СПОСОБ ПРИЖИЗНЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 2007 года по МПК G01N33/569 

Изобретение относится к биологии, а именно к разделу иммунологии. Оно может быть использовано для хемилюминесцентного анализа в медицине и ветеринарии, науке, экологии.

Известна реакция мононуклеаров крови (РМК) на туберкулин in vitro (1980). Результаты ее оценивали на основании учета клеточного взаимодействия в культуре лейкоцитов в присутствии туберкулина. Установлено, что при инкубировании крови больного туберкулезом крупного рогатого скота в среде 199 в присутствии туберкулина проявляются три иммунологических феномена: агломерация лейкоцитов, торможение развития и гибель макрофагов и гигантских клеток; бластобразование. Критерием оценки реакции был морфологическиий состав культуры лейкоцитов: «положительная» реакция - морфологическая картина: плотные, округлые скопления недоразвитых и погибших макрофагов и гигантских клеток, и большим количеством бластных клеток; «отрицательная» реакция при наличии хорошо развитых макрофагов и гигантских клеток. Положительные результаты внутрикожной туберкулиновой пробы совпали с положительными результатами РСК в 61,28% случаев, а из числа коров, с кровью которых получен положительный результат РМК, реагировало на внутрикожную туберкулиновую пробу 93,48%. Высокий процент совпадения положительных результатов внутрикожной пробы и РМК обусловлен тем, что в основе этих реакций лежит единый процесс взаимодействия клеток-эффекторов гиперчувствительности замедленного типа, о чем говорится в работе Е.И.Буряка «Изучение реактивности организма коров к туберкулину и дифференциальное значение симультанной туберкулиновой пробы, РМК и РСК», 1987.

Однако эти известные методы являются недостаточно достоверными.

Также известны другие методы диагностики туберкулеза, в частности проводился анализ эффективности методов усовершенствованной люминесцентной микроскопии, иммуноферментного анализа (ИФА) и экспресс диагностики туберкулеза «MycoDot™» (Салина Т.Ю., 2000). Люминесцентная микроскопия проводилась с применением сверхтонкого железа, дополнительно обработанного на ультразвуковом диспергаторе УЗДН-А для концентрирования возбудителя туберкулеза.

Из серологических методов применялся непрямой твердофазный иммуноферментный анализ с применением двух иммуноферментных тест-систем. В качестве антигена использовалась суспензия гамма-облученной биомассы вирулентного штамма микобактерий H₃₇Rv. Учет результатов осуществляли по определению оптической плотности в лунках планшета на фотометре.

В качестве экспресс-диагностики применяли коммерческий набор «MycoDot™» производства США. Для выявления специфических антител использовали высокоочищенный липоарабиноманнановый комплекс микобактерий, адсорбированный на поверхности пластиковых гребенок. Оценку реакции в тесте осуществляли визуально.

Достаточно чувствительным методом диагностики оказался метод ИФА с использованием тест-системы «Антитуб» (Москва), и метод усовершенствованной люминесцентной микроскопии с добавлением сверхтонкого железа.

Недостатком люминесцентного метода является технический момент (радиоактивный источник люминесценции).

Серологический метод ИФА позволяет провести диагностику с учетом плотности выявленных иммуноглобулинов в лунках планшета на фотометре.

Тест-система производства Санкт-Петербургского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера отличалась меньшей чувствительностью, чем «Антитуб», и рекомендуется ее использование только в трудных случаях диагностики при больших, распространенных процессах.

Метод «MycoDot™» обладает низкой чувствительностью при всех формах туберкулеза и не может быть рекомендован для раннего выявления туберкулеза.

Из описанных в литературе наиболее близким к изобретению является работа Л.М.Куртасовой, Е.И.Прахина, Н.А.Шакиной, Н.Н.Горбачевой, О.А.Лещенко «Структурно-функциональное состояние иммунной системы у детей раннего возраста, инфицированных микобактериями туберкулеза» (2004), которые изучали структурно-функциональное состояние иммунной системы у детей раннего возраста, инфицированных микобактериями туберкулеза. Фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови исследовали в тесте с латексом. Оценку спонтанной и индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции проводили в течение 90 мин на 36-канальном хемилюминесцентном анализаторе CL3604 (Красноярск, Россия). Определяли следующие показатели: время выхода на максимум (Tmax), максимальное значение (I max), площадь кривой (S²). Регистрацию результатов и управление хемилюминесцентным анализатором осуществляли посредством микро-ЭВМ IBM/PC/AT.

В качестве индуктора "дыхательного взрыва" использовали опсонизированный зимозан в дозе 2 мг/мл ("Sigma", США).Усиление хемилюминесценции, индуцированной зимозаном, относительно спонтанной оценивали по соотношению s²зим./s²спонт.

Недостатками этого метода являются: использование фагоцитарной активности одного типа лейкоцитов-нейтрофилов, использование в качестве индуктора латекса, обладающего неспецифическим стимулирующим действием в отсутствие сывороточных опсонинов и вызывающего меньшую дыхательную активность.

Задачей изобретения является повышение достоверности прижизненной диагностики туберкулеза.

Предлагаемый способ туберкулеза позволяет провести прижизненную экспресс-диагностику острой фазы воспаления при туберкулезе в течение 1,5 часов с момента доставки крови; подготовка компонентов достаточно проста, в частности при приготовлении туберкулезного антигена не требуется источник гамма-облучения.

Общепризнанно, что при воздействии на организм животного различных экологически неблагоприятных факторов химической, физической и биологической природы развивается состояние стрессовой дезадаптации, усиливаются процессы пероксидации липидов и при нарушении контроля над ними многократно усиливаются.

Генерация ХЛ фагоцитами связана с активацией НАДФН-оксидазы и последующим протеканием реакций активных форм кислорода как активатора электронов для генерации свободнорадикальных реакций и возбужденных состояний, из которых возможна эмиссия квантов.

Для усиления природной ХЛ применяют хромофоры, одним из которых является люминол. При взаимодействии с активными формами кислорода люминофоры переходят в возбужденное состояние и при возвращении в исходное испускают квант света, регистрируемый с помощью хемилюминометра.

Специфичность реакции при данной инфекции обусловлена туберкулезным антигеном. Специфическими являются поверхностные антигены, расположенные в стенках микобактериальных клеток. Детерминанты поверхностных антигенов комплементарно взаимодействуют с сенсибилизированными антителами (Olitzki A.L. et al., 1967).

Способ осуществляют следующим образом: проводят забор крови; выделяют полиморфноядерные лейкоциты, добавляют люминол, определяют функциональную активность лейкоцитов опсонизированным зимозаном, в качестве индуктора используют специфический туберкулезный антиген в разведении 1:100.

Выделяют полиморфноядерные лейкоциты путем гипотонического лизиса эритроцитов дистиллированной водой с последующим центрифугированием и отмыванием выделенных лейкоцитов 1-кратным раствором Хэнкса без фенолового красного, трилоном Б (См. заявку на изобретение №2002 112596/15(013262) от 13.05.02).

Суспензию полученных отмытых лейкоцитов ресуспендируют в стабилизирующем растворе (см.приоритетную справку №2004113929 от 25.05.04).

Определяют жизнеспособность клеток 1% трипановым синим в камере Горяева (90-95%).

Добавляют:

раствор люминола;

суспензию лейкоцитов в стабилизирующем растворе с концентрацией лейкоцитов 2 млн в 1 мл;

зимозан опсонизированный;

антиген туберкулезный в разведении 1:100;

стабилизирующий раствор в контроль антигена.

Приготовление стабилизирующего раствора. В однократном растворе Хэнкса (К 90 мл дистиллированной воды добавить 10 мл концентрата Хэнкса без фенолового красного), растворить на магнитной мешалке при подогреве не выше 50°С 100 мг сухого бычьего лиофилизированного альбумина, 50 мг глюкозы («хч»).

Приготовление люминола - люминол-гидразид-3-фталевой кислоты),

40 мг люминола растворяют горячим (˜100°С) раствором 0,01 Н NaOH Определяют рН 7,2, доводят общий объем до 20 мл 1-кратным раствором Хэнкса без фенолового красного.

Приготовление опсонизированного зимозана для определения функциональной (фагоцитирующей) активности лейкоцитов крови. Взвешивают 20 (30, 40) мг зимозана, помещают в мерную колбу, заливают 10-кратным концентратом Хэнкса без фенолового красного (1 мл на 10 мг), кипятят 1 час. Центрифугируют 2 раза по 15 мин при 3000 об/мин 0,15 М NaCl. Опсонизируют нормальной сывороткой (пулом) в термостате 37°С - 30 мин. Центрифугируют, суспендируют осадок в 1-кратном Хэнкса без фенолового красного (1 мг/1 мл).

При высокой активности «дыхательного взрыва» исследуемых лейкоцитов уровень свечения превышает спонтанную хемилюминесценцию в 10 и более раз.

Приготовление антигена туберкулезного AT - ФО.

В качестве антигена используют специфическую фракцию из клеточных стенок микобактерий туберкулеза бычьего вида (штамм 8). Бактериальную массу двухмесячной культуры М. Bovis 8, выращенную на синтетической среде ВКЛ, осаждают центрифугированием и промывают дистиллированной водой. Суспензию бактериальных клеток в концентрации 50 мг/мл полувлажной бакмассы подвергают ультразвуковой дезинтеграции на аппарате УЗДН - 1 при параметрах 22 кГц, 0,5 А в течение 8-10 мин. Клеточные стенки отделяют центрифугированием 8 тыс. об/мин 30 мин, осадок ресуспендируют в 0,5% растворе фенола и вновь воздействуют ультразвуком в течение 30 мин. Осадок отделяют центрифугированием, а из надосадочной жидкости путем изоэлектрического фокусирования осаждают протеиновую фракцию при рН 4,0. Осадок суспендируют в минимальном объеме 0,5%-ного фенола и доводят концентрацию белка до 0,6-0,7 мг/мл. Активность антигена проверяют со специфическими кроличьими антисыворотками. Устанавливают рабочий титр не менее 1:400-1:800.

Пример 1. Подбор режима дезинтеграции бактериальной массы микобактерий.

Для получения антигенов из микобактерий сравнивали ультразвук:

а) высокой частоты (от 400 до 2400 кГц) и низкой интенсивности и б) низкой частоты (22 кГц) и высокой интенсивности.

При применении ультразвука высокой частоты и низкой интенсивности для разрушения микобактерий требуется продолжительное воздействие (1,5-4 часа) ультразвука, что вызывает значительную денатурацию активных комплексов бактериальной клетки и нагревание озвучиваемой смеси. Для охлаждения разрушаемой суспензии требуются дополнительные сложные приспособления (В.С.Золотов, 1967).

При применении ультразвука низкой частоты и высокой интенсивности для разрушения бактериальной клетки и клеточных оболочек требуется 10-30 мин при условии охлаждения разрушаемой бакмассы. Денатурации активных комплексов не наблюдается.

Таким образом, ультразвук низкой частоты и высокой интенсивности является оптимальным для разрушения бактериальной клетки и клеточных оболочек.

Пример 2. Подбор разведении антигена

Таблица 1 Уровень свечения лейкоцитов крови лабораторных животных при разведении антигена M.bovis шт.8 1:50, имп./сКонтрольная группа751Подопытная группа1812

Из таблицы 1 видно, что у зараженных животных свечение превышает контроль в 2,4 раза.

Таблица 2Уровень свечения лейкоцитов лабораторных животных при разведении антигена М.bovis 1:100, имп./сКонтрольная группа1116Подопытная группа5604

Из таблицы 2 видно, что у зараженных животных уровень свечения превышает контроль в 5 раз.

Таким образом, оптимальным разведением туберкулезного антигена является разведение 1:100.

В таблице 3 приводятся данные экспериментов на лабораторных животных.

Таблица 3Уровень ХЛ лейкоцитов лабораторных животных,экспериментально зараженных M.bovis шт.14 и M.tuberculosis, имп./сИсследуемые животныеAr-М.bovis шт.14Ar-tuberculosis H₃₇RvМорские свинкиЗаражен. M.bovis4532±19,6*1800±5,7Заражен. M.tuberculosis1572±19,68712±39,7*Контрольная группа1623±3,71754±75,3КроликиЗаражен. M.bovis1941±23,1*716±8,8Заражен. M.tuberculosis961±35,21440±6,0*Контрольная группа1020±25,4684±8,6

Примечание: *Р<0,001 уровень достоверно значимых различий между подопытными и контрольными группами.

Из таблицы 3 видно, что антиген M.bovis шт.8 взаимодействует только с гомологичными иммуноглобулинами животных, зараженных M.bovis, дает достоверное превышение уровня свечения по сравнению с контролем.

Проведенный эксперимент доказывает, что именно антиген M.bovis шт.8 дает наибольший пик свечения, что доказывает достоверность данных.

Учет результатов реакции. Положительной на туберкулез считается проба при превышении уровня свечения исследуемой по сравнению с контролем в 3-5 и более раз.

Общее время постановки реакции на приборе при условии, что клетки крови выделены непосредственно перед постановкой реакции, а компоненты реакции подготовлены заранее - не более 1, 5 часов.

Примечание: Абсолютные значения зависят от настройки хемилюминометра к калибровочному источнику.

Пример 3. Изучение диагностической эффективности ХЛ-метода в условиях эксперимента.

В эксперименте использовали телят 4-месячного возраста, содержащихся в условиях изолятора ОПХ ВНИИБТЖ. Животные 1-ой группы (2 гол.) были заражены дробно в 2 дня M.bovis шт.8 в дозе 0,15 мг/кг живой массы. Культура задавалась per os.

Телята второй группы (2 гол.) служили контролем. Пробы крови исследовали до заражения, после заражения - с интервалом 3-4 дня.

Полученные данные представлены в табл.4.

Таблица 4Уровень хемилюминесценции лейкоцитов телят, экспериментально зараженных М.bovis, имп./сСроки исследованияУровень хемилюминесценцииПодопытная группаДо заражения30,3±4,63После заражения:7-й день111,6±7,88*18-й день122,3±5,69*28-й день204,6±10,52*60-й день39,3±10,17Контрольная группа26,83±2,6Примечание: *Р<0,001 уровень достоверно значимых различий между подопытной и контрольной группами.

Из таблицы 4 видно, что уровень свечения клеток крови подопытных телят до заражения не превышает уровня контрольной группы.

На 8-й день после заражения - превышение уровня свечения клеток крови зараженных телят в сравнении с контролем в 4-5 раз;

на 18-й день - превышение уровня свечения клеток крови зараженных животных в сравнении с контролем в 3-5 раз;

на 28-й день - превышение уровня свечения клеток крови зараженных телят в сравнении с контролем у 2-го опытного теленка - в 8 раз.

Полученные данные показывают динамику туберкулезного процесса в организме, его активности и дальнейшей частичной элиминации возбудителя туберкулеза из организма.

Аллергическое исследование подопытных и контрольных телят до заражения дало отрицательный результат, у подопытных телят на 60-й день после заражения увеличение кожной складки от 7 до 30 мм.

По окончании опыта животные были убиты, при патологоанатомической экспертизе внутренних органов в заглоточных лимфоузлах обоих животных - туберкулезный лимфаденит.

При бактериологическом исследовании туберкулезного биоматериала выделены исходные заражающие штаммы М.bovis. Биопроба на морских свинках - положительная.

Таким образом, данные хемилюминесценции лейкоцитов крови подопытных телят положительно коррелировали с аллергическими и бактериологическими данными.

Опыт 2. Изучение диагностической эффективности ХЛ-метода в производственных условиях.

Изучение диагностической эффективности ХЛ-метода проводилось в хозяйствах, благополучных по туберкулезу.

Предполагается использовать этот метод как дополнительный для дифференциальной диагностики неспецифических реакций на ППД-туберкулин для млекопитающих, дальнейшего контроля благополучия по туберкулезу, предотвращения необоснованного убоя крупного рогатого скота.

В благополучных по туберкулезу АО «Конезавод Омский», АО «Дружба» и АО «Знамя» Марьяновского района Омской области исследованы 94 пробы крови от реагирующих на ППД-туберкулин коров.

Контролем служили пробы крови здоровых коров, не реагирующих на ППД-туберкулин для млекопитающих. Полученные результаты представлены в табл.5.

Таблица 5Данные комплексных исследований коров из хозяйств с разной эпизоотической ситуацией по туберкулезуХозяйство (АО, СПК)Эпизоот. ситуацияИсслед. коров (гол.)Реагиров. на ППД-туберкулин (гол.)Убито с диагност. цельюРезультат патологоанатомич. экспертизВыделены культурыИсслед. коров ХЛ-методом (гол.)Уровень свечения лейкоцитов исследов. коров (имп/с)Уровень свечения лейкоцит. контрольных коров (имп/с)ДружбаБлагопол.956486Отриц.Атипич. Микобакт.75М±mM±m150-160120-130Конезавод «Омский»Благопол.5341769Отриц.Атипич. Микобакт10126,3±1,4130±4,05ЗнамяБлагопол.4763383Отриц.Атипич.9120-130150-155

Из таблицы 5 видно, что в благополучных хозяйствах увеличения свечения исследуемых проб клеток крови при взаимодействии со специфическим антигеном в сравнении с контролем не наблюдалось. Данные ХЛ измерений помимо аллергического сопоставлялись с патологоанатомическим и бактериологическим методами. При контрольно-диагностическом убое во внутренних органах туберкулезных изменений не обнаружено. При бактериологическом исследовании культур возбудителей туберкулеза бычьего, человеческого и птичьего видов не выделено. Выделены атипичные микобактерии 3-4 гр. по классификации Раньона.

Таким образом, результаты измерений ХЛ оценивались по общепринятым статистическим критериям достоверности, сопоставлялись с бактериологическими, патологоанатомическими исследованиями. Данные бактериологических исследований дополнительно, наряду с ХЛ исследованиями, подтверждают неспецифическую природу аллергических реакций на ППД-туберкулин у исследованного поголовья крупного рогатого скота в этих хозяйствах, благополучных по туберкулезу.

На основании проведенных комплексных диагностических исследований исключен туберкулез крупного рогатого скота на фермах АО «Конезавод Омский», ЗАО «Знамя», ЗАО «Дружба».

На примере ЗАО «Дружба» показана экономическая эффективность проводимой работы по дифференциальной диагностике туберкулеза.

Расчет экономической эффективности работы по диагностике туберкулеза крупного рогатого скота на фермах ЗАО «Дружба» Марьяновского района.

В 2005 году предотвращен убой 42 реагирующих на ППД-туберкулин коров.

Удой молока от 1 коровы составляет 3378 кг. Реализационная цена 1 кг молока - 5,7 руб., себестоимость 1 кг молока - 3,4 руб., прибыль от производства 1 кг молока - 2,3 руб.

Производство продукции. От одной коровы получено молока на реализационную сумму 19254,6 руб.(5,7×3378) и прибыль хозяйства в 7769,4 руб.(2,3×3378).

От 42 коров получено молока в год на реализационную сумму 808693,2 тыс.руб. (19254,6×42) и прибыль хозяйства в 326314,8 руб.(7769,4 руб.×42).

Примечание: х) При расчете не учтено, что в ЗАО «Дружба» использовались и прореагировавшие в прошлые годы оставленные в хозяйстве коровы, в частности, в 2003 г. - 49 коров, в 2004 г. - 106 коров.

Таким образом, на 1 рубль затрат получена прибыль 8,15 руб.

Сопоставительный анализ показал, что в отличие от прототипа использование предлагаемого способа прижизненной диагностики туберкулеза позволяет повысить ее эффективность, что способствует решению поставленной нами задачи.

Изобретение относится к области лабораторной диагностики и может быть использовано для прижизненной диагностики туберкулеза. Сущность изобретения состоит в том, что прижизненную диагностику туберкулеза проводят путем выделения полиморфноядерных лейкоцитов, сохранения их в стабилизирующем растворе, в качестве индуктора используют опсонизированный зимозан, в качестве дополнительного индуктора используют специфический туберкулезный антиген в разведении 1:100, дезинтеграцию микобактерий осуществляют ультразвуком, исследуемая проба считается положительной при превышении уровня свечения исследуемой пробы крови в 3-5 раз в сравнении с контрольной пробой. Техническим результатом является повышение достоверности прижизненной диагностики туберкулеза. 5 табл.

Способ прижизненной диагностики туберкулеза, включающий выделение полиморфноядерных лейкоцитов, сохранение их в стабилизирующем растворе, определение индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции с использованием в качестве индуктора «дыхательного взрыва» опсонизированного зимозана, отличающийся тем, что в качестве дополнительного индуктора используют специфический туберкулезный антиген в разведении 1:100, представляющий собой специфическую фракцию клеточных стенок микробактерий туберкулеза M.bovis шт.8, дезинтеграцию которых проводят ультразвуком при параметрах 22 кГц, 0,5 А, и при повышении свечения по сравнению с контролем в 3-5 раз диагностируют туберкулез.