Область техники

Настоящее изобретение относится к водному гелю на основе гиалуроновой кислоты, содержащему по меньшей мере сшитую гиалуроновую кислоту и по меньшей мере один тип водорастворимой гиалуроновой кислоты. Настоящее изобретение также относится к способу получения композиций с добавками на основе гликозаминогликанов, в частности на основе гиалуроновых кислот, которые являются мягкими, стабильными, стерильными и пригодными для инъекций. Полученные таким образом водный гель и композиции содержат по меньшей мере два типа гликозаминогликанов, включая по меньшей мере один сшитый гликозаминогликан, в частности, по меньшей мере одну сшитую гиалуроновую кислоту, полученный из несшитого гликозаминогликана с высокой молярной массой и по меньшей мере одного несшитого гликозаминогликана с низкой молярной массой, в частности, полученный из по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты с высокой молярной массой и по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты с низкой молярной массой.

Предшествующий уровень техники

Полисахариды, такие как гликозаминогликаны, широко используются в биомедицинской области. В частности, большинство продуктов, продаваемых для эстетического и/или косметического применения, основаны на гиалуроновой кислоте.

Для улучшения качества кожи гели немодифицированной гиалуроновой кислоты являются привлекательными, поскольку они имеют преимущество, связанное с тем, что они являются идеально биосовместимыми. Однако после имплантации in vivo они очень быстро деградируют. Таким образом, эффекты таких гелей носят лишь кратковременный характер.

Для повышения ее долговечности in vivo и устойчивости к деградации гиалуроновую кислоту обычно модифицируют сшиванием. Гели сшитой гиалуроновой кислоты могут быть получены различными способами получения. Полисахариды, такие как гиалуроновая кислота, могут быть сшиты с помощью различных сшивающих агентов, таких как эпоксидные агенты, альдегиды, такие как глутаральдегид, дивинилсульфон (DVS) или полиамины. В настоящее время наиболее распространенным агентом, используемым для сшивания гиалуроновой кислоты, является эпоксидный агент, диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола (БДДЭ).

Такие процессы сшивания требуют осуществления двух основных стадий, а именно гидратации полисахарида и сшивания.

Полученные таким образом коммерческие продукты на основе гиалуроновой кислоты, как правило, имеют, и в соответствии с их показаниями для применения, фракцию сшитой гиалуроновой кислоты и степень модификации в диапазоне от 1 до 10 %.

Тем не менее, увеличение сшивания гиалуроновой кислоты приводит к получению более химически модифицированного геля, который, следовательно, потенциально является менее биосовместимым. С другой стороны, механические характеристики этих композиций ограничены и приводят к получению очень эластичного и/или хрупкого конечного продукта.

Однако, по соображениям безопасности и эффективности продукта, существует заинтересованность в том, чтобы иметь долговечные in vivo композиции, которые содержат биосовместимый полисахарид, настолько природный и настолько менее модифицированный, таким образом, менее сшитый, насколько это возможно.

Помимо степени сшивания, концентрация применяемого гликозаминогликана является ключевым параметром при определении механических и резистентных свойств композиции. Таким образом, альтернативой для увеличения долговечности in vivo и устойчивости к деградации композиции на основе полисахарида является увеличение его общей концентрации в конечной композиции.

Однако, помимо увеличения ее устойчивости и долговечности, увеличение общей концентрации указанного гликозаминогликана приводит к утолщению композиции со значительным увеличением ее вязкости. Такое увеличение вязкости, таким образом, делает гель трудно инъецируемым и неспособным естественным образом интегрироваться в ткани. В частности, известно, что увеличение общей концентрации гиалуроновой кислоты является источником возникновения папул после инъекции.

Таким образом, по всем этим причинам большинство продуктов на основе сшитой гиалуроновой кислоты, продаваемых на сегодняшний день, имеют общую концентрацию гиалуроновой кислоты только около 25 или 26 мг/г. Однако, хотя такие гели потенциально пригодны для применений в области объемного заполнения кожи, они не подходят для кожных применений для регенерации и улучшения внешнего вида поверхности кожи, в которых механическое заполнение не является основным желаемым эффектом и которые требуют инъекции в поверхностные зоны кожи. Для последнего типа инъекции на самом деле желательно получить гель с более низкими модулями упругости (G') и вязкости (G''), то есть мягкий, легко инъецируемый и легко диффундирующий в ткани.

В тоже время, в этом контексте повышения устойчивости и долговечности продуктов на основе гликозаминогликанов, таких как гиалуроновая кислота, также было предложено добавлять различные соединения, обладающими защитными свойствами в отношении гиалуроновой кислоты. Так, против деградации гиалуроновой кислоты при нагревании заявка WO2014/032804 раскрывает добавление аскорбилфосфата магния, заявка WO2013/186493 - октасульфата сахарозы, и заявка WO2007/077399 - глицерина. Однако добавление этого типа стабилизирующих соединений увеличивает неопределенность с точки зрения биосовместимости продуктов.

Следовательно, остается необходимость в стерильных гелях на основе гликозаминогликанов, и в частности на основе гиалуроновой кислоты, которые являются мягкими, легко инъецируемыми и легко диффундирующими в ткани, которые при этом являются достаточно долговечными и эффективными для регенерации и/или улучшения внешнего вида поверхности кожи.

В частности, остается необходимость увеличения устойчивости и долговечности композиций на основе гликозаминогликанов, таких как гиалуроновая кислота, для преодоления проблем предшествующего уровня техники. Настоящее изобретение предлагает удовлетворить эти потребности.

Краткое описание изобретения

Согласно первому аспекту настоящее изобретение относится к водному гелю на основе гиалуроновой кислоты, содержащему сшитую гиалуроновую кислоту, характеризующемуся тем, что указанный гель содержит по меньшей мере:

- водорастворимую гиалуроновую кислоту, имеющую среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,02 до 0,30 МДа, называемую «sHA LMW», в количестве от 30 до 70 мас.% в расчете на общую массу гиалуроновой кислоты; и

- необязательно, водорастворимую гиалуроновую кислоту, имеющую среднемассовую молярную массу более 0,30 МДа, называемую «sHA HMW»,

и тем, что указанные водорастворимые гиалуроновые кислоты имеют степень модификации 5 % или меньше, предпочтительно 3 % или меньше, более предпочтительно 1 % или меньше,

соответствующие процентные значения для растворимых гиалуроновых кислот определяют путем разбавления водного геля раствором 150 нМ нитрата натрия с рН 7,2, содержащим 0,02%NaN₃, при 25°С в течение 5 дней и его центрифугирования при 4400 об/мин в течение 10 мин и фильтрации через 0,45 мм указанного разбавленного геля с получением фильтрата, затем анализа указанного фильтрата с помощью прибора для эксклюзионной хроматографии, оснащенного детектором многоуглового рассеяния света (MALS) и рефрактометрическим (RI) детектором с инкрементом показателя преломления (dn/dc), установленным на уровне 0,165 мл/г, и насосной станции жидкостного хроматографа, оснащенной двойным набором эксклюзионных колонок, адаптированных для молекул, имеющих среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,001 Да до 20 МДа, с подвижной фазой нитрата натрия с pH 7,2 при скорости потока 0,3 мл/мин.

В настоящем тексте описан способ получения водного геля, содержащего по меньшей мере один сшитый гликозаминогликан и по меньшей мере один несшитый гликозаминогликан, причем указанный способ включает по меньшей мере стадии, состоящие в:

a) обеспечении водного раствора, содержащего по меньшей мере один сшитый гликозаминогликан, называемый «сшитый гликозаминогликан HMW», полученный из несшитого гликозаминогликана с молярной массой 0,50 МДа или более, предпочтительно более 1,00 МДа, более предпочтительно в диапазоне от 1,00 до 4,00 МДа, и сшивающего агента;

b) обеспечении водного раствора, содержащего по меньшей мере один несшитый гликозаминогликан с молярной массой в диапазоне от 0,04 до 0,30 МДа, предпочтительно от 0,08 до 0,20 МДа, более предпочтительно от 0,08 до 0,15 МДа, еще более предпочтительно от 0,08 до 0,10 МДа, называемый «несшитый гликозаминогликан LMW»; и

c) образовании гомогенной смеси всех или части указанных растворов со стадий a) и b).

Согласно второму аспекту настоящее изобретение относится к способу получения водного геля, содержащего по меньшей мере одну сшитую гиалуроновую кислоту и по меньшей мере одну несшитую гиалуроновую кислоту, причем указанный способ включает по меньшей мере стадии, состоящие в:

a) обеспечении водного раствора, содержащего по меньшей мере одну сшитую гиалуроновую кислоту, называемую «сшитая HA HMW», полученную из несшитой гиалуроновой кислоты, имеющей среднемассовую молярную массу 0,50 МДа или более, предпочтительно более 1,00 МДа, более предпочтительно в диапазоне от 1,00 до 4,00 МДа, и сшивающего агента;

b) обеспечении водного раствора, содержащего по меньшей мере одну несшитую гиалуроновую кислоту, называемую «несшитая HA LMW», имеющую среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,04 до 0,30 МДа, предпочтительно от 0,08 до 0,20 МДа; более предпочтительно от 0,08 до 0,15 МДа; и

c) образовании гомогенной смеси всех или части указанных растворов со стадий а) и b);

характеризующийся тем, что он включает применение гиалуроновой кислоты в массовом соотношении «несшитой HA LMW» к «HA HMW» от 1:3 до 2:1.

Неожиданно авторы изобретения обнаружили, что добавление к композициям, содержащим по меньшей мере один сшитый гликозаминогликан, полученный из по меньшей мере одного несшитого гликозаминогликана с высокой молярной массой, по меньшей мере одного несшитого гликозаминогликана с низкой молярной массой, в частности добавление к композициям, содержащим по меньшей мере сшитую гиалуроновую кислоту, полученную из по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты с высокой молярной массой, по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты с низкой молярной массой, усиливает устойчивость конечной композиции.

Как показано в примерах ниже, результат представляет собой:

улучшение устойчивости к деградации по сравнению с той же композицией без добавления несшитого гликозаминогликана с низкой молярной массой и, в частности, без добавления несшитой гиалуроновой кислоты с низкой молярной массой; и

лучшую устойчивость к деградации по сравнению с композициями с такой же общей концентрацией гликозаминогликана, в частности, гиалуроновой кислоты, и такой же степенью сшивания фракции сшитого гликозаминогликана, в частности, сшитой гиалуроновой кислоты.

Благодаря такой улучшенной устойчивости к деградации композиции согласно изобретению более устойчивы к тепловой стерилизации. Таким образом, между двумя стерильными и инъекционными композициями, обладающими схожими реологическими свойствами до стерилизации, одной в соответствии с изобретением, и другой, полученной в соответствии с принципами предшествующего уровня техники, первая демонстрирует реологические свойства после стерилизации, превосходящие свойства последней.

Благодаря своей повышенной устойчивости к деградации композиции согласно изобретению преимущественно способны выдерживать переменные температуры, в частности, во время их транспортировки и хранения.

Кроме того, добавление по меньшей мере одного несшитого гликозаминогликана с низкой молярной массой, в частности, по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты с низкой молярной массой, позволяет получить мягкие, легко инъецируемые и легко диффундирующие композиции с повышенной общей концентрацией гликозаминогликана, таким образом, с одним или более значительными биомеханическими и/или биологическими эффектами в отношении физиологии кожи.

Кроме того, применение композиции, полученной согласно изобретению, позволяет одновременно вводить гликозаминогликаны, в частности гиалуроновые кислоты, с различными молярными массами, способствующие диверсификации физиологических эффектов гликозаминогликана, в частности гиалуроновой кислоты, в обрабатываемом участке.

Согласно третьему аспекту настоящее изобретение относится к водному гелю гликозаминогликанов, в частности гиалуроновых кислот, получаемому в соответствии со способом согласно изобретению.

В соответствии с четвертым аспектом настоящее изобретение относится к косметической и/или дерматологической композиции, содержащей водный гель, как определено в настоящем изобретении.

Настоящее изобретение также относится к композициям, полученным способом в соответствии с изобретением.

Изобретение также относится к водному гелю согласно изобретению или композиции согласно изобретению для применения в предотвращении и/или лечении изменения вязкоупругих или биомеханических свойств кожи.

Изобретение также относится к водному гелю согласно изобретению или дерматологической композиции согласно изобретению для применения в предотвращении и/или лечении изменения внешнего вида поверхности кожи, например, вызванного внешними факторами, такими как стресс, загрязнение атмосферы, табак или длительное воздействие ультрафиолетового (УФ) света.

Предпочтительно изобретение относится к водному гелю согласно изобретению или дерматологической композиции согласно изобретению для применения в контурной пластике и/или заполнении мягких тканей.

Оно также относится к нетерапевтическому косметическому применению водного геля, как определено в настоящем изобретении, или косметической композиции, как определено в настоящем изобретении, для предотвращения и/или лечения изменения внешнего вида поверхности кожи, например, кожных признаков хронологического старения.

Оно также относится к нетерапевтическому косметическому применению водного геля, как определено в настоящем изобретении, или косметической композиции, как определено в настоящем изобретении, для контурной пластики и/или заполнения мягких тканей, в частности заполнения морщин.

Краткое описание графических материалов

[Фиг. 1] Фиг. 1 представляет собой графическое представление потери модуля упругости (G') при автоклавной стерилизации (ΔG'(%)), концентрации несшитой гиалуроновой кислоты с низкой молярной массой и концентрации сшитой и несшитой гиалуроновой кислоты с высокой молярной массой для образцов от 1-1 до 1-3.

[Фиг. 2] Фиг. 2 представляет собой график, демонстрирующий потери модуля упругости (G') при автоклавной стерилизации (Δ G'(%)) для образца 3-5 без добавления несшитой гиалуроновой кислоты и образцов от 3-6 до 3-9, содержащих добавленную несшитую гиалуроновую кислоту с молярной массой 0,04 МДа, 0,10 МДа, 0,20 МДа и 1,50 МДа, соответственно.

[Фиг. 3] Фиг. 3 представляет собой график, демонстрирующий проценты улучшения потери модуля упругости (G') при автоклавной стерилизации для образца 3-5 без добавления несшитой гиалуроновой кислоты и образцов от 3-6 до 3-9, содержащих добавленную несшитую гиалуроновую кислоту с молярной массой 0,04 МДа, 0,10 МДа, 0,20 МДа и 1,50 МДа, соответственно.

[Фиг. 4] Фиг. 4 представляет собой графическое представление потери модуля упругости (G') при автоклавной стерилизации (Δ G'(%)), концентрации несшитой гиалуроновой кислоты с низкой молярной массой и концентрации сшитой и несшитой гиалуроновой кислоты с высокой молярной массой для образца 4-1 (без добавок) и образцов от 4-2 до 4-4.

[Фиг. 5] Фиг. 5 представляет собой график, демонстрирующий различия в модуле упругости (G') до и после обработки гиалуронидазой (Δ G'(%)) для образца 6-1 без добавления несшитой гиалуроновой кислоты и образцов 6-2 и 6-3, содержащих добавленную несшитую гиалуроновую кислоту с молярной массой 0,10 МДа и 1,50 МДа, соответственно.

Подробное описание изобретения

Определение терминов согласно изобретению:

- «Гликозаминогликаны» определяются как длинные цепи, состоящие из повторяющихся дисахаридных звеньев, в которых один из двух углеводных остатков представляет собой аминоуглевод (N-ацетилглюкозамин или N-ацетилгалактозамин), а второй представляет собой уроновую (глюкуроновую или идуроновую) кислоту или галактозу. Гликозаминогликаны включают гиалуроновую кислоту, гепарозан, хондроитина сульфат, дерматана сульфат и кератана сульфат. Особенно предпочтительным гликозаминогликаном является гиалуроновая кислота.

- «Гиалуроновая кислота» означает гиалуроновую кислоту или гиалуронан и их производные. Следовательно, термин «гиалуроновая кислота» также включает соли гиалуроновой кислоты, такие как гиалуронат натрия, и гиалуроновые кислоты, которые были химически модифицированы, например, путем окисления, восстановления, деацетилирования, сульфатирования или амидирования. Гиалуроновая кислота представляет собой линейный полисахарид с чередующимися звеньями D-глюкуроновой кислоты и N-ацетил-D-глюкозамина, связанными чередующимися β-1,3-гликозидными и β-1,4-гликозидными связями.

Он естественным образом присутствует в нескольких тканях человеческого организма и разрушается ферментами, гиалуронидазами, также присутствующими в организме, и/или через механизмы окисления.

- «Водорастворимая гиалуроновая кислота», или «растворимая гиалуроновая кислота», или «экстрагируемая гиалуроновая кислота», также называемая «sHA», означает гиалуроновую кислоту, которая может экстрагироваться из геля на основе гиалуроновой кислоты, когда последний набухает в избытке водной среды. Соответствующие процентные значения для растворимых гиалуроновых кислот определяют путем разбавления водного геля раствором 150 нМ нитрата натрия с рН 7,2, содержащим 0,02%NaN₃, при 25°С в течение 5 дней и его центрифугирования при 4400 об/мин в течение 10 мин и фильтрации через 0,45 мм указанного разбавленного геля с получением фильтрата, затем анализа указанного фильтрата с помощью прибора для эксклюзионной хроматографии, оснащенного детектором многоуглового рассеяния света (MALS) и рефрактометрическим (RI) детектором с инкрементом показателя преломления (dn/dc), установленным на уровне 0,165 мл/г, и насосной станции жидкостного хроматографа, оснащенной двойным набором эксклюзионных колонок, адаптированных для молекул, имеющих среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,001 Да до 20 МДа, с подвижной фазой нитрата натрия с pH 7,2 при скорости потока 0,3 мл/мин. Практически, концентрация геля в подвижной фазе для стадии разбавления, а также введенный объем в SEC (эксклюзионная хроматография) соответствующим образом регулируются специалистом в данной области техники как функция супернатанта композиции, чтобы максимизировать отношение сигнал-шум и избежать перегрузки колонки.

В противоположность этому, «неводорастворимая гиалуроновая кислота», или «нерастворимая гиалуроновая кислота», или «неэкстрагируемая гиалуроновая кислота», также называемая «nsHA», означает гиалуроновую кислоту, которая не может экстрагироваться из геля на основе гиалуроновой кислоты, когда последний набухает в избытке водной среды.

- «Среднемассовая молярная масса», выраженная в г/моль или Дa, и сокращенно Mw гликозаминогликана, в частности гиалуроновой кислоты, относится к среднемассовой молярной массе применяемых молекул гликозаминогликана. Среднемассовая молярная масса гликозаминогликана может быть определена различными способами, известными специалисту в данной области техники, такими как капиллярный электрофорез, эксклюзионная хроматография или измерение характеристической вязкости. В настоящем тексте выражения «молярная масса», «средняя молярная масса», «среднемассовая молярная масса» или «массовая молярная масса» могут использоваться взаимозаменяемо.

- «Характеристическая вязкость» ([η]), выраженная в мл/г илим³/кг, гликозаминогликана, в частности гиалуроновой кислоты, относится к вкладу гликозаминогликана в вязкость раствора. Ее можно измерить путем пропускания через капиллярный вискозиметр. Она представляет собой гидродинамический удельный объем полимера. Чем ниже характеристическая вязкость гликозаминогликана, тем ниже его молярная масса. Для данного гликозаминогликана характеристическая вязкость связана с молярной массой эмпирическим соотношением, соотношением Марка-Хаувинка, которое может быть понято любым специалистом в данной области техники, и формула которого является следующей:

[η] = K×Mwα,

где:

- К представляет собой постоянную функцию исследуемого полимера, применяемого растворителя и температуры, в частности, К связана с размерами цепей исследуемого полимера;

- α представляет собой постоянную функцию исследуемого полимера, применяемого растворителя и температуры, в частности, α связана с конформацией исследуемого полимера; и

- Mw представляет собой среднемассовую молярную массу полимера, выраженную в дальтонах (Да).

- «Гликозаминогликан с низкой молярной массой», также называемый «гликозаминогликан LMW» или «LMW гликозаминогликан», означает гликозаминогликан в качестве исходного материала со среднемассовой молярной массой в диапазоне от 0,04 до 0,30 МДа, предпочтительно от 0,08 до 0,20 МДа, более предпочтительно от 0,08 до 0,15 МДа, еще более предпочтительно от 0,08 до 0,10 МДа.

- «Гиалуроновая кислота с низкой молярной массой», также называемая «гиалуроновая кислота LMW», или «HA LMW», или «LMW гиалуроновая кислота», или «LMW HA», означает гиалуроновую кислоту в качестве исходного материала с молярной массой в диапазоне от 0,04 до 0,30 МДа, предпочтительно от 0,08 до 0,20 МДа, более предпочтительно от 0,08 до 0,15 МДа, что соответствует гиалуроновой кислоте с низкой характеристической вязкостью, то есть с характеристической вязкостью в диапазоне от 0,10 до 0,8 м³/кг, предпочтительно от 0,2 до 0,5 м³/кг, более предпочтительно от 0,2 до 0,4 м³/кг, измеренной в соответствии со способом, указанным в Европейской фармакопее (издание 01/2017:1472).

- «Водорастворимая гиалуроновая кислота с низкой молярной массой» или «растворимая гиалуроновая кислота с низкой молярной массой», также называемая «sHA LMW» или «LMW sHA», означает растворимую гиалуроновую кислоту с молярной массой в диапазоне от 0,02 до 0,30 МДа, предпочтительно от 0,04 до 0,20 МДа, более предпочтительно от 0,04 до 0,15 МДа, измеренную на конечном геле в соответствии со способом, описанным в п. 1 формулы, то есть путем разбавления водного геля раствором 150 нM нитрата натрия с pH 7,2, содержащим 0,02 %NaN₃, при 25°C в течение 5 дней и его центрифугирования при 4400 об/мин в течение 10 минут и фильтрации через 0,45 мм указанного разбавленного геля с получением фильтрата, затем анализа указанного фильтрата с помощью прибора для эксклюзионной хроматографии, оснащенного детектором многоуглового рассеяния света (MALS) и рефрактометрическим (RI) детектором с инкрементом показателя преломления (dn/dc), установленным на уровне 0,165 мл/г, и насосной станции жидкостного хроматографа, оснащенной двойным набором эксклюзионных колонок, адаптированных для молекул, имеющих среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,001 Да до 20 MДa, с подвижной фазой нитрата натрия с pH 7,2 при скорости потока 0,3 мл/мин. Практически, концентрация геля в подвижной фазе для стадии разбавления, а также введенный объем в SEC соответствующим образом регулируются специалистом в данной области техники как функция супернатанта композиции, чтобы максимизировать отношение сигнал-шум и избежать перегрузки колонки.

- «Гликозаминогликан с высокой молярной массой», также называемый «гликозаминогликан HMW» или «HMW гликозаминогликан», означает гликозаминогликан в качестве исходного материала с молекулярной массой более 0,50 МДа, предпочтительно более 1,00 МДа и более предпочтительно в диапазоне от 1,00 до 4,00 МДа.

- «Гиалуроновая кислота с высокой молярной массой», также называемая «гиалуроновая кислота HMW», или «HA HMW», или «HMW гиалуроновая кислота», или «HMW HA», означает гиалуроновую кислоту в качестве исходного материала с молярной массой более 0,50 МДа, предпочтительно более 1,00 МДа и более предпочтительно в диапазоне от 1,00 до 4,00 МДа, что соответствует гиалуроновой кислоте с высокой характеристической вязкостью, т.е. характеристической вязкостью более 0,8м³/кг, предпочтительно более 1,2м³/кг, более предпочтительно в диапазоне от 1,2 до 3,5м³/кг, измеренной в соответствии с методом, указанным в Европейской фармакопее (издание 01/2017: 1472).

- «Растворимая гиалуроновая кислота с высокой молярной массой» или «водорастворимая гиалуроновая кислота с высокой молярной массой», также называемая «sHA HMW» или «HMW sHA», означает растворимую гиалуроновую кислоту с молярной массой более 0,30 МДа, предпочтительно более 0,30 МДа и меньше или равную 4,00 МДа, измеренной на конечном геле в соответствии со способом, описанным в п. 1 формулы, то есть путем разбавления водного геля раствором 150 нM нитрата натрия с pH 7,2, содержащим 0,02 %NaN₃, при 25°C в течение 5 дней и его центрифугирования при 4400 об/мин в течение 10 минут и фильтрации через 0,45 мм указанного разбавленного геля с получением фильтрата, затем анализа указанного фильтрата с помощью прибора для эксклюзионной хроматографии, оснащенного детектором многоуглового рассеяния света (MALS) и рефрактометрическим (RI) детектором с инкрементом показателя преломления (dn/dc), установленным на уровне 0,165 мл/г, и насосной станции жидкостного хроматографа, оснащенной двойным набором эксклюзионных колонок, адаптированных для молекул, имеющих среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,001 Да до 20 MДa, с подвижной фазой нитрата натрия с pH 7,2 при скорости потока 0,3 мл/мин. Практически, концентрация геля в подвижной фазе для стадии разбавления, а также введенный объем в SEC соответствующим образом регулируются специалистом в данной области техники как функция супернатанта композиции, чтобы максимизировать отношение сигнал-шум и избежать перегрузки колонки.

- «Сшитый гликозаминогликан» относится к гликозаминогликану, модифицированному сшивающим агентом во время реакции сшивания. В противоположность этому, «несшитый гликозаминогликан» относится к гликозаминогликану, который не был модифицирован сшивающим агентом и, следовательно, не подвергался реакции сшивания.

- «Сшитая гиалуроновая кислота» относится к гиалуроновой кислоте, модифицированной сшивающим агентом во время реакции сшивания. В противоположность этому, «несшитая гиалуроновая кислота» относится к гиалуроновой кислоте, которая не была модифицирована сшивающим агентом и, следовательно, не подвергалась реакции сшивания.

- «Несшитая» и «не являющаяся сшитой» являются синонимами и могут использоваться взаимозаменяемо в настоящем тексте.

- Выражение «гликозаминогликан HMW» или «HMW гликозаминогликан» относится к компоненту «сшитый гликозаминогликан HMW» и компоненту «несшитый гликозаминогликан HMW», если таковой присутствует, в водном геле.

- Выражение «гиалуроновая кислота HMW», также называемая «HA HMW» или «HMW HA», относится к компоненту «сшитая гиалуроновая кислота HMW» (также называемая «сшитой HA HMW» или «сшитой HMW HA») и, если применимо, к компоненту «несшитая гиалуроновая кислота HMW» (также называемая «несшитая HA HMW» или «несшитая HMW HA»), если он присутствует, в водном геле.

- «Степень сшивания», применяемая при получении «сшитого гликозаминогликана», в частности «сшитой гиалуроновой кислоты», соответствует соотношению между массой (или весом) сшивающего агента и массой гликозаминогликана, в частности гиалуроновой кислоты, применяемого для получения указанного сшитого гликозаминогликана, в частности указанной сшитой гиалуроновой кислоты. Она обычно выражается в процентах.

- Сшитый гликозаминогликан и композицию, содержащую такой сшитый гликозаминогликан, в частности сшитую гиалуроновую кислоту и композицию, содержащую такую сшитую гиалуроновую кислоту, можно квалифицировать по их «степени модификации» (MOD). Эта степень модификации соответствует молярному количеству модифицирующего агента, связанного с указанным гликозаминогликаном одним или несколькими его концами, выраженному на 100 моль дисахаридных повторяющихся звеньев гликозаминогликана в композиции, в частности 100 моль дисахаридных повторяющихся звеньев гиалуроновой кислоты в композиции. Референсным методом определения этой степени модификации является ядерно-магнитная резонансная спектроскопия (¹H ЯМР). Указанная степень модификации определяется молярным отношением сигналов сшивающего агента к сигналу дисахаридных звеньев гликозаминогликана (гликозаминогликан участвовал в сшивании или нет).

- «Сшитый гликозаминогликан с высокой молярной массой (HMW)» или «сшитый высокомолекулярный (HMW) гликозаминогликан» относится к сшитому гликозаминогликану, полученному из несшитого гликозаминогликана с высокой молярной массой. Предпочтительно, сшитый HMW гликозаминогликан имеет степень сшивания 8 % или меньше, предпочтительно 5 % или меньше и более предпочтительно меньше 2 %.

- «Сшитая гиалуроновая кислота с высокой молярной массой (HMW)» или «сшитая высокомолекулярная (HMW) гиалуроновая кислота» относится к сшитой гиалуроновой кислоте, полученной из несшитой гиалуроновой кислоты с высокой молярной массой. Предпочтительно, сшитая HMW гиалуроновая кислота имеет степень сшивания 8 % или меньше, предпочтительно 5 % или меньше и более предпочтительно меньше 2 %.

- «Биомеханические и биологические свойства гликозаминогликанов в отношении физиологии кожи» включают, в частности, гидратацию и активацию фибробластов. Например, благодаря своим биомеханическим и биологическим свойствам гиалуроновая кислота участвует в реструктуризации, регенерации и/или омоложении кожи.

- «Добавка» к композиции представляет собой добавление к этой композиции по меньшей мере одного несшитого гликозаминогликана с низкой молярной массой. Предпочтительно, добавка соответствует добавлению к композиции по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты с низкой молярной массой.

- «Общая концентрация гликозаминогликана» означает сумму концентрации сшитого гликозаминогликана с высокой молярной массой и, необязательно, несшитого гликозаминогликана с высокой молярной массой и концентрации гликозаминогликана, применяемого для добавки. Эта концентрация выражается в миллиграммах гликозаминогликана на грамм геля.

- «Общая концентрация гиалуроновой кислоты» означает сумму концентрации сшитой гиалуроновой кислоты с высокой молярной массой и, необязательно, несшитой гиалуроновой кислоты с высокой молярной массой и концентрации гиалуроновой кислоты, применяемой для добавки. Эта концентрация выражается в миллиграммах гликозаминогликана на грамм геля.

Раствор считается «гомогенным», когда его цвет, внешний вид и вязкость воспринимаются невооруженным глазом и на ощупь как однородные.

- «Водная среда» означает любую жидкую среду, содержащую по меньшей мере воду в качестве растворителя и обладающую свойством растворять гликозаминогликан, в частности гиалуроновую кислоту.

- «Сшивающий агент» означает любое соединение, способное осуществлять сшивание между различными цепями гликозаминогликана. В качестве сшивающих агентов, подходящих для осуществления изобретения, можно упомянуть, в частности, би- или полифункциональные эпоксидные или неэпоксидные сшивающие агенты. Среди эпоксидных агентов можно упомянуть диглицидиловый эфир бутандиола (БДДЭ), диэпоксиоктан, 1,2-бис(2,3-эпоксипропил)-2,3-этилен, 1,2-бис(2,3-эпоксипропил)-2,3-эмилен и их смеси. Среди неэпоксидных агентов могут быть упомянуты эндогенные полиамины, такие как спермин, спермидин и путресцин, альдегиды, карбодиимиды и дивинилсульфон.

- «водный гель» означает как водный гель, получаемый способом согласно изобретению, так и водный гель согласно настоящему изобретению, когда не указано другое.

- «Мягкий гель» означает гель, вязкоупругое распределение которого остается умеренно эластичным, то есть достаточно вязким с фазовым углом (δ) от 15° до 50° и низким модулем упругости G', другими словами, G' 150 Па или менее, предпочтительно от 20 до 150 Па, измеренными для напряжения 5 Па при комнатной температуре с использованием реометра (TA Instruments DHR2), имеющего геометрию конус/пластина (угол конуса 1°/диаметр пластины 40 мм), с применением колебательного напряжения развертки с частотой 1 Гц, и силу экструзии 18 Н или менее, предпочтительно менее 15 Н, измеренную при фиксированной скорости около 12,5 мм/мин, в шприцах с внутренним диаметром 6,3 мм или более, с иглой с внешним диаметром 0,3 мм (30 G) или меньше и длиной ½″, при комнатной температуре.

- «Легко инъецируемый» означает гель со средней силой экструзии менее 18 Н, предпочтительно менее 15 Н, при измерении динамометром при фиксированной скорости около 12,5 мм/мин, в шприцах с внешним диаметром 6,3 мм или более, с иглой внешним диаметром 0,3 мм (30 G) или меньше и длиной ½″, при комнатной температуре.

- Композиция или гель, «легко диффундирующий в тканях», означает композицию для кожных применений в области регенерации и улучшения внешнего вида поверхности кожи, которая не способствует образованию папул после ее инъекции в поверхностные зоны кожи, т.е. в верхнюю и среднюю части дермы.

- «Долговечность in vivo» означает способность геля оставаться в обработанном месте в течение долгого времени после его введения. Гель, долговечный in vivo, представляет собой гель, способный оставаться в обработанном участке по меньшей мере 1 месяц, предпочтительно по меньшей мере 3 месяца, более предпочтительно по меньшей мере 6 месяцев, т.е. способный поддерживать после нанесения общее эстетическое улучшение в течение по меньшей мере 1 месяца, предпочтительно по меньшей мере 3 месяцев, более предпочтительно по меньшей мере 6 месяцев, другими словами, способный поддерживать после нанесения по меньшей мере улучшение 1 или 2 степени по субъективной шкале оценки общего эстетического улучшения, включающей 5 степеней: 1. Значительное улучшение; 2. Улучшение; 3. Без изменений; 4. Деградация; 5. Сильная деградация, и делать это по меньшей мере 1 месяц, предпочтительно по меньшей мере 3 месяца, более предпочтительно по меньшей мере 6 месяцев.

- Термин «стабильность» характеризует способность композиции сохранять физико-химические свойства (цвет, рН, гомогенность, мутность, реологию и т.д.) в соответствии с ее характеристиками при хранении по меньшей мере один год. Стабильность композиции обычно контролируют путем наблюдения и/или измерения одного или нескольких ее физико-химических параметров, в частности, одного или более ее реологических параметров, таких как модуль упругости (G') или вязкость (η).

- «Стерильный гель» означает гель, который безопасен для введения в поверхностные участки кожи или через них, т.е. верхнюю и среднюю части дермы. В частности, важно, чтобы гель, подлежащий введению методом инъекции, не содержал каких-либо загрязняющих веществ, которые могли бы инициировать нежелательную вторичную реакцию в организме-хозяине.

Термины «вспомогательное вещество», «дополнительный компонент» и «эксципиент» используются взаимозаменяемо и относятся к любому компоненту, совместимому с нанесением в кожу и/или на кожу. Количество применяемого вспомогательного вещества зависит от природы указанного компонента, желаемого эффекта и применения композиции согласно изобретению. Это вспомогательное вещество может представлять собой один из следующих компонентов или одно из его производных: анестетик, антиоксидант, аминокислоту, витамин, минералы, нуклеиновую кислоту, нуклеотид, нуклеозид, кофермент, адренергическое производное, натрия дигидрофосфата моногидрат и/или дигидрат или хлорид натрия.

- В качестве «анестетика» можно упомянуть амбукаин, амоксекаин, амилеин, априндин, аптокаин, артикаин, бензокаин, бетоксикаин, бупивакаин, бутакаин, бутамбен, бутаниликаин, хлорбутанол, хлорпрокаин, цинхокаин, клодакаин, кокаин, криофлуоран, циклометикаин, дексивакаин, диамокаин, диперодон, диклонин, этидокаин, эупроцин, фебуерин, фомокаин, гуафекаинол, гептакаин, гексилкаин, гидроксипрокаин, гидрокситетракаин, изобутамбен, лейцинокаин, левобупивакаин, левоксадрол, лидамидин, лидокаин, лотукаин, менглитат, мепивакаин, меприлкаин, миртекаин, октакаин, октодрин, оксетакаин, оксибупрокаин, паретоксикаин, паридокаин, фенакаин, пиперокаин, пиридокаин, полидоканол, прамокаин, прилокаин, прокаин, пропанокаин, пропипокаин, пропоксикаин, проксиметакаин, пиррокаин, кватакаин, хинисокаин, рисокаин, родокаин, ропивакаин, тетракаин, толикаин, тримекаин и их соли.

- В качестве «антиоксиданта» можно упомянуть глутатион, эллаговую кислоту, спермин, ресвератрол, ретинол, L-карнитин, полиолы, полифенолы, флавонолы, теафлавины, катехины, кофеин, убихинол, убихинон, альфа-липоевую кислоту.

- В качестве «аминокислот» можно упомянуть аргинин, изолейцин, лейцин, лизин, глицин, валин, треонин, пролин, метионин, гистидин, фенилаланин, триптофан, цистеин.

В качестве «витаминов» можно упомянуть витамины Е, А, С, В и, в частности, витамины В4, В5, В6, В8, В9, В7, В12 и, предпочтительно, пиридоксин.

- В качестве «минералов» можно упомянуть соли цинка, магния, кальция, калия, марганца, натрия, меди.

- В качестве «коферментов» можно упомянуть коферменты Q10, CoA, NAD, NADP.

- В качестве «адренергического производного» можно упомянуть адреналин и норадреналин.

Наконец, следует понимать, что все указанные числовые значения должны рассматриваться не строго, а приблизительно в соответствии с общей Конвенцией, то есть последняя цифра, указанная в числовых значениях, соответствует точности измерения. Например, для молярной массы 0,04 МДа погрешность составляет 0,035-0,044 МДа.

Способ согласно изобретению

Как указано выше, в настоящем тексте описан способ получения водного геля, требующего обеспечения, с одной стороны, водного раствора, содержащего по меньшей мере один сшитый гликозаминогликан, также называемый «сшитый гликозаминогликан HMW», поскольку он получен из несшитого гликозаминогликана с высокой молярной массой и сшивающего агента, и, с другой стороны, водного раствора, содержащего по меньшей мере один несшитый гликозаминогликан с низкой молярной массой, называемый «несшитый гликозаминогликан LMW», и образования гомогенной смеси всех или части указанных растворов.

Гликозаминогликаны, применяемые в способе согласно изобретению, могут быть выбраны из гиалуроновой кислоты, гепарозана, хондроитина сульфата, дерматана сульфата, кератана сульфата и их смесей.

Гликозаминогликаны, применяемые в способе согласно изобретению, могут иметь одинаковую или различную химическую природу.

В конкретном варианте осуществления гликозаминогликаны, применяемые в способе согласно изобретению, имеют одинаковую химическую природу и предпочтительно представляют собой гиалуроновую кислоту.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу получения водного геля, требующего обеспечения, с одной стороны, водного раствора, содержащего по меньшей мере одну сшитую гиалуроновую кислоту, также называемую «сшитая HA HMW», поскольку она получена из несшитой гиалуроновой кислоты с высокой молярной массой и сшивающего агента, и, с другой стороны, водного раствора, содержащего по меньшей мере одну несшитую гиалуроновую кислоту с низкой молярной массой, называемую «несшитая HA LMW», и образования гомогенной смеси всех или части указанных растворов,

характеризующемуся тем, что он включает применение гиалуроновой кислоты в массовом соотношении «несшитой HA LMW» к «HA HMW» от 1:3 до 2:1.

В конкретном варианте осуществления гиалуроновые кислоты, применяемые в способе изобретения, не являются химически модифицированными.

Как указывалось ранее, в способе согласно изобретению применяют эти гликозаминогликаны и предпочтительно эти гиалуроновые кислоты в форме водных растворов, в частности, как определено на стадиях а) и b) способа согласно изобретению.

Эти растворы гликозаминогликанов, в частности гиалуроновых кислот, являются предпочтительно гомогенными.

Они могут быть получены в соответствии с традиционным способом, например, путем солюбилизации и/или разбавления гликозаминогликана, в частности гиалуроновой кислоты, сшитой или несшитой, в водной среде, такой как фосфатно-солевой буфер. Эти получения предпочтительно проводят при комнатной температуре, предпочтительно при температуре от 15 до 25°С, при механическом или ручном перемешивании.

Стадия а)

Что касается водного раствора «сшитого гликозаминогликана HMW» и, в частности «сшитой HA HMW», рассматриваемого на стадии а), то их сначала получают путем сшивания по меньшей мере одного несшитого гликозаминогликана, имеющего среднемассовую молярную массу 0,50 МДа или более, предпочтительно более 1,00 МДа, более предпочтительно от 1,00 до 4,00 МДа, с по меньшей мере одним сшивающим агентом; и, в частности, их сначала получают путем сшивания по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты, имеющей среднемассовую молярную массу 0,50 МДа или более, предпочтительно более 1,00 МДа, более предпочтительно от 1,00 до 4,00 МДа, с по меньшей мере одним сшивающим агентом.

Осуществление такого сшивания явно входит в компетенцию специалиста в области техники.

Предпочтительно сшивающий агент вводят со степенью сшивания 8 мас.% или менее, предпочтительно 5 % или менее, более предпочтительно менее 2 %.

Предпочтительно сшивающий агент вводят в молярном соотношении в расчете на общее количество молей звеньев гликозаминогликана, в частности в расчете на общее количество молей звеньев гиалуроновой кислоты, составляющему от 0,001 до 0,25.

Таким образом, в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления указанную «сшитую HA HMW» получают со степенью сшивания 8 мас.% или менее, предпочтительно 5 % и менее и более предпочтительно менее 2 %.

Это сшивание проводят при различных температурах и времени для получения ожидаемой степени модификации.

Таким образом, сшивание, осуществляемое при комнатной температуре, то есть температуре в диапазоне от 15 до 25°С, может потребовать времени реакции более 5 ч или даже 10 ч или более.

С другой стороны, сшивание, стимулируемое с помощью стимулирующего элемента, такого как нагревание, УФ-облучение, микроволновое воздействие или катализатор, предпочтительно с помощью нагревания, может иметь значительно повышенную степень сшивания и продолжительность менее 5 часов.

В конкретном варианте осуществления сшивание несшитого гликозаминогликана, в частности несшитой гиалуроновой кислоты, с молярной массой 0,50 МДа или более, предпочтительно более 1,00 МДа, более предпочтительно в диапазоне от 1,00 до 4,00 МДа проводят при температуре более 40°С, предпочтительно более 50°С, более предпочтительно в диапазоне от 45 до 60°С или еще более предпочтительно от 50 до 55°С.

Такое сшивание предпочтительно имеет продолжительность от 30 до 300 минут, предпочтительно от 100 до 240 минут.

В особенно предпочтительном варианте осуществления сшивание несшитой гиалуроновой кислоты с молярной массой 0,50 МДа или более, предпочтительно более 1,00 МДа, более предпочтительно в диапазоне от 1,00 до 4,00 МДа проводят при комнатной температуре, то есть температуре в диапазоне от 15 до 25°С.

Такое сшивание предпочтительно имеет время реакции более 5 ч или даже более 10 ч, в частности от 10 до 100 ч.

Предпочтительно, сшивающий агент, применяемый в способе согласно изобретению, представляет собой эпоксидный сшивающий агент, предпочтительно диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола (БДДЭ).

В конкретном варианте осуществления, где применяемый сшивающий агент представляет собой би- или полифункциональный эпоксидный сшивающий агент, такой как БДДЭ, рН водной среды подщелачивают или подкисляют для активации реакции сшивания. Согласно конкретному варианту осуществления водную среду подщелачивают, как правило, раствором, содержащим гидроксид натрия, и предпочтительно pH водной среды составляет 11 или более, более предпочтительно pH водной среды составляет 12 или более.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления концентрацию «сшитого HMW гликозаминогликана», более конкретно «сшитой HMW HA», водной среды со стадии a) регулируют для образования в конце стадии c) водного геля, в котором концентрация «сшитого HMW гликозаминогликана», более конкретно «сшитой HMW HA», составляет по меньшей мере 5 мг/г в расчете на общую массу указанного водного геля.

Предпочтительно, в способе согласно изобретению применяют водный раствор, содержащий от 5 до 15 мг/г «сшитой HA HMW».

Стадия b)

Стадия b) способа по изобретению требует, со своей стороны, чтобы водный раствор содержал по меньшей мере один «несшитый гликозаминогликан LMW», в частности по меньшей мере одну «несшитую HA LMW».

Предпочтительно, концентрацию «несшитого гликозаминогликана LMW», в частности «несшитой HA LMW», рассматриваемого в водном растворе на стадии b), регулируют для образования в конце стадии c) водного геля, в котором концентрация «несшитого гликозаминогликана LMW», в частности концентрация «несшитой HA LMW», составляет по меньшей мере 3 мг/г, предпочтительно 10 мг/г в расчете на общую массу указанного водного геля.

Предпочтительно, в способе согласно изобретению применяют водный раствор, содержащий от 50 до 60 мг/г «несшитой HA LMW».

Как подробно описано ниже, способ согласно изобретению может также включать применение гликозаминогликана, в частности гиалуроновой кислоты, отличного от тех, которые определены для стадий a) и b).

Стадия с)

Как описано выше, стадия c) заключается в образовании гомогенной смеси из по меньшей мере некоторых или всех растворов, полученных на стадиях a) и b).

Образование гомогенной смеси, рассматриваемое на стадии c), предпочтительно включает по меньшей мере одну стадию гомогенизации.

Гомогенизацию предпочтительно проводят в щадящих условиях для предотвращения деградации применяемых цепей гликозаминогликана.

Эта стадия c) образования гомогенной смеси по меньшей мере одного сшитого гликозаминогликана и по меньшей мере одного несшитого гликозаминогликана, в частности по меньшей мере одной сшитой гиалуроновой кислоты и по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты, может осуществляться в соответствии с обычными способами гомогенизации, такими как трехмерное перемешивание, перемешивание с помощью лопастной мешалки, перемешивание с помощью шпателя и/или стадия экструзии через по меньшей мере одну сетку.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления стадия c) включает по меньшей мере одну стадию экструзии полученной смеси через по меньшей мере одну сетку. Регулирование характеристик такой сетки является частью общих знаний специалиста в области техники. Традиционно их выбирают в зависимости от свойств, ожидаемых для образуемой смеси, и с учетом соответствующих особенностей растворов гликозаминогликанов, в частности растворов гиалуроновых кислот, которые объединяют вместе.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления эта стадия c), таким образом, включает по меньшей мере одну стадию гомогенизации с помощью лопастной мешалки, за которой следует по меньшей мере одна стадия экструзии смеси через по меньшей мере одну сетку.

Гомогенизация считается удовлетворительной, когда полученный гель имеет макроскопически, невооруженным глазом и на ощупь однородный цвет, однородную вязкость и не содержит агломератов. Продолжительность гомогенизации оценивается специалистом в данной области техники в соответствии с его общими знаниями. Указанная гомогенизация может включать несколько циклов, необязательно разнесенных по времени фазой покоя, в частности, для оценки качества гомогенизации гликозаминогликанов, в частности гиалуроновых кислот, в указанном геле.

Более конкретно, стадия c) согласно настоящему изобретению может включать гомогенизацию с общей продолжительностью менее 200 минут, предпочтительно менее 150 минут или даже продолжительностью в диапазоне от 5 до 100 минут.

Несшитый HMW гликозаминогликан, в частности несшитая HMW гиалуроновая кислота

В конкретном варианте осуществления способ согласно изобретению также предусматривает применение по меньшей мере одного несшитого гликозаминогликана с молярной массой 0,50 МДа или более, предпочтительно более 1,00 МДа, более предпочтительно в диапазоне от 1,00 до 4,00 МДа, называемого «несшитый HMW гликозаминогликан», в частности применение по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты, имеющей среднемассовую молярную массу 0,50 МДа или более, предпочтительно более 1,00 МДа, более предпочтительно в диапазоне от 1,00 до 4,00 MДa, так называемой «несшитой HA HMW».

Предпочтительно, указанный «несшитый HMW гликозаминогликан», в частности указанная «несшитая HA HMW», осуществляют в водном растворе. Этот водный раствор может отличаться или быть схожим с одним из водных растворов, рассматриваемых на стадиях а) и b).

Согласно альтернативному варианту осуществления весь или часть указанного «несшитого гликозаминогликана HMW», в частности указанной «несшитой HA HMW» применяют в водном растворе на стадии b).

Согласно другому альтернативному варианту осуществления, весь или часть указанного «несшитого HMW гликозаминогликана», в частности указанной «несшитой HA HMW», применяют в форме водного раствора, отличного от водных растворов со стадий a) и b). Согласно этому альтернативному варианту водный раствор, содержащий весь или часть указанного «несшитого HMW гликозаминогликана», в частности указанной «несшитой HA HMW», и водный раствор со стадии b) смешивают одновременно или последовательно с водным раствором со стадии a).

Предпочтительно, в способе согласно изобретению на стадии b) применяют водный раствор, содержащий от 5 до 15 мг/г «несшитой HA HMW».

Вспомогательное вещество

В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу, как описано выше, дополнительно включающему осуществление по меньшей мере одного вспомогательного вещества, выбранного из группы, состоящей из анестетиков, антиоксидантов, аминокислот, витаминов, минералов, нуклеиновых кислот, нуклеотидов, нуклеозидов, коферментов, адренергических производных, натрия дигидрофосфата моногидрата и/или дигидрата и хлорида натрия.

Стерилизация

Таким образом, в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, для поддержания стерильности указанного геля, применяемые исходные материалы являются стерильными, и получение указанного геля, включая его упаковку в устройство для введения, осуществляют в контролируемых атмосферных условиях.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу получения стерильного и инъекционного водного геля, включающему по меньшей мере одну стадию, заключающуюся в применении водного геля, полученного способом согласно изобретению, или водного геля, как определено в настоящем изобретении, и стадию стерилизации, в частности в автоклаве.

Более конкретно, способ получения водного геля согласно изобретению включает по меньшей мере стадии, состоящие в:

a) обеспечении водного раствора, содержащего по меньшей мере один сшитый гликозаминогликан, называемый «сшитый гликозаминогликан HMW», полученный из несшитого гликозаминогликана с молярной массой 0,50 МДа или более, предпочтительно более 1,00 МДа, более предпочтительно в диапазоне от 1,00 до 4,00 МДа, и сшивающего агента;

b) обеспечении водного раствора, содержащего по меньшей мере один несшитый гликозаминогликан с молярной массой в диапазоне от 0,04 до 0,30 МДа, предпочтительно от 0,08 до 0,20 МДа, более предпочтительно от 0,08 до 0,15 МДа, еще более предпочтительно от 0,08 до 0,10 МДа, называемый «несшитый гликозаминогликан LMW»;

с) образовании гомогенной смеси всех или части указанных растворов со стадий а) и b), которую стерилизуют, в частности в автоклаве.

Более конкретно, способ получения водного геля согласно изобретению включает по меньшей мере стадии, состоящие в:

a) обеспечении водного раствора, содержащего по меньшей мере одну сшитую гиалуроновую кислоту, называемую «сшитая HA HMW», полученную из несшитой гиалуроновой кислоты, имеющей среднемассовую молярную массу 0,50 МДа или более, предпочтительно более 1,00 МДа, более предпочтительно в диапазоне от 1,00 до 4,00 МДа, и сшивающего агента;

b) обеспечении водного раствора, содержащего по меньшей мере одну несшитую гиалуроновую кислоту, называемую «несшитая HA LMW», имеющую среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,04 до 0,30 МДа, предпочтительно от 0,08 до 0,20 МДа; более предпочтительно от 0,08 до 0,15 МДа;

c) образовании гомогенной смеси всех или части указанных растворов со стадий а) и b), которую стерилизуют, в частности в автоклаве,

характеризующийся тем, что он включает применение гиалуроновой кислоты в массовом соотношении «несшитой HA LMW» к «HA HMW» от 1:3 до 2:1.

Указанную стерилизацию предпочтительно проводят на продукте, уже упакованном в устройство для введения, обычно на шприце.

Таким образом, предпочтительно, водный гель, получаемый способом согласно изобретению, упаковывают в шприц до его стерилизации.

Предпочтительно, указанный способ включает одну стадию стерилизации.

Предпочтительно, указанную стадию стерилизации проводят тепловым способом, например, в автоклаве, в частности при температуре от 120 до 140°С.

В частности, стадию стерилизации проводят в автоклаве, во влажных тепловых условиях, при стабильной температуре 121°С или более, предпочтительно от 121 до 135°С с F0 более 15 (показатель стерилизации). Согласно настоящему изобретению показатель стерилизации F0 соответствует времени, в минутах, необходимому при 121°С для инактивации 90 % популяции микроорганизмов, присутствующих в стерилизуемом продукте.

Водный гель

Как упоминалось выше, одним из аспектов настоящего изобретения является водный гель на основе гиалуроновой кислоты, содержащий сшитую гиалуроновую кислоту, характеризующийся тем, что указанный гель содержит по меньшей мере:

- водорастворимую гиалуроновую кислоту, имеющую среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,02 до 0,30 МДа, называемую «sHA LMW», в количестве от 30 до 70 мас.% в расчете на общую массу гиалуроновой кислоты; и

- необязательно, водорастворимую гиалуроновую кислоту, имеющую среднемассовую молярную массу более 0,30 МДа, называемую «sHA HMW»,

и характеризующийся тем, что все водорастворимые гиалуроновые кислоты имеют степень модификации 5 % и менее, предпочтительно3 % или менее, более предпочтительно 1 % или менее, соответствующие процентные значения для растворимых гиалуроновых кислот определяют путем разбавления водного геля раствором 150 нМ нитрата натрия с рН 7,2, содержащим 0,02% NaN₃, при 25°С в течение 5 дней и его центрифугирования при 4400 об/мин в течение 10 мин и фильтрации через 0,45 мм указанного разбавленного геля с получением фильтрата, затем анализа указанного фильтрата с помощью прибора для эксклюзионной хроматографии, оснащенного детектором многоуглового рассеяния света (MALS) и рефрактометрическим (RI) детектором с инкрементом показателя преломления (dn/dc), установленным на уровне 0,165 мл/г, и насосной станции жидкостного хроматографа, оснащенной двойным набором эксклюзионных колонок, адаптированных для молекул, имеющих среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,001 Да до 20 МДа, с подвижной фазой нитрата натрия с pH 7,2 при скорости потока 0,3 мл/мин.

В конкретном варианте осуществления водный гель согласно изобретению представляет собой мягкий гель, то есть гель, имеющий фазовый угол (δ) от 15° до 50° и модуль упругости G' 150 Пa или меньше, предпочтительно от 20 до 150 Пa, измеренные при напряжении 5 Пa при комнатной температуре с использованием реометра (TA Instruments DHR2) с геометрией конус/пластина (угол конуса 1°/диаметр пластины 40 мм) с применением колебательного напряжения развертки с частотой 1 Гц, и силу экструзии 18 Н или меньше, предпочтительно меньше 15 Н, измеренную при фиксированной скорости около 12,5 мм/мин, в шприцах с внутренним диаметром 6,3 мм или более, с иглой с внешним диаметром 0,3 мм (30 G) или меньше и длиной ½″, при комнатной температуре.

В конкретном варианте осуществления водный гель согласно изобретению содержит от 35 до 65 мас.% «sHA LMW» в расчете на общую массу указанного водного геля.

В конкретном варианте осуществления в водном геле согласно изобретению указанная водорастворимая гиалуроновая кислота, называемая «sHA LMW», имеет среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,04 до 0,20 МДа, предпочтительно от 0,04 до 0,15 МДа.

В конкретном варианте осуществления в водном геле согласно изобретению указанная водорастворимая гиалуроновая кислота, называемая «sHA HMW», имеет среднемассовую молярную массу более 0,30 МДа и меньше или равную 4,00 МДа.

В конкретном варианте осуществления водный гель согласно изобретению содержит от 10 до 30 мас.%, предпочтительно от 15 до 20 мас.% «sHA HMW» в расчете на общую массу указанного водного геля.

В конкретном варианте осуществления в водном геле согласно изобретению указанная сшитая гиалуроновая кислота присутствует в количестве по меньшей мере 5 мг/г в расчете на общую массу указанного водного геля.

В конкретном варианте осуществления в водном геле согласно изобретению указанная водорастворимая гиалуроновая кислота, называемая «sHA LMW», присутствует в количестве по меньшей мере 3 мг/г, предпочтительно 10 мг/г в расчете на общую массу указанного водного геля.

В конкретном варианте осуществления в водном геле согласно изобретению общая концентрация гиалуроновой кислоты составляет от 10 до 40 мг/г, предпочтительно от 15 до 35 мг/г, более предпочтительно от 20 до 30 мг/г в расчете на общую массу указанного водного геля.

В конкретном варианте осуществления в водном геле согласно изобретению степень модификации всех гиалуроновых кислот составляет 5 % или меньше, предпочтительно 3 % или меньше, более предпочтительно 1 % или меньше.

Согласно конкретному варианту осуществления в водном геле, как определено в изобретении:

- сшитая гиалуроновая кислота присутствует в количестве в диапазоне от 6 до 12 мг/г в расчете на общую массу водного геля,

- водорастворимая гиалуроновая кислота, называемая «sHA LMW», присутствует в количестве в диапазоне от 12 до 20 мг/г в расчете на общую массу водного геля,

- водорастворимая гиалуроновая кислота, называемая «sHA HMW», присутствует в количестве в диапазоне от 3 до 6 мг/г в расчете на общую массу водного геля,

причем указанный водный гель содержит общую концентрацию гиалуроновой кислоты от 20 до 30 мг/г в расчете на общую массу водного геля.

В конкретном варианте осуществления водный гель согласно изобретению подвергают стадии тепловой стерилизации, например, в автоклаве.

Известно, что гиалуроновая кислота очень чувствительна к сильному кислотному и щелочному рН, высоким температурам (например, во время тепловой стерилизации), окислению (например, активными формами кислорода) и ферментативной активности (Stern R, Kogan G, Jedrzejas MJ, et al. The many ways to cleave hyaluronan. Biotechnol Adv 2007;25:537-57).

В результате, способ получения, в частности условия сшивания, применяемые для получения композиций, содержащих сшитую гиалуроновую кислоту, способствуют деградации цепей гиалуроновой кислоты с высвобождением растворимой LMW гиалуроновой кислоты. Такие фрагменты LMW гиалуроновой кислоты по меньшей мере частично модифицированы применяемым сшивающим агентом, таким как БДДЭ.

Напротив, растворимая гиалуроновая кислота из несшитой LMW гиалуроновой кислоты, добавленной в процессе получения, не модифицируется БДДЭ.

Модификация с помощью БДДЭ может быть визуализирована путем измерения степени модификации (MOD). В этом контексте, чем выше MOD растворимой гиалуроновой кислоты, тем выше доля фрагментов LMW гиалуроновой кислоты, образуемых в процессе получения исследуемого геля, и тем ниже доля растворимой гиалуроновой кислоты из LMW гиалуроновой кислоты, добавленной в процессе получения.

Это проиллюстрировано в примере 7.

Вышеупомянутое расщепление гиалуроновой кислоты объясняет то, что молярная масса гиалуроновой кислоты, добавленной в гель до стерилизации с использованием тепла, выше, чем молярная масса растворимой гиалуроновой кислоты, измеренная в стерилизованном геле.

Такая чувствительность также характерна и для других гликозаминогликанов.

Практически «sHA» соответствует:

- несшитой HA LMW, добавленной в процессе получения геля после стадии сшивания a); и

- когда присутствует, несшитой HA HMW, добавленной в процессе получения геля после стадии сшивания a); и

- фрагментам HA, высвобожденным в процессе получения геля, причем указанные фрагменты HA по меньшей мере частично модифицированы сшивающим агентом, таким как БДДЭ.

Таким образом, количество «sHA LMW» по меньшей мере равно количеству:

- несшитой HA LMW, добавленной в процессе получения геля после стадии сшивания a); и

- когда присутствует, несшитой HA HMW, добавленной в процессе получения геля после стадии сшивания a).

- Напротив, «nsHA» соответствует сшитой HA.

Согласно конкретному варианту осуществления водный гель согласно изобретению содержит по меньшей мере:

- водорастворимую гиалуроновую кислоту, имеющую среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,04 до 0,20 МДа, называемую «sHA LMW», в количестве от 30 до 70 мас.% в расчете на общую массу гиалуроновой кислоты; и

- необязательно, водорастворимую гиалуроновую кислоту, имеющую среднемассовую молярную массу более 0,30 МДа и меньше или равную 4,00 МДа, называемую «sHA HMW»,

и все водорастворимые гиалуроновые кислоты имеют степень модификации 5 % или менее, предпочтительно 3 % или менее, более предпочтительно 1 % или менее,

соответствующие процентные значения для растворимых гиалуроновых кислот определяют путем разбавления водного геля раствором 150 нМ нитрата натрия с рН 7,2, содержащим 0,02% NaN₃, при 25°С в течение 5 дней и его центрифугирования при 4400 об/мин в течение 10 мин и фильтрации через 0,45 мм указанного разбавленного геля с получением фильтрата, затем анализа указанного фильтрата с помощью прибора для эксклюзионной хроматографии, оснащенного детектором многоуглового рассеяния света (MALS) и рефрактометрическим (RI) детектором с инкрементом показателя преломления (dn/dc), установленным на уровне 0,165 мл/г, и насосной станции жидкостного хроматографа, оснащенной двойным набором эксклюзионных колонок, адаптированных для молекул, имеющих среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,001 Да до 20 МДа, с подвижной фазой нитрата натрия с pH 7,2 при скорости потока 0,3 мл/мин. Согласно конкретному варианту осуществления водный гель согласно изобретению содержит по меньшей мере:

- водорастворимую гиалуроновую кислоту, имеющую среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,04 до 0,15 МДа, называемую «sHA LMW», в количестве от 30 до 70 мас.% в расчете на общую массу гиалуроновой кислоты; и

- необязательно, водорастворимую гиалуроновую кислоту, имеющую среднемассовую молярную массу более 0,30 МДа и меньше или равную 4,00 МДа, называемую «sHA HMW»,

и все водорастворимые гиалуроновые кислоты имеют степень модификации 5 % или менее, предпочтительно 3 % или менее, более предпочтительно 1 % или менее,

соответствующие процентные значения для растворимых гиалуроновых кислот определяют путем разбавления водного геля раствором 150 нМ нитрата натрия с рН 7,2, содержащим 0,02% NaN₃, при 25°С в течение 5 дней и его центрифугирования при 4400 об/мин в течение 10 мин и фильтрации через 0,45 мм указанного разбавленного геля с получением фильтрата, затем анализа указанного фильтрата с помощью прибора для эксклюзионной хроматографии, оснащенного детектором многоуглового рассеяния света (MALS) и рефрактометрическим (RI) детектором с инкрементом показателя преломления (dn/dc), установленным на уровне 0,165 мл/г, и насосной станции жидкостного хроматографа, оснащенной двойным набором эксклюзионных колонок, адаптированных для молекул, имеющих среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,001 Да до 20 МДа, с подвижной фазой нитрата натрия с pH 7,2 при скорости потока 0,3 мл/мин.

Согласно конкретному варианту осуществления водный гель согласно изобретению содержит по меньшей мере:

- водорастворимую гиалуроновую кислоту, имеющую среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,02 до 0,30 МДа, называемую «sHA LMW», в количестве от 35 до 65 мас.% в расчете на общую массу гиалуроновой кислоты; и

- необязательно, водорастворимую гиалуроновую кислоту, имеющую среднемассовую молярную массу более 0,30 МДа, называемую «sHA HMW»,

и все водорастворимые гиалуроновые кислоты имеют степень модификации 5 % или менее, предпочтительно 3 % или менее, более предпочтительно 1 % или менее,

соответствующие процентные значения для растворимых гиалуроновых кислот определяют путем разбавления водного геля раствором 150 нМ нитрата натрия с рН 7,2, содержащим 0,02%NaN₃, при 25°С в течение 5 дней и его центрифугирования при 4400 об/мин в течение 10 мин и фильтрации через 0,45 мм указанного разбавленного геля с получением фильтрата, затем анализа указанного фильтрата с помощью прибора для эксклюзионной хроматографии, оснащенного детектором многоуглового рассеяния света (MALS) и рефрактометрическим (RI) детектором с инкрементом показателя преломления (dn/dc), установленным на уровне 0,165 мл/г, и насосной станции жидкостного хроматографа, оснащенной двойным набором эксклюзионных колонок, адаптированных для молекул, имеющих среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,001 Да до 20 МДа, с подвижной фазой нитрата натрия с pH 7,2 при скорости потока 0,3 мл/мин.

Согласно конкретному варианту осуществления водный гель согласно изобретению содержит по меньшей мере:

- водорастворимую гиалуроновую кислоту, имеющую среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,04 до 0,20 МДа, называемую «sHA LMW», в количестве от 35 до 65 мас.% в расчете на общую массу гиалуроновой кислоты; и

- необязательно, водорастворимую гиалуроновую кислоту, имеющую среднемассовую молярную массу более 0,30 МДа и меньше или равную 4,00 МДа, называемую «sHA HMW»,

и все водорастворимые гиалуроновые кислоты имеют степень модификации 5 % или менее, предпочтительно 3 % или менее, более предпочтительно 1 % или менее,

соответствующие процентные значения для растворимых гиалуроновых кислот определяют путем разбавления водного геля раствором 150 нМ нитрата натрия с рН 7,2, содержащим 0,02%NaN₃, при 25°С в течение 5 дней и его центрифугирования при 4400 об/мин в течение 10 мин и фильтрации через 0,45 мм указанного разбавленного геля с получением фильтрата, затем анализа указанного фильтрата с помощью прибора для эксклюзионной хроматографии, оснащенного детектором многоуглового рассеяния света (MALS) и рефрактометрическим (RI) детектором с инкрементом показателя преломления (dn/dc), установленным на уровне 0,165 мл/г, и насосной станции жидкостного хроматографа, оснащенной двойным набором эксклюзионных колонок, адаптированных для молекул, имеющих среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,001 Да до 20 МДа, с подвижной фазой нитрата натрия с pH 7,2 при скорости потока 0,3 мл/мин.

Согласно конкретному варианту осуществления водный гель согласно изобретению содержит по меньшей мере:

- водорастворимую гиалуроновую кислоту, имеющую среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,04 до 0,15 МДа, называемую «sHA LMW», в количестве от 35 до 65 мас.% в расчете на общую массу гиалуроновой кислоты; и

- необязательно, водорастворимую гиалуроновую кислоту, имеющую среднемассовую молярную массу более 0,30 МДа и меньше или равную 4,00 МДа, называемую «sHA HMW»,

и все водорастворимые гиалуроновые кислоты имеют степень модификации 5 % или менее, предпочтительно 3 % или менее, более предпочтительно 1 % или менее,

соответствующие процентные значения для растворимых гиалуроновых кислот определяют путем разбавления водного геля раствором 150 нМ нитрата натрия с рН 7,2, содержащим 0,02% NaN₃, при 25°С в течение 5 дней и его центрифугирования при 4400 об/мин в течение 10 мин и фильтрации через 0,45 мм указанного разбавленного геля с получением фильтрата, затем анализа указанного фильтрата с помощью прибора для эксклюзионной хроматографии, оснащенного детектором многоуглового рассеяния света (MALS) и рефрактометрическим (RI) детектором с инкрементом показателя преломления (dn/dc), установленным на уровне 0,165 мл/г, и насосной станции жидкостного хроматографа, оснащенной двойным набором эксклюзионных колонок, адаптированных для молекул, имеющих среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,001 Да до 20 МДа, с подвижной фазой нитрата натрия с pH 7,2 при скорости потока 0,3 мл/мин. Как указано выше, настоящее изобретение также относится к водному гелю, получаемому согласно способу по изобретению.

В конце стадии c) получают гомогенный водный гель, содержащий по меньшей мере один «несшитый LMW гликозаминогликан» и «HMW гликозаминогликан», включая по меньшей мере один «сшитый HMW гликозаминогликан».

Предпочтительно водный гель, получаемый способом в соответствии с изобретением, содержит общую концентрацию гликозаминогликана в диапазоне от 10 до 40 мг/г, предпочтительно от 15 до 35 мг/г, более предпочтительно от 20 до 30 мг/г в расчете на его общую массу.

Водный гель, получаемый способом в соответствии с изобретением, также может характеризоваться массовым соотношением «несшитого гликозаминогликана LMW» к «гликозаминогликану HMW» в диапазоне от 1:4 до 4:1, предпочтительно от 1:3 до 5:3, более предпочтительно от 1:2 до 2:1.

Согласно конкретному варианту осуществления указанный водный гель имеет степень модификации указанных гликозаминогликанов менее 5 %, предпочтительно менее 3 %, более предпочтительно менее 1 %.

Более конкретно, в конце стадии c) получают гомогенный водный гель, содержащий по меньшей мере одну «несшитую HA LMW» и «HA HMW», включая по меньшей мере одну «сшитую HA HMW».

Предпочтительно водный гель, получаемый способом в соответствии с изобретением, содержит общую концентрацию гиалуроновой кислоты в диапазоне от 10 до 40 мг/г, предпочтительно от 15 до 35 мг/г, более предпочтительно от 20 до 30 мг/г в расчете на его общую массу.

В соответствии с вариантом осуществления водный гель, получаемый способом в соответствии с изобретением, также характеризуется массовым соотношением «несшитой HA LMW» к «HA HMW» в диапазоне от 1:3 до 5:3, предпочтительно от 1:2 до 5:3.

Согласно конкретному варианту осуществления указанный водный гель имеет степень модификации указанных гиалуроновых кислот 5 % или менее, предпочтительно 3 % или менее, более предпочтительно 1 % или менее.

В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления указанный водный гель, полученный способом согласно настоящему изобретению, представляет собой мягкий гель, то есть гель, имеющий фазовый угол (δ) от 15° до 50° и модуль упругости G' 150 Пa или меньше, предпочтительно от 20 до 150 Пa, измеренные при напряжении 5 Пa при комнатной температуре с использованием реометра (TA Instruments DHR2) с геометрией конус/пластина (угол конуса 1°/диаметр пластины 40 мм) с применением колебательного напряжения развертки с частотой 1 Гц, и силу экструзии 18 Н или меньше, предпочтительно меньше 15 Н, измеренную при фиксированной скорости около 12,5 мм/мин, в шприцах с внутренним диаметром 6,3 мм или более, с иглой с внешним диаметром 0,3 мм (30 G) или меньше и длиной ½″, при комнатной температуре.

Согласно одному варианту осуществления указанный водный гель получают в конце способа, в котором обеспечивают:

- на стадии а) водный раствор, содержащий от 5 до 15 мг/г «сшитого гликозаминогликана HMW»;

- на стадии b) водный раствор, содержащий от 50 до 60 мг/г «несшитого гликозаминогликана LMW» и от 5 до 20 мг/г «несшитого гликозаминогликана HMW», и

указанный полученный гель имеет общую концентрацию гликозаминогликана от 20 до 30 мг/г в расчете на его общую массу.

Согласно одному варианту осуществления указанный водный гель получают в конце способа, в котором обеспечивают:

- на стадии а) водный раствор, содержащий от 5 до 15 мг/г «сшитой HA HMW»;

- на стадии b) водный раствор, содержащий от 50 до 60 мг/г «несшитой HA LMW» и от 5 до 20 мг/г «несшитой HA HMW», и

указанный полученный гель имеет общую концентрацию гиалуроновой кислоты от 20 до 30 мг/г в расчете на его общую массу.

Представитель водных гелей, получаемых способом в соответствии с изобретением и имеющих общую концентрацию гликозаминогликана от 10 до 40 мг/г, предпочтительно от 15 до 35 мг/г, более предпочтительно от 20 до 30 мг/г в расчете на его общую массу, является результатом обеспечения, в частности:

- по меньшей мере одного сшитого гликозаминогликана, полученного из по меньшей мере одного несшитого гликозаминогликана с молярной массой 0,50 МДа или более, предпочтительно более 1,00 МДа, более предпочтительно в диапазоне от 1,00 до 4,00 МДа, называемого «сшитый гликозаминогликан HMW»;

- по меньшей мере одного несшитого гликозаминогликана с молярной массой от 0,04 до 0,30 МДа, предпочтительно от 0,08 до 0,20 МДа, более предпочтительно от 0,08 до 0,15 МДа, еще более предпочтительно от 0,08 до 0,10 МДа, называемого «несшитый гликозаминогликан LMW»; и

необязательно, по меньшей мере одного несшитого гликозаминогликана с молярной массой 0,50 МДа или более, предпочтительно более 1 МДа, более предпочтительно в диапазоне от 1,00 до 4,00 МДа, называемого «несшитый гликозаминогликан HMW».

Представитель водных гелей, получаемых способом в соответствии с изобретением и имеющих общую концентрацию гиалуроновой кислоты от 20 до 30 мг/г в расчете на его общую массу, является результатом обеспечения, в частности:

на стадии а) водного раствора, содержащего от 5 до 15 мг/г «сшитой HA HMW»;

на стадии b) водного раствора, содержащего от 50 до 60 мг/г «несшитой HA LMW» и от 5 до 20 мг/г «несшитой HA HMW».