УГЛЕВОДНЫЙ СШИВАЮЩИЙ АГЕНТ Российский патент 2020 года по МПК C08B37/08 C08B37/10 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области гидрогелей, содержащих сшитые полисахариды, и к применению таких гидрогелей в медицинских и/или косметических целях. Более конкретно, настоящее изобретение связано с гидрогелями, полученными из сшитых гликозаминогликанов, в частности, из сшитых гиалуроновой кислоты, хондроитина или сульфата хондроитина.

Предшествующий уровень техники

Водопоглощающие гели, или гидрогели, широко применяются в области биомедицины. Обычно их получают путем химического сшивания полимеров с образованием неограниченных полимерных сеток. Хотя многие полисахариды поглощают воду до полного своего растворения, сшитые гели из этих же полисахаридов обычно могут поглощать определенное количество воды до своего насыщения, т.е. они обладают ограниченной способностью удерживать жидкости или ограниченной степенью набухания.

Гиалуроновая кислота, хондроитин и сульфат хондроитина являются хорошо известными биосовместимыми полимерами. Они представляют собой природные полисахариды, принадлежащие к группе гликозаминогликанов (GAG, от англ. - glycosaminoglycans). Все GAG представляют собой отрицательно заряженные гетерополисахаридные цепи, способные поглощать значительные количества воды.

Гиалуроновая кислота (НА, от англ. - hyaluronic acid) является одним из наиболее широко применяемых в медицине и косметологии биосовместимых полимеров. НА представляет собой природный полисахарид, принадлежащий к группе гликозаминогликанов (GAG). Гиалуроновая кислота и продукты, полученные из гиалуроновой кислоты, широко применяются в области биомедицины и косметологии, например, при вискохирургии и в качестве кожного наполнителя (филлера).

Сульфат хондроитина (CS, от англ. - chondroitin sulfate) представляет собой широко распространенный GAG, входящий в состав соединительных тканей млекопитающих, где он вместе с другими сульфатированными GAG связан с белками как часть протеогликанов. Ранее было показано, что гидрогели, содержащие CS, благодаря своему сходству с природным внеклеточным матриксом могут с успехом применяться для биомедицинских целей (Lauder, R.M., Complement Ther Med 17: 56-62, 2009). Сульфат хондроитина также используется для лечения остеоартрита, например, в качестве пищевой добавки.

Сшивание гликозаминогликанов продлевает срок службы разлагаемых полимеров, составляющих сеть, что полезно для их возможного применения. Однако сшивание может при этом ослабить нативные свойства гликозаминогликанов. Таким образом, обычно желательно поддерживать низкую степень модификации с помощью эффективного сшивания, чтобы сохранить нативные свойства и эффекты самого гликозаминогликана.

Сущность изобретения

Объектом настоящего изобретения является создание гидрогеля, содержащего гликозаминогликан (GAG) в качестве способного к набуханию полимера.

Еще одним объектом настоящего изобретения является создание способа сшивания молекул GAG с уменьшенным воздействием на нативные свойства молекул GAG.

Объектом настоящего изобретения также является обеспечение способа приготовления гидрогелей на основе молекул GAG с помощью мягких и эффективных способов.

Для этих и других объектов, которые будут очевидны из данного раскрытия, в соответствии с первым аспектом, настоящее изобретение предлагает гидрогелевый продукт, содержащий в качестве способного к набуханию полимера молекулы гликозаминогликанов, где молекулы гликозаминогликанов ковалентно сшиты посредством поперечных связей, содержащих спейсерную группу, выбранную из группы, состоящей из ди-, три-, тетра- и олигосахаридов.

Что касается предложенных способов получения гидрогелевых продуктов, описанных в данном контексте, термин "сшивающий агент" относится к молекуле, имеющей две или более функциональные группы, в частности, нуклеофильные функциональные группы, присоединенные к нереакционноспособной спейсерной группе, в частности, ди-, три-, тетра- или олигосахариду. Каждая из двух или более функциональных групп может реагировать с карбоксильными группами на молекулах GAG с образованием стабильных ковалентных связей. Предпочтительно, сшивающий агент состоит из двух или более функциональных групп и спейсера.

Что касается гидрогелевых продуктов по изобретению, описанных в данном контексте, термин "поперечная связь" относится к части или остатку сшивающего агента, при помощи которых молекулы GAG являются ковалентно связанными после сшивания. Поперечная связь обычно состоит из i) спейсерной группы и ii) связывающих групп, образующихся при реакции функциональных групп сшивающего агента с карбоксильными группами на GAG. Спейсерная группа может состоять, например, из тетрасахаридного остатка гиалуроновой кислоты, гексасахаридного остатка гиалуроновой кислоты, остатка трегалозы, лактозы, мальтозы, сахарозы, целлобиозы или рафинозы.

Сшивание посредством сшивающих агентов, содержащих спейсерную группу, выбранную из группы, состоящей из ди-, три-, тетра- и олигосахаридов, позволяет получить гидрогелевый продукт, полностью основанный на структурах углеводного типа или их производных, что сводит к минимуму негативное воздействие сшивания на нативные свойства гликозаминогликанов. Ди-, три-, тетра- или олигосахариды, предпочтительно, четко определены по структуре и молекулярной массе. Предпочтительно, спейсер выбирают из конкретной ди-, три-, тетра- или олигосахаридной структуры. Предпочтительно, ди-, три-, тетра- или олигосахарид является монодисперсным или имеет узкое молекулярно-массовое распределение. Использование сшивающих агентов на основе строго определенных ди-, три-, тетра- или олигосахаридов наряду с высокоэффективной реакцией конденсации позволяет получать продукт контролируемым образом. Сам по себе сшивающий агент также может способствовать поддержанию или усилению свойств гидрогеля, например, при сшивании с помощью структуры, которая коррелирует с гиалуроновой кислотой (например, с помощью диаминогиалуроновой кислоты в форме тетрасахарида), или при сшивании с помощью структуры с высокой водоудерживающей способностью (например, трегалозы).

GAG могут быть, например, сульфатированными или несульфатированными гликозаминогликанами, такими как гиалуронан, сульфат хондроитина, сульфат гепарана, гепаросан, гепарин, сульфат дерматана и сульфат кератана. Согласно некоторым вариантам осуществления, GAG является гиалуроновой кислотой, хондроитином или сульфатом хондроитина. Согласно предпочтительному варианту осуществления, GAG является гиалуроновой кислотой.

Согласно предпочтительным вариантам осуществления, GAG представляет собой нативный GAG. GAG, используемый применительно к изобретению, предпочтительно является природным GAG. GAG предпочтительно используют в его нативном (естественном) состоянии. Т.е. химическая структура GAG предпочтительно не преобразована или не модифицирована добавлением функциональных групп или тому подобным. Использование GAG в его нативном состоянии является предпочтительным, поскольку это позволяет создавать сшитую структуру, очень напоминающую природные молекулы, что сохраняет нативные свойства и эффекты самого GAG и может свести к минимуму иммунный ответ при введении сшитого GAG в организм.

Ковалентно сшитые молекулы GAG предпочтительно состоят или по существу состоят из структур углеводного типа или их производных. Это означает, что сшитые молекулы GAG предпочтительно не содержат или по существу не содержат синтетических неуглеводных структур или сшивающих агентов. Это может быть достигнуто за счет использования GAG в его нативном состоянии со сшивающим агентом, который состоит или по существу состоит из структур углеводного типа или их производных. Функциональные группы сшивающего агента далее ковалентно связываются с карбоксильными группами GAG. Таким образом, поперечные связи ковалентно сшитого GAG предпочтительно состоят или по существу состоят из ди-, три-, тетра- и олигосахаридных спейсерных групп.

Согласно второму аспекту, настоящее изобретение предлагает способ приготовления гидрогелевого продукта, содержащего сшитые молекулы гликозаминогликанов, включающий стадии:

(a) обеспечения раствора молекул гликозаминогликанов;

(b) активирования карбоксильных групп на молекулах гликозаминогликанов с помощью связывающего агента с образованием активированных молекул гликозаминогликанов;

(c) сшивания активированных молекул гликозаминогликанов посредством их активированных карбоксильных групп с помощью ди- или мультинуклеофильного функционального сшивающего агента, содержащего спейсерную группу, выбранную из группы, состоящей из ди-, три-, тетра- и олигосахаридов, с образованием сшитых молекул гликозаминогликанов.

Настоящее изобретение включает сшивание молекул гликозаминогликанов при помощи ковалентных связей, предпочтительно, амидных связей, обычно с использованием активирующего агента для карбоксильных групп на основной цепи молекулы гликозаминогликана и ди- или мультинуклеофильного функционального сшивающего агента, содержащего спейсерную группу, выбранную из группы, состоящей из ди-, три-, тетра- и олигосахаридов. Сшивание в соответствии со способом изобретения может быть обеспечено с помощью мягких и эффективных способов, приводящих к высоким выходам с минимальным разрушением молекул GAG.

Ди- или мультинуклеофильный функциональный сшивающий агент содержит спейсерную группу, выбранную из группы, состоящей из ди-, три-, тетра- и олигосахаридов, которая сохраняется в поперечных связях между молекулами GAG. Ди- или мультинуклеофильные функциональные ди-, три-, тетра- и олигосахариды содержат по меньшей мере две присоединенные к ним нуклеофильные функциональные группы. По меньшей мере две нуклеофильные функциональные группы предпочтительно разделены спейсерной группой, выбранной из группы, состоящей из ди-, три-, тетра- и олигосахаридов.

Ди- или мультинуклеофильный функциональный сшивающий агент содержит две или более функциональные группы, способные реагировать с функциональными карбоксильными группами GAG, что приводит к образованию ковалентных связей, предпочтительно, амидных связей. Нуклеофильные функциональные группы предпочтительно могут реагировать с карбоксильными группами на молекуле гликозаминогликана с образованием амидных связей. Согласно некоторым вариантам осуществления, нуклеофильные функциональные группы ди-, три-, тетра- и олигосахаридов выбирают из группы, состоящей из первичного амина, гидразина, гидразида, карбазата, семикарбазида, тиосемикарбазида, тиокарбазата и аминоокси.

Ди- или мультинуклеофильные функциональные ди-, три-, тетра- и олигосахариды могут быть получены из нуклеофильных функциональных полисахаридов, таких как хитобиоза, получаемая из хитина. Ди- или мультинуклеофильные функциональные ди-, три-, тетра- и олигосахариды также могут быть ди-, три-, тетра- и олигосахаридами, модифицированными путем введения двух или более нуклеофильных функциональных групп.

Предпочтительная группа ди- или мультинуклеофильного функционального сшивающего агента включает гомо- или гетеробифункциональные первичные амины, гидразины, гидразиды, карбазаты, семикарбазиды, тиосемикарбазиды, тиокарбазаты и аминоокси.

Согласно некоторым вариантам осуществления, стадия активирования (b) и стадия сшивания (с) протекают одновременно. Согласно другим вариантам осуществления, стадия активирования (b) протекает до и отдельно от стадии сшивания (с).

Согласно предпочтительному варианту осуществления, стадия (с) также включает обеспечение частиц из сшитой молекулы GAG, имеющих средний размер в диапазоне от 0,01 до 5 мм, предпочтительно, от 0,1 до 0,8 мм.

Согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления, связывающий агент на стадии (b) является конденсирующим реагентом для образования пептидной связи. Конденсирующий реагент для образования пептидной связи может быть выбран из группы, состоящей из связывающих реагентов на основе триазинов, связывающих реагентов на основе карбодиимидов, связывающих реагентов на основе производных имидазолия, Охута и COMU. Предпочтительный конденсирующий реагент для образования пептидной связи представляет собой связывающий реагент на основе триазина, включающий группу, состоящую из хлорида 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолина (DMTMM) и 2-хлор-4,6-диметокси-1,3,5-триазина (CDMT), предпочтительно, DMTMM. Другой предпочтительный конденсирующий реагент для образования пептидной связи представляет собой связывающий реагент на основе карбодиимида, предпочтительно, N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимид (ЕОС) в сочетании с N-гидроксисукцинимидом (NHS).

Согласно соответствующему аспекту, настоящее изобретение также предлагает применение гидрогелевого продукта в качестве лекарственного средства, например, при лечении дефектов мягких тканей. Предложен способ лечения пациента, страдающего дефектом мягких тканей, путем введения пациенту терапевтически эффективного количества гидрогелевого продукта. Также предложен способ обеспечения корректирующей или эстетической терапии в отношении пациента путем введения пациенту терапевтически эффективного количества гидрогелевого продукта.

Другие аспекты и предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания изобретения и прилагаемой формулы изобретения.

Подробный перечень предпочтительных вариантов осуществления изобретения

1. Гидрогелевый продукт, содержащий молекулы гликозаминогликанов в качестве способного к набуханию полимера, где молекулы гликозаминогликанов ковалентно сшиты посредством поперечных связей, содержащих спейсерную группу, выбранную из группы, состоящей из ди-, три-, тетра- и олигосахаридов.

2. Гидрогелевый продукт в соответствии с вариантом осуществления 1, где молекулы гликозаминогликанов выбраны из группы, состоящей из гиалуроновой кислоты, хондроитина и сульфата хондроитина, а также их смесей.

3. Гидрогелевый продукт в соответствии с вариантом осуществления 2, где молекулы гликозаминогликанов представляют собой гиалуроновую кислоту.

4. Гидрогелевый продукт в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где по меньшей мере 75% поперечных связей содержат спейсерную группу, выбранную из группы, состоящей из ди-, три-, тетра- и олигосахаридов.

5. Гидрогелевый продукт в соответствии с вариантом осуществления 4, где по меньшей мере 90% поперечных связей содержат спейсерную группу, выбранную из группы, состоящей из ди-, три-, тетра- и олигосахаридов.

6. Гидрогелевый продукт в соответствии с вариантом осуществления 5, где по меньшей мере 95% поперечных связей содержат спейсерную группу, выбранную из группы, состоящей из ди-, три-, тетра- и олигосахаридов.

7. Гидрогелевый продукт в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где спейсерная группа является тетрасахаридным остатком гиалуроновой кислоты, гексасахаридным остатком гиалуроновой кислоты, остатком трегалозы, лактозы, мальтозы, сахарозы, целлобиозы или рафинозы.

8. Гидрогелевый продукт в соответствии с вариантом осуществления 7, где спейсерная группа является тетрасахаридным остатком гиалуроновой кислоты или гексасахаридным остатком гиалуроновой кислоты.

9. Гидрогелевый продукт в соответствии с вариантом осуществления 7, где спейсерная группа является остатком трегалозы, лактозы, мальтозы, сахарозы, целлобиозы или рафинозы.

10. Гидрогелевый продукт в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где спейсерная группа выбрана из группы, состоящей из ди-, три- и тетрасахаридов.

11. Гидрогелевый продукт в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где поперечные связи связаны с молекулами гликозаминогликанов при помощи амидных связей.

12. Гидрогелевый продукт в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где по меньшей мере 75% связей между молекулами гликозаминогликанов и поперечными связями являются амидными связями.

13. Гидрогелевый продукт в соответствии с вариантом осуществления 12, где по меньшей мере 90% связей между молекулами гликозаминогликанов и поперечными связями являются амидными связями.

14. Гидрогелевый продукт в соответствии с вариантом осуществления 13, где по меньшей мере 95% связей между молекулами гликозаминогликанов и поперечными связями являются амидными связями.

15. Гидрогелевый продукт в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где менее чем 5% связей между молекулами гликозаминогликанов и поперечными связями являются сложноэфирными связями.

16. Гидрогелевый продукт в соответствии с вариантом осуществления 15, где менее чем 1% связей между молекулами гликозаминогликанов и поперечными связями являются сложноэфирными связями.

17. Гидрогелевый продукт в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где сшитая молекула гликозаминогликана имеет форму гелевых частиц, имеющих средний размер в диапазоне от 0,01 до 5 мм, предпочтительно, от 0,1 до 0,8 мм.

18. Гидрогелевый продукт в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления в форме инъецируемой композиции.

19. Способ приготовления гидрогелевого продукта, содержащего сшитые молекулы гликозаминогликанов, включающий стадии:

(a) обеспечения раствора молекул гликозаминогликанов;

(b) активирования карбоксильных групп на молекулах гликозаминогликанов с помощью связывающего агента с образованием активированных молекул гликозаминогликанов;

(c) сшивания активированных молекул гликозаминогликанов посредством их активированных карбоксильных групп с помощью ди- или мультинуклеофильного функционального сшивающего агента, содержащего спейсерную группу, выбранную из группы, состоящей из ди-, три-, тетра и олигосахаридов, с образованием сшитых молекул гликозаминогликанов.

20. Способ в соответствии с вариантом осуществления 19, где сшивание на стадии (с) обеспечивает амидные связи между молекулами гликозаминогликанов и сшивающими агентами.

21. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления с 19 по 20, где стадия активирования (b) и стадия сшивания (с) протекают одновременно.

22. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления с 19 по 21, где связывающий агент и сшивающий агент добавляют в гликозаминогликан одновременно.

23. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления с 19 по 20, где стадия активирования (b) протекает до и отдельно от стадии сшивания (с).

24. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления с 19 по 23, где стадия (с) также включает обеспечение частиц сшитого гликозаминогликана, имеющих средний размер в диапазоне от 0,01 до 5 мм, предпочтительно, от 0,1 до 0,8 мм.

25. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления с 19 по 24, где молекулы гликозаминогликанов выбирают из группы, состоящей из гиалуроновой кислоты, хондроитина и сульфата хондроитина, а также их смесей.

26. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления с 19 по 25, где молекулы гликозаминогликанов являются гиалуроновой кислотой.

27. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления с 19 по 26, где связывающий агент на стадии (b) является конденсирующим реагентом для образования пептидной связи.

28. Способ в соответствии с вариантом осуществления 27, где конденсирующий реагент для образования пептидной связи выбирают из группы, состоящей из связывающих реагентов на основе триазинов, связывающих реагентов на основе карбодиимидов, связывающих реагентов на основе производных имидазолия, Охугпа и COMU.

29. Способ в соответствии с вариантом осуществления 28, где конденсирующий реагент для образования пептидной связи является связывающим реагентом на основе триазина.

30. Способ в соответствии с вариантом осуществления 29, где связывающий реагент на основе триазина выбирают из группы, состоящей из хлорида 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолина (DMTMM) и 2-хлор-4,6-диметокси-1,3,5-триазина (CDMT).

31. Способ в соответствии с вариантом осуществления 30, где связывающий реагент на основе триазина представляет собой DMTMM.

32. Способ в соответствии с вариантом осуществления 28, где конденсирующий реагент для образования пептидной связи является связывающим реагентом на основе карбодиимида.

33. Способ в соответствии с вариантом осуществления 32, где связывающий реагент на основе карбодиимида представляет собой N-(3-диметиламинопропил)-N-этилкарбодиимид (EDC) в сочетании с N-гидроксисукцинимидом (NHS).

34. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления с 19 по 33, где спейсерная группа является тетрасахаридным остатком гиалуроновой кислоты, гексасахаридным остатком гиалуроновой кислоты, остатком трегалозы, лактозы, мальтозы, сахарозы, целлобиозы или рафинозы.

35. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления с 19 по 33, где спейсерная группа является тетрасахаридным остатком гиалуроновой кислоты или гексасахаридным остатком гиалуроновой кислоты.

36. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления с 19 по 33, где спейсерная группа является остатком трегалозы, лактозы, мальтозы, сахарозы, целлобиозы или рафинозы.

37. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления с 19 по 36, где спейсерную группу выбирают из группы, состоящей из ди-, три- и тетрасахаридов.

38. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления с 19 по 37, где нуклеофильные группы сшивающего агента выбирают из группы, состоящей из первичного амина, гидразина, гидразида, карбазата, семикарбазида, тиосемикарбазида, тиокарбазата и аминоокси.

39. Способ в соответствии с вариантом осуществления 38, где нуклеофильные группы ди-, три-, тетра- и олигосахаридов являются первичным амином.

40. Способ в соответствии с вариантом осуществления 39, где сшивающий агент является динуклеофильным функциональным сшивающим агентом.

41. Способ в соответствии с вариантом осуществления 40, где сшивающий агент выбирают из группы, состоящей из диаминогиалуроновой кислоты в форме тетрасахарида, диаминогиалуроновой кислоты в форме гексасахарида, диаминотрегалозы, диаминолактозы, диаминомальтозы, диаминосахарозы, хитобиозы или диаминорафинозы.

42. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления с 19 по 41, также включающий стадию:

(d) подвергания сшитых молекул гликозаминогликанов, полученных на стадии (с), щелочной обработке.

43. Продукт, получаемый с помощью способа в соответствии с любым из вариантов осуществления с 19 по 42.

44. Гидрогелевый продукт в соответствии с любым из вариантов осуществления с 1 по 18 и 43 для применения в качестве лекарственного средства.

45. Гидрогелевый продукт в соответствии с вариантом осуществления 44 для применения при лечении дефектов мягких тканей.

46. Применение гидрогелевого продукта в соответствии с любым из вариантов осуществления с 1 по 18 и 43 для приготовления лекарственного средства для лечения дефектов мягких тканей.

47. Способ лечения пациента, страдающего дефектом мягких тканей, путем введения пациенту терапевтически эффективного количества гидрогелевого продукта в соответствии с любым из вариантов осуществления с 1 по 18 и 43.

48. Способ обеспечения корректирующей или эстетической терапии в отношении пациента путем введения пациенту терапевтически эффективного количества гидрогелевого продукта в соответствии с любым из вариантов осуществления с 1 по 18 и 43.

49. Способ косметического лечения кожи, включающий введение в кожу гидрогелевого продукта в соответствии с любым из вариантов осуществления с 1 по 18 и 43.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение предлагает эффективные способы приготовления гидрогелей, полученных из сшитых молекул гликозаминогликанов (GAG), получаемые в результате этого гидрогелевые продукты и их применение. GAG представляют собой отрицательно заряженные гетерополисахаридные цепи, обладающие способностью поглощать значительные количества воды. В гидрогелевых продуктах согласно изобретению сшитая молекула GAG представляет собой способный к набуханию полимер, обеспечивающий гелевые свойства. Способ приготовления, описанный в данном контексте, является мягким по отношению к молекулам GAG, но при этом обеспечивает эффективное сшивание.

Таким образом, настоящее изобретение позволяет получать гидрогели молекул GAG путем сшивания в водных средах с использованием ди- или мультинуклеофильного функционального сшивающего агента, способного образовывать ковалентные связи непосредственно с карбоксильными группами молекул GAG посредством реакции с использованием связывающего агента.

GAG согласно изобретению предпочтительно выбирают из группы, состоящей из гиалуроновой кислоты, хондроитина и сульфата хондроитина. Согласно предпочтительному варианту осуществления, молекула GAG представляет собой гиалуроновую кислоту. Гиалуроновая кислота (НА) является одним из наиболее широко применяемых для медицинских и косметических целей биосовместимых полимеров. НА представляет собой природный полисахарид, принадлежащий к группе гликозаминогликанов (GAG). Гиалуроновая кислота и продукты, полученные из гиалуроновой кислоты, широко применяются в биомедицинских и косметических областях, например, при вискохирургии и в качестве кожного наполнителя.

Если не указано иное, термин "гиалуроновая кислота" охватывает все варианты и комбинации вариантов гиалуроновой кислоты, гиалуроната или гиалуронана с различными длинами цепей и зарядными состояниями, а также с различными химическими модификациями. То есть термин также охватывает различные гиалуронатные соли гиалуроновой кислоты с различными противоионами, такие как гиалуронат натрия. Гиалуроновая кислота может быть получена из различных источников животного и неживотного происхождения. Источники неживотного происхождения включают дрожжи и, предпочтительно, бактерии. Молекулярная масса одной молекулы гиалуроновой кислоты, как правило, составляет от 0,1 до 10 МДа, но возможны также и другие молекулярные массы.

Термин "хондроитин" относится к GAG, содержащим дисахаридное повторяющееся звено, состоящее из чередующихся фрагментов несульфатированной D-глюкуроновой кислоты и N-ацетил-D-галактозамина. Во избежание неопределенности, термин "хондроитин" не охватывает ни одну из форм сульфата хондроитина.

Термин "сульфат хондроитина" относится к GAG, содержащим дисахаридное повторяющееся звено, состоящее из чередующихся фрагментов D-глюкуроновой кислоты и N-ацетил-D-галактозамина. Сульфатная группа может находиться в различных положениях. Предпочтительными молекулами сульфата хондроитина являются хондроитин-4-сульфат и хондроитин-6-сульфат.

Молекулы хондроитина могут быть получены из различных источников животного и неживотного происхождения. Источники неживотного происхождения включают дрожжи и, предпочтительно, бактерии. Молекулярная масса одной молекулы хондроитина, как правило, составляет от 1 до 500 кДа, но возможны и другие молекулярные массы.

Сшитый GAG содержит поперечные связи между цепями молекул GAG, что создает непрерывную сетку из молекул GAG, которая удерживается вместе с помощью ковалентных поперечных связей.

Цепи молекул GAG предпочтительно сшиты друг с другом с помощью сшивающих агентов, содержащих спейсерную группу, выбранную из группы, состоящей из ди-, три-, тетра- и олигосахаридов.

Предпочтительно, чтобы сшивающие агенты связывались с молекулами гликозаминогликанов амидными связями.

Сшитый продукт GAG предпочтительно является биосовместимым. Это означает, что у подвергнутого лечению индивидуума иммунный ответ отсутствует или проявляется очень слабо. То есть у подвергнутого лечению индивидуума нежелательные местные или системные эффекты отсутствуют или являются очень слабыми.

Сшитый продукт согласно изобретению является гелем или гидрогелем. То есть при воздействии жидкости, как правило, водной жидкости, его можно рассматривать как нерастворимую в воде, но по существу разбавленную сшитую систему молекул GAG.

Гель содержит в основном жидкость по массе и может содержать, например, от 90 до 99,9% воды, но при этом ведет себя подобно твердому веществу из-за трехмерной сетки из сшитых молекул GAG внутри жидкости. Благодаря значительному содержанию в нем жидкости гель является структурно гибким и подобен природной ткани, что позволяет использовать его в качестве каркаса в тканевой инженерии и для увеличения ткани. Он также полезен для терапии дефектов мягких тканей и для корректирующей или эстетической терапии. Его предпочтительно используют в виде инъецируемой композиции.

Сшивание молекулы GAG может быть осуществлено путем активации с помощью связывающего агента с последующей реакцией со сшивающим агентом. Концентрация молекул и степень сшивания влияют на механические свойства, например, модуль упругости G', и характеристики устойчивости геля. Гели из сшитых молекул GAG можно охарактеризовать с точки зрения "степени модификации". Степень модификации гелей молекул GAG, как правило, составляет от 0,01 до 15 мол. %. Степень модификации (мол. %) определяет количество сшивающего агента (агентов), связанного с молекулой GAG, т.е. количество в молях связанного сшивающего агента (агентов) относительно общего молярного количества повторяющихся дисахаридных звеньев. Степень модификации отражает то, насколько молекула GAG химически модифицирована с помощью сшивающего агента. Условия реакции активации и сшивания, а также подходящие аналитические методы определения степени модификации хорошо известны специалистам в данной области, которые смогут легко отрегулировать эти и другие соответствующие факторы и тем самым обеспечить подходящие условия для получения требуемой степени модификации, а также проконтролировать характеристики конечного продукта в отношении степени модификации.

Гидрогелевый продукт также может содержать часть молекул GAG, которые не являются сшитыми, то есть не связаны с трехмерной сетью из сшитых молекул GAG. Тем не менее, предпочтительно, чтобы по меньшей мере 50 мас. %, предпочтительно, по меньшей мере 60 мас. %, более предпочтительно, по меньшей мере 70 мас. % и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 80 мас. % молекул GAG в гелевой композиции составляли часть сети из сшитых молекул GAG.

Сшитая молекула GAG предпочтительно присутствует в форме гелевых частиц. Гелевые частицы предпочтительно имеют средний размер в диапазоне от 0,01 до 5 мм, предпочтительно, от 0,1 до 0,8 мм, такой как от 0,2 до 0,5 мм или 0,5 до 0,8 мм.

Гидрогелевый продукт может входить в состав водного раствора, но может также присутствовать в высушенной или осажденной форме, например, в этаноле. Гидрогелевый продукт предпочтительно является инъецируемым.

Гидрогелевый продукт может быть получен с помощью способа, включающего стадии:

(a) обеспечения раствора молекул гликозаминогликанов;

(b) активирования карбоксильных групп на молекулах гликозаминогликанов с помощью связывающего агента с образованием активированных молекул гликозаминогликанов;

(c) сшивания активированных молекул гликозаминогликанов посредством их активированных карбоксильных групп с помощью ди- или мультинуклеофильного функционального сшивающего агента, содержащего спейсерную группу, выбранную из группы, состоящей из ди-, три-, тетра и олигосахаридов, с образованием сшитых молекул гликозаминогликанов.

GAG согласно изобретению предпочтительно выбирают из группы, состоящей из гиалуроновой кислоты, хондроитина и сульфата хондроитина. Согласно предпочтительному варианту осуществления, молекула GAG является гиалуроновой кислотой.

На стадии активирования (b) карбоксильные группы на молекулах GAG активируют с помощью связывающего агента с образованием активированных молекул GAG.

Согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления, конденсирующий реагент для образования пептидной связи выбран из группы, состоящей из связывающих реагентов на основе триазинов, связывающих реагентов на основе карбодиимидов, связывающих реагентов на основе производных имидазолия, Oxyma и COMU.

Конденсирующий реагент для образования пептидной связи предпочтительно представляет собой связывающий реагент на основе триазина, такой как хлорид 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолина (DMTMM) и 2-хлор-4,6-диметокси-1,3,5-триазин (CDMT). Предпочтительным конденсирующим реагентом для образования пептидной связи на основе триазина является DMTMM.

Другими предпочтительными конденсирующими реагентами для образования пептидной связи являются связывающие реагенты на основе карбодиимидов, предпочтительно, N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимид (EDC) в сочетании с N-гидроксисукцинимидом (NHS).

На стадии сшивания (с) сшивание активированных молекул GAG происходит посредством их карбоксильных групп с помощью сшивающего агента. Сшивающий агент представляет собой ди- или мультинуклеофильный функциональный сшивающий агент, содержащий спейсерную группу, выбранную из группы, состоящей из ди-, три-, тетра- и олигосахаридов. Сшивающий агент соединяет цепи GAG друг с другом посредством карбоксильных групп на основной цепи GAG. Спейсерной группой может быть, например, тетрасахаридный остаток гиалуроновой кислоты, гексасахаридный остаток гиалуроновой кислоты, остаток трегалозы, лактозы, мальтозы, сахарозы, целлобиозы или рафинозы. Под термином "остаток" в данном контексте подразумевается, что структура соединения аналогична, но не идентична общеизвестным соединениям гиалуроновой кислоты в форме тетрасахарида, гиалуроновой кислоты в форме гексасахарида, трегалозе, лактозе, мальтозе, сахарозе, целлобиозе или рафинозе, соответственно. Структура остатка может отличаться от структуры исходного соединения тем, что она снабжена двумя или более нуклеофильными функциональными группами и необязательно ковалентно связана посредством указанных нуклеофильных функциональных групп с карбоксильными группами на основной цепи GAG.

Ди- или мультинуклеофильный функциональный сшивающий агент содержит две или более функциональные группы, способные реагировать с функциональными карбоксильными группами GAG, что приводит к образованию ковалентных связей, предпочтительно, амидных связей.

Предпочтительная группа ди- или мультинуклеофильного функционального сшивающего агента включает гомо- или гетеробифункциональные первичные амины, гидразины, гидразиды, карбазаты, семикарбазиды, тиосемикарбазиды, тиокарбазаты и аминоокси. Неограничивающие примеры таких гетеробифункциональных сшивающих агентов, используемых в настоящем изобретении, включают:

диаминотрегалозу (6,6'-диамино-6,6'-дидезокситрегалозу);

диаминосахарозу (6,6'-диамино-6,6'-дидезоксисахарозу);

хитобиозу (2,2'-диамино-2,2'-дидезоксицеллобиозу);

диаминолактозу (6,6'-диамино-6,6'-дидезоксилактозу);

"восстановленную N-дезацетилированную гиалуроновую кислоту в форме тетрасахарида" или

"восстановленную диаминогиалуроновую кислоту в форме тетрасахарида"; и

диаминорафинозу (6,6''-диамино-6,6''-дидезоксирафинозу).

Схемы реакций с 1а по 1h схематически иллюстрируют примеры связывания с помощью гетеробифункционального первичного амина (1а), аминоокси (1b), карбазата (1с), семикарбазида (1d), тиосемикарбазида (1е), тиокарбазата (1f), гидразина (1g) и гидразида (1h):

Ди- или мультинуклеофильный функциональный сшивающий агент содержит спейсерную группу, выбранную из группы, состоящей из ди-, три-, тетра- и олигосахаридов, остающуюся в поперечных связях между молекулами GAG.

Способ может быть осуществлен как однореакторный синтез в водной среде, включающий ковалентное связывание ди- или мультинуклеофильных функциональных сшивающих агентов непосредственно с собственными карбоксильными группами на нативных GAG при использовании подходящего связывающего агента. Согласно предпочтительному варианту осуществления, стадия активирования (b) и стадия сшивания (с) протекают одновременно.

Согласно другому варианту осуществления, стадия активирования (b) протекает до и отдельно от стадии сшивания (с).

Способ получения сшитого гидрогеля обычно включает приготовление смеси молекулы GAG, такой как гиалуроновая кислота, со сшивающим агентом, таким как диаминотрегалоза (DATH) (от 0,001 до 10 молярных эквивалентов амина по отношению к карбоксильным группам или, предпочтительно, от 0,001 до 1 молярных эквивалентов), и связывающим агентом, таким как DMTMM (от 0,01 до 10 молярных эквивалентов по отношению к карбоксильным группам или, предпочтительно, от 0,05 до 1 молярных эквивалентов). Инкубирование смеси при температуре от 5 до 50°С, предпочтительно, от 10 до 40°С или, еще более предпочтительно, от 20 до 35°С, в течение от 2 до 120 часов, предпочтительно, от 4 до 48 часов, с последующей обработкой щелочью, нейтрализацией, осаждением, промывкой и сушкой в вакууме позволяет получить сшитый полисахарид в виде твердого вещества. Осадку давали возможность набухнуть в фосфатном буфере, содержащем NaCl, с образованием гидрогеля, гидрогель предпочтительно микронизировали с получением гидрогелевых частиц размером от 0,01 до 5 мм, предпочтительно, от 0,1 до 1 мм.

Стандартное применение получаемого в результате гидрогелевого продукта включает приготовление инъецируемых композиций для лечения дефектов мягких тканей, включая, но не ограничиваясь перечнем, корректирующую и эстетическую терапии.

Согласно еще одному конкретному варианту осуществления, сшивание сульфата хондроитина с помощью DATH может быть осуществлено следующим образом.

Диаминотрегалозу (DATH) синтезируют, как описано в работе "Synthetic Carbohydrate Polymers Containing Trehalose Residues in the Main Chain: Preparation and Characteristic Properties (Синтетические углеводные полимеры, содержащие остатки трегалозы в основной цепи: получение и свойства)"; Keisuke Kurita,* Naoko Masuda, Sadafumi Aibe, Kaori Murakami, Shigeru Ishii, Shin-Ichiro Nishimurat; Macromolecules 1994, 27, 7544-7549.

Сульфат хондроитина (CS) (от 10 до 200 кДа) взвешивают в пробирке фирмы Falcon. Базовый раствор диаминотрегалозы (DATH) готовят растворением DATH в фосфатном буфере с рН 7,4. DMTMM взвешивают в колбе, и в DMTMM добавляют раствор DATH. Величину рН раствора DMTMM-DATH доводят приблизительно до 7 с помощью 1,2 М HCl или 0,25 М NaOH, после чего смесь добавляют в CS. Содержимое тщательно гомогенизируют и затем инкубируют при температуре от 15 до 55°С в течение от 2 до 48 ч. Полученный материал дважды продавливают через стальную сетку с ячейками 1 мм и дают возможность набухнуть в NaOH. Гель нейтрализуют при помощи 1,2 М HCl до рН 7 и осаждают этанолом. Полученный осадок промывают раствором 100 мМ NaCl в 70% этаноле, 70% раствором этанола и этанолом. Полученное твердое вещество сушат при температуре 25°С в вакууме. Осадку дают возможность набухнуть в фосфатном буфере с рН 7,4, содержащем 0,7% NaCl, и трижды продавливают через фильтровальную сетку. Сшитый CS-гель заполняют в шприцы и стерилизуют.

Согласно другому конкретному варианту осуществления, сшивание НА с помощью диаминосахарозы может быть осуществлено следующим образом.

Диаминосахарозу получают, как описано в работе "Library of mild and economic protocols for the selective derivatization of sucrose under microwave irradiation (Библиотека легких и экономичных протоколов для селективной дериватизации сахарозы под действием микроволнового излучения)"; М. Teresa Barros, Krasimira Т. Petrova, Paula Correia-da-Silva, Taterao M. Potewar; Green Chem., 2011, 13, 1897-1906.

Гиалуроновую кислоту (НА) (от 10 до 1000 кДа) взвешивают в колбе. Базовый раствор диаминосахарозы готовят растворением диаминосахарозы в фосфатном буфере с рН 7,4. DMTMM взвешивают в колбе, и в DMTMM добавляют раствор диаминосахарозы. Величину рН раствора DMTMM-диаминосахарозы доводят приблизительно до 7 с помощью 1,2 М HCl или 0,25 М NaOH, после чего смесь добавляют в НА. Содержимое тщательно гомогенизируют и затем инкубируют при температуре от 15 до 55°С в течение от 2 до 48 ч. Полученный материал дважды продавливают через стальную сетку с ячейками 1 мм и дают возможность набухнуть в NaOH. Гель нейтрализуют при помощи 1,2 М HCl до рН 7 и осаждают этанолом. Полученный осадок промывают раствором 100 мМ NaCl в 70% этаноле, 70% раствором этанола и этанолом. Полученное твердое вещество сушат при температуре 25°С в вакууме. Осадку дают возможность набухнуть в фосфатном буфере с рН 7,4, содержащем 0,7% NaCl, и трижды продавливают через фильтровальную сетку. Сшитый НА-гель заполняют в шприцы и стерилизуют.

Согласно другому конкретному варианту осуществления, сшивание НА с помощью хитобиозы может быть осуществлено следующим образом.

Гиалуроновую кислоту (НА) (от 10 до 1000 кДа) взвешивают в колбе. Базовый раствор хитобиозы (приобретенной в Carbosynth Ltd. UK) готовят растворением хитобиозы в фосфатном буфере с рН 7,4. DMTMM взвешивают в колбе, и в DMTMM добавляют раствор хитобиозы. Величину рН раствора DMTMM-хитобиозы доводят приблизительно до 7 с помощью 1,2 М HCl или 0,25 М NaOH, после чего смесь добавляют в НА. Содержимое тщательно гомогенизируют и затем инкубируют при температуре от 15 до 55°С в течение от 2 до 48 ч. Полученный материал дважды продавливают через стальную сетку с ячейками 1 мм и дают возможность набухнуть в NaOH. Гель нейтрализуют при помощи 1,2 М HCl до рН 7 и затем осаждают этанолом. Полученный осадок промывают раствором 100 мМ NaCl в 70% этаноле, 70% раствором этанола и этанолом. Полученное твердое вещество сушат при температуре 25°С в вакууме. Осадку дают возможность набухнуть в фосфатном буфере с рН 7,4, содержащем 0,7% NaCl, и трижды продавливают через фильтровальную сетку. Сшитый НА-гель заполняют в шприцы и стерилизуют.

Согласно другому конкретному варианту осуществления, сшивание НА с помощью восстановленного диамино-НА-тетрасахарида может быть осуществлено следующим образом.

Гиалуроновую кислоту (НА) (от 10 до 1000 кДа) взвешивают в колбе. Базовый раствор восстановленного диамино-НА-тетрасахарида готовят растворением восстановленного диамино-НА-тетрасахарида в фосфатном буфере с рН 7,4. DMTMM взвешивают в колбе, и в DMTMM добавляют раствор восстановленного диамино-НА-тетрасахарида. Величину рН раствора DMTMM и восстановленного диамино-НА-тетрасахарида доводят приблизительно до 7 с помощью 1,2 М HCl или 0,25 М NaOH, после чего смесь добавляют в НА. Содержимое тщательно гомогенизируют и инкубируют при температуре от 15 до 55°С в течение от 2 до 48 ч. Полученный материал дважды продавливают через стальную сетку с ячейками 1 мм и дают возможность набухнуть в NaOH. Гель нейтрализуют при помощи 1,2 М HCl до рН 7 и осаждают этанолом. Полученный осадок промывают раствором 100 мМ NaCl в 70% этаноле, 70% раствором этанола и этанолом. Полученное твердое вещество сушат при температуре 25°С в вакууме. Осадку дают возможность набухнуть в фосфатном буфере с рН 7,4, содержащем 0,7% NaCl, и трижды продавливают через фильтровальную сетку. Сшитый НА-гель заполняют в шприцы и стерилизуют.

Согласно другому конкретному варианту осуществления, сшивание НА с помощью дикарбазаттрегалозы может быть осуществлено следующим образом.

α,α-D-Трегалозу (1 экв.) (безводную) (Carbosynth Ltd. UK) растворяют в сухом диметилформамиде (ДМФА), после чего добавляют триэтиламин (от 2 до 6 экв.). Колбу охлаждают до температуры 0°С (лед/вода) в атмосфере N₂. В колбу по каплям прибавляют 4-нитрофенилхлорформиат (от 2 до 6 экв.). Полученную смесь оставляют перемешиваться при комнатной температуре в течение от 2 до 48 ч, после чего концентрируют, очищают с помощью FC (англ. Flash Chromatography - флэш-хроматография) и сушат в вакууме. Продукт растворяют в ДМФА, в раствор добавляют моногидрат гидразина (от 2 до 20 экв.) и перемешивают при температуре от 0 до 50°С в течение от 4 до 48 ч. Затем реакционную массу концентрируют, очищают с помощью FC и сушат в вакууме с получением α,α-В-6,6'-дидезокси-6,6'-дикарбазаттрегалозы (дикарбазаттрегалозы, DCT).

Гиалуроновую кислоту (НА) (от 10 до 1000 кДа) взвешивают в колбе. Базовый раствор дикарбазаттрегалозы (DCT) готовят растворением DCT в фосфатном буфере с рН 7,4. DMTMM взвешивают в колбе, и в DMTMM добавляют раствор DCT. Величину рН раствора DMTMM-DCT доводят приблизительно до 7 с помощью 1,2 М HCl или 0,25 М NaOH, после чего смесь добавляют в НА. Содержимое тщательно гомогенизируют и инкубируют при температуре от 15 до 55°С в течение от 2 до 48 ч. Полученный материал дважды продавливают через стальную сетку с ячейками 1 мм и дают возможность набухнуть в NaOH. Гель нейтрализуют при помощи 1,2 М HCl до рН 7 и осаждают этанолом. Полученный осадок промывают раствором 100 мМ NaCl в 70% этаноле, 70% раствором этанола и этанолом. Полученное твердое вещество сушат при температуре 25°С в вакууме. Осадку дают возможность набухнуть в фосфатном буфере с рН 7,4, содержащем 0,7% NaCl, и затем трижды продавливают через фильтровальную сетку. Сшитый НА-гель заполняют в шприцы и стерилизуют.

Согласно другому конкретному варианту осуществления, сшивание НА с помощью диаминоокситрегалозы может быть осуществлено следующим образом.

К перемешиваемой суспензии α,α-D-трегалозы (1 экв.) (безводной) (Carbosynth Ltd. UK) в безводном ТГФ прибавляют N-гидроксифталимид (от 2 до 10 экв.) и трифенилфосфин (от 2 до 10 экв.), после чего смесь перемешивают в течение от 5 до 60 мин. После этого по каплям при температуре от 0 до 40°С прибавляют диизопропилазодикарбоксилат (DIAD, от 2 до 10 экв.), и смесь перемешивают в течение от 2 до 48 ч при температуре от 0 до 40°С.Растворитель отгоняют в вакууме, технический продукт очищают при помощи FC и сушат в вакууме. Суспензию продукта в смеси МеОН и CH₂Cl₂ обрабатывают моногидратом гидразина (от 2 до 20 экв.), смесь перемешивают при температуре от 0 до 40°С в течение от 2 до 24 ч, затем концентрируют, очищают при помощи FC и сушат в вакууме с получением диаминоокситрегалозы.

Гиалуроновую кислоту (НА) (от 10 до 1000 кДа) взвешивают в колбе. Базовый раствор диаминоокситрегалозы (DAOT) готовят растворением DAOT в фосфатном буфере с рН 7,4. DMTMM взвешивают в колбе, и в DMTMM добавляют раствор DAOT. Величину рН раствора DMTMM-DAOT доводят приблизительно до 7 с помощью 1,2 М HCl или 0,25 М NaOH, после чего смесь добавляют в НА. Содержимое тщательно гомогенизируют и инкубируют при температуре от 15 до 55°С в течение от 2 до 48 ч.

Полученный материал дважды продавливают через стальную сетку с ячейками 1 мм и дают возможность набухнуть в NaOH. Гель нейтрализуют при помощи 1,2 М HCl до рН 7 и осаждают этанолом. Полученный осадок промывают раствором 100 мМ NaCl в 70% этаноле, 70% раствором этанола и этанолом. Полученное твердое вещество сушат при температуре 25°С в вакууме. Осадку дают возможность набухнуть в фосфатном буфере с рН 7,4, содержащем 0,7% NaCl, и затем трижды продавливают через фильтровальную сетку. Сшитый НА-гель заполняют в шприцы и стерилизуют.

Описание примеров осуществления изобретения

Не ограничиваясь этим, настоящее изобретение далее будет проиллюстрировано с помощью примеров.

Определения и анализ

SwF - набухаемость (от англ. - swelling factor); анализ набухаемости проводили в солевом растворе.

[PS] - концентрация полисахарида, например, концентрация НА. Концентрацию PS измеряли с помощью жидкостной хроматографии-эксклюзионной хроматографии размеров-УФ (англ. LC-SEC-UV) или в ближней ИК-области (англ. NIR).

GelP - гелевая часть (также иногда называемая содержанием геля или GelC), представляет собой процентную долю полисахарида, входящего в состав гелевой сетки. Число 90% означает, что лишь 10% полисахарида не входит в состав сетки. Количество свободного полисахарида в геле измеряли с помощью жидкостной хроматографии-эксклюзионной хроматографии размеров-УФ (англ. LC-SEC-UV).

SwC - набухающая способность (от англ. - swelling capacity), представляет собой общее количество жидкости, поглощенной одним граммом полисахарида, не скорректированное с учетом гелевой части.

SwCC - скорректированная набухающая способность (также иногда называемая SwDC), представляет собой общее количество жидкости, поглощенной одним граммом полисахарида, скорректированное с учетом гелевой части.

CrR - коэффициент эффективного сшивания, анализировали методом жидкостной хроматографии-эксклюзионной хроматографии размеров-МС (англ. LC-SEC-MS) и определяли следующим образом:

CrR, равный 1,0, означает, что весь сшивающий агент является сшитым.

Щелочной или тепловой гидролиз

В некоторых из представленных ниже примеров для того, чтобы гидролизовать эфирные связи, образовавшиеся во время процесса сшивания, продукт подвергали щелочному либо тепловому гидролизу. Щелочной/тепловой гидролиз приводит к образованию в конечном продукте только амидных поперечных связей. Щелочной/тепловой гидролиз выполняли следующим образом.

Щелочной гидролиз

Материалу давали возможность набухнуть в 0,25 М NaOH (1 г материала: 9 г 0,25 М NaOH, с получением рН 13) в течение по меньшей мере 1 ч при комнатной температуре. Гель нейтрализовали 1,2 М HCl до рН 7, после чего осаждали при помощи этанола. Полученный осадок промывали раствором 100 мМ NaCl в 70% этаноле для удаления избыточных реагентов, затем 70% этанолом для удаления солей и, наконец, этанолом для удаления воды. Этанол удаляли в вакуумной сушильной установке в течение ночи.

Осадку давали возможность набухнуть в фосфатном буфере с рН 7,4, содержащем 0,7% NaCl, и затем трижды продавливали через мелкую фильтровальную сетку. Гель заполняли в шприцы и стерилизовали. В некоторых случаях пару шприцов оставляли нестерилизованными, чтобы оценить эффект от стерилизации.

Тепловой гидролиз

Материалу давали возможность набухнуть в фосфатном буфере с рН 7,4, содержащем 0,7% NaCl, при комнатной температуре. При необходимости величину рН доводили до 7,2-7,5. Гель оставляли при температуре 70°С в течение 20-24 ч, после чего уменьшали размер частиц, трижды пропуская через мелкую фильтровальную сетку. Гель заполняли в шприцы и стерилизовали. В некоторых случаях пару шприцов оставляли нестерилизованными, чтобы оценить эффект от стерилизации.

Синтез гиалуроновой диаминотрегалозы

Диаминотрегалозу (DATH) синтезировали, как описано в работе "Synthetic Carbohydrate Polymers Containing Trehalose Residues in the Main Chain: Preparation and Characteristic Properties (Синтетические углеводные полимеры, содержащие остатки трегалозы в основной цепи: получение и свойства)"; Keisuke Kurita,* Naoko Masuda, Sadafumi Aibe, Kaori Murakami, Shigeru Ishii, Shin-Ichiro Nishimurat; Macromolecules 1994, 27, 7544-7549.

Пример 1

Сшивание гиалуроновой кислоты с помощью диаминотрегалозы (DATH)

Была проведена серия экспериментов (Примеры с 1-1 по 1-5), включающая сшивание гиалуроновой кислоты (НА), имеющей разные молекулярные массы, с помощью различных молярных соотношений DATH при использовании в качестве связывающего агента хлорида 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолина (DMTMM). Соотношения между НА, DATH и DMTMM указаны в Таблице 1 ниже.

Гиалуронан (молекулярная масса (M_w) приблизительно от 100 кДа до 1000 кДа) взвешивали в пробирке фирмы Falcon. Базовый раствор диаминотрегалозы (DATH) готовили растворением DATH (0,001-0,005 экв.) в фосфатном буфере с рН 7,4. DMTMM (0,05 экв.) взвешивали в политетрафторэтиленовом (англ. PTFE) контейнере, и в DMTMM добавляли раствор DATH для его растворения. Величину рН раствора DMTMM-DATH доводили до 6-7 с помощью 1,2 М HCl или 0,25 М NaOH, после чего его добавляли в НА. Содержимое тщательно гомогенизировали и затем инкубировали при температуре 35°С в течение 24 ч.

Полученный материал дважды продавливали через стальную сетку с ячейками 1 мм и затем обрабатывали раствором NaOH. Гель нейтрализовали 1,2 М HCl до рН 7, после чего осаждали при помощи этанола. Полученный осадок промывали раствором 100 мМ NaCl в 70% этаноле для удаления избыточных реагентов, затем 70% этанолом для удаления солей и, наконец, этанолом для удаления воды. Этанол удаляли в вакуумной сушильной установке в течение ночи.

Осадку давали возможность набухнуть в фосфатном буфере с рН 7,4, содержащем 0,7% NaCl, и затем трижды продавливали через фильтровальную сетку. Гель заполняли в шприцы и стерилизовали.

н/д - нет данных, так как анализ не проводили

Пример 2

Сшивание гиалуроновой кислоты с помощью диаминотрегалозы (DATH)

Проводили серию экспериментов (Примеры с 2-1 по 2-11), включающих сшивание гиалуроновой кислоты (НА), имеющей различные молекулярные массы, с помощью различных молярных соотношений DATH при использовании хлорида в качестве связывающего агента 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолина (DMTMM). Соотношения между НА, DATH и DMTMM указаны в Таблице 2 ниже.

Гиалуроновую кислоту взвешивали в реакционной колбе. Базовый раствор сшивающего агента (DATH) готовили растворением его в фосфатном буфере с рН 7,4. DMTMM взвешивали в политетрафторэтиленовом (англ. PTFE) контейнере, и в DMTMM добавляли раствор сшивающего агента для его растворения. Величину рН раствора DMTMM-сшивающего агента доводили до 6-7 с помощью 1,2 М HCl или 0,25 М NaOH, после чего добавляли его в НА. Содержимое тщательно гомогенизировали и затем инкубировали при температуре 35°С в течение 24 ч. Полученный материал дважды продавливали через стальную сетку с ячейками 1 мм и затем обрабатывали либо теплом, либо щелочью. Результаты представлены в Таблице 2.

Пустые клетки - не анализировали.

Пример 3

Сшивание гиалуроновой кислоты с помощью хитобиозы (СВ)

Гиалуроновую кислоту взвешивали в реакционной колбе. Базовый раствор сшивающего агента (хитобиозы) готовили растворением его в фосфатном буфере с рН 7,4. DMTMM взвешивали в политетрафторэтиленовом (англ. PTFE) контейнере, и в DMTMM добавляли раствор сшивающего агента для его растворения. Величину рН раствора DMTMM-сшивающего агента доводили до 6-7 с помощью 1,2 М HCl, после чего добавляли его в НА. Содержимое тщательно гомогенизировали и затем инкубировали при температуре 35°С в течение 24 ч. Полученный материал дважды продавливали через стальную сетку с ячейками 1 мм и затем обрабатывали либо теплом, либо щелочью в соответствии с общими методиками. Соотношения между НА, хитобиозой и DMTMM указаны ниже в Таблице 3 (Примеры с 3-1 по 3-2).

Пример 4

Сшивание гиалуроновой кислоты с помощью диаминотетра-НА (DA-4HA)

Диаминотетра-НА (DA-4HA) синтезировали в соответствии с приведенной ниже схемой:

Стадия 1

Раствор НА-4 (500 мг, 0,61 ммоль) в воде (5 мл) при комнатной температуре обрабатывали боргидридом натрия (230,5 мг, 0,61 ммоль), полученный раствор перемешивали в течение 3 ч, концентрировали досуха и получали восстановленный продукт 1 (532 мг, условно 100%) в виде пены белого цвета.

ЖХМС (t_r=0,28 мин, ES+=779,4 (М-2 Na+2Н)

Стадия 2

Восстановленный продукт 1 (532 мг) растворяли в водном NH₂OH (5 мл, 50% об./об.) и добавляли твердый NH₄I (100 мг). Полученную суспензию нагревали при температуре 70°С в течение 48 ч, охлаждали до комнатной температуры и концентрировали досуха с получением остатка. Остаток осаждали в неразбавленном EtOH, полученный осадок собирали фильтрацией и сушили до постоянного веса с получением смеси 1:1 диамина 2 и моноамина 3 с количественным выходом. Технический реакционный продукт использовали без дополнительной очистки.

2: ЖХМС (t_r=0,16 мин, ES+=695,36 (М-2 Na+2Н)

3: ЖХМС (t_r=0,19 мин, ES+=737,47 (М-2 Na+2Н)

Гиалуроновую кислоту взвешивали в реакционной колбе. Базовый раствор сшивающего агента (диаминотетра-НА), синтезированного как описано выше, и DMTMM, соответственно, готовили растворением их в фосфатном буфере с рН 7,4. Величину рН растворов доводили до 7, после чего добавляли их в НА. Содержимое тщательно гомогенизировали и затем инкубировали при температуре 23°С в течение 24 ч. Полученный материал дважды продавливали через стальную сетку с ячейками 1 мм и термически обрабатывали в соответствии с общими методиками. Соотношения между НА, диаминотетра-НА и DMTMM указаны ниже в Таблице 3 (Пример 4).

Пример 5

Сшивание гепаросана (HEP) с помощью диаминотрегалозы (DATH)

Связывающий агент DMTMM и сшивающий агент DATH взвешивали в отдельных реакционных колбах и растворяли в фосфатном буфере (рН 7,4). Величины рН растворов доводили до рН 7-7,5 с помощью 1,2 М HCl или 0,25 М NaOH. После этого растворы DMTMM и DATH последовательно добавляли в гепаросан, взвешенный в реакционной колбе. Содержимое тщательно гомогенизировали и затем инкубировали при температуре 35°С в течение 24 ч. Полученный материал дважды продавливали через стальную сетку с ячейками 1 мм и термически обрабатывали в соответствии с общими методиками. Соотношения между гепаросаном, DATH и DMTMM указаны в Таблице 3 ниже (Примеры с 5-1 по 5-2).

Пример 6

Сшивание сульфата хондроитина (CS) с помощью диаминотрегалозы (DATH)

Связывающий агент DMTMM и сшивающий агент DATH взвешивали в отдельных реакционных колбах и растворяли в фосфатном буфере (рН 7,4). Величины рН растворов доводили до рН 7-7,5 с помощью 1,2 М HCl или 0,25 М NaOH. После этого растворы DMTMM и DATH последовательно добавляли в сульфат хондроитина, взвешенный в реакционной колбе. Содержимое тщательно гомогенизировали и затем инкубировали при температуре 35°С в течение 24 ч. Полученный материал дважды продавливали через стальную сетку с ячейками 1 мм и термически обрабатывали в соответствии с общими методиками. Соотношения между сульфатом хондроитина, DATH и DMTMM указаны ниже в Таблице 3 (Примеры с 6-1 по 6-2).

PS - полисахарид, НА - гиалуронан, HEP - гепаросан, CS - сульфат хондроитина, DA-4HA - диаминотетра - НА, СВ - хитобиоза Пустые клетки - не анализировали.

Изобретение относится к получению гидрогелей из гликозаминогликанов. Предложенный гидрогелевый продукт содержит молекулы гликозаминогликанов в качестве способного к набуханию полимера. Гликозаминогликан выбирают из гиалуроновой кислоты, гепаросана и сульфата хондроитина. Причем молекулы гликозаминогликанов ковалентно сшиты посредством поперечных связей, содержащих спейсерную группу, выбранную из группы, состоящей из ди-, три-, тетра- и олигосахаридов. Сшитые молекулы гликозаминогликанов не содержат синтетических неуглеводных структур или сшивающих агентов. Способ приготовления гидрогелевого продукта, содержащего сшитые молекулы гликозаминогликанов, выбранных из гиалуроновой кислоты, гепаросана и сульфата хондроитина, включает обеспечение раствора молекул гликозаминогликанов; активирование карбоксильных групп на молекулах гликозаминогликанов с помощью связывающего агента с образованием активированных молекул гликозаминогликанов. Затем осуществляют сшивание активированных молекул гликозаминогликанов посредством их активированных карбоксильных групп с помощью ди- или мультинуклеофильного функционального сшивающего агента, содержащего спейсерную группу, выбранную из группы, состоящей из ди-, три-, тетра- и олигосахаридов, с образованием сшитых молекул гликозаминогликанов. Причем сшитые гликозаминогликаны не содержат синтетических неуглеводных структур или сшивающих агентов. Также предложен способ косметической обработки кожи с использованием указанного гидрогелевого продукта. Изобретение направлено на получение гидрогелевого продукта из гликозаминогликана, более близкого по структуре к природным молекулам, чем известные из уровня техники гидрогелевые продукты. 3 н. и 13 з.п. ф-лы, 3 табл., 6 пр.

1. Гидрогелевый продукт, содержащий молекулы гликозаминогликанов, выбранных из гиалуроновой кислоты, гепаросана и сульфата хондроитина, в качестве способного к набуханию полимера, где молекулы гликозаминогликанов ковалентно сшиты посредством поперечных связей, состоящих из спейсерной группы, выбранной из группы, состоящей из ди-, три-, тетра- и олигосахаридов, где

сшитые молекулы гликозаминогликанов не содержат синтетических неуглеводных структур или сшивающих агентов.

2. Гидрогелевый продукт по п. 1, где молекулы гликозаминогликанов являются гиалуроновой кислотой.

3. Гидрогелевый продукт по п. 1 или 2, где по меньшей мере 75% поперечных связей содержат спейсерную группу, выбранную из группы, состоящей из ди-, три-, тетра- и олигосахаридов.

4. Гидрогелевый продукт по любому из пп. 1-3, где спейсерная группа является тетрасахаридным остатком гиалуроновой кислоты, гексасахаридным остатком гиалуроновой кислоты, остатком трегалозы, лактозы, мальтозы, сахарозы, целлобиозы или рафинозы.

5. Гидрогелевый продукт по любому из пп. 1-4, где спейсерная группа выбрана из группы, состоящей из ди-, три- и тетрасахаридов.

6. Гидрогелевый продукт по любому из пп. 1-5, где по меньшей мере 90% связей между молекулами гликозаминогликанов и поперечными связями являются амидными связями.

7. Гидрогелевый продукт по любому из пп. 1-6, где менее чем 5% связей между молекулами гликозаминогликанов и поперечными связями являются сложноэфирными связями.

8. Гидрогелевый продукт по любому из пп. 1-7 в форме инъецируемой композиции.

9. Способ приготовления гидрогелевого продукта, содержащего сшитые молекулы гликозаминогликанов, выбранных из гиалуроновой кислоты, гепаросана и сульфата хондроитина, включающий стадии:

(a) обеспечения раствора молекул гликозаминогликанов;

(b) активирования карбоксильных групп на молекулах гликозаминогликанов с помощью связывающего агента с образованием активированных молекул гликозаминогликанов;

(c) сшивания активированных молекул гликозаминогликанов посредством их активированных карбоксильных групп с помощью ди- или мультинуклеофильного функционального сшивающего агента, содержащего спейсерную группу, выбранную из группы, состоящей из ди-, три-, тетра- и олигосахаридов, с образованием сшитых молекул гликозаминогликанов, где сшитые гликозаминогликаны не содержат синтетических неуглеводных структур или сшивающих агентов.

10. Способ по п. 9, где молекулы гликозаминогликанов являются гиалуроновой кислотой.

11. Способ по п.9 или 10, где спейсерная группа является тетрасахаридным остатком гиалуроновой кислоты, гексасахаридным остатком гиалуроновой кислоты, остатком трегалозы, лактозы, мальтозы, сахарозы, целлобиозы или рафинозы.

12. Способ по любому из пп. 9-11, где спейсерную группу выбирают из группы, состоящей из ди-, три- и тетрасахаридов.

13. Способ по любому из пп. 9-12, где нуклеофильные группы сшивающего агента выбирают из группы, состоящей из первичного амина, гидразина, гидразида, карбазата, семикарбазида, тиосемикарбазида, тиокарбазата и аминоокси.

14. Способ по любому из пп. 9-13, где сшивание на стадии (c) обеспечивает амидные связи между молекулами гликозаминогликанов и сшивающими агентами.

15. Способ по любому из пп. 9-14, где конденсирующий реагент для образования пептидной связи представляет собой связывающий реагент на основе триазина, предпочтительно, хлорид 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолина (DMTMM).

16. Способ косметической обработки кожи, включающий введение в кожу гидрогелевого продукта по любому из пп. 1-8 или гидрогелевого продукта, получаемого с помощью способа по любому из пп. 9-15.