Способ оценки риска тяжелой формы акне на основе определения экспрессии генов IL1RN и IL10 Российский патент 2020 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматовенерологии, иммунологии, и может быть использовано для диагностики тяжелой формы акне.

Акне - это хроническое воспалительное заболевание кожи, характеризующееся комедонами, папулами, пустулами, узлами и кистами с приемущественной локализацией на коже лица, нередко сопровождающийся тяжелыми психо-эмоциональными расстройствами, вплоть до суицидальных попыток у 20% подростков (Демина О.М. Угревая болезнь: комбинированная лазерная и фотодинамическая терапия: руководство для врачей / Демина О.М., Картелишев А.В. // М.: БИНОМ, 2017. - 160 с.; Румянцев А.Г., Демина О.М., Райкина Е.В. Патогенетический механизм воспаления при акне // Российский иммунологический журнал. - 2020. - Т. 23. - №1. - С. 19 -26.).

Заболеваемость акне достаточно высока и составляет по данным разных авторов до 90% пациентов в возрасте 12-24 лет. При этом у большинства больных развиваются легкие и средне-тяжелые формы акне, однако у 10% регистрируются тяжелые и очень тяжелые варианты течения дерматоза.

Показано, что этнические группы несущественно различаются по распространенности акне, частоте клинических форм, однако имеется мнение о наличии разных ассоциаций изменений генов с развитием акне (Petridis С., Navarini A.A., Dand N. et al. Genome-wide meta-analysis implicates mediators of hair follicle development and morphogenesis in risk for severe acne. Nat Commun 2018; 9:5075).

Одним из методов диагностики кожных болезней является молекулярно-генетическое исследование с анализом ДНК пациента.

Так, полногеномное исследование полиморфизмов, например, в китайской популяции хань выявили 3 однонуклеотидные замены, ассоцированные с тяжелым течением акне, среди которых было идентифицировано два новых локуса предрасположенности в 11p11.2 (DDB2, rs747650 и rs1060573) и 1q24.2 (SELL, rs7531806), которые регулируют метаболизм андрогенов, воспалительные процессы и развитие рубцов при тяжелом тячении акне (Не L., Wu W.J., Yang J.K. et al. Two new susceptibility loci 1q24.2 and 11p11.2 confer risk to severe acne. Nat Commun 2014; 5:2870). В результате метаанализа была подтверждена ассоциация полиморфизма -308 G/A гена TNFα и акне (Yang J.K., Wu W.J., Qi J., He L., Zhang Y.P. TNF-308 G/A polymorphism and risk of acne vulgaris: a meta-analysis. PLoS One. 2014 Feb 3;9(2) e87806. doi: 10.1371/journal.pone.0087806. eCollection 2014). Среди провоспалительных цитокинов также исследовались полиморфизмы гена IL10 (IL10, 1082 A/G), IL4 (IL4, -590 Т/С), но достоверной связи с акне не отмечено. Хотя анализ полиморфизма IL4R (Q551R A/G) показал более высокую частоту встречаемости гомозиготы GG при акне (Al-Shobaili Н.А., Salem Т.A., Alzolibani А.А., Robaee А.А., Settin А.А. Tumor necrosis factor-α -308 G/A and interleukin 10 -1082 A/G gene polymorphisms in patients with acne vulgaris. J Dermatol Sci. 2012 Oct; 68(1):52-5).

Описан способ диагностики псориаза, при котором в цельной крови исследуют аллельный полиморфизм С-597А гена IL10, а в сыворотке крови определяют уровень цитокина IL-10 (RU 2620561 С1, 26.05.2017). При наличии псориатической триады у больного утром натощак производят забор крови из локтевой вены для определения уровня цитокина IL-10 и исследования полиморфизма С-597А гена IL10.

На основании результата анализа составляют клиническую интерпретацию, при этом у больного диагностируют псориаз при выявлении генотипа А/А-597IL10 и уровня цитокина IL-10 ниже 1,9 пг/мл.

Недостатком способ является проведение исследования на выявление точечного конкретного полиморфного аллеля, при отсутствии которого диагноз псориаз не устанавливается. Однако, известно, что в одном и том же гене могут возникать различные точечные полиморфизмы и мутации de novo, т.е. ранее не описанные в базах данных клинических исследований. Но, учитывая, что ген IL10 кодирует патогенетически значимый цитокин - IL10, то наличие других изменений этого гена не может быть выявлено предложенным способом, следовательно, не подтверждает клинический диагноз.

Показано, что профилирование экспрессии генов в коже больных акне может служит показателем генетической предрасположенности к акне, а также являться основой для создания терапевтических средств, модулирующих экспрессию выявленных генов.

Описан метод диагностики угрей с использованием биомаркеров поражений и метод скрининга in vitro для выявления его модуляторов (ЕР 2124058 (А1), 25.11.2009). Данный способ осуществляется путем профилирования экспрессии генов в коже in vitro, полученной из области пораженной кожи при акне и области нормальной кожи, с использованием микросхем Affymetrix U133A. Метод осуществляли следующим образом: образцы кожи подвергали быстрой заморозке и подвергали индивидуальному криосекционированию для облегчения выделения РНК.

Метод диагностики включает этап сравнения экспрессии активности генов или биомаркеров / продуктов экспрессии генов в биологическом образце пациента с контрольным образцом субъекта. Продукты экспрессии генов / биомаркеры (например, белки) могут быть определены любыми подходящими методами, такими как вестерн-блот, IHC, MAS спектрометрический анализ (MAldi-TOF и LC/MS анализ), радиоиммуноанализ (RIA), Elisa или любым другим методом, известным специалисту в данной области или дозировке мРНК любыми подходящими способами, хорошо известными специалисту в данной области.

Другим вариантом осуществления изобретения является способ определения чувствительности пациента in vitro к развитию угревой болезни и/или связанных с угревой болезнью нарушений, который включает этап сравнения уровней экспрессии генов или уровней продуктов экспрессии генов или активности биомаркеров / продуктов экспрессии генов.

В вышеупомянутом способе гены с наибольшим кратным увеличением экспрессии в очагах поражения акне включали матричные металлопротеиназы ММР-1 и ММР-3, которые имели 92 и 64-кратные более высокие паттерны экспрессии соответственно. Другие гены, значительно повышающие активность, включали противовоспалительные цитокины IL-8 (в 52 раза) и CXCL-2 (в 16 раз). Также было отмечено значительное увеличение экспрессии хемокинового рецептора 1 (CCR1), рецептора IL-7, рецептора IL-13 и членов семейства IL-1 5 и 9. Экспрессия нескольких антимикробных пептидов была также значительно увеличена в очагах поражения акне по сравнению с нормальной кожей у этих же пациентов. К ним относятся HBD-4 и гранулизин, которые были активированы более чем в 33 раза и в 2 раза соответственно. Также были активированы гранзим В более чем в 10 раз при поражениях угрей по сравнению с нормальной кожей, в то время как уровень GPR65 был увеличен примерно в 2,7 раза.

Недостатком описанного способа является определение уровня предполагаемых биомаркеров экспрессии генов, т.е. происходит оценка результата работы гена и/или группы генов, которые предположительно вовлечены в патогенез акне. При этом не учитывается, во-первых, что данные биомаркеры могут кодироваться совокупностью различных генов, не участвующих в патогенезе акне. Во-вторых, на синтез продуктов экспрессии генов оказывают влияние внешние (средовые) и внутренние (сопутствующая патология) факторы, что в целом не может служить достоверным критерием диагностики собственно заболевания кожи, в частности акне. Также метод является трудоемким из-за необходимости проводить биопсию кожи с последующим поэтапным многокомпонентным анализом экспрессии генов, что ограничивает применение данного способа у пациентов с акне, локализация высыпания при котором в более чем 90% случаев на коже лица.

Ближайшим аналогом является способ диагностики акне путем мониторинга увеличения эпителиальной адгезии за счет повышения уровня экспрессии LAMC2 как фактора риска среднетяжелого и тяжелого течения акне и скрининга эффективности терапии акне (WO 2018046999 (А1), 15.03.2018 - прототип).

В качестве биологического образца используются образец жидкости (кровь, лимфа, интерстециальная жидкость) или образец ткани (биоптат кожи). ДНК генотипировали с использованием массива генотипирования Illumina Human OmniExpressExome. В результате в качестве маркера был идентифицирован ген, который находится в непосредственно близости к геномному локусу 1 q25.3 SNP 1: 183167051_A_G аллель. Этот маркер представляет собой ген ламинина гамма 2 (γ2) (LAMC2) и его генный продукт, гамма-субъединица ламинина 2 (γ2) (LAMC2). Показано, что аллель SNP 1: 183167051_A_G, модулирует и предпочтительно увеличивает и/или усиливает экспрессию и/или активность LAMC2 и/или LAMC2, что свидетельствует о диагнозе и прогнозе акне среднетяжелого и тяжелого течения. В некоторых вариантах осуществления маркер, предпочтительно другой аллель в SNP 1: 183167051, модулирует и предпочтительно уменьшает и/или ингибирует экспрессию и/или активность LAMC2 и/или LAMC2, что свидетельствует об эффективном лечении и успешном скрининге эффективного кандидата для лечения акне среднетяжелого и тяжелого течения.

Недостатком данного способа является вариативность выбора биологического образца, что не позволяет оценить валидность и дать сравнительную характеристику полученным результатам у разных пациентов.

Известно, что одним из важных цитокинов в патогенезе акне является интерлейкин 1α (IL1α), который кодируется геном интерлейкин 1А (ILIA). IL1α один из многофункциональных цитокинов, которые координируют работу врожденного и адаптивного звеньев иммунной системы. Развитие воспалительной реакции обусловлено как действие собственно IL1α, так и нарушением его регуляции, в частности антагониста его рецептора IL-1ra, кодируемого геном IL1RN (Румянцев А.Г., Демина О.М., Райкина Е.В. Патогенетический механизм воспаления при акне // Российский иммунологический журнал. - 2020. - Т. 23. - №1. - С. 19 -26).

Ген IL1RN картирован в области 2q14.1 и в настоящее время описано четыре изоформы этого гена. Ген IL1RN продуцирует 2 формы: внутриклеточную (icIL1RN) и секретируемую (sIL1RN), которые контролируются различными промоторными областями.

В ряде исследований было показано значение полиморфизма гена IL1RN при различных заболеваниях. При изучении полиморфизма IL1RN переменным числом тандемных повторов (variable number of tandem repeat,VNTR) было выделено 5 разновидностей генотипов. VNTR гена IL1RN - это тандем из повторяющейся последовательности длиной 86 нуклеотидов во 2 интроне гена IL1RN, который описан как фактор восприимчивости для ряда аутоиммунных, воспалительных и инфекционных заболеваний. Приводятся данные об ассоциации витилиго с VNTR гена IL1RN (rs2234663) (Singh М., Mansuri M.S., Jadeja S.D., Marfatia Y.S., Begum R. Association of interleukin 1 receptor antagonist intron 2 variable number of tandem repeats polymorphism with vitiligo susceptibility in Gujarat population. Indian J Dermatol Venereol Leprol. 2018 May-Jun; 84(3):285-291. doi: 10.4103/ijdvl.IJDVL_1_17).

При исследовании полиморфизма VNTR гена IL1RN y больных акне было выявлено 3 вида аллелей: наиболее часто встречающийся аллель 1, из четырех повторов тандема, аллель 2, содержащий два повтора, и аллель 3, включающий пять тандемных повторов. При этом не было выявлено статистически значимой разницы между группами больных и контроля в распределении частот различных генотипов и аллелей. Эти результаты обосновывают вывод авторов об отсутствии ассоциации VNTR полиморфизма гена IL1RN и акне (Szabo K., Tax G., Kis K. et al. Interleukin-1A+4845(G>T) polymorphism is a factor predisposing to acne vulgaris. Tissue Antigens 2010; 76:411-15).

Одним из плеотропных цитокинов при иммунорегуляции и воспалении является интерлейкина 10 (IL10). Имеются данные об ассоциации полиморфизма гена IL10 с развитием ряда дерматозов. Так, показано, что полиморфизмы IL10 -819С/Т, -1082G/A и -592С/А и гаплотипы связаны с восприимчивостью к системной красной волчанке, повышенной активностью заболевания и повышенные уровни IL10 (Mohammadi S., Saghaeian J.M., Zare Ebrahimabad M., Eghbalpour F., Abdolahi N., Tabarraei A., Yazdani Y.. Interleukin 10 gene promoter polymorphisms (rs1800896, rs1800871 and rs1800872) and haplotypes are associated with the activity of systemic lupus erythematosus and IL10 levels in an Iranian population. / Int J Immunogenet. 2019 Feb;46(1):20-30. doi: 10.1111/iji.12407. Epub 2018 Nov 15). Показано, что полиморфизм гена IL10 -1082G/A является наиболее распространенным SNP IL10 связаным с риском развития псориаза, a SNP -819С/Т и -592С/А являются наименее распространенными полиморфизмами, связанными с риском развития псориаза (Isac L., Jiquan S. Interleukin 10 promotor gene polymorphism in the pathogenesis of psoriasis. Acta Dermatovenerol Alp Pannonica Adriat. 2019 Sep; 28(3): 119-123). Другие авторы не выявили взаимосвязи аналогичных полиморфизмов гена IL10 -1082 A/G, - 819Т/С и - 592А/С с риском развития атопического дерматита (Qi Y., Kong J., Не J. Genetic relationship between IL-10 gene polymorphisms and the risk of clinical atopic dermatitis. BMC Med Genet. 2019 May 17; 20(1):83. doi: 10.1186/s12881-019-0817-8). Приводятся сведения о роли IL10 при воспалении у больных акне. Известно, что IL10 кодируется геном IL10. Показано, что IL10 секретируется главным образом моноцитами и, в меньшей степени, лимфоцитами и имеет плейотропное действие при иммунорегуляции и воспалении. Он оказывает ингибирующее действие на экспрессию цитокинов Th1, АН МНС класса II и костимулирующих молекул на макрофагах. Это также увеличивает выживаемость В-клеток, пролиферацию и выработку антител. IL10 способен угнетать активность NF-каппа В, а также участвует в регуляции сигнального пути JAK-STAT. Ген IL10 картирован в области 1q32.1.

Противоречивые данные результатов молекулярно-генетических методов исследования свидетельствует о необходимости поиска надежных и значимых генетических маркеров тяжелого течения акне, что является актуальной проблемой ранней диагностики и превентивной медицины.

Задачей настоящего изобретения является повышение достоверности выявления генетической предрасположенности к тяжелому течению акне на основании выявления полиморфизмов генов IL1RN и IL10.

Технический результат изобретения - выявление надежных и значимых генетических маркеров тяжелого течения акне.

Патентуемый способ прогнозирования риска тяжелого течения акне включает отбор цельной венозной крови больного, выделение ДНК и проведение молекулярно-генетического исследования. Молекулярно-генетическое исследование ДНК проводят методом высокопроизводительного секвенирования, определяют полиморфизм генов IL10 и IL1RN, и при выявлении полиморфизма rs145922845, rs768132338, rs146520891, rs45587633, rs3024494, rs3024492, rs3021094 гена IL10 и полиморфизма rs928940, rs2232354 и rs380092 гена IL1RN, прогнозируют риск тяжелого течения акне.

Способ осуществляют следующим образом.

У больного акне утром натощак производят забор венозной крови из кубитальной вены в стандартных условиях в пластиковые пробирки системы «Vacutainer ®» с консервантом этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) (0,5М раствор, рН=8,0) в объеме 5 мл.

Для молекулярно-генетического исследования производят выделение ДНК из цельной венозной крови больного с использованием стандартного набора CellSep Advanced Kit. (DiaSorin Ireland Ltd., Ирландия) и автоматической станции Arrow NorDiag Arrow (DiaSorin) («NorDiag Asa», Норвегия).

Молекулярно-генетическое исследование проводится методом высокопроизводительного секвенирования ДНК - секвенирование «нового поколения» (next-generation sequencing, NGS).

Основные этапы NGS секвенирования:

1. Выделение ДНК;

2. Приготовление библиотеки ДНК;

3. Гибридизационное обогащение смесью праймеров с последующей полимеразной цепной реакцией;

4. Секвенирование на секвенаторе MiSeq («Illumina», США);

5. Автоматический анализ исходных данных;

6. Фильтрация полученных вариантов с помощью программ-аннотаторов, анализ отфильтрованных вариантов.

Анализ ДНК пациента проведится на платформе NextSeq Illumina методом парно-концевого чтения. Для оценки популяционных частот выявленных вариантов используются данные международного проекта gnomAD Exomes (ЕхАС) для экзонных варинатов и базы gnomAD Genomes для интронных вариантов. Для компьютерной оценки патогенности найденных миссенс-вариантов применяются программы предсказания патогенности замен аминокислот (SIFT, PolyPhen-2, PROVEAN, UMD Predictor). Для компьютерного предсказания эффекта изменений в сайтах сплайсинга или прилежащих к сайту сплайсинга участках используются программы Human Splicing Finder и NNSplice.

Для оценки клинической релевантности выявленных вариантов используются база данных Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), Human Gene Mutation Database (HGMD), Leiden Open Variation Database (LOVD), Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC), специализированные базы данных по отдельным заболеваниям.

При выявлении полиморфизмов гена IL10: rs145922845, rs768132338, rs146520891, rs45587633, rs3024494, rs3024492, rs3021094 и гена IL1RN rs928940, rs2232354 и rs380092 диагностируют ассоциацию с развитием тяжелой формы акне.

Клинический пример 1.

Пациентка А., 24 лет.

Поступила с жалобами на высыпания на коже лица и спины. Предварительный диагноз: акне, тяжелое течение.

Проведено исследование по заявленному способу.

Данные объективного осмотра: патологический кожный процесс распространенный симметричный подостровоспалительный, локализован на коже лица и спины, представлен множественными открытыми и закрытыми комедонами, воспалительным папулами, пустулами, атрофическими рубцами.

При молекулярно-генетическом исследовании методом NGS выявлены полиморфизмы гена IL10: rs145922845, rs768132338, rs146520891, rs45587633, rs3024494, rs3024492, rs3021094 и гена IL1RN rs928940, rs2232354 и rs380092, что позволяет диагностировать ассоциацию с тяжелым течением акне.

Клинический пример 2.

Пациент Р., 18 лет.

Поступил с жалобами на высыпания на коже лица и спины. Предварительный диагноз: акне, тяжелое течение.

Проведено исследование по заявленному способу.

Данные объективного осмотра: патологический кожный процесс распространенный симметричный островоспалительный, локализован на коже лица, спины груди, представлен множественными открытыми и закрытыми комедонами, воспалительным глубокими папулами, пустулами, узлами, сливающимися в конгломераты, на фоне застойно-синюшной эритемы, множественными атрофическими рубцами.

При молекулярно-генетическом исследовании методом NGS выявлены полиморфизмы гена IL10: rs145922845, rs768132338, rs146520891, rs45587633, rs3024494, rs3024492, rs3021094 и гена IL1RN rs928940, rs2232354 и rs380092, что позволяет диагностировать ассоциацию с тяжелым течением акне.

Были использованы образцы периферической крови 50 неродственных больных акне и 20 условно здоровых лиц, 42 - мужчины и 28 женщин в возрасте от 15 до 46 лет (медиана - 22,1 год).

При молекулярно-генетическом исследовании методом NGS у больных акне выявлены полиморфизмы гена IL10: rs145922845 (OR=1,22), rs768132338 (OR=1,22) и rs146520891 (OR=1,22), rs45587633 (OR=1,22), rs3024494 (OR=2,48), rs3024492 (OR=1,06), rs3021094 (OR=2,18) и гена IL1RN rs928940 (OR=1,65), rs2232354 (OR=2,39) и rs380092 (OR=1,28), что позволяет диагностировать ассоциацию с тяжелым течением акне.

Вышеприведенные примеры свидетельствуют о возможности использования заявленного способа для выявления генетической предрасположенности человека к развитию тяжелой формы акне, а именно оценки риска тяжелой формы акне.

Таким образом, способ информативен, расширяет арсенал способов диагностики акне, отвечает современным требованиям к методам лабораторной диагностики и может быть рекомендовани для клинической практике.

Изобретение относится к области биотехнологии. Для прогнозирования риска тяжелого течения акне производят отбор цельной венозной крови больного, выделение ДНК и проведение молекулярно-генетического исследования. Молекулярно-генетическое исследование ДНК проводят методом высокопроизводительного секвенирования, определяют полиморфизм генов IL10 и IL1RN, и при выявлении полиморфизма rs145922845, rs768132338, rs146520891, rs45587633, rs3024494, rs3024492, rs3021094 гена IL10 и полиморфизма rs928940, rs2232354 и rs380092 гена IL1RN прогнозируют риск тяжелого течения акне. Изобретение позволяет выявить надежные и значимые генетические маркеры тяжелого течения акне. 2 пр.

Способ прогнозирования риска тяжелого течения акне, включающий отбор цельной венозной крови больного, выделение ДНК и проведение молекулярно-генетического исследования,

отличающийся тем, что молекулярно-генетическое исследование ДНК проводят методом высокопроизводительного секвенирования, определяют полиморфизм генов IL10 и IL1RN, и при выявлении полиморфизма rs145922845, rs768132338, rs146520891, rs45587633, rs3024494, rs3024492, rs3021094 гена IL10 и полиморфизма rs928940, rs2232354 и rs380092 гена IL1RN прогнозируют риск тяжелого течения акне.