Способ адаптации ротавируса группы А человека к росту на перевиваемых культурах клеток животных Российский патент 2019 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и биотехнологии и касается способа адаптации ротавируса группы А человека к росту на перевиваемых культурах клеток животных для использования при получении диагностических и вакцинных препаратов.

Острые кишечные инфекции, вызываемые ротавирусами (РВИ), несмотря на значительные успехи вирусологии, продолжают оставаться чрезвычайно актуальными, особенно у детей до 2-х лет жизни. Важным условием борьбы с ротавирусной инфекцией является разработка методов и средств специфической диагностики, лечения и профилактики. При этом, если при получении диагностических средств возможно использование штаммов ротавируса животного происхождения, то для профилактических препаратов необходимо применение штаммов ротавируса, выделенных от человека, так как только они будут стимулировать выработку антител к поверхностным антигенам ротавируса человека, отвечающим за вируснейтрализующую активность. К тому же, учитывая периодическую смену доминирующих серотипов и генетических вариантов ротавируса, необходим постоянный мониторинг за циркулирующими штаммами с целью отбора серотипов ротавируса, обладающих высокой степенью гомологии с эпидемическими штаммами человека, для введения их в состав вакцины.

Штаммы ротавирусов человека относятся к труднокультивируемым, поэтому необходима адаптация штамма ротавируса человека к росту на перевиваемых культурах клеток животных. Стандартных способов адаптации, дающих возможность культивировать ротавирусы человека в высоких титрах, до сих пор не существует.

Существует способ адаптации штаммов ротавируса группы А человека, предполагающий адаптацию штаммов ротавирусов на культуре клеток МА 104 (RU 2026345, SU 1687613 А1). Однако при использовании данного способа титр ротавируса достигает всего 5,5 lg ТЦД₅₀/мл, что вообще не позволяет создавать инактивированные вакцины. Живые вакцины с такой концентрацией вирионов неспособны вызвать напряженный иммунитет в детском организме.

Целью изобретения явилась разработка способа адаптации, позволяющего в кратчайшие сроки получать стабильно растущие на перевиваемых культурах клеток штаммы ротавируса человека группы А с концентрацией вирусных частиц не менее, чем 1⋅10⁹ в 1 мл. культуральной жидкости.

Цель достигается тем, что в предлагаемом способе адаптацию и культивирование ротавируса человека группы А проводят на смешанной культуре, состоящей из эпителиоидного и фибробластного типов клеток (СПЭВ и ФК) в соотношении 1:1. При этом в качестве клеток эпителиоидного ряда используют перевиваемую культуру клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ), а в качестве клеток фибробластного типа - перевиваемую культуру фибробластов крысы (ФК).

Способ осуществляют поэтапно.

Этап 1. Подготовка культур клеток

Культуры клеток ведут отдельно, выращивают во флаконах емкостью 250 мл на среде 199 и пересевают 1 раз в неделю с кратностью пересева 1:4-1:6. Полученный монослой клеток обоих типов снимают со стекла смесью раствора Версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 5:1. Полученные суспензии клеток разводят средой 199 в 4 раза и смешивают в одном флаконе емкостью 250 мл при соотношении культур клеток 1:1. Во флаконы добавляют 10% прогретой сыворотки крупного рогатого скота, разливают по флаконам и выдерживают в термостате при +37°С в течение 2 суток. После образования на стекле видимого плотного монослоя клетки готовы к заражению.

Этап 2. Подготовка 10% фекальных суспензий от больных детей

К 1 г фекалий от больных детей, в которых методом электронной микроскопии (ЭМ) обнаружен ротавирус, добавляют 9 мл раствора Хенкса, гомогенизируют стеклянной палочкой в центрифужной пробирке и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 15 мин. Полученный супернатант - 10% фекальную суспензию - используют для заражения.

Этап 3. Заражение смешанной культуры клеток ротавирусом человека

Проводят 3-х кратную отмывку монослоя клеток от ростовой среды раствором Хенкса. Из флаконов с выращенным монослоем смешанных клеток выливают ростовую среду, вносят такой же объем раствора Хенкса. Путем легкого покачивания флакона промывают монослой и выливают раствор Хенкса. Операцию повторяют трижды. Полученную 10% суспензию фекалий с ротавирусом человека обрабатывают раствором трипсина (20 мкг/мл).

Во флакон с монослоем клеток добавляют 0,5 мл обработанной трипсином суспензии и контактируют в течение 10 мин. с клеточным монослоем, добавляют среду 199 без сыворотки до первоначального объема. Флаконы оставляют в термостате при +37°С в течение 10 суток. Через 3-5 дней наблюдают первые признаки нарушения целостности монослоя в виде неспецифической деградации клеток. Через 10 суток все флаконы вне зависимости от наличия или отсутствия цитопатогенного действия вирусной этиологии подвергают замораживанию при -18-20°С в течение 5 час. с последующим оттаиванием при 37°С, повторяя процедуру трижды.

Последующие пассажи проводят по той же схеме, используя инокулят предыдущего пассажа.

К 4-5 пассажу во флаконах обнаруживают ротавирус с типичными морфологическими признаками, присущими всем ротавирусам.

Сравнительные результаты выращивания ротавируса человека на смешанной клеточной культуре и клеточных культурах, использованных в смеси, представлены в таблице 1.

Контроль адаптированных ротавирусов

Контроль выросших ротавирусов осуществляли методами электронной и иммуноэлектронной микроскопии и электрофорезом геномной РНК.

Электронная микроскопия. «Окрашивание» сеток с образцами проводят методом негативного контрастирования с помощью 0,5% уранилацетата. Просматривают под электронным микроскопом при инструментальном увеличении 85000 раз. Концентрация вирионов в поддерживающей среде составила 10⁹-10¹⁰ в мл (Рисунок 1).

Иммуноэлектронная микроскопия. Иммуноэлектронную микроскопию проводят с антиротавирусной сывороткой белых крыс, иммунизированных ротавирусом обезьян SA-11. Сыворотку разводят в 2000 раз и соединяют с культуральным неразведенным ротавирусом на 20 мин., после чего приготавливают препараты на электронномикроскопических сетках. Иммунные комплексы под микроскопом имеют характерный вид «декорированных» частиц (Рисунок 2).

Электрофорез геномной РНК. РНК адаптированных штаммов изучали электрофорезом в 8% полиакриламидном геле (ЭФ в ПААГ) в системе Лемли в течение 10 час с последующим окрашиванием 0.2% раствором азотнокислого серебра. Гены имели фрагментированное строение с распределением сегментов, характерным для ротавирусов группы А: 4-2-3-2 (11 генов), со штаммовой вариабельностью, не выходящей за пределы каждого сегмента (рис. 3)

Краткое описание рисунков

Рисунок 1. Представлена электронно-микроскопическая фотография ротавируса человека группы А. Подтверждает принадлежность данного вируса к семейству Reoviridae, роду Rotavirus. Негативное контрастирование, увеличение 430000 раз.

Рисунок 2. Показано скопление агрегированных антиротавирусной сывороткой культуральных ротавирусов человека при негативном контрастировании и увеличении в 190000 раз.

Рисунок 3. Представлены результаты электрофореза в 8% полиакриламидном геле РНК ротавирусов человека группы А и штамма ротавируса обезьян SA-11, относящегося к группе А. Показано, что распределение сегментов генома ротавируса человека (11 пар), характерно для ротавирусов группы А (4-2-3-2), что подтверждает их принадлежность к ротавирусам группы А.

Предлагаемым способом к росту на культуре клеток адаптированы 6 штаммов ротавируса человека, три из которых депонированы в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России, номера депонентов ГКВ №№2727, 2728, 2729. Количество вирионов в поддерживающей среде до лиофилизации, по данным электронной микроскопии, составило не менее 1⋅10⁹ в 1 мл.

Геном всех адаптированных штаммов ротавируса человека содержит 11 сегментов РНК, состоящих из 4 групп: 1 группа - 4 сегмента, 2 группа- 2 сегмента, 3 группа - 2 сегмента 4 группа - 2 сегмента. По распределению сегментов РНК после электрофореза все эти штаммы можно однозначно отнести к группе А ротавируса человека.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ адаптации ротавируса человека группы А к росту на перевиваемых культурах клеток животных, заключающийся в том, что адаптацию и последующее культивирование ротавируса человека группы А проводят путем последовательных пассажей на смешанной культуре, состоящей из эпителиоидного и фибробластного типов клеток в соотношении 1:1; в качестве клеток эпителиоидного ряда используют перевиваемую культуру клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ), фибробластного типа - перевиваемую культуру фибробластов крысы (ФК), выращенные раздельно на среде 199; полученный монослой клеток обоих типов снимают со стекла смесью раствора Версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 5:1, разводят средой 199 в 4 раза, смешивают при соотношении культур клеток 1:1, добавляют 10% прогретой сыворотки крупного рогатого скота, выдерживают в термостате при +37°С в течение 2 суток; отмывают 3-кратно монослой смеси клеток от ростовой среды раствором Хенкса, добавляют 0,5 мл обработанной раствором трипсина (20 мкг/мл) 10% фекальной суспензии, содержащей ротавирус человека, и контактируют в течение 10 мин; добавляют поддерживающую среду 199 без сыворотки до первоначального объема и выдерживают в термостате при +37°С в течение 10 суток; замораживают при -18-20°С в течение 5 ч с последующим оттаиванием при 37°С, повторяя процедуру трижды; последующие пассажи проводят по той же схеме, используя инокулят предыдущего пассажа. Изобретение позволяет получить стабильно растущие на перевиваемых культурах клеток штаммы ротавируса человека группы А с концентрацией вирусных частиц не менее чем 1⋅10⁹ в 1 мл. культуральной жидкости, имеющие типичную морфологию ротавирусных частиц и двунитевую сегментированную РНК. 1 табл., 3 ил.

Способ адаптации ротавируса человека группы А к росту на перевиваемых культурах клеток животных, заключающийся в том, что адаптацию и последующее культивирование ротавируса человека группы А проводят путем последовательных пассажей на смешанной культуре, состоящей из эпителиоидного и фибробластного типов клеток в соотношении 1:1; в качестве клеток эпителиоидного ряда используют перевиваемую культуру клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ), фибробластного типа - перевиваемую культуру фибробластов крысы (ФК), выращенные раздельно на среде 199; полученный монослой клеток обоих типов снимают со стекла смесью раствора Версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 5:1, разводят средой 199 в 4 раза, смешивают при соотношении культур клеток 1:1, добавляют 10% прогретой сыворотки крупного рогатого скота, выдерживают в термостате при +37°С в течение 2 суток; отмывают 3-кратно монослой смеси клеток от ростовой среды раствором Хенкса, добавляют 0,5 мл обработанной раствором трипсина (20 мкг/мл) 10% фекальной суспензии, содержащей ротавирус человека, и контактируют в течение 10 мин; добавляют поддерживающую среду 199 без сыворотки до первоначального объема и выдерживают в термостате при +37°С в течение 10 суток; замораживают при -18-20°С в течение 5 ч с последующим оттаиванием при 37°С, повторяя процедуру трижды; последующие пассажи проводят по той же схеме, используя инокулят предыдущего пассажа.