли экспериментально. Содержание воды измеряли путем погружения, предварительно взвешенной, губки в дистиллированную воду при 25°С в течение 2 часов, по истечению времени, губку извлекали из воды, промокали фильтровальной бумагой и вновь взвешивали губку, напитанную влагой. Содержание поглощенной воды определяли путем расчета содержания воды в терминах коэффициента набухания (S%) с использованием формулы 1:

где W₁ - масса влажного образца, г; W₂ - масса сухого образца, г.

Результаты измерений сорбционной емкости образцов приведены в таблице 1.

Бактерицидный эффект оценивали по величине зоны задержки роста бактерий (зоны «просветления»). Эксперимент проводился в чашках Петри (D=90 мм) с агаризованной питательной средой LB, на поверхность которой делали посев газоном исследуемой культуры микроорганизмов: вносили 0,1 мл суспензии микроорганизмов с концентрацией 1,5×10⁹ кл/мл в фазе активного роста и распределяли стерильным шпателем. На поверхности агаризованной среды с засеянными микроорганизмами помещали испытуемые образцы губок. Культивирование проводили в термостате в течение 24 часов при 37°С. Результат визуально определяли визуально по наличию зоны, свободной от микроорганизмов. Контролем служила чистая альгинат-хитозановая губка, не содержащая наночастицы серебра. Использовали следующие штаммы патогенных бактерий: Bacillus cereus B504^T UNIQEM, Staphylococcus aureus 209р, Pseudomonas aeruginosa РА01 4/4-15.

Результаты микробиологического теста образцов с коллоидным серебром, полученным культурой Fusarium nivale (FN) приведены на Фиг. 2; образцов с коллоидным серебром, полученным культурой Fusarium oxysporum (FO) - на Фиг. 3; образцов с коллоидным серебром, полученным культурой Penicillium glabrum (PG) - на Фиг. 4. На Фиг. 3-4 культуры обозначены следующими индексами: 1 - Bacillus cereus, 2 - Staphylococcus aureus, 3 - Pseudomonas aeruginosa.

Было установлено, что сублимационно-высушенные гемостатические губки, полученные по описанному способу, проявляют бактерицидный эффект. Образцы сравнения без иммобилизованных наночастиц серебра, выделенных культурами грибов, не демонстрируют бактерицидный эффект.

В ходе микробиологического теста было отмечено, что все губки, полученные на основе коллоидного серебра, проявили значимый бактерицидный эффект в тестах с Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa. В тесте с Bacillus cereus все образцы проявили слабый бактерицидный эффект, при этом губки на основе коллоидного серебра, выделенного культурой Penicillium glabrum проявили его в наименьшей степени (самый маленький размер зон «просветвления»). Во всех экспериментах максимальные размеры зон «просветления» наблюдались при исследовании губок с иммобилизованным микробиологическим серебром, выделенным культурой Fusarium nivale.

Предложенные сублимационно-высушенные гемостатические губки после стерилизации представляют собой готовый материал, пригодный для клинического применения, обладают высокой гемостатической способностью и бактерицидным эффектом, доказанным на разных патогенных и условно-патогенных культурах, что позволяет ее использовать в различных областях медицины.

Группа изобретений относится к области медицины. Раскрыта сублимационно-высушенная гемостатическая губка с бактерицидным эффектом, включающая альгинат, хитозан и покрытые белковой оболочкой наночастицы серебра, полученные микробным синтезом с использованием грибных культур-продуцентов восстановительных биологически активных соединений, в соотношениях (0,5-1,5):(0,5-1,0):10^-3. Также раскрыт способ получения указанной гемостатической губки. Группа изобретений обеспечивает получение гемостатической губки с выраженным бактерицидным эффектом. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 1 пр.

1. Сублимационно-высушенная гемостатическая губка с бактерицидным эффектом, отличающаяся тем, что она содержит альгинат, хитозан и покрытые белковой оболочкой наночастицы серебра, полученные микробным синтезом с использованием грибных культур-продуцентов восстановительных биологически активных соединений, в соотношениях (0,5-1,5):(0,5-1,0):10^-3.

2. Способ получения гемостатической губки с бактерицидным эффектом по п. 1, содержащей альгинат, хитозан и наночастицы серебра в соотношениях (0,5-1,5):(0,5-1,0):10^-3, включающий приготовление раствора альгината натрия на основе коллоидного раствора серебра, выделенного грибной культурой-продуцентом восстановительных биологически активных соединений, криоструктурирование полученного раствора с формированием первичной структуры, фиксацию первичной структуры путем ионотропного гелирования или ионотропного гелирования, совмещенного с сшивкой методом ионного замещения, путем постепенной диффузии молекул хитозана или молекул хитозана и ионов кальция в криоструктурированную матрицу альгината натрия при ее оттаивании, с последующим замораживанием и вакуумной сублимационной сушкой полученной губки.