СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ КАРРИМИЦИНА ПРОТИВ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ИНФЕКЦИИ, СПРОВОЦИРОВАННОЙ МИКОБАКТЕРИЕЙ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 2020 года по МПК A61K31/7048 A61P31/06 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ:

Настоящее изобретение относится к способу применения макролидных антибиотиков при лечении инфекций, спровоцированных туберкулезной бациллой.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ:

Туберкулез - хроническое инфекционное заболевание вследствие заражения микобактерией туберкулеза (МБТ). В основном поражает легкие и является заболеванием с наибольшей одиночной смертностью среди инфекционных заболеваний. Туберкулез зачастую встречается у людей с ослабленным иммунитетом и представляет собой наиболее распространенное условно-патогенное заболевание, связанное со СПИДом (синдромом приобретенного иммунодефицита). По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) в год во всем мире фиксируются от 8 до 10 миллионов новых случаев заболевания туберкулезом и от 3 до 4 миллионов летальных исходов из-за туберкулеза, причем наибольшее количество пациентов наблюдается в развивающихся странах. Кроме того, прогнозируется, что в период с 2000 по 2020 год туберкулезом будут заражены около одного миллиарда людей, и 35 миллионов людей погибнут от него. В то же время, со временем резистентность МБТ к препаратам возрастает, и это станет крупной угрозой для контроля туберкулеза во всем мире. Наша страна - одна из 22 стран мира с высокой заболеваемостью туберкулезом. Количество пациентов, страдающих от открытой формы туберкулеза, оценивается как второе в мире, а эпидемические характеристики включают высокие уровень заболеваемости, коэффициент заболеваемости, резистентность к препаратам и уровень смертности. Также 1/4 из 2 миллионов пациентов с положительным анализом на наличие МБТ или большее их количество в стране являются пациентами с высокой резистентностью к препаратам против туберкулезной бациллы.

В настоящее время препараты первого ряда, используемые для клинического лечения туберкулеза (с определенным действием относительно резистентности микобактерии туберкулеза), состоят из 5 видов, т.е., рифампицина, изониазида, стрептомицина, этамбутола и пиразинамида. При этом данные препараты имеют множество неблагоприятных побочных реакций и ограниченное бактерицидное действие. Курс лечения сравнительно долог, и, как правило, они применяются более 6 месяцев. А пациенты демонстрируют слабую приверженность лечению. Противотуберкулезные препараты второго ряда (с бактериостатическим действием относительно микобактерии туберкулеза) включают: капреомицин, этионамид, парааминосалициловую кислоту, циклосерин, ципрофлоксацин, амикацин, канамицин и т.д. При этом данные препараты обладают повышенными побочными реакциями, а курс лечения еще дольше (18-24 месяца), цена высока, а частота выздоровления ниже. Следует отметить, что клинические исследования доказывают, что все противотуберкулезные препараты первого ряда могут приводить к поражению печени. Например: побочные реакции на изониазид включают в себя периферический нефрит, гепатотоксичность, расстройство центральной нервной системы и аллергию. Побочные реакции рифампицина включают в себя гепатотоксичность, расстройства желудочно-кишечного тракта, неврологические симптомы и аллергию. Побочная реакция на этамбутол, в основном, выражается токсичностью для зрительного нерва. Побочные реакции на пиразинамид включают в себя ксантохромию и повышение содержания мочевой кислоты в крови. Проблемы токсичности и бактериальной резистентности к препарату стрептомицину серьезно ограничивают его использование, а коэффициент частоты заболеваний ввиду бактериальной резистентности к препаратам может быть снижен при совместном применении стрептомицина с другими препаратами. Несмотря на узкое клиническое применение, стрептомицин все еще служит в качестве противотуберкулезного средства первого ряда [Чжу, Шанымей, Strait Pharmaceutical Journal, 2010, 22 (2): 123-125]. Кроме того, сообщалось, что исследования 518 клинически выведенных штаммов микобактерии туберкулеза в 2010 году продемонстрировали, что среди препаратов первого ряда наибольший коэффициент резистентности микобактерии туберкулеза к изониазиду составил 53,67%, а к стрептомицину - 45,95%; среди препаратов второго ряда резистентность к офлоксацину достигает 39,77%, амикацину - 15,83% и капреомицину - 21,81%; среди 321 штамма, резистентного к одному или нескольким препаратам первого ряда, резистентность к офлоксацину достигает 57,01%, а к амикацину и капреомицину - 25,55 и 33,02% соответственно; среди 217 штаммов, резистентных к нескольким препаратам, устойчивость к офлоксацину достигает 72,35% [Лю, Идянь и соавт. Подборка материалов симпозиума клинических работников китайской ассоциации по борьбе с туберкулезом за 2010 г., стр. 274-275]. Это приводит к возникновению сложной проблемы по реализации работы по контролю туберкулеза, а в частности, работы по контролю туберкулеза, резистентного к нескольким препаратам, в нашей стране. Таким образом, уже крайне необходимо в кратчайшие сроки найти замену для борьбы с резистентной микобактерией туберкулеза, а в частности, со штаммами, устойчивыми к нескольким препаратам.

Новые макролидные препараты, т.е., кларитромицин, азитромицин и рокситромицин представляют собой компоненты 14-членного эритромицина и отличаются от противотуберкулезных препаратов первого и второго рядов по своему механизму противобактериального действия, а также обратимо связаны с рибосомальными субъединицами 50S в талломе и препятствуют синтезу белков. По представленным внутригосударственным данным МИК кларитромицина для чувствительной микобактерии туберкулеза составляет 0,25-2,0 мкг/мл, а для бактерий, резистентных к препаратам - 2,0-32 мкг/мл. МИК азитромицина против микобактерии туберкулеза составляет 128 мкг/мл [Тан, Шэньцзе. Последние достижения исследований противотуберкулезных препаратов. Anti-Tuberculosis Journal of China, стр. 1-3, дополнение, том 28, 2006]. По представленным зарубежным данным МИК кларитромицина для микобактерии туберкулеза H37Rv (АТСС 27294) составляет 6 мкг/мл. МИК азитромицина составляет 95 мкг/мл [Канакешвари Фалзари и соавт.: Действие макролидных компонентов in vitro и in vivo на микобактерию туберкулеза. Antimicrob. Agents and Chemother. 2005, 49(4): 1447-1454]; и МИК рокситромицина превышает или равен 64 мкг/мл. Этот вид препаратов не входит в препараты для клинического лечения инфекций, спровоцированных микобактерией туберкулеза, но имеются сведения о клиническом лечении заболеваний вследствие заражения туберкулезной бациллой с отдельным или совместным применением препаратов с противотуберкулезными средствами [Сюй, Ли и соавт. Исследование применения противотуберкулезных антибактериальных препаратов на пациентах в Шэньчжене. Anti-Tuberculosis Journal of China, 2010, 32 (3): 151-154].

Как доказано исследованиями, 16- и 14-членные цикломакролидные антибиотики имеют аналогичные механизмы противобактериального действия. Эти виды препаратов демонстрируют низкую активность в отношении микобактерии туберкулеза. Например, МИК тилозина для микобактерии туберкулеза H37Rv (АТСС 27294) составляет 58,6 мкг/мл, а МИК как спирамицина, так и медемицина превышает 100 мкг/мл [Канакешвари Фалзари и соавт.: Действие макролидных компонентов in vitro и in vivo на микобактерию туберкулеза. Antimicrob. Agents and Chemother. 2005, 49(4): 1447-1454]. Следовательно, связанные сведения о клиническом лечении туберкулеза посредством применения этого вида антибиотиков внутри государства и за рубежом на данный момент отсутствуют.

Новый 16-членный макролидный антибиотик, т.е., карримицин (предыдущее наименование: шэнцзимицин и биотекспирамицин), разработанный в нашей лаборатории - это 4'-ацилированный спирамицин с основным компонентом в виде изовалерил-спирамицина, а механизм действия карримицина состоит в ингибировании синтеза белков посредством связывания с бактериальными рибосомами. Согласно результатам испытаний способами in-vivo и in-vitro карримицин эффективен против грамположительных бактерий, в частности против некоторых бактерий, резистентных к препаратам (например, золотистый стафилококк, устойчивый к бета-лактамам, эритромицину и т.д.), и у него отсутствует перекрестная лекарственная резистентность в отношении аналогичных препаратов. В то же время, карримицин оказывает очень хорошее противобактериальное действие на микоплазму и хламидию, а также на часть грамотрицательных бактерий, и при этом имеет хороший противобактериальный эффект на токсоплазму, легионеллу и т.д. [Вон, Игуан и соавт. «Биотекспирамицин и его применение при резистентности при инфекционных заболеваниях». 23 декабря 2003 г. Патент на изобретение Китая: ZL 2003 1 0122420.9]. Карримицин обладает хорошей проницаемостью тканей, а противобактериальное действие карримицина in-vivo явно превосходит таковое при способе in-vitro. Также карримицин обладает потенциальным иммунорегуляторным действием. Карримицин - безопасный в использовании антибиотик, обладающий прекрасным лечебным эффектом, что подтверждается клиническими исследованиями I, II и III этапов. В нашей лаборатории проводятся дополнительные исследования потенциальных эффектов карримицина, и клинические показания, а также область его применения расширяются.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ:

Цель настоящего изобретения - предоставление ряда результатов и экспериментальных исследований действия карримицина на клинически выведенные микобактерии туберкулеза для подтверждения того, что карримицин, возможно, имеет новый способ применения при лечении заболеваний вследствие заражения туберкулезной бациллой.

Согласно настоящему изобретению основные этапы следующие: проведение измерений воздействия карримицина на резистентность туберкулезной бациллы, т.е., микобактерии туберкулеза посредством применения метода абсолютной концентрации и клинических противотуберкулезных препаратов первого ряда, т.е., изониазида и рифампицина в качестве контрольных. Карримицин продемонстрировал действие на 172 из 240 клинически выведенных штаммов микобактерии туберкулеза, что подтверждается результатами экспериментальных исследований, и суммарный коэффициент его эффективности составил 71,66%. Действие на 37 штаммов оказалось сильнее, чем у изониазида, и количество привлеченных штаммов составило 21,5%. Действие на 39 штаммов оказалось сильнее, чем у рифампицина, и количество привлеченных штаммов составило 22,7%. Действие на 23 штамма оказалось сильнее, чем у изониазида и рифампицина, и количество привлеченных штаммов составило 13,4%. Результаты по настоящему изобретению показывают, что новый способ применения карримицина обеспечивает преимущество при лечении инфекционных заболеваний, спровоцированных микобактерией туберкулеза, резистентной к изониазиду и рифампицину.

В настоящем изобретении дополнительно предлагается применение композиции при производстве препаратов для лечения заболеваний вследствие заражения туберкулезной бациллой, и эта композиция включает в себя карримицин в качестве активного компонента и фармацевтически приемлемого носителя.

Применение по настоящему изобретению предлагается пероральное, в форме инъекции, или же может использоваться любая другая соответствующая лекарственная форма.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Варианты осуществления, приведенные ниже, используются исключительно для содействия специалистам в настоящей области техники для лучшего понимания настоящего изобретения и никоим образом не ограничивают его.

В конкретных вариантах осуществления ряд исследований по измерению действия на резистентность микобактерии туберкулеза к карримицину проводится с использованием противотуберкулезных препаратов первого ряда, часто используемых в клинических условиях, в качестве контрольных. В отношении микобактерии туберкулеза результаты демонстрируют, что количество привлеченных штаммов, на которые оказывает действие карримицин, превышает таковое в контрольных группах. Карримицин применяется при лечении инфекционных заболеваний, спровоцированных микобактерией туберкулеза, резистентной к препаратам.

<Вариант осуществления 1> Получение и обработка образца микобактерии туберкулеза

Согласно положениям государственного стандарта WS288-2008 <Стандарт диагностики туберкулеза легких>, выпущенного Министерством здравоохранения, отбираются пациенты, у которых явно диагностирован туберкулез или имеется обоснованное клиническими проявлениями, признаками и исследованиями грудной клетки подозрение на заболевание. У отобранных пациентов были взяты образцы мокроты, гидроторакса, спинномозговой жидкости и материи в количестве 2 мл, и каждый образец был помещен в центрифужную пробирку объемом 50 мл с закручивающейся крышкой. В центрифужную пробирку было добавлено одинаковое количество раствора N-ацетила-L-цистеина гидроксида натрия (NaOH-NALC) для предварительной обработки и произведено перемешивание вихревым способом в течение 20 секунд. Перемешанному материалу дали отстояться в течение 18 минут при комнатной температуре. Был добавлен натрий-фосфатный буфер (рН 6,8) до получения объема 40 мл. Было произведено центрифугирование при силе 3000 g в течение 20 минут, после чего супернатант был удален, а преципитат - сохранен. Для приготовления суспензии были добавлены 2 мл натрий-фосфатного буфера (рН 6,8). Культуральная среда была засеяна обработанными образцами для твердой культуральной среды.

<Вариант осуществления 2> Изоляция, выращивание и определение образца микобактерии туберкулеза

1. Подготовка культуральной среды

Компоненты культуральной среды приведены в таблице 1. Все компоненты были добавлены в дистиллированную воду согласно указанной дозировке и были полностью растворены. Было проведено кипячение в течение 30 минут или 15 минут под высоким давлением при температуре 12°С.

Были взяты свежие куриные яйца, для очистки промыты водопроводной водой, очищены щеткой в мыльной воде и обработаны спиртом 75% для дезинфекции после их опорожнения. Содержимое яйца было вылито в стерильный эмалированный мерный сосуд в стерильных условиях и полностью перемешано для однородности. Затем была проведена фильтрация содержимого яйца с помощью стерилизационной марли. После этого 1000 мл содержимого яйца было добавлено в культуральную среду и полностью и равномерно перемешано. Были добавлены 20 мл красителя малахитовый зеленый 2% и выполнено полное и однородное перемешивание. Были добавлены 7 мл общекультуральной среды в пробирке (18 * 180 мм) и проведена коагуляция в течение 50 минут при температуре 85°С в паровом термостате. 5% подготовленной культуральной среды были извлечены из пробирки, и было проведено выращивание в течение 48 часов при температуре 37°С для стерильного исследования. Культуральная среда была помещена в холодильную камеру с температурой 4°С для дальнейшего использования после проведения стерильного исследования, и эта среда использовалась в течение одного месяца.

2. Засеянная культура туберкулезной бациллы

0,1 мл образца, обработанного по <варианту осуществления 1>, был откачан и равномерно посеян на поверхность скошенного агара культуральной среды. Вся поверхность скошенного агара была покрыта суспензией. Было проведено выращивание на засеянной поверхности скошенного агара культуральной среды в инкубаторе при температуре 37°С. Контроль условий роста бактерий осуществлялся на третий и седьмой дни. Далее контроль осуществлялся один раз в неделю. Образцы с подозрением на положительную реакцию своевременно обирались при обнаружении таковых, и каждый день осуществлялся контроль. Положительный рост проверялся посредством окрашивания мазков. Установлено, что культура микобактерий туберкулеза отрицательная, если в течение 8 недель выращивания рост бактерий отсутствует.

3. Окрашивание туберкулезной бациллы при кислотостойкости

Отбиралось небольшое количество выращенных положительных штаммов микобактерии туберкулеза, и штамм равномерно наносился на микропрепараты, закреплялся на горелке, окрашивался раствором угольной кислоты, прогревался пламенем в течение 5 минут, обесцвечивался соляной кислотой 3% в течение приблизительно 1 минуты и ополаскивался водой. После докраски раствором щелочного метилена в течение 1 минуты штамм ополаскивался водой, блотировался насухо, и выполнялся его контроль под микроскопом с иммерсионной системой. Микобактерия туберкулеза окрашивалась красным.

<Вариант осуществления 3> Эксперимент по воздействию карримицина на резистентность микобактерии туберкулеза

1. Метод абсолютной концентрации

1) Противотуберкулезные препараты

Стандартные лекарственные препараты на основе карримицина:

полученные из Национального института по контролю фармацевтических и биологических препаратов; контрольные препараты: изониазид и рифампицин, приобретенные как стандартные лекарственные препараты у компании Sigma. Необходимая дозировка (таблица 2) подготавливается с помощью исходных растворов с противотуберкулезными препаратами в соответствии с определенными концентрациями, после чего добавляется определенное количество культуральной среды.

2) Посев штаммов

Путем окрашивания было подтверждено, что клинически выведенные образцы штаммов представляют собой культуру кислотостойких бактерий. Далее культура была разбавлена физиологическим раствором с содержанием 10% полисорбата-80, была проведена нефелометрия на соответствие стандарту мутности по МакФарланду в пробирке (Guangdong Huankai Microbiological technology Co., Ltd.). Был приготовлен бактериальный раствор 10^-2 мг/мл, и культуральная среда с содержанием препарата-детектора была засеяна этим раствором.

В каждой партии испытаний были организованы положительные и отрицательные контрольные пробы. Отрицательная контрольная проба включает культуральную среду без препаратов. Положительная контрольная проба включает стандартные штаммы микобактерии туберкулеза H37Rv. Объем посева в каждой пробирке составляет 0,1 мл. Культура была обработана с использованием засеянной культуральной среды при температуре 37°С.

3) Контроль результатов и выводы

После засева бактериального раствора контроль проводился один раз в 3 дня, после чего контроль выполнялся один раз в неделю, и результаты фиксировались через 4 недели.

Оценка результатов культуры выполнялась согласно следующим нормам:

(1) отчет о том, что культура микобактерий туберкулеза отрицательная (-), если в течение 8 недель выращивания рост колоний бактерий отсутствует;

(2) отчет о том, что микобактерия положительная, и о количестве бактериальных колоний, если количество этих колоний, выросших на поверхности скошенного агара культуральной среды, составляет 20 или менее;

(3) отчет о том, что микобактерия положительная (1+), если бактериальные колонии разрозненно вырастают на поверхности скошенного агара культуральной среды и занимают 1/4 площади поверхности этого агара или менее, а количество бактериальных колоний составляет 20 или более;

(4) отчет о том, что микобактерия положительная (2+), если бактериальные колонии разрозненно вырастают на поверхности скошенного агара культуральной среды и занимают 1/4 площади поверхности этого агара или более, или 1/2 его поверхности или менее;

(5) отчет о том, что микобактерия положительная (3+), если бактериальные колонии плотно вырастают на поверхности скошенного агара культуральной среды и занимают 1/2 площади поверхности этого агара или более, или 3/4 его поверхности или менее; и

(6) отчет о том, что микобактерия положительная (4+), если бактериальные колонии плотно вырастают на поверхности скошенного агара культуральной среды и занимают 3/4 площади поверхности этого агара или более.

2. Воздействие карримицина на резистентность микобактерии туберкулеза 1) Клиническая микобактерия туберкулеза, чувствительная к карримицину Из 240 клинически выведенных идентифицированных штаммов микобактерий туберкулеза 172 оказались чувствительны к 1 мкг/мл или 20 мкг/мл карримицина (таблица 3). Как приведено в таблице 3, чувствительность 92 из 172 клинически выведенных штаммов, чувствительных к карримицину, равна этому показателю для штамма контроля качества H37Rv в лаборатории и составляет 53,48% привлеченных штаммов. Другие 80 чувствительных штаммов явно превосходят по количеству штаммы контроля качества H37Rv в лаборатории. При этом 54 штамма оказались чувствительны к 1 мкг/мл карримицина и составили 31,39% от суммарного количества привлеченных штаммов. Следовательно, карримицин оказывает более сильное воздействие на клинически выведенные микобактерии туберкулеза.

Контроль качества: в качестве контрольной пробы служат стандартные лабораторные штаммы микобактерий туберкулеза H37Rv; Контрольная проба: культуральная среда без препаратов. Все выведенные штаммы, растущие в культуральной среде без препаратов, относятся к категории 4+

2) Сопоставление действия карримицина и изониазида на некоторые клинические микобактерии туберкулеза

Были сопоставлены воздействия карримицина и клинического противотуберкулезного препарата первого ряда, т.е., изониазида на микобактерию туберкулеза, и результат показывает, что 20 мкг/мл карримицина эффективны против 37 клинических штаммов микобактерий туберкулеза, резистентных к изониазиду (таблица 4).

3) Сопоставление действия карримицина и рифампицина на некоторые клинические микобактерии туберкулеза

Были сопоставлены воздействия карримицина и клинического противотуберкулезного препарата первого ряда, т.е., рифампицина на клинически выведенную микобактерию туберкулеза, и результат эксперимента показывает, что 20 мкг/мл карримицина эффективны против 39 клинических штаммов микобактерий туберкулеза, резистентных к рифампицину (таблица 5).

Действие карримицина на некоторые клинические бактерии туберкулеза превосходит таковое, оказываемое 250 мкг/мл рифампицина. 4) Сопоставление действия карримицина на некоторые клинические микобактерии туберкулеза, резистентные к изониазиду и рифампицину Было сопоставлено воздействие карримицина на клинически выведенную микобактерию туберкулеза, резистентную к изониазиду и рифампицину, и результат эксперимента показывает, что воздействие 20 мкг/мл карримицина на 23 клинических штамма микобактерий туберкулеза превосходит таковое, оказываемое 1 мкг/мл изониазида и 250 мкг/мл рифампицина (таблица 6).

Карримицин оказывает действие не только на бактерии, чувствительные к клиническим противотуберкулезным препаратам первого ряда, т.е., изониазиду и рифампицину, но также на часть бактерий, резистентных к этим препаратам, что доказано результатами экспериментальных исследований. Таким образом, благодаря новому способу применения карримицина при лечении инфекционных заболеваний, спровоцированных микобактерией туберкулеза, резистентной к препаратам, обеспечивается преимущество.

Изобретение относится к медицине, а именно к применению карримицина для подавления роста микробактерии туберкулеза. Изобретение позволяет эффективно подавлять рост как чувствительной к препаратам первого ряда микробактерии туберкулеза, так и резистентной к ним. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 6 табл.

1. Применение карримицина для подавления роста микобактерии туберкулеза.

2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что карримицин изготавливается в пероральной форме, в форме инъекции или любой другой соответствующей лекарственной форме.

3. Применение композиции для подавления роста микобактерии туберкулеза, отличающееся тем, что эта композиция включает в себя карримицин в качестве активного компонента и фармацевтически приемлемый носитель.

4. Применение по п. 3, отличающееся тем, что композиция, включающая карримицин, изготавливается в пероральной форме, в форме инъекции или любой другой соответствующей лекарственной форме.