Способ инактивации культурального ротавируса человека Российский патент 2020 года по МПК A61K35/765 A61L2/10 A61K41/17 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и биотехнологии и касается способа инактивации культурального ротавируса человека группы А для использования при получении диагностических и вакцинных препаратов.

Ротавирусный гастроэнтерит относится к острым инфекционным заболеваниям, широко распространенным во всех странах мира, в том числе в Российской Федерации и вызывает более половины всех кишечных расстройств у детей первых двух лет жизни, поэтому разработка вакцин против ротавирусной инфекции является приоритетной.

Известны живые ротавирусные вакцины, но они сохраняют некоторый уровень остаточной патогенности, хотя и очень низкий, и у детей, особенно с дефектной иммунной системой, они могут вызывать тяжелые формы заболевания. Серьезной проблемой живых вакцин может быть также их биологическая нестабильность при хранении.

Трудности, возникающие при получении и использовании живых вакцин, удается преодолевать в случае использования инактивированных (убитых) ротавирусных вакцин. Риск заражения при вакцинации инактивированной вакциной практически отсутствует. Инактивированные вакцины отвечают требованиям инфекционной безопасности, отсутствия поствакцинальных последствий, обеспечивают стабильность иммуногенного начала, сохранение полноценности антигенных белков и химической чистоты вакцинного препарата. Инактивация при этом должна быть направлена на вирусный геном и, по возможности, не затрагивать белковый каркас вирусной частицы.

При разработке инактивированной ротавирусной вакцины большое значение имеет способ инактивации ротавируса, который должен обеспечить необратимое повреждение его репликативного механизма при полном сохранении исходной антигенной структуры. Особенно важен подбор способа инактивации ротавируса человека, трудно поддающегося культивированию и более чувствительного к разрушению.

Существуют способы инактивации вирусного антигена химические и физические.

При химической инактивации вирусов используют разные химические препараты, в том числе формалин (RU 2078816), β-пропиолактон (RU 2537183), димер этиленимина (SU 594771) и другие. Однако надежное подавление инфекционности нередко сопровождается существенным снижением других видов биологической активности, в том числе иммуногенности. В ряде случаев требуется нейтрализация инактивирующих агентов. Кроме того, все инактивирующие агенты, в той или иной степени, вызывают изменения как в нуклеиновой кислоте, так и в белковой оболочке (Сергеев В.А., Сергеев Е.А., Непоклонов В.А., Алипер Т.Н. Вирусы и вирусные вакцины. М.: Библионика, 2007. - С. 206-216, http://bookre.org/reader?file=1483804&pg=207).

К физическим способам инактивации вирусных антигенов относят воздействие повышенной температурой (прогревание) (Земсков М.В., Соколов М.И., Земсков В.М. Основы общей микробиологии, вирусологии и иммунологии. - М., Колос - 1972. - С. 117), гамма-лучами (Сергеев В.А., Сергеев Е.А., Непоклонов В.А., Алипер Т.И. Вирусы и вирусные вакцины. М.: Библионика, 2007. - С. 216-217, http://bookre.org/reader?file=1483804&pg=216).

Тепловая обработка и воздействие инфракрасными лучами на вируссодержащую жидкость не всегда приводят к полной инактивации вирусных патогенов, при этом также происходит частичная инактивация иммуногенных белков.

Большой проникающей способностью обладают гамма-лучи. Инфекционность вирусов при воздействии гамма-лучами теряется быстрее, чем антигенность за счет различных повреждений нуклеиновых кислот, но при этом все-таки сохраняется возможность повреждения белковой оболочки (Сергеев В.А., Сергеев Е.А., Непоклонов В.А., Алипер Т.И. Вирусы и вирусные вакцины. 2007. - С. 216, http://bookre.org/reader?file=1483804&pg=216).

К физическим способам инактивации вирусных антигенов относится также воздействие ультрафиолетовыми лучами (Сергеев В.А., Сергеев Е.А., Непоклонов В.А., Алипер Т.И. Вирусы и вирусные вакцины. М.: Библионика, 2007. - С.217, http://bookre.org/reader?file= 1483804&pg=217.

Изучено действие ультрафиолетового облучения на инфекционность ротавируса обезьяны SA11 9 (Смирнов Ю.А. Действие ультрафиолетового облучения на РНК-содержащие вирусы. Автореф. дисс.на соиск. уч. степени д.м.н. - Москва, 1993. - С.4, 40 http://earthpapers.net/preview/424125/a#?page=1). Показано, что коротковолновое ультрафиолетовое облучение (УФ) оказывает необратимое повреждающее воздействие на геномный аппарат и наиболее мягкое воздействие на белки капсида ротавируса обезьяны SA11 без изменения первичной и вторичной структуры белка.

Ротавирус человека более чувствителен к разрушительному воздействию, нежели обезьяний. Для его инактивации необходим более мягкий способ инактивации, который должен обеспечить необратимое повреждение его репликативного механизма при полном сохранении исходной антигенной структуры.

Целью предлагаемого изобретения является способ инактивации культурального ротавируса человека, обеспечивающий 100% инактивацию инфекционных свойств ротавируса, не изменяющий белковую структуру и сохраняющий его иммуногенные свойства.

Поставленной цели достигают воздействием ультрафиолетового излучения определенной длины волны и экспозиции на ротавирус человека группы А с проведением предварительного высокоскоростного центрифугирования ротавирусной суспензии для удаления компонентов клеточного детрита и обеспечения эффективности инактивации вирусной РНК.

Суспензию ротавируса человека группы А получают путем последовательных пассажей на культуре перевиваемых клеток СПЭВ (культура клеток почки эмбриона свиньи) по общепринятой методике (Вирусология. Методы /под ред. Б. Мейхи.- М., Мир;1988. - С. 207). Монослой клеток СПЭВ выращивают на среде 199 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота (КРС), отмывают 3-х кратно раствором Хенкса. Культуральный ротавирус человека группы А в отдельном флаконе обрабатывают раствором трипсина (20 мкг/мл). На отмытый клеточный монослой в течение 10 минут наслаивают активированный трипсином ротавирус человека. Добавляют поддерживающую среду во флаконы до первоначального объема и выдерживают при 37°С в течение 10 сут. Накопление вирусов в культуре клеток оценивают по цитопатогенному действию (ЦПД) - количеству разрушенных клеток монослоя к общему первоначальному количеству клеток, которое в процентном выражении должно быть равно 100% через 24-36 час от начала заражения. Проводят трехкратное замораживание с последующим оттаиванием ротавирусной суспензии и центрифугируют при 5000 g в течение 30 мин.

Проводят контроль полученной суспензии электронно-микроскопическим методом для подтверждения типичной морфологии ротавирусных частиц и прямым подсчетом частиц в 1 мл культуральной жидкости.

В электронно-микроскопических препаратах видны икосаэдрические частицы размером 60-75 нм, отдельные и в виде скоплений, с уникальной для ротавируса структурой: внешний капсид в виде тонкой пленки, внутренний - с рисунком, похожим на спицы колеса и сердцевиной 30-40 нм. Капсомеры, формирующие внутренний капсид, образуют четкую структуру из пента- и гексомеров.

При прямом подсчете ротавирусных вирионов в препарате в пересчете в 1 мл количество вирионов составляет 10⁸-10⁹ частиц.

Ротавирусная суспензия, полученная по вышеуказанной методике, содержит остаточные компоненты клеточного детрита, что затрудняет проведение полноценной инактивации ротавирусов.

Для очистки от клеточного детрита и посторонних примесей ротавирусную суспензию дополнительно подвергают высокоскоростному центрифугированию при 40000 g в течение 5 мин. Для дальнейшей работы используют надосадочную жидкость, содержащую вирус.

Полученную вируссодержащую жидкость помешают в кювету из кварцевого стекла размером 20 мм × 200. Кювету размещают на расстоянии в 1 мм от поверхности лампы бактерицидного облучателя ОБН-75 УХЛ4 и подвергают воздействию ультрафиолетового излучения с длиной волны 253,7 нм в течение 3, 5, 7, 10 мин.

Эффективность УФ облучения проверяют на клетках СПЭВ, используя типичное культуральное свойство ротавируса - вызывать ЦПД на чувствительных к нему клетках млекопитающих: инактивированный вирус таким свойством не обладает. Монослой перевиваемых клеток СПЭВ заражают облученной вируссодержащей жидкостью и выращивают по вышеуказанной методике. Параллельно ставят контроль 1 - заражают клетки СПЭВ культуральным ротавирусом по той же методике; контроль 2 - культура клеток в поддерживающей среде, предварительно трижды отмытая раствором Хенкса и выращивают при таких же условиях.

Полноту инактивации оценивают в процентах разрушенного монослоя по отношению к первоначальному монослою - до заражения инактивированным ротавирусом. Срок наблюдения - 10 дней. При заражении инактивированным вирусом нарушения монослоя не происходит, клетки продолжают делиться до образования плотного монослоя в течение срока наблюдения. Отсутствие ЦПД в течение срока наблюдения (0% разрушенных клеток монослоя от общего количества клеток) через 36 час от начала заражения и последующем наблюдении за культурой клеток в течение 10 суток является подтверждением полноты инактивации ротавируса и утраты им репродуктивных свойств в культуре клеток. Результаты инактивации ротавируса в зависимости от времени воздействия УФ излучения представлены в табл. 1

Установлено, что воздействие УФ излучения длиной волны 253,7 нм в течение 5 мин полностью лишает ротавирус человека способности размножаться на культуре клеток и разрушать клеточный монослой клеток СПЭВ.

С целью подтверждения стойкого нарушения и отсутствия реверсии патогенных свойств по отношению к культуре клеток инактивированного ротавируса проводят три последовательных заражения клеток СПЭВ по вышеуказанной методике инактивированным вирусом и культуральным (контроль 1) с контролем культуры клеток в поддерживающей среде, предварительно трижды отмытой раствором Хенкса (контроль 2) при одинаковых условиях выращивания. Результаты контроля патогенности инактивированных ротавирусов человека по отношению к культуре клеток приведены в таблице 2.

В последовательных (1, 2, 3) заражениях культуры клеток инактивированным ротавирусом отсутствуют признаки повреждения монослоя клеток. Клетки СПЭВ после заражения инактивированным ротавирусом продолжают делиться до образования плотного монослоя в течение всего срока наблюдения (10 дней), так же, как и в контроле 2 (незараженная культура клеток), что свидетельствует о полной необратимой инактивации вирусных частиц.

Таким образом, инактивированный УФ облучением ротавирус не проявляет инфекционных свойств на культуре клеток СПЭВ в течение нескольких заражений (не реплицируется, не разрушает клетку, не изменяет структуру монослоя клеток), что свидетельствует о стойкой утрате ротавирусом репродуктивной способности.

Способность инактивированного УФ-облучением штамма ротавируса человека образовывать в организме млекопитающих нейтрализующие антитела проверяли в эксперименте на белых лабораторных мышах (9 голов) с 5-кратной иммунизацией инактивированным вирусом в дозе 0,2 мл, чередуя внутримышечное заражение и пероральное, с последующим забором крови у иммунизированных животных. В контрольной группе (5 голов) иммунизацию в таком же режиме проводили поддерживающей средой 199 без сыворотки. Уровень антител к ротавирусу человека определяли следующим образом:

- в реакции непрямой гемагглютинации - РНГА - эритроцитарным диагностикумом определяли рабочую дозу антигена в АЕ (агглютинирующих единицах);

- в реакции торможения непрямой гемагглютинации - РТНГА -установленной рабочей дозой определяли титр антител сывороток иммунизированных животных (Иммунологическая диагностика вирусных инфекций /под ред. Т.В. Перадзе, П. Халонена. - М.: Медицина, 1985. - С. 108; Эпиднадзор за ротавирусными заболеваниями. Методические рекомендации. Утв. Гокомсанэпиднадзором России 28.11.1994;).

Результаты иммунизации представлены в таблице 3.

В результате пятикратной иммунизации животных инактивированным ротавирусом человека группы А установлено, что сыворотки иммунизированных инактивированным ротавирусом животных содержали поствакцинальные нейтрализующие антитела в титрах, не уступающих титрам при иммунизации культуральным ротавирусом.

Морфологию, геномную идентичность инактивированного ротавируса человека проверяют методом электрофореза РНК вируса и электронной микроскопией.

Электрофорез РНК. Электрофорез РНК штаммов ротавируса проводят в 8% разделяющем полиакриламидном геле (ЭФ в ПААГ) в системе Лемли в течение 10 час, сила тока 11 мА, с последующим окрашиванием 0.2% раствором азотнокислого серебра.

Электронная микроскопия. Электронную микроскопию проводят методом негативного контрастирования, используя 0,5% уранилацетат. Сетки с препаратом просматривают при инструментальном увеличении 85000 раз.

Перечень фигур с краткими пояснениями

Фиг. 1. Электрофореграмма РНК ротавируса человека группы А до УФ облучения (А) и после (Б). Представлен результат электрофореза РНК ротавируса человека группы А в полиакриламидном геле (ЭФ в ПААГ). У инактивированного ротавируса (Б) по сравнению с культуральным (А) не изменена молекулярная масса фрагментов РНК, скорость движения фрагментов и не нарушен характер распределения 11 фрагментов РНК ротавируса группы А: 4-2-3-2 в пределах штаммовой вариабельности.

Фиг. 2. Ротавирус человека группы А до УФ облучения (А) и после (Б).

Электронная микроскопия. Негативное контрастирование. Увеличение в 430000 раз. Морфология вирионов инактивированного УФ облучением штамма ротавируса (Б) соответствует морфологии вирионов ротавируса до облучения (А), относящихся к роду Rotavirus семейства Reoviridae (тонкий внешний капсид, внутренний капсид в виде колеса, сердцевина 30-40 нм, капсомеры уложены в виде гексомеров).

Предлагаемым способом инактивированы 3 адаптированных к росту на культуре клеток штамма ротавируса человека группы А, депонированных в Государственной коллекции вирусов ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России (номера депонентов ГКВ №№2727, 2728, 2729).

Изобретение относится к области медицинской вирусологии и биотехнологии. Раскрыт способ инактивации культурального ротавируса человека, заключающийся в том, что суспензию ротавируса человека, полученную путем последовательных пассажей на культуре перевиваемых клеток животных СПЭВ, трехкратного замораживания-оттаивания, центрифугирования при 5000 g в течение 30 минут и контроля цитопатогенного действия на культуру клеток животных, центрифугируют при 40000 g в течение 5 минут; полученную надосадочную вируссодержащую жидкость помещают в кювету из кварцевого стекла размером 20х200 мм, кювету размещают на расстоянии 1 мм от поверхности ламы бактерицидного излучателя ОБН-75 УХЛ4 и подвергают воздействию ультрафиолетового излучения с длиной волны 253,7 нм в течение 5 минут. Изобретение обеспечивает 100% инактивацию инфекционных свойств ротавируса, не изменяет белковую структуру и сохраняет его иммуногенные свойства. 2 ил., 3 табл.

Способ инактивации культурального ротавируса человека, заключающийся в том, что суспензию ротавируса человека, полученную путем последовательных пассажей на культуре перевиваемых клеток животных СПЭВ, трехкратного замораживания-оттаивания, центрифугирования при 5000 g в течение 30 минут и контроля цитопатогенного действия на культуру клеток животных, центрифугируют при 40000 g в течение 5 минут; полученную надосадочную вируссодержащую жидкость помещают в кювету из кварцевого стекла размером 20х200 мм, кювету размещают на расстоянии 1 мм от поверхности ламы бактерицидного излучателя ОБН-75 УХЛ4 и подвергают воздействию ультрафиолетового излучения с длиной волны 253,7 нм в течение 5 минут.