Способ определения филогенетической принадлежности штаммов Yersinia pestis основного подвида методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени Российский патент 2023 года по МПК C12N1/00 C12N1/20 C12Q1/00 C12Q1/04 C12Q1/6806 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к молекулярному типированию и внутривидовой дифференциации штаммов Yersinia pestis, и может быть применено в научно-исследовательских учреждениях и службах Роспотребнадзора.

Yersinia pestis - этиологический агент особо опасной инфекционной болезни - чумы, способной вызывать чрезвычайные ситуации в области общественного здравоохранения. Природные очаги чумы находятся на всех континентах, за исключением Австралии и Антарктиды, в разных ландшафтно-климатических зонах, что является причиной значительного внутривидового разнообразия штаммов Y. pestis и отличий в фенотипических свойствах и вирулентности.

На основании данных полногеномного секвенирования и молекулярно-генетического анализа уточнена популяционная структура вида Y. pestis. В виде Y. pestis выделяется семь подвидов, которые имеют генетическое обозначение: основной, ssp.pestis; кавказский, ssp.caucasica (0.РЕ2); ангольский, ssp.angolica (0.PE3); центральноазиатский, ssp.central asiatica (0.PE4); улегейский, ssp.ulegeica (0.PE5); тибетский, ssp.tibetica (0.PE7); цинхайский, ssp.qinghaica (0.PE10).

Многообразие штаммов основного подвида складывается из трех биоваров -античного, средневекового и восточного. В свою очередь штаммы античного биовара делятся на несколько филогенетических ветвей: 0.ANT (включает ветви 0.ANT1, 0.ANT2, которые распространены в Китае; 0.ANT3, 0.ANT5, штаммы которых циркулируют на территории Кыргызстана), 1.ANT (распространены в Центральной Африке), 2.ANT (очаги Китая и Забайкальский степной природный очаг чумы), 3.ANT (очаги Китая и Монголии), 4.ANT (эндемичны для Горно-Алтайского и Сайлюгемского высокогорных природных очагов РФ и Монголии). Восточный биовар (1.ORI), распространился по всем континентам во время третьей пандемии чумы, и, в свою очередь, делится на несколько филогенетических ветвей (1.ORI1 - США, 1.0RI2 - Европа, Южная Америка, Африка, Юго-Восточная Азия, 1.0RI3 - Мадагаскар). Средневековый биовар (2.MED) также состоит из нескольких филогенетических ветвей. На территории Российской Федерации распространены штаммы ветвей 2.MED0 (Центрально-Кавказский высокогорный очаг чумы) и 2.MED1 (большинство очагов РФ и других стран СНГ). Штаммы филогенетических ветвей 2.MED2 и 2.MED3 уникальны для ряда очагов Китая. Также описана филогенетическая ветвь Y. pestis средневекового биовара - 2.MED4, включающая штаммы, циркулировавшие в природных очагах Поволжья, Прикаспия и Кавказа в начале XX века.

Для штаммов неосновных подвидов характерна избирательная вирулентность и низкая эпидемическая значимость, они распространены в отдельных регионах: штаммы кавказского подвида - на Кавказе; центральноазиатского - в Горном Алтае в РФ и Монголии, Гиссарском высокогорном очаге в Таджикистане, Таласском высокогорном очаге в Кыргызстане, в двух очагах чумы в Китае; улегейского - в Монголии. В тоже время штаммы основного подвида высоковирулентны и эпидемически значимы и получили широкое распространение в мире. Кроме того, на территории Российской Федерации есть природные очаги сочетанного типа, в которых отмечается циркуляция штаммов разных подвидов. Примерами таких очагов являются Горно-Алтайский высокогорный природный очаг чумы (циркулируют штаммы основного и центральноазиатского подвидов), Сайлюгемский очаг Монголии (выделяются штаммы основного, улегейского и центральноазиатского подвидов), очаги Кавказа (распространены штаммы основного и кавказского подвидов). Циркулирование в сочетанных природных очагах штаммов разных ветвей эволюции чумного микроба осложняют дифференциацию и типирование Y. pestis с разной вирулентностью в рамках эпидемиологического расследования.

Таким образом, в Российской Федерации и сопредельных государствах распространены штаммы различных филогенетических ветвей возбудителя чумы. В связи с активными торгово-экономические и социокультурные связи со странами ближнего и дальнего зарубежья, возможны завозы штаммов, относящихся к другим филогенетическим ветвям Y. pestis. Перечисленные выше факты свидетельствуют о необходимости разработки способа оперативной и надежной идентификации штаммов Y. pestis по их принадлежности к конкретным филогенетическим ветвям основного подвида чумного микроба. Создание такого способа значительно повысит эффективность молекулярно-эпидемиологического мониторинга очагов чумы, эпидемиологического расследования вспышек и заносов штаммов возбудителя чумы на территорию РФ.

Высокоэффективным методом молекулярной идентификации микроорганизмов является полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ), позволяющая устанавливать наличие маркерных мутаций, таких как специфические делеции или вставки в геномах штаммов различных ветвей эволюции возбудителя чумы, возникших в результате эволюционной изменчивости возбудителя чумы. Однако не для всех филогенетических ветвей Y. pestis удается обнаружить такие маркерные протяженные мутации, в связи с чем необходим поиск уникальных единичных полиморфных нуклеотидов (SNPs), представляющих собой наиболее распространенные генетические маркеры в геноме.

Выявление наличия маркерного SNP возможно с помощью проведения фрагментного секвенирования полиморфного участка генома, однако, этот метод требует больших временных и материальных затрат для получения результата, чем ПЦР-РВ. В связи с этим очевидна необходимость разработки способа быстрой и точной идентификации штаммов основного подвида Y. pestis по их филогенетической принадлежности, основанном на аллель-специфической ПЦР-РВ.

К настоящему времени разработано несколько способов молекулярно-генетической индикации и идентификации штаммов возбудителя чумы, выполненных на основе методов ПЦР и секвенирования. Известен ряд методов с использованием метода ПЦР с электрофоретическим учетом результатов.

В патенте RU №2415948 (Опубликован 10.04.2011 Бюл. №10) описан способ подвидовой дифференциации штаммов Y. pestis методом мультилокусного сиквенс-типирования. Но данный метод требует наличия дорогостоящего оборудования и реактивов для проведения фрагментного секвенирования полученных ПЦР-фрагментов вариабельных у разных подвидов Y. pestis участков генов жизнеобеспечения, а также значительных временных затрат.

Зарегистрирована тест-система «ГенПест» (регистрационный номер ФСР 2007/00096 по ТУ 8895-005-01898109-2007, предназначенная для экспресс-диагностики штаммов Y. pestis методом ПЦР с использованием двух пар праймеров на участки генов caf1 (плазмида pFra) и pla (плазмида pPst). При этом тест-система предназначена для детекции вида Y. pestis и не может быть использована для проведения внутривидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы по их принадлежности к отдельным филогенетическим ветвям.

Известен способ дифференциации штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов и возбудителя псевдотуберкулеза методом полимеразной цепной реакции (патент RU №2425891, опубликован 10.08.2011 Бюл. №22). В этом способе, дифференциацию исследуемых штаммов проводят на основе сравнения размеров получаемых фрагментов генов terC, ilvN и inv с аналогичными фрагментами типичных штаммов возбудителей чумы основного и неосновных подвидов. Этот метод позволяет быстро, эффективно и надежно проводить дифференциацию штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов и Y. pseudotuberculosis, однако, он не обеспечивает внутривидовую дифференциацию штаммов возбудителя чумы по их филогенетической принадлежности.

Описан способ дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба (патент RU №2332464, опубликован 27.08.2008 Бюл. №24). Дифференциацию исследуемых штаммов проводят по размеру ампликонов вариабельной хромосомной области hutG-YP01967, полученных с помощью праймеров TAN1 и TAN2. Недостатком этого способа является то, что этот способ требует большего временного ресурса и использования большого количества референтных штаммов.

Опубликован способ дифференциации биоваров и геновариантов штаммов Y. pestis основного подвида с помощью полимеразной цепной реакции (патент RU №2565554, опубликован 20.10.2015 Бюл. №29). Этот способ предназначен для разделения биоваров основного подвида и отдельных популяций штаммов Y. pestis, но не для внутривидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы по их принадлежности к отдельным филогенетическим ветвям.

Разработан способ подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы методом полимеразной цепной реакции (патент RU №2552611, опубликован 10.06.2015 Бюл. №16), основанный на использовании метода ПЦР с электрофоретическим учетом результатов. Однако и этот способ не позволяет осуществлять внутривидовую дифференциацию штаммов возбудителя чумы по их филогенетической принадлежности.

Известен «Набор и способ для ускоренной идентификации чумного микроба с одновременной дифференциацией вирулентных и авирулентных штаммов Y. pestis, определением их плазмидного профиля» (патент RU №2473701, опубликован 27.01.2013 Бюл. №3). Недостатком этого способа является невозможность определять принадлежность штаммов к конкретными филогенетическим ветвям Y. pestis.

Описан способ проведения внутривидовой дифференциации типичных и атипичных штаммов Y. pestis средневекового биовара методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов (Патент RU №2550257, опубликован 10.05.2015 Бюл. №13). Способ предназначен для разделения штаммов основного подвида средневекового биовара, и не позволяет разделять штаммы других филогенетических ветвей возбудителя чумы.

Есть данные о разработке способа идентификации штаммов Yersinia pestis средневекового биовара с последующей дифференциацией по филогенетической принадлежности методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов (Патент RU №2705813 С1, опубликован 12.11.2019 Бюл. №32). Предложенный способ предоставляет возможность проводить дифференциацию лишь филогенетических ветвей 2.MED0, 2.MED1 и 2.MED3.

В патенте RU №2621869 (Опубликован 07.06.2017 Бюл. №16) представлен способ подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени. Описанный способ позволяет проводить подвидовую дифференциацию штаммов Y. pestis, но не дает возможности разделять штаммы по их принадлежности к филогенетическим ветвям.

Зарегистрирован способ индикации и идентификации штаммов возбудителя чумы по их принадлежности к виду Yersinia pestis, к подвидам, биоварам, филогенетическим ветвям (1.ANT, 2.ANT, 2.MED0) и по наличию генов основных факторов патогенности методом ДНК-чипа (RU№2734636 С1 опубликован 21.10.2020 Бюл. №30). Однако этот способ не позволяет определять принадлежность штаммов к филогенетическим ветвям, таким как 0.ANT1, 0.ANT2, 0.ANT3, 0.ANT5, 3.ANT, 4.ANT, 2.MED1, 2.MED2, 2.MED3, 2.MED4, 1.ORI1, 1.ORI2, 1.ORI3.

Технический результат изобретения заключается в обеспечении быстрой и надежной идентификации штаммов Y. pestis по их принадлежности к филогенетическим ветвям основного подвида 0.ANT1, 0.ANT2, 0.ANT3, 0.ANT5, 3.ANT, 4.ANT, 2.MED1, 2.MED2, 2.MED3, 2.MED4, 1.ORI1, 1.ORI2, 1.ORI3.

Технический результат достигается высокоэффективным и быстрым способом идентификации штаммов Y. pestis с определением филогенетической принадлежности методом аллель-специфической ПЦР-РВ, который предусматривает проведение 28 моноплексных аллель-специфических ПЦР-РВ с двумя вариантами прямого праймера с последующим определением штаммов по наличию и отсутствию сигналов флуоресценции по маркерным SNPs.

Координаты SNP мишеней (названия и координаты даны по номенклатуре генома штамма Y. pestis С092, номер доступа в NCBI GenBank NC 003143), использованных в разработанном способе определении штаммов У. pestis по их филогенетической принадлежности методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени:

Заявляемый способ осуществляют следующим образом:

Полимеразную цепную реакцию проводят с использованием сконструированных праймеров и зондов в 28 моноплексных аллель-специфических ПЦР-РВ (АС-ПЦР-РВ) реакциях в отдельных пробирках с двумя вариантами прямого праймера SEQ ID NO: 1-14

Подчеркиванием отмечены нуклеотиды с LNA (Locked Nucleic Acid)-модифицированными основаниями.

Олигонуклеотидные праймеры, применяемые для амплификации в ПЦР, рассчитаны на основе нуклеотидных последовательностей штаммов Y. pestis С092 (номер доступа в NCBI GenBank NC_003143.1), KIM10 (номер доступа в NCBI GenBank NC_004088.1), Antiqua (номер доступа в NCBI GenBank NC_008150.1) и Nepal516 (номер доступа в NCBI GenBank NC_008149.1) и штаммов неосновных подвидов, представленных в базе данных NCBI GenBank - Pestoides F (NC 009381.1), Angola (NC_010159.1), Pestoides A (NZ_ACNT00000000.1). Маркерный SNP соответствует нуклеотиду в позиции минус 1 от 3'-конца прямого праймера, который был заменен на LNA-олигонуклеотид (нуклеотиды с замкнутым кольцом рибозы в позициях C₂ и С₄ и метальной группой, повышающей температуру плавления цепей ДНК по сравнению с обычными нуклеотидами). На каждую мишень рассчитано по два прямых праймера, один из которых комплементарен варианту SNP у штаммов дикого типа (обозначен W), а второй варианту мутантного типа (обозначен М) (характерен для определенной филогенетической ветви Y. pestis). С помощью указанных праймеров в ПЦР проводят амплификацию участков «0.ANT1», «0.ANT2», «0.ANT3», «0.ANT5», «3.ANT», «4.ANT», «2.MED0», «2.MED1», «2.MED2», «2.MED3», «2.MED4», «1.ORI1», «1.ORI2», «1.ORI3».

Для проведения ПЦР применяют следующие условия реакции на приборах типа RotorGene:

для мишеней 3.ANT, 4.ANT, 1.ORI3, 2.MED0, 2.MED2, 2.MED3 - денатурация - 95°С - 10 мин; цитирование (40 циклов) - 95°С - 10 с, 59°С - 30 с, 72°С - 10 с;

для мишеней 2.MED1, 1.ORI1, 0.ANT3, 0.ANT5, 2.MED4: денатурация - 95°С - 10 мин; циклирование (40 циклов) - 95°С - 10 с, 60°С - 30 с, 72°С - 10 с;

для мишеней 1.ORI2, 0.ANT1, 0.ANT2: денатурация - 95°С - 10 мин; циклирование (40 циклов) - 95°С - 10 с, 62°С - 30 с, 72°С - 10 с.

Флуоресценцию измеряют по каналу FAM/Green. Значения Threshold (пороговой линии) составляют 0,05 для всех мишеней. Функция устранение выбросов - 15%. Максимальная величина порогового цикла (Ct), при которой результат реакции считается положительным - 36.

Принадлежность выделенного изолята к определенной филогенетической ветви устанавливают по наличию или отсутствию флуоресценции в пробирке при проведении ПЦР-РВ. Сигнал флуоресценции с вариантом прямого праймера М, комплементарным варианту SNP определенной филогенетической ветви возбудителя чумы, отмечается только у штаммов этой ветви. Сигнал флуоресценции с вариантом прямого праймера W, комплементарным варианту SNP, не свойственному для этой филогенетической ветви возбудителя чумы, регистрируется у штаммов всех других ветвей эволюции.

Специфичность сконструированных праймеров проверена с помощью 132 штаммов возбудителя чумы различных филогенетических ветвей (их филогенетическая принадлежность проверена методом полногеномного SNP-анализа): кавказского подвида - 9 штаммов (7896, 471, 1146, 805, 6499, С-740, КМ797, 1075Д, С-370), алтайского биовара центральноазиатского подвида - 9 штаммов (И-3705, И-1031, М-1912, КМ1204, КМ1205, КМ675, 2416, 2633, И-2795), гиссарского биовара центральноазиатского подвида - 5 штаммов (А-1627, А-1249, А-1728, А-1723, А-1724), биовара microtus центральноазиатского подвида - 2 (И-3085, И-3086), таласского биовара центральноазиатского подвида - 5 штаммов (А-1817, А-1805, А-1807, А-1815, А-1818), улегейского подвида - 5 штаммов (И-3068, И-3193, И-3269, И-2972, И-2962), античного биовара основного подвида (ветви 0.ANT3, 0.ANT5, 1.ANT, 2.ANT, 3.ANT, 4.ANT) - 36 штаммов (А-1836, А-100, А-1691, 120, 1203, 1/156, 353, 14/1646, А-1785, 1454, 517, 1530, 157, 257, КМ932, И-3205, И-3358, 209, И-1270, 16, И-84, 1843, И-839, И-840, И-3101, И-3102, И-3033, И-3030, И-3036, И-3197, 231, 236, 1562, 1864, 211, 212), средневекового биовара основного подвида (ветви 2.MED0, 2.MED1, 2.MED2, 2.MED4) - 25 штаммов (КМ918, КМ919, С-762, 1116-Д, 146, М-978, 27(33), М-1484, М-956, 4, 31, М-1467, А-1825, А-161, 173, М-519, КМ638, КМ1864, 20, 922, 923, 924, 206, 208, 209), восточного биовара основного подвида (ветви 1.ORI1, 1.ORI2, 1.ORI3) - 35 штамма (Р-14720, Saigon 64-1198, 78046, 78054, 79052, 129, 203, RN 69, КМ753, Р-13227, Р-13228, 296Е, Р-14719, 124 Dalat, 64/307, 65/2 Nhatraung, 65/63, КМ762, 154, Р-14714, Р-14716, Sonche, Hamburg 15, Shasta, 23 Kenya, Exu 21, Exu 33, Marselt Frid, Israel, 119, 1/64, EV, Madagascar, P-13242, P-13270), биовара intermedium основного подвида - 1 штамм (ветвь 1.IN1) (134). Сущность изобретения поясняется примерами. Пример 1. Определение штамма Y. pestis основного подвида восточного биовара ветви 1.ORI2

Первоначально проводят определение принадлежности штамма к виду Y. pestis. Экстракцию ДНК проводят с помощью коммерческих наборов для выделения ДНК. Полученную ДНК используют для постановки АС-ПЦР-РВ с помощью сконструированных праймеров и зонда на ДНК мишени «0.ANT1», «0.ANT2», «0.ANT3», «0.ANT5», «3.ANT», «4.ANT», «2.MED0», «2.MED1», «2.MED2», «2.MED3», «2.MED4», «1.ORI1», «1.ORI2», «1.ORI3» в двух вариантах - с использованием прямых праймеров М и W соответственно. В результате в пробирках со смесью праймеров и зондов на мишень «1.ORI2» с праймером М будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером W не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала. И наоборот, в пробирках со смесями праймеров и зондов на мишени «0.ANT1», «0.ANT2», «0.ANT3», «0.ANT5», «3.ANT», «4.ANT», «2.MED0», «2.MED1», «2.MED2», «2.MED3», «2.MED4», «1.ORI1», «1.ORI3» с праймером W будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером М не будет регистрироваться флуоресцентный сигнал. Следовательно, исследуемый штамм Y. pestis относится к ветви 1.ORI2 восточного биовара основного подвида.

Аналогично определяется принадлежность штаммов к ветви 1.ORI1: в пробирках со смесью праймеров и зондов на мишень «1.ORI1» с праймером М будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером W не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала. В пробирках со смесями праймеров и зондов на мишени «0.ANT1», «0.ANT2», «0.ANT3», «0.ANT5», «3.ANT», «4.ANT», «2.MED0», «2.MED1», «2.MED2», «2.MED3», «2.MED4», «1.ORI2» «1.ORI3» с праймером W будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером М не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала.

Для штаммов ветви 1.ORI3 будет характерно: в пробирках со смесью праймеров и зондов на мишень «1.ORI3» с праймером М будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером W не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала. В пробирках со смесями праймеров и зондов на мишени «0.ANT1», «0.ANT2», «0.ANT3», «0.ANT5», «3.ANT», «4.ANT», «2.MED0», «2.MED1», «2.MED2», «2.MED3», «2.MED4», «1.ORI1» и «1.ORI2» с праймером W будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером М не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала.

Если перед проведением АС-ПЦР-РВ установлена принадлежность исследуемого штамма к восточному биовару основного подвида, то количество АС-ПЦР-РВ можно сократить до трех - на мишени «1.ORI1», «1.ORI2», «1.ORI3» (в двух вариантах - с использованием прямых праймеров М и W соответственно). В результате в пробирках со смесью праймеров и зондов на мишень «1.ORI2» с праймером М будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером W не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала. В то же время для смесей праймеров и зондов на мишени «1.ORI1» и «1.ORI3» с праймером М не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала, а для смесей с праймером W будет отмечаться рост флуоресценции. Следовательно, исследуемый штамм Y. pestis относится к ветви 1.ORI2 восточного биовара основного подвида.

Пример 2. Определение штамма Y. pestis основного подвида античного биовара филогенетической ветви 4.ANT

Исследование штамма Y. pestis проводят аналогично примеру №1. В результате в пробирках со смесью праймеров и зондов на мишень «4.ANT» с праймером М будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером W не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала. В пробирках со смесями праймеров и зондов на мишени «0.ANT1», «0.ANT2», «0.ANT3», «0.ANT5», «3.ANT», «2.MED0», «2.MED1», «2.MED2», «2.MED3», «2.MED4», «1.ORI1», «1.ORI2» «1.ORI3» с праймером W будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером М не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала. Следовательно, исследуемый штамм Y. pestis относится ветви 4.ANT античного биовара основного подвида.

Для штаммов ветви 0.ANT1 будет характерно: в пробирках со смесью праймеров и зондов на мишень «0.ANT1» с праймером М будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером W не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала. В пробирках со смесями праймеров и зондов на мишени «0.ANT2», «0.ANT3», «0.ANT5», «3.ANT», «4.ANT», «2.MED0», «2.MED1», «2.MED2», «2.MED3», «2.MED4», «1.ORI1», «1.ORI2» «1.ORI3» с праймером W будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером М не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала.

Для штаммов ветви 0.ANT2 будет характерно: в пробирках со смесью праймеров и зондов на мишень «0.ANT2» с праймером М будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером W не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала. В пробирках со смесями праймеров и зондов на мишени «0.ANT1», «0.ANT3», «0.ANT5», «3.ANT», «4.ANT», «2.MED0», «2.MED1», «2.MED2», «2.MED3», «2.MED4», «1.ORI1», «1.ORI2» «1.ORI3» с праймером W будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером М не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала.

Для штаммов ветви 0.ANT3 будет характерно: в пробирках со смесью праймеров и зондов на мишень «0.ANT3» с праймером М будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером W не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала. В пробирках со смесями праймеров и зондов на мишени «0.ANT1», «0.ANT2», «0.ANT5», «3.ANT», «4.ANT», «2.MED0», «2.MED1», «2.MED2», «2.MED3», «2.MED4», «1.ORI1», «1.ORI2» «1.ORI3» с праймером W будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером М не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала.

Для штаммов ветви 0.ANT5 будет характерно: в пробирках со смесью праймеров и зондов на мишень «0.ANT5» с праймером М будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером W не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала. В пробирках со смесями праймеров и зондов на мишени «0.ANT1», «0.ANT2», «0.ANT3», «3.ANT», «4.ANT», «2.MED0», «2.MED1», «2.MED2», «2.MED3», «2.MED4», «1.ORI1», «1.ORI2» «1.ORI3» с праймером W будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером М не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала.

Для штаммов ветви 3.ANT будет характерно: в пробирках со смесью праймеров и зондов на мишень «3.ANT» с праймером М будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером W не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала. В пробирках со смесями праймеров и зондов на мишени «0.ANT1», «0.ANT2», «0.ANT3», «0.ANT5», «4.ANT», «2.MED0», «2.MED1», «2.MED2», «2.MED3», «2.MED4», «1.ORI1», «1.ORI2» «1.ORI3» с праймером W будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером М не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала.

Если перед проведением АС-ПЦР-РВ установлена принадлежность исследуемого штамма к античному биовару основного подвида, то количество АС-ПЦР-РВ можно сократить до шести - на мишени «0.ANT1», «0.ANT2», «0.ANT3», «0.ANT5», «3.ANT», «4.ANT» (в двух вариантах - с использованием прямых праймеров М и W соответственно). В результате в пробирках со смесью праймеров и зондов на мишень «4.ANT» с праймером М будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером W не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала. В то же время для смесей праймеров и зондов на мишени «0.ANT1», «0.ANT2», «0.ANT3», «0.ANT5», «3.ANT» с праймером M не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала, а для смесей с праймером W будет отмечаться рост флуоресценции. Следовательно, исследуемый штамм Y. pestis относится ветви 4.ANT античного биовара основного подвида.

Пример 3. Определение штамма Y. pestis основного подвида средневекового биовара филогенетической ветви 2.MED1.

Исследование штамма Y. pestis проводят аналогично примеру №1. В результате в пробирках со смесью праймеров и зондов на мишень «2.MED1» с праймером М будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером W не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала. В пробирках со смесями праймеров и зондов на мишени «0.ANT1», «0.ANT2», «0.ANT3», «0.ANT5», «3.ANT», «4.ANT», «2.MED0», «2.MED2», «2.MED3», «2.MED4», «1.ORI1», «1.ORI2» «1.ORI3» с праймером W будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером М не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала. Следовательно, исследуемый штамм Y. pestis относится к ветви 2.MED1 средневекового биовара основного подвида.

Для штаммов ветви 2.MED0 будет характерно: в пробирках со смесью праймеров и зондов на мишень «2.MED0» с праймером М будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером W не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала. В пробирках со смесями праймеров и зондов на мишени «0.ANT1», «0.ANT2», «0.ANT3», «0.ANT5», «3.ANT», «4.ANT», «2.MED1», «2.MED2», «2.MED3», «2.MED4», «1.ORI1», «1.ORI2» «1.ORI3» с праймером W будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером М не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала.

Для штаммов ветви 2.MED2 будет характерно: в пробирках со смесью праймеров и зондов на мишень «2.MED2» с праймером М будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером W не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала. В пробирках со смесями праймеров и зондов на мишени «0.ANT1», «0.ANT2», «0.ANT3», «0.ANT5», «3.ANT», «4.ANT», «2.MED0», «2.MED1», «2.MED3», «2.MED4», «1.ORI1», «1.ORI2» «1.ORI3» с праймером W будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером М не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала.

Для штаммов ветви 2.MED3 будет характерно: в пробирках со смесью праймеров и зондов на мишень «2.MED3» с праймером М будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером W не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала. В пробирках со смесями праймеров и зондов на мишени «0.ANT1», «0.ANT2», «0.ANT3», «0.ANT5», «3.ANT», «4.ANT», «2.MED0», «2.MED1», «2.MED2», «2.MED4», «1.ORI1», «1.ORI2» «1.ORI3» с праймером W будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером М не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала.

Для штаммов ветви 2.MED4 будет характерно: в пробирках со смесью праймеров и зондов на мишень «2.MED4» с праймером М будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером W не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала. В пробирках со смесями праймеров и зондов на мишени «0.ANT1», «0.ANT2», «0.ANT3», «0.ANT5», «3.ANT», «4.ANT», «2.MED0», «2.MED1», «2.MED2», «2.MED3», «1.ORI1», «1.ORI2» «1.ORI3» с праймером W будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером М не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала.

Если перед проведением АС-ПЦР-РВ установлена принадлежность исследуемого штамма к средневековому биовару основного подвида, то количество АС-ПЦР-РВ можно сократить до пяти - на мишени «2.MED0», «2.MED1», «2.MED2», «2.MED3», «2.MED4» (в двух вариантах - с использованием прямых праймеров М и W соответственно). В результате в пробирках со смесью праймеров и зондов на мишень «2.MED1» с праймером М будет отмечаться рост флуоресценции, в то время как в пробирках с праймером W не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала. В то же время для смесей праймеров и зондов на мишени «2.MED0», «2.MED2», «2.MED3», «2.MED4» с праймером М не будет регистрироваться роста флуоресцентного сигнала, а для смесей с праймером W будет отмечаться рост флуоресценции. Следовательно, исследуемый штамм Y. pestis относится ветви 2.MED1 античного биовара основного подвида.

Таким образом, заявленный способ определения филогенетической принадлежности штаммов Y. pestis основного подвида методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени с использованием мишеней «0.ANT1», «0.ANT2», «0.ANT3», «0.ANT5», «3.ANT», «4.ANT», «2.MED0», «2.MED1», «2.MED2», «2.MED3», «2.MED4», «1.ORI1», «1.ORI2», «1.ORI3» позволяет быстро и эффективно определять филогенетическую принадлежности штаммов Yersinia pestis методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Способ определения

филогенетической принадлежности штаммов Yersinia pestis основного

подвида методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального

времени.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2022-09-01">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2022120285</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-07-22</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2022120285</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-07-22</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="en">FFSI Russian Research Anti-Plague

Institute &quot;Microbe&quot;</ApplicantName>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ определения

филогенетической принадлежности штаммов Yersinia pestis основного

подвида методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального

времени</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>56</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>attgagtagcacttcagtg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>attgagtagcacttcagcg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>acgcatcggtattggtc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gacgatgccattgacgagt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>16</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..16</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctatcttatggctcgc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>16</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..16</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctatcttatggctctc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q7">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gccgtcagttgactgat</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aatctctggagcgccttgc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="9">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>16</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..16</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q9">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>attaaacgggctacca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="10">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>16</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..16</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>attaaacgggctacta</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="11">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q11">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtcccaggtgaaaatgct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="12">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q12">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaccgggctagataccag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="13">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>15</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..15</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q13">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cggcttccgggatct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="14">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>15</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..15</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q14">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cggcttccgggatat</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="15">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q15">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cggcaagaaaagcaagcagg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="16">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q16">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tggccagccgctaccgaatg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="17">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q17">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tccccagctcacactct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="18">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q18">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tccccagctcacactat</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="19">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q19">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcgttatacccagtgggattt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="20">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q20">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atcgccacaacatcgcc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="21">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q21">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtacattttagcggtgt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="22">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q22">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtacattttagcggtat</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="23">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q23">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcacccgaatatcaggc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="24">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q24">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agctgtccacaatcgcatc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="25">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>15</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..15</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q25">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cacatcgagcaaccg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="26">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>15</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..15</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q26">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cacatcgagcaactg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="27">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q27">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgaagatttacgtgcgg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="28">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q28">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcaggcagaagcggaaggt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="29">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>15</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..15</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q29">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gactccccgctcggc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="30">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>15</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..15</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q30">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gactccccgctcgac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="31">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q31">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aagccgagcctacacattgccc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="32">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q32">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggagattgcccacgccgc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="33">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>15</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..15</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q33">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgtcgtggaagccg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="34">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>15</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..15</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q34">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgtcgtggaagctg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="35">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q35">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccagaggcattaaccca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="36">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q36">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgagcaatgccctgatc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="37">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>14</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..14</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q37">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agcaggggatggcc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="38">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>14</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..14</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q38">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agcaggggatggtc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="39">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q39">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccatagccaaagcgtcg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="40">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q40">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gccgcaggttccccacgta</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="41">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>15</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..15</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q41">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccgtttggcttgtaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="42">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>15</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..15</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q42">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccgtttggcttgtga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="43">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q43">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgccctataccagccat</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="44">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q44">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggccagccccctcaaag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="45">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>15</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..15</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q45">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctgatgcggttcgac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="46">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>15</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..15</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q46">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctgatgcggttcggc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="47">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q47">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcgacattggctgatca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="48">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q48">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctcctggctttattggc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="49">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>15</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..15</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q49">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tggtgctgcctgtcg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="50">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>15</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..15</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q50">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tggtgctgcctgttg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="51">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q51">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcgggctggctaataat</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="52">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q52">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>caaatcactggctcatgtc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="53">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q53">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agaataaagggttaaatgt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="54">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q54">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agaataaagggttaaatat</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="55">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q55">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gccgataacagcttcaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="56">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q56">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Y. pestis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tggctgtttctgctttc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ определения филогенетической принадлежности штаммов Y. pestis основного подвида методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени. Способ предусматривает выделение ДНК штамма, проведение ПЦР-РВ по 14 ДНК-мишеням с двумя вариантами прямого праймера, с использованием соответствующих праймеров и зондов, имеющими последовательности SEQ ID NO: 1-14 на ДНК мишени «0.ANT1», «0.ANT2», «0.ANT3», «0.ANT5», «3.ANT», «4.ANT», «2.MED0», «2.MED1», «2.MED2», «2.MED3», «2.MED4», «1.ORI1», «1.ORI2», «1.ORI3», и дифференциацию штаммов по их принадлежности к филогенетическим ветвям по наличию/отсутствию сигналов флуоресценции с указанными праймерами. Изобретение расширяет арсенал средств, обеспечивающих быструю и надежную идентификацию штаммов Y. pestis по их принадлежности к филогенетическим ветвям основного подвида 0.ANT1, 0.ANT2, 0.ANT3, 0.ANT5, 3.ANT, 4.ANT, 2.MED1, 2.MED2, 2.MED3, 2.MED4, 1.ORI1, 1.ORI2, 1.ORI3. 1 табл., 3 пр.

Способ определения филогенетической принадлежности штаммов Y. pestis основного подвида методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени, предусматривающий выделение ДНК штамма, проведение аллель-специфической ПЦР-РВ по 14 ДНК-мишеням с двумя вариантами прямых праймеров М и W, с использованием соответствующих праймеров и зондов SEQ ID NO: 1-14 на ДНК мишени «0.ANT1», «0.ANT2», «0.ANT3», «0.ANT5», «3.ANT», «4.ANT», «2.MED0», «2.MED1», «2.MED2», «2.MED3», «2.MED4», «1.ORI1», «1.ORI2», «1.ORI3» и идентификацию штаммов по наличию и отсутствию сигналов флуоресценции по маркерным SNPs: сигнал флуоресценции с вариантом прямого праймера М, комплементарным варианту SNP определенной филогенетической ветви возбудителя чумы, отмечается только у штаммов этой ветви, а сигнал флуоресценции с вариантом прямого праймера W, комплементарным варианту SNP, не свойственному для этой филогенетической ветви возбудителя чумы, регистрируется у штаммов всех других ветвей эволюции, причем при условии определения принадлежности штамма к определенному биовару основного подвида число проводимых аллель-специфических ПЦР в режиме реального времени сокращается: для установления принадлежности исследуемого штамма к античному биовару АС-ПЦР-РВ проводятся по шести мишеням «0.ANT1», «0.ANT2», «0.ANT3», «0.ANT5», «3.ANT», «4.ANT»; при установлении принадлежности исследуемого штамма к средневековому биовару АС-ПЦР-РВ проводятся по пяти мишеням «2.MED0», «2.MED1», «2.MED2», «2.MED3», «2.MED4; при установления исследуемого штамма к восточному биовару АС-ПЦР-РВ проводятся по трем мишеням «1.ORI1», «1.ORI2», «1.ORI3».