СПОСОБ ВАКЦИНАЦИИ ПРОТИВ АУТОАНТИГЕНА У ПАЦИЕНТА-ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2020 года по МПК C12Q1/68 A61K39/00 

Настоящее изобретение относится к способу вакцинации против аутоантигена у пациента-человека, и к наборам из вакцинных композиций, пригодных для таких вакцинаций.

Активная иммунизация с применением собственных белковых антигенов заключается в генерации иммунного ответа с участием и Т-, и В-клеток, приводящего к индукции путей дифференцировки высоко эффективных В-клеток посредством специфических структур (зародышевых центров, GC), в которых антиген-специфические В-клетки пролиферируют и дифференцируют в антитело-секретирующие плазматические клетки и В-клетки памяти. С учетом того факта, что аутоиммунитет является главным побочным эффектом вакцин, направленных на собственные белки (например, Gilman et al., Neurology 64 (2005), 1553-1562), потенциально успешная вакцина должна соответствовать ряду критериев.

Во-первых, её антигенный компонент не должен активировать Т-клетки, но должен служить в качестве В-клеточного антигена. Таким образом, Аг должен быть представлен антиген-презентирующими клетками на их МНС молекулах. Связывание с ними требует, чтобы пептидные антигены (i) имели определенную длину (8-9 ак (аминокислотных остатков) в случае МНС класса I) и (ii) экспонировали определенные аминокислотные остатки в так называемых якорных положениях (Rudolph, Ann. Rev. Immunol. 24 (2006), 419-466). Как правило, антигенный эпитоп должен быть достаточно коротким, чтобы предотвратить Т-клеточную активацию, но достаточно длинным, чтобы служить в качестве эпитопа антитела. Однако генерация ответа антител IgG типа также зависит от Т-хелперных (TH) клеток, таким образом, вакцина должна содержать эпитоп(ы), способный к активации Т-хелперных (TH) клеток. Эпитопы не должны относиться к интересующему Аг, поскольку это может приводить к клеточному аутоиммунитету. В идеале они должны быть сильными TH эпитопами, с установленным отсутствием способности к активации Ат, перекрестно реагирующих с молекулами/структурами, найденными у людей. В связи с этим, в доклинических, а также в клинических испытаниях было показано, что различные белковые носители являются мощными активаторами Т-хелперных клеток. Гемоцианин лимфы улитки (KLH) хорошо описан как белок, «чужеродный для иммунной системы человека», генерирующий мощный ответ антител, когда он физически связан со специфическими антигенными эпитопами, например, антигенными пептидными последовательностями.

Адаптация Ат ответа вакцины, нацеленной на собственный белок, является серьезной проблемой. Она должна блокировать необходимую структуру, не атакуя связанные структуры. Это требует удовлетворения одновременно двух критериев. Во-первых, индуцированные антитела должны связываться с определенной мишенью, которая является критической для назначенной активности вакцины. Во-вторых, однако, она не должна связываться с родственными или гомологичными структурами, что является существенной характеристикой безопасности.

Болезнь Паркинсона (БП) является вторым из наиболее распространенных нейродегенеративных заболеваний. Она является сложным системным заболеванием, вызывающим широкий спектр инвалидизирующих моторных и не-моторных симптомов. Как правило, главными признаками БП являются неопределенные, не-моторные симптомы, включающие: психоневрологические (такие, как депрессия, нарушения парадоксального сна), желудочно-кишечные (такие, как запор) и вегетативные нарушения. Основные моторные симптомы БП, включая тремор в состоянии покоя, брадикинезию, ригидность и постуральную неустойчивость, могут развиваться вплоть до десятилетия спустя после проявления не-моторных симптомов заболевания. БП в настоящее время отмечается примерно у 5 миллионов людей в мире, и её частота увеличивается с повышением возраста мирового населения.

Несмотря на значительные инвестиции, в настоящее время нет средства, обладающего свойствами, модифицирующими болезнь. Лечение БП направлено в первую очередь на моторные симптомы посредством применения дофаминергических стратегий (леводопа или дофаминовых агонистов, ингибиторов COMT и MAO-B), антихолинергических средств, или глубокой стимуляции головного мозга, которые являются только симптоматическим лечением, и часто связаны с побочными эффектами. Проведено или продолжается в настоящее время более 20 клинических испытаний потенциальных агентов, модифицирующих заболевание; однако, ни одно из них не достигло своих конечных точек (AlDakheel et al., Neurotherapeutics 11, (2014) 6-23). Соответственно, имеется настоятельная потребность в разработке новых стратегий лечения, модифицирующих течение заболевания.

Все большее число свидетельств указывает на ведущую роль альфа-синуклеиновых (aSyn) олигомеров в процессе, приводящем к нейродегенерации при БП. Тельца Леви или нейриты Леви являются ключевыми гистопатологическими признаками БП; они появляются главным образом в нейронах и преимущественно состоят из неправильно свернутого, фибриллярного aSyn. В физиологических условиях aSyn представлен в виде цитозольного, внутриклеточного развернутого белка, чаще встречающегося в ядре и пресинаптических окончаниях; также предполагается, что aSyn может быть физиологически вовлечен в синаптическую пластичность. При БП патологические агрегированные формы aSyn, вероятно, включающие олигомеры aSyn, по-видимому, распространяют патологию телец Леви, а также заболевание, путем перехода от клетки к клетке, подобно прионам. Далее, некоторые линии доказательств на животных моделях поддерживают теорию о том, что снижение накоплений олигомерного aSyn может приводить к эффектам, модифицирующим заболевание (Games et al., Am. J. Pathol. 182 (2013), 940; Kim et al., J. Neurochem. 107 (2008), 303; Recasens et al., Ann. Neurol. 75 (2014), 351; и Winner et al., J. Neurosci. 32 (2012), 16906). Таким образом, считается, что лечение, снижающее агрегаты aSyn, обладает потенциалом к задержке прогрессирования заболевания (Lee et al., Neurosci. Res. 70 (2011), 339; Valera et al., Pharmacol. Ther. 138 (2013), 311). Был достигнут значительный прогресс за последнее десятилетие в развитии иммунотерапевтических подходов к удалению агрегатов aSyn. Уже было показано, что стратегии иммунизации против aSyn стимулируют деградацию агрегатов aSyn (Masliah et al., Neuron. 46 (2005), 857), предотвращают передачу от клетки к клетке (Bae et al., J. Neurosci. 32 (2012), 13454; Benner et al., PNAS 101 (2004), 9435; Games et al., J. Neurosci. 34 (2014), 9441), и снижают нарушения поведения (Masliah et al., PLoS One. 6 (2011), e19338) на животных моделях. Взятые вместе, эти исследования обеспечивают доказательство того, что иммунизация против aSyn может обеспечивать модифицирующие заболевание свойства у человека.

AFFITOPE^® PD01A был разработан для лечения синуклеинопатий, таких как БП (см.: Пресс-релиз AFFiRiS с отчетом о первых клинических данных по PD01A; http://www.affiris.com/news/first-clinical-data-of-therapeutic-parkinsons-disease-vaccine-encourage-s-continued-development/). PD01A является конъюгатом пептид-KLH, где пептидный компонент имитирует С-концевую область человеческого aSyn (WO 2009/103105 A2). Он нацелен на aSyn, но при этом избегает тесно связанных членов этого семейства белков, включая β-синуклеин (bSyn), который может обладать нейропротективными свойствами (Vigneswara et al., PLoS One 8 (2013), e61442). Все большее число доказательств указывают на определяющую роль олигомеров альфа-синуклеина в процессах, приводящих к нейродегенерации при БП. Тельца Леви или нейриты Леви являются гистопатологическими признаками БП; они появляются главным образом в нейронах, и преимущественно состоят из неправильно свернутого, фибриллярного aSyn. Далее, некоторые линии доказательств на животных моделях поддерживают теорию о том, что снижение накоплений олигомерного aSyn может приводить к эффектам, модифицирующим заболевание. Таким образом, лечение, снижающее агрегаты aSyn, может способствовать остановке прогрессирования заболевания.

Недавно было показано, что вакцинация с PD01A приводит к снижению накопления олигомеров aSyn и к улучшению памяти и снижению моторных дефектов на двух мышиных моделях синуклеопатий, включающих БП и МСА (множественную системную атрофию) (Mandler et al., Acta Neuropathol. 127 (2014), 861; Mandler et al., Molecular Neurodegeneration 10 (2015), 10). Несмотря на значительные клинические инвестиции, в настоящее время нет терапевтически активного агента, обладающего свойствами, модифицирующими болезнь. Лечение БП направлено в первую очередь на моторные симптомы посредством применения дофаминергических стратегий, антихолинергических средств, или глубокой стимуляции головного мозга, которые являются только симптоматическим лечением, и часто связаны с побочными эффектами. Проведено или продолжается в настоящее время более 20 клинических испытаний потенциальных агентов, модифицирующих заболевание; однако, ни одно из них не достигло своих конечных точек. Соответственно, имеется настоятельная потребность в разработке новых стратегий лечения, изменяющих течение заболевания.

Задачей настоящего изобретения является обеспечение более эффективных стратегий лечения, модифицирующих заболевание, на основе иммунизации аутоантигенами.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает способ вакцинации против аутоантигена у пациента-человека, где дозу эффективного количества аутоантигена вводят пациенту для индукции первичного иммунного ответа; характеризующийся тем, что пациента подвергают бустерному введению указанного аутоантигена, где количество аутоантигена в дозе для бустерного введения выше количества аутоантигена в дозе, используемой для индукции первичного иммунного ответа (т.е. выше количества аутоантигена в дозе, используемой для примирования иммунного ответа).

В ходе создания настоящего изобретения авторами заявки были получены клинические данные, показавшие, что в процессе вакцинации пациентов против аутоантигенов бустерное введение играет центральную роль в достижении эффективных иммунологических и терапевтических эффектов. Также было установлено, что данные, полученные с обычными антигенами (не-ауто-антигенами, такими как патогенные антигены), не сопоставимы и не согласуются со стратегиями вакцинации против аутоантигенов. Результаты, полученные в настоящей заявке, показывают, что предпочтительно, чтобы первичная иммунизация (т.е. достижение первичного иммунного ответа) была осуществлена с относительно небольшим количеством антигена, а бустерная иммунизация была осуществлена с более высоким количеством аутоантигена, чем то, которое применяли для первичного иммунного ответа.

Несмотря на обнадеживающие первые результаты в ходе испытаний AFF008 (см. пресс-релиз выше), было неожиданно установлено, что специфический выбор схемы бустерной вакцинации в соответствии с настоящим изобретением значительно влиял на клинический результат с точки зрения общей эффективности при различных используемых дозировках. В частности, в долгосрочной перспективе дозировка вакцины в фазе буста (по отношению к фазе примирования) имела первостепенное значение для ответа специфических антител и специфической реактивности вакцины. Это было особенно неожиданным, поскольку успешные результаты были получены, когда количество аутоантигена в дозе для бустерного введения было выше количества аутоантигена в дозе, используемой при введении с целью первичного иммунного ответа. Это не было известно ни из предшествующего уровня техники, предлагающего вакцинацию против таких антигенов (например, WO 2009/103105 A2, WO 2011/009152 A1, WO 2014/033158 A2, и т.д.), ни из научных отчетов о мышиных моделях с применением таких вакцин (Mandler et al., Mol. Neurodeg. 10 (2015): 10; Mandler et al., Acta Neuropathol. 127 (2014): 861-879). Это было еще более неожиданным из предшествующего уровня техники, поскольку эффект примирующей и бустерной доз, как сообщалось ранее, считался специфическим для конкретной вакцины, и для конкретных доз и даже для конкретных индивидуумов (например, Shete et al., J. Aids & Clin. Res. 5 (2014), DOI: 10.4172/2155-6113.1000293; Morera et al., Vaccine 30 (2012): 368-377; Gonzales et al., Hum. Vaccines 3 (2007): 8-13), но не для класса аутоантигенных вакцин в соответствии с настоящим изобретением, особенно для аутоантигенов, как специфически раскрыто в настоящей заявке и показано в разделе, посвященном примерам, из настоящего изобретения, а именно, для бета-амилоида, пропротеиновой конвертазы субтилизин-кексинового типа 9 (PSCK9), мембрано-связанных иммуноглобулинов IgE типа, белка гентингтина, CD26 или альфа-синуклеина (см. ниже). Для настоящего изобретения существенно, чтобы доза для введения с целью первичного иммунного ответа была низкой, т.е. ниже, чем при бустерном введении, так что большинство специфических В-клеток можно выбрать на этой первичной стадии вакцинации. Эта стратегия предотвращает появление менее специфических В-клеток и рецепторов антигена. С другой стороны, бустерное введение нужно проводить с более высокими дозировками (т.е. выше, чем при первичном иммунном ответе) в отношении количества антигена, адресованного как можно большему числу В-клеток (обеспеченных первичным иммунным ответом), независимо от их настоящего местоположения (костный мозг, лимфатические узлы, селезенка, и т.д.). Таким образом, более высокое количество, используемое в соответствии с настоящим изобретением, обеспечивает стимуляцию, которая позволяет установить (на основе наиболее специфичных В-клеток, примированных в первичном иммунном ответе) эффективную иммунизацию против аутоантигена, и в итоге, эффективный контроль этого аутоантигена с настоящим подходом посредством вакцинации. В связи с этим, также важно отметить, что индукция первичного иммунного ответа может быть достигнута посредством одного или нескольких введений дозы аутоантигена у индивидуума, подвергающегося вакцинации. Предпочтительно, первичный иммунный ответ достигается с помощью двух, более предпочтительно трех, особо предпочтительно четырех введений аутоантигена. Эти введения для первичного иммунного ответа предпочтительно осуществляют в пределах интервалов времени по меньшей мере две недели, более предпочтительно по меньшей мере три недели, особо предпочтительно по меньшей мере четыре недели. Множество схем вакцинации применяют двухнедельный или месячный интервал вакцинации, который, таким образом, является особо предпочтительным. То же самое относится к бустерному введению; как уже установлено, это дозировка на одно введение, а не на (общее) количество всех вводимых доз, что является существенным элементом для достижения целей настоящего изобретения, а именно для индукции общего эффективного иммунного ответа по отношению к аутоантигену.

Это было конкретно показано для настоящего изобретения в клиническом испытании, касающемся стратегии вакцинации против БП, нацеленной на альфа-синуклеин («aSyn») в качестве аутоантигена, посредством мимотопов aSyn для модуляции уровня агрегатов aSyn в головном мозге, агрегатов патологического белка в случае БП.

Авторы настоящего изобретения недавно завершили испытания I фазы первого применения препарата с участием людей для оценки безопасности и переносимости двух доз (15 мкг и 75 мкг) терапевтической вакцины AFFITOPE^® PD01A, применяемой у пациентов в ранней фазе БП. Все нежелательные явления были слабой или средней тяжести, и лечение было признано хорошо переносимым. Было показано, что применение антигена (PD01A) (вводимого 4 раза в месяц) вызывает внефолликулярный ответ, который приводит к появлению (низкого уровня) IgG Ат, реагирующих с (i) PD01A, пептидным компонентом вакцины, а также (ii) целевой пептидной последовательностью aSyn (фиг. 1). Когда В-клетки пролиферируют в зародышевых центрах и дифференцируются в плазматические клетки, титры IgG Ат возрастают до пикового значения, достигаемого спустя 4 недели после третьей иммунизации (V8).

Для лучшего понимания индукции функциональных Ат, например, aSyn-специфических Ат посредством иммунизации, отношение между дозой в момент примирующей иммунизации(й) и полученным ответом Ат, а также того, насколько примированный иммунный ответ (PD01A-индуцированный ответ) на аутоантиген (например, aSyn) может быть «реактивирован» у людей, пациентов, получавших лечение PD01A из исследования AFF008, анализировали во втором клиническом испытании. Для этого пациентов с БП, иммунизированных PD01A, подвергали бустерной иммунизации спустя 115 недель (в среднем) с одной дозой 15 мкг или 75 мкг PD01A. В испытании AFF08A «бустерное» воздействие антигена PD01A реактивировало иммунную память и приводило к быстрому повышению титра Ат против PD01A и целевой пептидной последовательности aSyn (см. фиг. 1), демонстрируя настоящий вторичный иммунный ответ. В целом, короткоживущие плазматические клетки поддерживали пиковые уровни Ат в течение нескольких недель, после чего сывороточные титры Ат снижались исходно с той же самой быстрой кинетикой, как после первичной иммунизации. Долгоживущие плазматические клетки, которые достигали ниш выживания в костном мозге, продолжали продуцировать антиген-специфические Ат, которые затем снижались с более медленной кинетикой.

Многочисленные детерминанты модулируют интенсивность индуцированных вакциной ЗК, и таким образом, пик Ат ответов. Главными детерминантами являются природа вакцинного антигена и его собственная иммуногенность.

Другим важным фактором первичных ответов Ат на вакцину является введение оптимальной дозы вакцинного антигена, которая может быть определена экспериментально. Как правило, высокие дозы антигена (до определенного предела) обеспечивают более высокие ответы Ат. При использовании дозы выше пороговой можно наблюдать колоколообразный ответ или ответ, имеющий форму плато. Это может быть особенно пригодным, когда иммунологическая компетентность ограничена.

Ограниченная доза вакцины может ограничивать первичные иммунные ответы, но повышает конкуренцию В-клеток за антигены, ассоциированные с фолликулярными дендритными клетками, а также приводит к более жесткой селекции GC-B-клеток более высокой аффинности и к более сильным вторичным «бустерным» ответам. Таким образом, у людей только специфические комбинации доз антигена, например, оптимального окна дозы антигена, в фазе «примирования» и вновь в «бустерной» фазе обеспечивают достаточный Ат ответ, способный модулировать экспрессию агрегатов патологического белка, например, агрегатов aSyn в случае БП.

Как уже указано выше, вакцина в соответствии с настоящим изобретением соответствует критериям релевантности, поскольку соответствующая вакцина направлена на аутоантиген («собственный белок»), т.е. направлена на антиген, который является «собственным» для вакцинируемого индивидуума, но не должна при введении приводить к аутоиммунитету в качестве побочного эффекта. Соответственно, антигенный компонент аутоантигена не должен активировать Т-клетки, но должен служить в качестве В-клеточного антигена. Таким образом, антиген должен быть представлен антиген-презентирующими клетками на их МНС молекулах. Также выполняются требования, указанные Rudolph, Ann. Rev. Immunol. 24 (2006), 419-466. В целом, эпитоп антигена должен быть достаточно коротким для предотвращения Т-клеточной активации, но достаточно длинным, чтобы служить в качестве эпитопа антигена. Далее, генерация ответа антител IgG типа также зависит от Т-хелперных (TH) клеток; таким образом, вакцина должна содержать эпитоп(ы), способный к активации Т-хелперных (TH) клеток (не связанных с интересующим антигеном (для предотвращения клеточного аутоиммунитета)). В идеале, вакцины в соответствии с настоящим изобретением являются сильными TH эпитопами, и как известно, неспособными к активации антител, перекрестно реагирующих с другими молекулами/структурами, найденными у человека. Соответственно, было показано в доклинических, а также в клинических испытаниях, что (белковые) носители, такие как гемоцианин лимфы улитки (KLH), являются мощными активаторами Т-хелперных клеток. Например, KLH является хорошо описанным «чужеродным для человеческой иммунной системы» белком, генерирующим мощные ответы Ат при физическом связывании со специфическими антигенными эпитопами, например, антигенными пептидными последовательностями. Иммунный ответ на настоящую вакцину должен быть направлен на необходимую структуру, не будучи направленным на связанные структуры. Соответственно, антитела, индуцированные у вакцинированного индивидуума, должны связываться с определенной мишенью (аутоантигеном), который является критическим для назначенной активности вакцины; далее, эти антитела, индуцированные вакциной, не должны связываться с родственными или гомологичными структурами (в качестве существенной характеристики безопасности).

Предпочтительно, аутоантигены в соответствии с настоящим изобретением являются антигенами, которые, как сообщалось или предполагается, являются возможными с научной точки зрения кандидатами для вакцин или мишенями для вакцинации в данной области.

Таким образом, способ в соответствии с настоящим изобретением является в принципе пригодным для всех типов стратегий вакцинации аутоантигенами; однако, предпочтительно применять настоящий способ для аутоантигенов, для которых, как известно, трудно получить эффективный иммунный ответ. Соответственно, предпочтительные аутоантигены в соответствии с настоящим изобретением выбраны из группы, состоящей из бета-амилоида, пропротеиновой конвертазы субтилизин-кексинового типа 9 (PSCK9), мембрано-связанных иммуноглобулинов IgE типа, белка гентингтина, CD26 или альфа-синуклеинового антигена, предпочтительно, альфа-синуклеинового антигена, особо предпочтительно альфа-синуклеинового антигена, содержащего эпитоп DMPVDPDN и/или KNEEGAP.

Было показано, что если применяют варианты нативной последовательности аутоантигенов, которые имеют по меньшей мере те же самые (предпочтительно, улучшенные) характеристики иммунизации, по сравнению с нативной последовательностью, иммунизация посредством вакцинации может быть дополнительно улучшена. Соответственно, ясно, что для настоящего изобретения такие варианты нативной аминокислотной последовательности аутоантигена должны быть включены в термин «аутоантиген» в соответствии с настоящим изобретением до тех пор, пока характеристики иммунизации в отношении индукции специфических антител, связывающих (нативный) аутоантиген, у вакцинированного индивидуума (по меньшей мере) сохраняются (или предпочтительно, улучшаются). Такие варианты могут быть обеспечены технологией AFFITOME® (например, раскрытой в Schneeberger et al. Human Vacc. 6 (2010), 1-5). Эти варианты, обеспеченные технологией AFFITOME®, обозначаются как AFFITOPE®, и раскрыты, среди прочего, в WO 2004/062556 A и WO 2006/005707 A для бета-амилоида, и в WO 2009/103105 A и WO 2011/020133 A для aSyn, в WO 2011/009152 A для AngII, в WO 2013/174920 A для C5a, в WO 2014/033158 A и в WO 2015/128287 A для PCSK9. AFFITOPE®, раскрытые в этих документах, также являются предпочтительными аутоантигенами в соответствии с настоящим изобретением.

Соответственно, в настоящем изобретении предпочтительно применяют вариант нативной последовательности аутоантигена в качестве аутоантигена, т.е. AFFITOPE® (который также может быть обозначен как «мимотоп», являющийся пептидом, который содержит варианты последовательности, по сравнению с исходной нативной последовательностью аутоантигена, но при этом мимотоп демонстрирует схожие (такие же или улучшенные) характеристики иммунизации, т.е. способен вызвать иммунный ответ, подобный или превышающий иммунный ответ, полученный с нативной последовательностью; таким образом, мимотоп распознается теми же самыми мАт или пАт, как нативный аутоантиген, но вызывает более сильный иммунный ответ, или иммунный ответ, не связанный с тяжелыми нежелательными явлениями, такими как воспаление нервной ткани). Таким образом, предпочтительно применяют мимотоп альфа-синуклеина, мимотоп ангиотензина II или мимотоп PCSK9 в качестве аутоантигенов при вакцинации в соответствии с настоящим изобретением, более предпочтительно, мимотоп альфа-синуклеина, выбранный из группы, состоящей из DQPVLPD, DMPVLPD, DSPVLPD, DSPVWAE, DTPVLAE, DQPVLPDN, DMPVLPDN, DSPVLPDN, DQPVTAEN, DSPVWAEN, DTPVLAEN, HDRPVTPD, DRPVTPD, DVPVLPD, DTPVYPD, DTPVIPD, HDRPVTPDN, DRPVTPDN, DNPVHPEN, DVPVLPDN, DTPVYPDN, DTPVIPDN, DQPVLPDG, DMPVLPDG, DSPVLPDG, DSPVWAEG, DRPVAPEG, DHPVHPDS, DMPVSPDR, DSPVPPDD, DQPVYPDI, DRPVYPDI, DHPVTPDR, EYPVYPES, DTPVLPDS, DMPVTPDT, DAPVTPDT, DSPVVPDN, DLPVTPDR, DSPVHPDT, DAPVRPDS, DMPVWPDG, DAPVYPDG, DRPVQPDR, YDRPVQPDR, DMPVDPEN, DMPVDADN, EMPVDPDN, DNPVHPE, KNDEGAP, ANEEGAP, KAEEGAP, KNAEGAP, RNEEGAP, HNEEGAP, KNEDGAP, KQEEGAP, KSEEGAP, KNDDGAP, RNDEGAP, RNEDGAP, RQEEGAP, RSEEGAP, ANDEGAP, ANEDGAP, HSEEGAP, ASEEGAP, HNEDGAP, HNDEGAP, RNAEGAP, HNAEGAP, KSAEGAP, KSDEGAP, KSEDGAP, RQDEGAP, RQEDGAP, HSAEGAP, RSAEGAP, RSDEGAP, RSEDGAP, HSDEGAP, HSEDGAP, and RQDDGAP; especially DQPVLPD, DSPVLPD, DVPVLPD, DSPVLPDG, YDRPVQPDR, DHPVHPDS, DAPVRPDS, KNDEGAP, KQEEGAP или KSEEGAP; мимотоп ангиотензина II, выбранный из группы, состоящей из DPVYIHPF, DAVYIHPF, DRHYIHPF, DAAYIHPF, DRAYAHPF, DPGYIHPF, DRAYDHPF, AAYIHPF, RAYAHPF и PGYIHPF, особенно DRAYAHPF, RAYAHPF, DPGYIHPF или PGYIHPF; или мимотоп PCSK9, выбранный из группы, состоящей из SIPWSLERIT, SIPWSLERITPPR, SIPWSLERTTPPR, VIPWNLERILPPR, SVPWNLERIQPPR, SIPWSLERTT, SIPWSLERLT, SIPWSLERLTPPR, SIPWSLERIQ, SIPWSLERIQPPR, VIPWNLERIL и SVPWNLERIQ, особенно SIPWSLERIT, VIPWNLERIL или SVPWNLERIQ.

Предпочтительно вводят значительно более высокое количество аутоантигена в дозе для бустерной иммунизации, чем в дозе для индукции первичного иммунитета. Соответственно, количество аутоантигена в дозе для бустерного применения по меньшей мере на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 100%, особо предпочтительно по меньшей мере на 200% больше количества, используемого для введения с целью первичного иммунного ответа.

В абсолютных количествах предпочтительно вводить количество аутоантигена в дозе для бустерного введения по меньшей мере 20 мкг, предпочтительно по меньшей мере 50 мкг. В связи с этим, важно отметить, что «мкг аутоантигена» в настоящем изобретении означает количество антигенного пептида в дозе, и не включает носитель или линкерную часть конъюгата вакцины (если он присутствует).

Для настоящего изобретения важно применять бустерную вакцинацию в момент времени, когда первичный иммунный ответ уже пройден, т.е. когда титры антител, индуцированных этой первичной вакцинацией (вызванной одним, двумя, тремя, четырьмя или более введениями вакцины в ходе индукции первичного иммунного ответа) падают ниже значительных уровней (например, ниже определенного порогового уровня или даже ниже пределов обнаружения (предпочтительно, становятся неопределяемыми) анализа, пригодного для тестирования большого числа образцов) или по меньшей мере снижаются ниже 30%, предпочтительно ниже 20%, особо предпочтительно ниже 10% от максимального уровня антител, отмечающегося в ходе первичной вакцинации. Такие уровни могут различаться между различными аутоантигенными вакцинами, но обычно присутствуют спустя по меньшей мере 6 месяцев после первичной вакцинации. Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления бустерная иммунизация может проводится спустя по меньшей мере 6 месяцев, предпочтительно по меньшей мере 12 месяцев после первого введения аутоантигена для индукции первичного иммунного ответа. Возможны также стратегии, при которых проведение бустерной иммунизации предпочтительно осуществляют в более поздние моменты времени, например, 18 месяцев, 2 года, три года или пять лет спустя после вакцинации для обеспечения первичного иммунного ответа.

Способы введения в соответствии с настоящим изобретением обычно являются такими же способами, которые применяются для современных вакцин. Таким образом, предпочтительными способами введения аутоантигена являются подкожное, интрадермальное или внутримышечное введение.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, аутоантиген применяют вместе с адъювантом, предпочтительно алюминия оксигидроксидом. В соответствии с этим наиболее предпочтительным вариантом осуществления, настоящее изобретение относится к применению алюминия оксигидроксида качества Европейской Фармакопеи (Алюминия оксигидроксид, монография 1664), более конкретно, продукта, произведенного Brenntag Biosector (2% Alhydrogel), тестированного на соответствие требованиям Евр.Фарм. Alhydrogel поставляется в трех видах: Alhydrogel 1,3%, Alhydrogel 2% и Alhydrogel «85». Alhydrogel 2% был выбран в качестве Международного стандартного препарата для гелей алюминия гидроксида. Фармацевтический препарат в соответствии с настоящим изобретением приготовлен асептически в подходящем буфере, предпочтительно в изотоническом фосфатном буфере (от 1 мМ до 100 мМ), предпочтительно в концентрации ≥ 1,0 мг/мл Alhydrogel (в качестве эквивалента Al₂O₃; этот показатель (Al в качестве «эквивалента Al₂O₃») применяют, как правило, в настоящем изобретении; соответственно, все дозы и количества упоминаются в настоящей заявке, как относящиеся к алюминия оксигидроксиду в связи с эквивалентами Al₂O₃ (из алюминия оксигидроксида (Alhydrogel)), еще более предпочтительно, в концентрации ≥ 1,5 мг/мл Alhydrogel (с Al₂O₃ в качестве эквивалента), наиболее предпочтительно в концентрации ≥ 2,0 мг/мл Alhydrogel (с Al₂O₃ в качестве эквивалента). Количество соли алюминия для Alhydrogel приводится в качестве эквивалента Al₂O₃ в соответствии с концентрацией, установленной производителем (т.е. 2% Alhydrogel приравнивается к 2% Al₂O₃, т.е. 20 мг/мл). Эта концентрация непосредственно преобразуется в соответствующую концентрацию алюминия с применением соответствующих молекулярных масс (20 мг/мл Al₂O₃ (М.м. 101,96) соответствует 10,6 мг/мл алюминия (молекулярная масса 26,98)).

Предпочтительные аутоантигены в соответствии с настоящим изобретением являются полипептидами, включающими от 7 до 30, предпочтительно от 7 до 20, более предпочтительно от 7 до 16, наиболее предпочтительно 8 аминокислотных остатков. Также предпочтительно (и часто существенно для достижения иммунного ответа) объединяют эти пептидные антигены с фармацевтически пригодным носителем, предпочтительно, белковым носителем, особенно KLH (гемоцианином лимфы улитки), Crm-197, столбнячным анатоксином (СА) или дифтерийным токсином (ДТ).

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления, бустерное введение повторяют спустя некоторое время, например, спустя один, два, три года, пять или десять лет. Предпочтительно, второе или последующие бустерные введения осуществляют таким же или подобным образом, как первое бустерное введение, т.е. с повышенным количеством аутоантигена, по сравнению с дозой для первичной вакцинации.

В соответствии с первым аспектом, настоящее изобретение также относится к набору для применения в вакцинации против аутоантигена у пациента-человека, включающему:

- первую вакцинную композицию, содержащую эффективное количество аутоантигена для индукции первичного иммунного ответа против аутоантигена, и

- вторую вакцинную композицию, содержащую эффективное количество аутоантигена для индукции бустерного иммунного ответа против аутоантигена,

где количество аутоантигена во второй вакцинной композиции выше, чем в первой вакцинной композиции.

В этом наборе обеспечивается вакцинная композиция(ии) в соответствии с настоящим изобретением (т.е. как раскрыто в настоящей заявке).

Настоящее изобретение также относится к применению набора в соответствии с настоящим изобретением для производства вакцины для индукции иммунного ответа против аутоантигена у пациента-человека.

Настоящее изобретение также обеспечивает вакцину для применения в вакцинации пациента-человека против аутоантигена, где дозу с эффективным количеством аутоантигена, особенно мимотопа аутоантигена, вводят пациенту для индукции первичного иммунного ответа, где пациента подвергают бустерному введению указанного аутоантигена, и где количество аутоантигена в дозе для бустерного введения выше количества аутоантигена в дозе, используемой для введения с целью первичного иммунного ответа.

Изобретение далее раскрыто в следующих примерах и фигурах, хотя не ограничивается ими.

Фиг. 1A-D показывают, что введение aSyn мимотопа PD01A спустя 20 месяцев после примирования приводит к иммунологическому бустерному эффекту. (С) Наиболее выраженный иммунологический эффект наблюдался, когда примирование проводили с 4 ежемесячными инъекциями 15 мкг PD01A, а бустерную иммунизацию проводили с 75 мкг PD01A. (D) Бустерная иммунизация с 75 мкг усиливала ответ антител сверх уровня, достигнутого при примировании; фиг. 1Е-Н показывают aSyn-специфические антитела в сыворотке человека; фиг. 1I-L показывают KLH-специфические антитела в сыворотке человека.

Фиг. 2A-D оказывают титры антител против AngII (3 вакцинации раз в две недели с 5 мкг и бустерная вакцинация с 5 мкг на 22 неделе, и на 33 неделе с 50 мкг).

Фиг. 3 показывает титры антител против huPCSK9 (долговременные вакцинации (3 вакцинации раз в две недели, последующий период 52 недели); повторная вакцинация на 52 неделе с 30 мкг).

Фиг. 4 показывает клинические испытания вакцинной композиции AFF008A.

Фиг. 5 показывает исходные характеристики пациентов в клинических испытаниях AFF008A.

Фиг. 6 показывает календарь иммунизации и наблюдений при клинических испытаниях AFF008A.

Фиг. 7 показывает побочные эффекты в исследуемой группе при клинических испытаниях AFF008A.

Фиг. 8 показывает побочные эффекты по классам систем органов в исследуемой группе при клинических испытаниях AFF008A.

Фиг. 9 показывает титры PD01-специфических антител в клинических испытаниях AFF008A.

Примеры

Пример 1. Бустерная вакцинация при БП.

AFFITOPE® PD01A был разработан для лечения синуклеинопатий, таких как БП (WO 2009/103105 A2). PD01A является конъюгатом пептид-KLH, где пептидный компонент имитирует С-концевую область человеческого aSyn (с нативным эпитопом DMPVDPDN). Он нацелен на aSyn, и в то же время избегает тесно связанных членов семейства белков, включая β-Синуклеин (bSyn), который может обладать нейропротективными свойствами (Vigneswara et al., PLoS One 8 (2013), e61442). Недавно было показано, что вакцинация PD01A приводит к снижению накопления олигомеров aSyn и к улучшению памяти и снижению моторных дефектов на двух мышиных моделях БП (Mandler et al., Acta Neuropathol. 127 (2014), 861; Mandler et al., Molecular Neurodegeneration 10:10 (2015)).

Участники:

Участники испытания были привлечены из Вены, Австрия, и окружающих районов. Для включения в клиническое испытание пациенты должны были иметь подтвержденный диагноз БП. У пациентов с идиопатической болезнью Паркинсона длительность заболевания составляла меньше 4 лет, стадии I/II по шкале Хён и Яра (Goetz et al., Mov. Disord. 19 (2004), 1020; Hoehn et al., Neurology 17 (1967), 427), и выполнялись критерии Банка головного мозга Общества болезни Паркинсона Великобритании (Hughes et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 55 (1992), 181).

Результаты анализа головного мозга пациентов посредством однофотонной эмиссионной компьютерной хроматографии переносчиков дофамина (DAT-SPECT) и магнитно-резонансной томографии (МРТ) должны были соответствовать диагнозу БП. Все потенциальные участники, получавшие обычное лечение БП, должны были получать стабильные дозы в течение по меньшей мере 3 месяцев до периода исследования, и намереваться продолжать в течение всего периода испытания.

Все индивидуумы, участвующие в исследование, давали информированное согласие. Протокол испытания, информация для пациента, информированное согласие и все другие необходимые для испытаний документы были утверждены независимым этическим комитетом.

Материалы и методы

AFFITOPE® PD01A вначале применяли у 24 индивидуумов, страдающих ранней стадией БП в AFF008, I фазе клинических испытаний, предназначенных для первичной оценки безопасности и переносимости вакцины, а затем иммунологической и клинической активности (эксплоративный анализ). Для этого две дозы (15 мкг или 75 мкг AFFITOPE® PD01A (т.е. 15 мкг или 75 мкг пептида C-DMPVDPDN, связанного с соответствующим количеством KLH), адсорбированного на 1 мг Alhydrogel (в качестве эквивалента Al₂O₃)), вводили 4 раза с 4-недельными интервалами. Каждую дозу применяли у 12 пациентов. Кроме того, для 8 пациентов было предложено участие в группе сравнения без лечения. Полученные результаты (i) подтвердили безопасность и переносимость вакцины, (ii) продемонстрировали индукцию вакцино-специфического IgG ответа, и (iii) предоставили свидетельство назначенной клинической активности. Все 32 пациента были подвергнуты последующему наблюдению (AFF008E), 31 (24 вакцинированных пациента и 7 контрольных) были приняты в исследование, и 30 завершили исследование. Для одного пациента из группы с низкой дозой не было продолжено наблюдение. Участники AFF008E получили единственную «бустерную инъекцию» с низкой (15 мкг; получено из высокой дозы путем разбавления непосредственно перед введением) или высокой дозой (75 мкг) композиции с получением 4 различных опытных групп: низкая доза (AFF008) - низкая доза (AFF08A); низкая доза - высокая доза; высокая доза - низкая доза и высокая доза - высокая доза. Пациенты из группы сравнения не получали этого лечения. В целом было принято 28 (22/6) пациентов, и все 28 завершили AFF008A исследование.

Инъекции осуществлялись подкожно главным исследователем. Все введения проводили в клинике. Пациентов в опытных группах произвольно распределяли по группам, получавшим 15 мкг или 75 мкг AFFITOPE® PD01A. Обе композиции содержали 0,5 мг эквивалента алюминия.

Испытания были проведены в соответствии с Надлежащей клинической практикой (GCP), Хельсинкской декларацией с изменениями (2013), и местными законодательными и нормативными требованиями (Закон Австрии об использовании лекарств) и применимыми международными правилами. Испытания зарегистрированы в утвержденной базе клинических испытаний (www.clinicaltrials.gov, идентификаторы: NCT01568099, NCT02216188).

Результаты показаны на фиг. 1A-L. Фиг. 1A-D показывают, что введение aSyn мимотопа PD01A спустя 20 месяцев после примирования приводит к иммунологическому бустерному эффекту. (С) Наиболее выраженный иммунный эффект наблюдался, когда примирование проводили с 4 ежемесячными инъекциями 15 мкг PD01A, а бустерную иммунизацию проводили с 75 мкг PD01A. (D) Бустерная иммунизация с 75 мкг усиливала ответ антител сверх уровня, достигнутого при примировании.

Фиг. 1Е-Н показывают ответ на aSyn эпитоп; фиг. 1I-L показывают ответ на KLH. Все фиг. 1A-L демонстрируют титры антител в сыворотке человека.

Фиг. 1Е-Н и фиг. 1I-L построены подобно фиг. 1A-D. Пунктирная красная линия представляет среднее значение в группе. Заголовки фигур означают дозы вакцины: примирующая доза (AFF008)/ бустерная доза (AFF008A). Размер групп: n=4 (15 мкг/15 мкг), n=6 для всех других групп. Период времени, охватываемый фигурами: 3,5 года. Пациенты с ранней стадией болезни Паркинсона (стадии I/II по шкале Хён и Яра) получали 4 примирующих иммунизации в дозах 15 и 75 мкг с интервалами 28 суток. Антитела к иммунизирующему пептиду (PD01), к целевому альфа-синуклеиновому эпитопу (aa110-130; выполненному в виде конъюгата с BSA) и к KLH количественно определяли посредством ELISA. Примирующая доза была связана главным образом с долговременностью ответа антител: низкая доза индуцировала ответ антител, который длился дольше, чем с высокой дозой, амплитуда обоих ответов была сопоставимой. Подобным образом, итог бустерной иммунизации определялся дозами: низкая доза обеспечивала реактивацию ответа антител до уровня примирующего ответа. Напротив, высокая доза повышала ответ антител в десять раз, по сравнению с ответом, полученным во время фазы примирования. Наилучший ответ, составивший основу настоящего изобретения, наблюдался при комбинации низкая доза - высокая доза для примирования и бустерной иммунизации.

Пример 2. Бустерная вакцинация AngII.

Вакцины

Пептиды DRAYAHPF, RAYAHPF, DPGYIHPF и PGYIHPF конъюгировали посредством гетеробифункционального линкера GMBS (4-Малеимидомасляной кислоты N-гидроксисукцинимидный сложный эфир) с KLH (гемоцианином лимфы улитки) или CRM197 (Перекрестно-реагирующим материалом 197). Указанные количества связанных пептидов (1, 5, 30, 150 мкг) суспендировали с алюминия гидроксидом (конечная концентрация алюминия гилроксида составила 0,2%). В качестве буфера использовали PBS или маннитол/фосфат.

Эксперименты на животных

Мышей-самок BALB/c содержали в условиях цикла 12 часов света/темноты, и обеспечивали свободный доступ к корму и воде. Возраст мышей в начале эксперимента составил около 8-10 недель.

Иммунизировали посредством подкожного введения по 10 мышей Balb/c на группу. Мышам вначале вводили три раза с 2 недельными интервалами в целом объем 1 мл (2×500 мкл в левую и правую область холки). Кровь брали несколько раз с регулярными интервалами после третьего введения. Данные, представленные в настоящей заявке, приведены для плазмы, взятой спустя примерно 8 месяцев после третьей инъекции (обозначено как P3i). Спустя примерно 8,5 месяцев после третьей инъекции половину из оставшихся мышей в каждой группе подвергали бустерной иммунизации либо с тем же количеством антигена, которое применяли при первых трех иммунизациях, либо иммунизировали более высокими/низкими количествами, см. схему ниже. Итоговую плазму (обозначенную как P4b) брали спустя 6 недель после четвертной вакцинации.

Общая схема:

Вакцинация № 1/2/3 Число мышей* Вакцинация № 4 Число мышей* 1 мкг связанного пептида 10 «низкая»=1 мкг связанного пептида 5 «высокая»=30 мкг связанного пептида 5 30 мкг связанного пептида 10 «низкая»=1 мкг связанного пептида 5 «высокая»=30 мкг связанного пептида 5 150 мкг связанного пептида 10 «низкая»=5 мкг связанного пептида 5 «высокая»=150 мкг связанного пептида 5

*Из-за продолжительности эксперимента некоторые мыши умирали до окончания эксперимента. Таким образом, для определенных групп показаны данные для меньшего числа мышей.

Для всех экспериментов с AngII пептидом 10 мышам Balb/c проводили подкожные инъекции в соответствии со следующей таблицей.

Доза пептида, вводимый объем Момент времени 1-е введение 5 мкг пептида, 200 мкл Неделя 0 Отбор проб 1 - Неделя 2 2-е введение 5 мкг пептида, 200 мкл Неделя 2 Отбор проб 2 - Неделя 4 3-е введение 5 мкг пептида, 200 мкл Неделя 4 Отбор проб 3 - Неделя 6 Отбор проб 4 - Неделя 20 4-е введение 5 мкг пептида, 200 мкл Неделя 22 Отбор проб 5 - Неделя 24 Отбор проб 6 - Неделя 31 5-е введение 50 мкг пептида, 200 мкл Неделя 33 Отбор проб 7 - Неделя 35

ELISA пептидов

Для определения иммуногенности вакцин 96-луночные планшеты Nunc-Maxisorb покрывали 1 мкМ соответствующих введенных пептидов, связанных с бычьим сывороточным альбумином (BSA) в 0,1 M NaHCO₃, pH 9,2-9,4. Неспецифическое связывание блокировали путем инкубации с блокирующим буфером (5% BSA в PBS). В лунки добавляли подходящие разведения сыворотки, серийно разведенной 1:2, и инкубировали в течение примерно 1 часа при 37°C. Связанные антитела выявляли путем инкубации с биотинилированными козьими антителами против IgG мыши, а затем с пероксидазой хрена, связанной со стрептавидином. Добавляли субстрат ABTS, и определяли оптическую плотность (ОП) при 405 нм с помощью ридера для микропланшетов. Титры определяли как разведение сыворотки, где достигалось 50% максимальной оптической плотности в анализе.

Для расчета кратности индукции антител после повторной бустерной иммунизации, титры антител к введенному пептиду у отдельных мышей, определенные после четырех иммунизаций, делили на титры, определенные спустя примерно 8 месяцев после третьей иммунизации. На графиках изображены средние коэффициенты, полученные для каждой группы.

Результаты показаны на фиг. 2A-D. Группы мышей BALB/c (n=10) получали примирующие вакцинации в 0, 2 и 4 неделю путем введения 5 мкг пептидов, имитирующих ангиотензин II, связанных с KLH (A) и (B), пептидов, имитирующих ангиотензин II, связанных с CRM (C) и (D). Иммунизация любой вакциной приводила к появлению ответа Ang II-специфических IgG антител. Все вакцины показали схожие ответы с точки зрения кинетики, но различающиеся в некоторой степени по амплитуде. Бустерная иммунизация с низкой дозой, т.е. с 5 мкг соответствующей вакцины, вводимая на 22 неделе, не позволяла существенно повысить Ang II-специфический ответ антител, независимо от типа/состава вакцины. Напротив, введение соответствующей вакцины в более высокой дозе, т.е. 50 мкг, на 33 неделе явно усиливало Ang II-специфический ответ антител выше уровней, которые достигались в фазе примирования.

Пример 3. Бустерная иммунизация PCSK9

Материалы и методы

Вакцина:

Пептиды SIPWSLERIT, VIPWNLERIL и SVPWNLERIQ конъюгировали посредством гетеробифункционального линкера GMBS (4-Малеимидомасляной кислоты N-гидроксисукцинимидный сложный эфир) с KLH (гемоцианином лимфы улитки).

Эксперименты на животных

5 мышей BALB/c иммунизировали подкожно. Мышам обеспечивали свободный доступ к корму и воде, и содержали в условиях цикла 12 часов света/темноты. Возраст мышей в начале 21 экспериментов составил 8-10 недель. Мышам вводили три раза с 2 недельными интервалами либо 5 мкг, либо 25 мкг общего количества пептида, связанного с KLH и адсорбированного на Alhydrogel в качестве адъюванта, в объеме 1 мл в целом. Кровь отбирали спустя примерно 2 недели после каждого введения, и с месячным интервалом после итоговой 3-ей иммунизации (до года). На 52 неделе после примирующей иммунизации мышей повторно вакцинировали (4-я иммунизация) с 25 мкг общего пептида, связанного с KLH и адсорбированного на Alhydrogel в качестве адъюванта, в объеме 1 мл в целом. Кровь брали спустя 2 и 4 недели после 4-й иммунизации (Плазма 4a и 4b, соответственно).

ELISA белков:

Для определения иммуногенности вакцин, и таким образом, для идентификации количества PCSK9-специфических антител в плазме иммунизированных животных, проводили ELISA. ELISA генерирует сигнал, который можно легко определить количественно, и представляет количественную меру дозы вакцины, индуцирующей PCSK9-специфические антитела. Таким образом, титры, измеренные посредством ELISA, напрямую связаны с количеством (мкг/мл) специфических в отношении мишени антител в образцах плазмы иммунизированных животных. Все образцы плазмы собирали спустя две недели после итоговой иммунизации, и эквивалентно обрабатывали. Для прямого сравнения проводили количественную оценку посредством ELISA PCSK9 белка индуцированных вакциной PCSK9-специфических антител, и сравнение с их соответствующими контролями (оригинальная последовательность и отрицательный контроль) для всех образцов одновременно. Для этой цели планшеты для ELISA покрывали рекомбинантно экспрессированным человеческим PCSK9 белком. Неспецифическое связывание блокировали путем инкубации с блокирующим буфером (1% BSA в PBS). Подходящие разведения сыворотки (пулы со стартовым разведением 1:100) добавляли в лунки, серийно разбавляли 1:2 (12 этапов разведения) и инкубировали в течение примерно 1 часа. Связанные антитела выявляли путем инкубации с антителом к IgG мыши, добавляли ABTS в качестве субстрата, и измеряли ОП при 405 нм. В качестве отрицательного контроля анализировали сыворотку от контрольной группы, которой вводили нерелевантный пептид. Определяли титры в виде разведения сыворотки, где достигалось 50% от максимальной ОП в анализе.

Результаты показаны на фиг. 3. Группы мышей получали примирующие вакцинации в 0, 2 и 4 неделю путем введения 5 или 25 мкг AFFITOPE вакцины, направленной на PCSK9. Мыши в группе отрицательного контроля получали нерелевантный пептид, связанный с KLH и адсорбированный на алюминии гидроксиде. Антитела к человеческому PCSK9 все еще выявлялись спустя 48 и 52 недели после примирования в обеих опытных группах. Однако ответ был более выраженным в группе животных, получавших более низкую дозу. Напротив, животные из группы отрицательного контроля не проявляли ответа антител на человеческий PCSK9. Применение единственной бустерной иммунизации с 25 мкг вакцины AFFITOPE на 52 неделе приводило к более выраженному повышению антител к huPCSK9, при этом уровни, достигаемые в группе низкой дозы (5 мкг)/высокой дозы (25 мкг) были примерно в два раза выше, чем в группе с высокой дозой (25 мкг)/высокой дозой (25 мкг). Единственное введение 25 мкг вакцины AFFITOPE не приводило к ответу антител у контрольных мышей (которых до этого не подвергали воздействию вакцины AFFITOPE).

Пример 4. AFF008A: успешное бустерное усиление существующего иммунного ответа против альфа-синуклеина («aSyn»)

В ходе клинического испытания («AFF008A») оценивали безопасность и проводили иммунологический анализ вакцинного подхода на основе вакцины AFFITOPE® с целевой последовательностью aSyn (пептид DQPVLPD; «PD01A») у пациентов с ранней стадией болезни Паркинсона (БП).

БП является распространенным прогрессирующим нейродегенеративным расстройством, чья частота коррелирует с возрастом, и поражает до 4% людей в возрасте выше 85 лет. Первыми клиническими признаками заболевания являются двигательные расстройства. Однако, не-моторные симптомы, такие как нарушения обоняния, запор, депрессия и ортостатическая гипотензия, также являются характеристиками начала заболевания, в то время как при прогрессировании заболевания могут развиваться когнитивные нарушения или деменция. Несмотря на интенсивные научные исследования с целью понимания патогенеза заболевания, доступные в настоящее время способы лечения ограничены только симптоматическими, но способы, модифицирующие заболевание, отсутствуют. Считается, что альфа-синуклеин (aSyn), и в частности, его олигомерная структура, является главным патологическим признаком патогенеза заболевания, и таким образом, является привлекательной мишенью для разработки лечения БП.

Целью настоящего исследования была разработка вакцин на основе AFFITOPE (обозначенных PD01A; фиг. 4), направленных на aSyn, для долговременного лечения или профилактики БП.

Дизайн и способы исследования

Испытание I фазы AFF008A (NCT02216188 - после бустерной иммунизации) для оценки иммунизации с AFFITOPE® PD01A на пептидной основе было слепым, одноцентровым, рандомизированным, контролируемым, с оценкой в параллельных группах двух «бустерных» дозировок (15 мкг и 75 мкг). Исследование проводили у пациентов на ранней стадии БП (фиг. 5). Первичной конечной точкой была переносимость и безопасность одной подкожной бустерной инъекции (фиг. 6). Каждую дозу тестировали у пациентов, которые ранее получали примирующую иммунизацию с 15 мкг или 75 мкг AFFITOPE® PD01A (NCT01568099, «AFF008», см. Пример 1). Вторичной конечной точкой был иммунологический ответ после бустерной иммунизации, индуцированной двумя режимами применения AFFITOPE® PD01A. Затем контролировали титры IgG антител, специфических к пептиду, которым проводили иммунизацию, KLH (белку-носителю) и целевой последовательности aSyn посредством ELISA. Кроме того, измеряли реактивность против рекомбинантного белка aSyn также посредством ELISA.

Результаты

Бустерная иммунизация против различных дозировок PD01A вакцины на основе AFFITOPE® хорошо переносилась (фиг. 7, 8). Переменные поисковых показателей эффективности не показали ухудшения клинических симптомов в опытных группах по сравнению с группой сравнения, не получавшей лечения. Бустерная вакцинация с PD01A приводила к реактивации специфического иммунного ответа спустя примерно два года после примирующей иммунизации дозозависимым образом: пациенты с БП, иммунизированные четыре раза с низкой дозой (AFF008) с последующей бустерной иммунизацией с высокой дозой (AFF008A) показали явное усиление иммунного ответа. Иммунный ответ сохранялся в течение всего периода наблюдения 24 недели (фиг. 9).

Иммунный ответ против AFFITOPE® PD01A наблюдался у 19 из 22 (86%) вакцинированных пациентов с БП. У 14 из 19 пациентов с БП (73%) генерировались специфические антитела против оригинального эпитопа aSyn.

Заключение

Вакцинация AFFITOPE® PD01A у больных с ранней стадией БП хорошо переносится, приводит к долговременному иммунному ответу и поддается бустерной индукции.

Раскрыт способ вакцинации против аутоантигена у пациента-человека, где дозу с эффективным количеством аутоантигена применяют у пациента для индукции первичного иммунного ответа, характеризующийся тем, что пациента подвергают бустерному применению указанного аутоантигена, где количество аутоантигена в дозе для бустерного применения выше количества аутоантигена в дозе, используемой для применения с целью первичного иммунного ответа. 4 н. и 17 з.п. ф-лы, 9 ил.

1. Способ вакцинации против аутоантигена у пациента-человека, где дозу с эффективным количеством аутоантигена вводят пациенту для индукции первичного иммунного ответа, характеризующийся тем, что пациента подвергают бустерному введению указанного аутоантигена, где количество аутоантигена в дозе для бустерного введения по меньшей мере на 200% выше количества аутоантигена в дозе, используемой для введения с целью первичного иммунного ответа, где аутоантиген выбран из группы, состоящей из пропротеиновой конвертазы субтилизин-кексинового типа 9 (PSCK9), и альфа-синуклеинового антигена, и где бустерное введение осуществляют по меньшей мере 6 месяцев спустя после первого введения аутоантигена для индукции первичного иммунного ответа.

2. Способ по п. 1, где аутоантиген является альфа-синуклеиновым антигеном, особенно альфа-синуклеиновым антигеном, содержащим эпитоп DMPVDPDN и/или KNEEGAP.

3. Способ по п. 1 или 2, где аутоантиген является мимотопом, предпочтительно альфа-синуклеиновым мимотопом, мимотопом ангиотензина II или мимотопом PCSK9, более предпочтительно альфа-синуклеиновым мимотопом, выбранным из группы, состоящей из DQPVLPD, DMPVLPD, DSPVLPD, DSPVWAE, DTPVLAE, DQPVLPDN, DMPVLPDN, DSPVLPDN, DQPVTAEN, DSPVWAEN, DTPVLAEN, HDRPVTPD, DRPVTPD, DVPVLPD, DTPVYPD, DTPVIPD, HDRPVTPDN, DRPVTPDN, DNPVHPEN, DVPVLPDN, DTPVYPDN, DTPVIPDN, DQPVLPDG, DMPVLPDG, DSPVLPDG, DSPVWAEG, DRPVAPEG, DHPVHPDS, DMPVSPDR, DSPVPPDD, DQPVYPDI, DRPVYPDI, DHPVTPDR, EYPVYPES, DTPVLPDS, DMPVTPDT, DAPVTPDT, DSPVVPDN, DLPVTPDR, DSPVHPDT, DAPVRPDS, DMPVWPDG, DAPVYPDG, DRPVQPDR, YDRPVQPDR, DMPVDPEN, DMPVDADN, EMPVDPDN, DNPVHPE, KNDEGAP, ANEEGAP, KAEEGAP, KNAEGAP, RNEEGAP, HNEEGAP, KNEDGAP, KQEEGAP, KSEEGAP, KNDDGAP, RNDEGAP, RNEDGAP, RQEEGAP, RSEEGAP, ANDEGAP, ANEDGAP, HSEEGAP, ASEEGAP, HNEDGAP, HNDEGAP, RNAEGAP, HNAEGAP, KSAEGAP, KSDEGAP, KSEDGAP, RQDEGAP, RQEDGAP, HSAEGAP, RSAEGAP, RSDEGAP, RSEDGAP, HSDEGAP, HSEDGAP и RQDDGAP; особенно DQPVLPD, DSPVLPD, DVPVLPD, DSPVLPDG, YDRPVQPDR, DHPVHPDS, DAPVRPDS, KNDEGAP, KQEEGAP, или KSEEGAP; мимотопом ангиотензина II, выбранным из группы, состоящей из DPVYIHPF, DAVYIHPF, DRHYIHPF, DAAYIHPF, DRAYAHPF, DPGYIHPF, DRAYDHPF, AAYIHPF, RAYAHPF и PGYIHPF, особенно DRAYAHPF, RAYAHPF, DPGYIHPF или PGYIHPF; или мимотопом PCSK9, выбранным из группы, состоящей из SIPWSLERIT, SIPWSLERITPPR, SIPWSLERTTPPR, VIPWNLERILPPR, SVPWNLERIQPPR, SIPWSLERTT, SIPWSLERLT, SIPWSLERLTPPR, SIPWSLERIQ, SIPWSLERIQPPR, VIPWNLERIL и SVPWNLERIQ, особенно SIPWSLERIT, VIPWNLERIL или SVPWNLERIQ.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где количество аутоантигена в дозе для бустерного введения составляет по меньшей мере 20 мкг.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где количество аутоантигена в дозе для бустерного введения составляет по меньшей мере 50 мкг.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где бустерное введение осуществляют спустя по меньшей мере 12 месяцев после первого введения аутоантигена для индукции первичного иммунного ответа.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где введение аутоантигена является подкожным, интрадермальным или внутримышечным введением.

8. Способ по любому из пп. 1-4, где аутоантиген применяют вместе с адъювантом, предпочтительно алюминия оксигидроксидом.

9. Способ по любому из пп. 1-8, где аутоантиген, особенно мимотоп аутоантигена, является полипептидом, включающим от 7 до 30, предпочтительно от 7 до 20, более предпочтительно от 7 до 16, наиболее предпочтительно 8 аминокислотных остатков, и связан с фармацевтически пригодным носителем, предпочтительно белковым носителем, особенно KLH (гемоцианином лимфы улитки), Crm-197, столбнячным анатоксином (СА) или дифтерийным токсином (ДТ).

10. Способ по любому из пп. 1-9, где бустерное введение повторяют предпочтительно спустя по меньшей мере три года и с тем же самым количеством, как при первом бустерном введении.

11. Применение вакцины с целью вакцинации пациента-человека против аутоантигена, где дозу эффективного количества аутоантигена применяют у пациента для индукции первичного иммунного ответа, где пациента подвергают бустерному введению указанного аутоантигена, и где количество аутоантигена в дозе для бустерного введения по меньшей мере на 200% выше количества аутоантигена в дозе, используемой для введения для первичного иммунного ответа, где аутоантиген выбран из группы, состоящей из PSCK9 и альфа-синуклеинового антигена, и где бустерное введение осуществляют спустя по меньшей мере 6 месяцев после первого применения аутоантигена для индукции первичного иммунного ответа.

12. Применение по п. 11, где аутоантиген является альфа-синуклеиновым антигеном, особенно альфа-синуклеиновым антигеном, содержащим эпитоп DMPVDPDN и/или KNEEGAP.

13. Применение по п. 11 или 12, где аутоантиген является мимотопом, предпочтительно альфа-синуклеиновым мимотопом, мимотопом ангиотензина II или мимотопом PCSK9, более предпочтительно альфа-синуклеиновым мимотопом, выбранным из группы, состоящей из DQPVLPD, DMPVLPD, DSPVLPD, DSPVWAE, DTPVLAE, DQPVLPDN, DMPVLPDN, DSPVLPDN, DQPVTAEN, DSPVWAEN, DTPVLAEN, HDRPVTPD, DRPVTPD, DVPVLPD, DTPVYPD, DTPVIPD, HDRPVTPDN, DRPVTPDN, DNPVHPEN, DVPVLPDN, DTPVYPDN, DTPVIPDN, DQPVLPDG, DMPVLPDG, DSPVLPDG, DSPVWAEG, DRPVAPEG, DHPVHPDS, DMPVSPDR, DSPVPPDD, DQPVYPDI, DRPVYPDI, DHPVTPDR, EYPVYPES, DTPVLPDS, DMPVTPDT, DAPVTPDT, DSPVVPDN, DLPVTPDR, DSPVHPDT, DAPVRPDS, DMPVWPDG, DAPVYPDG, DRPVQPDR, YDRPVQPDR, DMPVDPEN, DMPVDADN, EMPVDPDN, DNPVHPE, KNDEGAP, ANEEGAP, KAEEGAP, KNAEGAP, RNEEGAP, HNEEGAP, KNEDGAP, KQEEGAP, KSEEGAP, KNDDGAP, RNDEGAP, RNEDGAP, RQEEGAP, RSEEGAP, ANDEGAP, ANEDGAP, HSEEGAP, ASEEGAP, HNEDGAP, HNDEGAP, RNAEGAP, HNAEGAP, KSAEGAP, KSDEGAP, KSEDGAP, RQDEGAP, RQEDGAP, HSAEGAP, RSAEGAP, RSDEGAP, RSEDGAP, HSDEGAP, HSEDGAP и RQDDGAP; особенно DQPVLPD, DSPVLPD, DVPVLPD, DSPVLPDG, YDRPVQPDR, DHPVHPDS, DAPVRPDS, KNDEGAP, KQEEGAP, или KSEEGAP; мимотопом ангиотензина II, выбранным из группы, состоящей из DPVYIHPF, DAVYIHPF, DRHYIHPF, DAAYIHPF, DRAYAHPF, DPGYIHPF, DRAYDHPF, AAYIHPF, RAYAHPF и PGYIHPF, особенно DRAYAHPF, RAYAHPF, DPGYIHPF или PGYIHPF; или мимотопом PCSK9, выбранным из группы, состоящей из SIPWSLERIT, SIPWSLERITPPR, SIPWSLERTTPPR, VIPWNLERILPPR, SVPWNLERIQPPR, SIPWSLERTT, SIPWSLERLT, SIPWSLERLTPPR, SIPWSLERIQ, SIPWSLERIQPPR, VIPWNLERIL и SVPWNLERIQ, особенно SIPWSLERIT, VIPWNLERIL или SVPWNLERIQ.

14. Применение по любому из пп. 11-13, где количество аутоантигена в дозе для бустерного введения составляет по меньшей мере 20 мкг.

15. Применение по любому из пп. 11-14, где количество аутоантигена в дозе для бустерного введения составляет по меньшей мере 50 мкг.

16. Применение по любому из пп. 11-15, где аутоантиген применяют вместе с адъювантом, предпочтительно алюминия оксигидроксидом.

17. Применение по любому из пп. 11-16, где аутоантиген, особенно мимотоп аутоантигена, является полипептидом, включающим от 7 до 30, предпочтительно от 7 до 20, более предпочтительно от 7 до 16, наиболее предпочтительно 8 аминокислотных остатков, и связан с фармацевтически пригодным носителем, предпочтительно белковым носителем, особенно KLH (гемоцианином лимфы улитки), Crm-197, столбнячным анатоксином (СА) или дифтерийным токсином (ДТ).

18. Применение набора в вакцинации против аутоантигена у пациента-человека, где набор включает:

- первую вакцинную композицию, содержащую эффективное количество аутоантигена для индукции первичного иммунного ответа против аутоантигена, и

- вторую вакцинную композицию, содержащую эффективное количество аутоантигена для индукции бустерного иммунного ответа против аутоантигена,

где количество аутоантигена во второй вакцинной композиции по меньшей мере на 200% выше, чем в первой вакцинной композиции, и

где аутоантиген выбран из группы, состоящей из PSCK9, и альфа-синуклеинового антигена.

19. Применение по п. 18, где вакцинная композиция определена в соответствии с любым из пп.11-17.

20. Применение набора, где набор включает:

- первую вакцинную композицию, содержащую эффективное количество аутоантигена для индукции первичного иммунного ответа против аутоантигена, и

- вторую вакцинную композицию, содержащую эффективное количество аутоантигена для индукции бустерного иммунного ответа против аутоантигена,

где количество аутоантигена во второй вакцинной композиции по меньшей мере на 200% выше, чем в первой вакцинной композиции, и

где аутоантиген выбран из группы, состоящей из PSCK9, и альфа-синуклеинового антигена для производства вакцины для индукции иммунного ответа против аутоантигена у пациента-человека.

21. Применение по п. 20, где вакцинная композиция определена в соответствии с любым из пп.11-17.