СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ШТАММОВ YERSINIA PESTIS СРЕДНЕВЕКОВОГО БИОВАРА С ПОСЛЕДУЮЩЕЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЕЙ ПО ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ УЧЕТОМ РЕЗУЛЬТАТОВ Российский патент 2019 года по МПК G01N33/58 C12Q1/6876 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности, к молекулярному типированию и подвидовой дифференциации штаммов Yersinia pestis и может быть использовано в научно-исследовательских медицинских учреждениях и службах Роспотребнадзора.

Бактерия Y. pestis является возбудителем особо опасной инфекции - чумы, способной приводить к возникновению чрезвычайных ситуаций в области общественного здравоохранения. Вид Y. pestis включает в себя основной подвид, отличающийся высокой вирулентностью и эпидемиологической значимостью и ряд неосновных подвидов, которые эпидемически малозначимы. На территории природных очагов чумы Российской Федерации и сопредельных государств широко распространены штаммы возбудителя чумы основного подвида. В большинстве этих очагов чумы циркулируют штаммы основного подвида средневекового биовара. Штаммы средневекового биовара высоко вирулентны и не-однократно служили причиной вспышек и случаев заболевания чумой в России в разные периоды ее истории. Ввиду этого актуальной является разработка способов быстрой и эффективной идентификации и дифференциации штаммов возбудителя чумы средневекового биовара.

Все штаммы Y. pestis основного подвида средневекового биовара делят на 4 филогенетические ветви - 2.MED0, 2.MED1, 2.MED2 и 2.MED3. Штаммы ветви 2.MED0 циркулируют только в Центрально-Кавказском высокогорном очаге в РФ, все остальные штаммы средневекового биовара из природных очагов РФ и стран ближнего зарубежья относятся к филогенетической ветви 2.MED1. Штаммы средневекового биовара ветвей 2.MED2 и 2.MED3 встречаются на территории Китая. Установление принадлежности выделенного штамма Y. pestis к средневековому биовару основного подвида позволит оценить его вирулентный и эпидемиологический потенциал, дальнейшая дифференциация по принадлежности к одной из 4-х филогенетических ветвей - определить его происхождение и установить источник инфекции.

Современный уровень молекулярно-генетических методов исследования позволяет разрабатывать быстрые и эффективные способы идентификации и дифференциации Y. pestis и других возбудителей инфекционных болезней на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), обладающие высокой степенью воспроизводимости. Одной из наиболее эффективных разновидностей ПЦР является ПЦР в режиме реального времени с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени. На текущий момент разработано несколько способов индикации и идентификации штаммов возбудителя чумы при помощи ПЦР.

Зарегистрирована «Тест-система для выявления ДНК Yersinia pestis методом ПЦР «ГенПест». Эта система основана на использовании ДНК мишеней - участков генов cafl и pla, находящихся в плазмидах pFra и pPst возбудителя чумы, соответственно. Однако эта тест-система не предназначена для внутривидовой дифференциации и идентификации штаммов средневекового биовара.

Внутривидовая дифференциация штаммов возбудителя чумы описана в патенте RU №2425891, дата опубликования 10.08.2011. При помощи указанного способа, возможно разделение штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis с дальнейшей дифференциацией штаммов Y. pestis по их принадлежности к основному и неосновным подвидам. В тоже время этот способ не предусматривает разделения биоваров основного подвида, в том числе и дифференциации штаммов средневекового биовара.

Разделение штаммов средневекового и античного биоваров основного подвида проводится способом, описанном в патенте RU №2496882 (опубликован 27.10.2013), который основан на ПЦР с электрофоретическим учетом результатов. Однако этот способ не предназначен для внутрибиоварной дифференциации штаммов средневекового биовара по принадлежности к четырем известным филогенетическим ветвям - 2.MED0, 2.MED1, 2.MED2 и 2.MED3.

Известен способ дифференциации биоваров и геновариантов штаммов Yersinia pestis основного подвида с помощью полимеразной цепной реакции (патент RU №2565554, опубликован 20.10.2015). Способ обеспечивает разделение античного, средне-векового биоваров основного подвида возбудителя чумы, а также филогенетических линий 1.ANT/1.ORI и 2.ANT/2.MED основного подвида. Однако способ не пригоден для определения филогенетической принадлежности штаммов средневекового биовара.

Опубликован способ подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени (Патент RU №2621869, опубликован 07.06.2017). Способ обеспечивает разделение основного, кавказского, алтайского, гиссарского и улегейского подвидов, но не решает проблемы идентификации штаммов средневекового биовара и внутрибиоварной дифференциации этих штаммов.

Известен способ дифференциации типичных и атипичных штаммов Y. pestis средневекового биовара из Центрально-Кавказского высокогорного очага в России, содержащих маркерную плазмиду pCKF. (Патент RU №2550257, опубликован 10.05.2015 г.) Однако данный способ не позволяет дифференцировать штаммы средневекового биовара по их принадлежности к филогенетическим ветвям 2.MED1, 2.MED2 и 2.MED3.

В научной и специальной литературе отсутствуют другие данные о способах идентификации штаммов Y. pestis средневекового биовара с их последующей дифференциацией по филогенетической принадлежности методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени.

Технический результат изобретения заключается в обеспечении быстрой и надежной идентификации штаммов Y. pestis средневекового биовара с разделением этих штаммов по филогенетической принадлежности.

Технический результат достигается способом идентификации штаммов Y. pestis средневекового биовара с определением филогенетической принадлежности методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени, который предусматривает проведение ПЦР с праймерами и зондами на ДНК мишень «Med24», имеющими последовательность SEQ ID NO: 3 и мультиплексной ПЦР с праймерами и зондами на ДНК мишени «2.Med1», «2.Med3», «pCKF», имеющими последовательность SEQ ID NO: 1, 2, 4 с последующей дифференциацией штаммов средневекового биовара по наличию и отсутствию сигналов с указанными праймерами в соответствии с таблицей.

Заявляемый способ осуществляют следующим образом.

Выделение ДНК исследуемого штамма чумного микроба проводят по стандартной методике в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».

Полимеразную цепную реакцию осуществляют с использованием предложенных праймеров и зондов на мишени «Med24», «pCKF», «2.Med1» и «2.Med3». Олигонуклеотидные праймеры, и зонды, применяемые для амплификации в ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов хромосомных мишеней «Med24», «2.Med1» и «2.Med3», рассчитаны на основе нуклеотидных последовательностей этих участков у штаммов Y. pestis С092, KIM, Antiqua и Nepal516, а также последовательности плазмиды pCKF, представленных в базе данных NCBI GenBank. С помощью указанных праймеров в ПЦР проводят амплификацию участков «Med24», «pCKF», «2.Med1» и «2.Med3». Для проведения ПЦР используют зонды в формате TaqMan и применяют следующие условия реакции: 1 цикл 95°С 15 мин; 5 циклов 95°С 20 с, 60°С 20 с, 72°С 20 сек; 30 циклов: 95°С 15 с, 58°С 45 с, 72°С 20 с.

Принадлежность выделенного изолята Y. pestis к средневековому биовару основного подвида и его филогенетическим ветвям устанавливают по совокупному результату двух реакций. В отдельной реакции проводят определение принадлежности штаммов к средневековому биовару с использованием праймеров на ДНК мишень «Med24». У всех штаммов средневекового биовара (за исключением штаммов филогенетической ветви 2.MED0) сигнал флуоресценции по мишени «Med24» отсутствует, поскольку рассчитанный на эту ДНК мишень зонд комплементарен участку делеции в 24 пн в этом участке генома, маркерной для штаммов средневекового биовара. Составляющие исключение штаммы средневекового биовара ветви 2.MED0 (циркулируют в Центрально-Кавказском высокогорном очаге чумы) идентифицируют по наличию сигнала флуоресценции с праймерами на мишень «pCKF» - участок плазмиды pCKF, маркерной только для штаммов ветви 2.MED0. Последовательность мишени «pCKF» выявляют в мультиплексной реакции одновременно с последовательностями мишеней «2.Med1» и «2.Med3». Мультиплексную ПЦР с праймерами на ДНК мишени «2.Med1», «2.Med3» и «pCKF» применяют для внут-рибиоварной дифференциации штаммов средневекового биовара по филогенетической принадлежности.

У штаммов средневекового биовара филогенетической ветви 2.MED1 отсутствует сигнал флуоресценции с праймерами на мишень «2.Med1» и присутствует сигнал с праймерами на мишень «2.Med3». У штаммов ветви 2.MED2 присутствует сигнал с праймерами на мишени «2.Med1» и «2.Med3», а у штаммов ветви 2.MED3 присутствует сигнал флуоресценции с праймерами «2.Med1» и отсутствует сигнал с праймерами «2.Med.3». У штаммов ветви 2.MED0 с праймерами на мишень «pCKF» в ПЦР проявляется сигнал флуоресценции, в то время как у штаммов других филогенетических ветвей средневекового биовара он отсутствует. Учет результатов идентификации и дифференциации штаммов Yersinia pestis средневекового биовара представлен в таблице.

Сущность изобретения поясняется примерами.

Пример 1. Дифференциация штамма Y. pestis средневекового биовара филогенети-ческой ветви 2.MED1 (модельный эксперимент) Выделение ДНК Y. pestis проводят стандартным методом с помощью лизирующего раствора на основе 6М гуанидинизотиоцианата с предварительным обеззараживанием культуры путем добавления мертиолята натрия до концентрации 1:10000 с последующим прогреванием при температуре 56°С в течение 30 мин. [МУ 1.3.2569-09].

С праймерами на ДНК мишень «Med24» ПЦР проводят в объеме 25 мкл, реакцион-ная смесь содержит: 2,5 мкл 10х буфера для ПЦР, 2,5 мкл раствора по 2 мМ четырех дНТФ, 1 мкл 25 мМ MgCl2, по 0,1 мкл (10 пМ) каждого праймера, 0,05 мкл (5 пМ) зонда в формате TaqMan, 0,2 мкл (5 ед.) Taq полимеразы, 10 мкл ДНК штамма. Мультиплексную ПЦР с праймерами на ДНК мишени «2.Med1», «2.Med3» и «pCKF» проводят в одной ре-акции. Реакционная смесь содержит 2,5 мкл 10х буфера для ПЦР, 2,5 мкл раствора по 2 мМ четырех дНТФ, 1,5 мкл 25 мМ MgCl2, по 0,08 мкл (8 пМ) каждого праймера, 0,04 мкл (4 пМ) зонда в формате TaqMan, 0,2 мкл (5 ед.) Taq полимеразы, 10 мкл ДНК штамма. В результате проведения реакции получают следующие результаты. По мишеням «Med24», «pCKF» и «2.Med1» сигнал флуоресценции отсутствует, но он проявляется по мишени «2.Med3». Следовательно, исследуемый штамм Y. pestis относится к средневековому биовару, филогенетической ветви 2.MED1.

Пример 2. Дифференциация штамма Y. pestis средневекового биовара филогенетической ветви 2.MED2

Исследование штамма Y. pestis проводят аналогично примеру №1. В ПЦР с использованием праймеров на ДНК мишени «Med24» и «pCKF» у исследуемого штамма отсутствуют сигналы флуоресценции, однако они проявляются с праймерами на мишени 2.Medl и 2.Med3. Следовательно, исследуемый штамм Y. pestis относится к средневековому биовару, филогенетической ветви 2.MED2.

Пример 3. Дифференциация штамма Y. pestis средневекового биовара филогенетической ветви 2.MED3

Исследование штамма Y. pestis проводят аналогично примеру №1. В ПЦР с использованием праймеров на ДНК мишени «Med24» и «pCKF» и «2.Med3» у исследуемого штамма Y. pestis отсутствуют сигналы флуоресценции, но он проявляется с праймерами по мишени «2.Med1». Следовательно, исследуемый штамм Y. pestis относится к средневековому биовару, филогенетической ветви 2.MED3.

Пример 4. Дифференциация штаммов Y.pestis средневекового биовара филогенетической ветви 2.MED0

Исследование штамма Y. pestis проводят аналогично примеру №1. В ПЦР с праймерами по мишени «Med24» наблюдают наличие флуоресцентного сигнала. В реакции по мишени pCKF также наблюдают наличие сигнала, что свидетельствует о принадлежности штамма к филогенетической ветви 2.MED0.

Таким образом, заявленный способ идентификации штаммов Y. pestis средневекового биовара с последующей дифференциацией по филогенетической принадлежности методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов с использованием мишеней «Med24», «2.Med1», «2.Med3» и «pCKF» позволяет быстро и эффективно определять принадлежность штаммов возбудителя чумы к основному подвиду средневекового биовара и дифференцировать их по филогенетической принадлежности.

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и предназначено для идентификации штаммов Yersinia pestis средневекового биовара с последующей дифференциацией по филогенетической принадлежности методом ПЦР в режиме реального времени. Проводят ПЦР с праймерами и зондами на ДНК мишени Med24, 2.Med1, 2.Med3 и pCKF. По наличию сигналов с указанными праймерами по мишеням Med24 и pCKF идентифицируют 2.MED0. По наличию сигналов с праймерами по мишени 2.Med3 и отсутствию сигналов по мишеням Med24, 2.Med1 и pCKF идентифицируют 2.MED1. По наличию сигналов с праймерами по мишеням 2.Med1 и 2.Med3 и отсутствию сигналов по мишеням Med24 и pCKF идентифицируют 2.MED2. По наличию сигналов с праймерами по мишени 2.Med1 и отсутствию сигналов по мишеням Med24, 2.Med3 и pCKF идентифицируют 2.MED3. Изобретение обеспечивает быструю и надежную идентификацию штаммов Y. pestis средневекового биовара с их разделением по филогенетической принадлежности. 1 табл., 3 пр.

Способ идентификации штаммов Yersinia pestis средневекового биовара с последующей дифференциацией по филогенетической принадлежности методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени, предусматривающий проведение ПЦР с праймерами и зондами на ДНК мишень Med24, имеющими последовательность SEQ ID NO: 3, и мультиплексной ПЦР с праймерами и зондами на ДНК мишени 2.Med1, 2.Med3 и pCKF, имеющими последовательность SEQ ID NO: 1, 2, 4 со следующей дифференциацией штаммов средневекового биовара по их принадлежности к филогенетической ветви: 2.MED0 по наличию сигналов с указанными праймерами по мишеням Med24 и pCKF; 2.MED1 по наличию сигналов с праймерами по мишени 2.Med3 и отсутствию сигналов по мишеням Med24, 2.Med1 и pCKF; 2.MED2 по наличию сигналов с праймерами по мишеням 2.Med1 и 2.Med3 и отсутствию сигналов по мишеням Med24 и pCKF; 2.MED3 по наличию сигналов с праймерами по мишени 2.Med1 и отсутствию сигналов по мишеням Med24, 2.Med3 и pCKF.