АНТИДЕПРЕССАНТНОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2021 года по МПК C07K5/11 A61K38/07 A61P25/24 

Изобретение относится к области биохимии, конкретно к новому биологически активному соединению - пептиду, обладающему антидепрессантным действием против нарушений деятельности головного мозга, и может быть использовано для создания лекарственного препарата для терапии депрессивного состояния больных.

Современные социоэкономические условия отличаются обилием стрессовых ситуаций и характеризуются высокой распространенностью психоневрологических заболеваний, при этом неуклонно растет доля пограничных психических расстройств, сопровождающихся тревожно-депрессивной симптоматикой, когнитивным дефицитом, астено-невротическими проявлениями, снижением иммунитета, физической и умственной работоспособности, для профилактики и лечения которых применяются антидепрессанты.

Под антидепрессантами понимаются психотропные лекарственные средства, применяемые для лечения депрессии, оказывая влияние на уровень нейромедиаторов, в частности серотонина, норадреналина и дофалина, улучшая настроение пациента, уменьшая тоску, вялость, напряжение и т.п. [wikipedia.org/wik/антидепрессанты]. При этом, поддерживая уровень серотонина, некоторые антидепрессанты способны за счет замедления процессов образования бляшек в головном мозге способствовать улучшению состояния больных такими заболеваниями, как болезнь Альцгеймера, особенно перенесших инсульт [http:www.patronage.ru/news].

Антидепрессанты делят на препараты, ингибирующие моноаминоксидазу и тем самым тормозящие дезаминирование (инактивацию) норадреналина и серотонина, и препараты, которые блокируют обратный нейрональный захват этих медиаторов (т.наз. трициклич. антидепрессанты). Основные препараты - производные гидразина, из которых практическое применение имеет ниаламид, имизин, амитриптилин, а также азафен. Получены также лекарственные, средства, отличающиеся по структуре и механизму действия от "типичных" антидепрессантов. К числу таких "атипичных" антидепрессантов относятся пиразидол, миансерин, людиомил, иприндол, тразодон, инказан и другие. Предполагают, что они влияют на чувствительность постсинаптических рецепторов к действию нейромедиаторов [http://www.xumuk.ru/en-cyklopedia/310.html]. Однако, как правило, вышеуказанные антидепрессанты обладают недостаточной клинической эффективностью, медленным развитием клинически значимого эффекта, низкими избирательностью и широтой терапевтического действия, достаточно высокой токсичностью, серьезными побочными эффектами, что в значительной мере ограничивает их использование в широкой медицинской практике и сужает область возможного применения. В частности, известным церебропротекторным средством является пирацетам, который имеет невысокую эффективность и побочные явления - может вызвать нарушение сна, повышение судорожной готовности, неспецифическое возбуждение. [RU 2327480, 2008].

Данные причины диктуют необходимость поиска и разработки новых высокоэффективных и малотоксичных антидепрессионных лекарственных препаратов с широким спектром активности, позволяющим осуществлять фармакологическую коррекцию совокупности симптомов психоневрологических заболеваний без полипрагмазии и безопасных при длительном применении. Важность такого поиска возрастает в связи с тем, что многие препараты против депрессии перспективны для лечения болезни Альцгеймера (БА) и аналогичных патологий головного мозга. [RU 2327480, 2008].

В настоящее время установлено, что структурные и гистопатологические изменения, наблюдаемые в мозге заболевших болезнью Альцгеймера, представляют собой нейрофибриллярные пучки и отложения амилоида. Предполагают, что связывание рецептора конечных продуктов гликозилирования с амилоидом, способствует проникновению последнего через гематоэнцефалический барьер центральной нервной системы и накоплению в виде амилоидных бляшек - основной причины болезни Альцгеймера [Leclerc Е., Sturchler Е., Vetter S. The S100B/RAGE Axis in Alzheimer's Disease. Cardiovasc. Psychiatry Neurol. 2010. V. 2010. P. 1-11]. Главным компонентом наиболее распространенных амилоидных нейритных бляшек является полипептид из 40-42 аминокислот, называемый амилоидным пептидом Аβ4, который образуется в результате протеолиза мембранных гликопротеинов, обозначаемых белками-предшественниками амилоидного пептида Аβ4 (βАРР) (Price, D.L. andall, Drug Development Research (1985) 5:59-68), однако от использования пептида для лечения БА отказались в связи с вероятностью возникновения таких осложнений, как энцефалит [Scrip Daily Online, 25 Feb 2002, S007455320, The Scientist 16[7]: 22, April 1, 2002].

Среди других пептидов, предлагаемых для лечения деменции и БА, следует отметить пептиды, разработанные ИБХ РАН и состоящие из последовательности аминокислот Glu-Trp-Asp-Leu-Val-Gly-Ile-Pro-Gly-Lys-Arg-Ser-Glu-Arg-Phe-Tyr-Glu-Cys-Cys-Lys-Glu [RU 2372355, 2009] и Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala [RU 2558242, 2015], а также полипренолы [RU 237480, 2008] общей формулы

где n=8-20.

Последний может рассматриваться как аналог по структуре отношению к заявляемому средству. Препарат показал эффективность при воздействии на поведение экспериментальных животных, однако его действие недостаточно эффективно.

В качестве препарата сравнения в экспериментах использовался имипрамин [https://ru.wikipedia.org/wiki/Имипрамин] - один из основных представителей трициклических антидепрессантов.

Заявляемое изобретение решает задачу расширения ассортимента антидепрессивных препаратов, обладающих лечебным действием против болезни Альцгеймера, в частности, создание препарата, обладающего лечебным действием на больных болезнью Альцгеймера, осложненных депрессивным состоянием.

Поставленная задача решается за счет применения пептида общей формулы ацетил- D-LYS -LYS-ARG-ARG-амид.

Проведенные исследования показали, что пептид проявляет нормализующую активность на моделях деменции, в том числе БА у крыс, что обусловлено его уникальными первичной структурой и пространственным строением вследствие присутствия аминокислотных остатков в различных стереоконфигурациях.

Тетрапептид получали стандартной технологией пептидного синтеза на твердой фазе [J.M. Stewardand, J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis",W.H. FreemanCo., San Francisco, 1969] с последующим отщеплением защитных групп и очисткой конечного продукта.

Для синтеза пептида в реакционный сосуд загружали 0.2 г N-трет-бутилоксикарбонил--мезитиленсульфонил-аргинил-метилбензгидрил аминополимера в 10 мл диметилформамида. Пептидную цепь далее наращивали с С-конца по программе, приведенной в таблице 1.

При положительном нингидриновом тесте, повторяли конденсацию, начиная с п. 3. Полученный пептидил-полимер обрабатывали безводным фтористым водородом и выделяли грубый продукт в соответствии с программой, приведенной в таблице 2.

Полученные грубые продукты подвергали очистке обращенно-фазовой высокоэффективной хроматографией на колонке С18 Nova Pack, 19×300 мм, 300 в градиенте 2-50% ацетонитрила в 0.1% трифторуксусной кислоте. Содержание пептида - по данным оптической плотности - составляло 99,5%. Аминокислотный состав пептида и его молекулярная масса соответствовали теоретическим.

Структура и гомогенность полученного пептида была подтверждена данными высокоэффективной жидкостной хроматографии, аминокислотного и масс-спектрального анализов.

Свойства тетрапептида иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Исследование андидепрессантных свойств тетрапептида (LYS) на модели резерпиновой депрессии.

Эксперимент был выполнен на 16 белых половозрелых рандомбредных крысах-самцах массой 180-220 г. Оценивали антидепрессантную активность нейропротектора тетрапептида (LYS) в дозе 0,02 мг/кг интраназально (и/н). В качестве препарата сравнения использовали классический трициклический антидепрессант имипрамин в дозе 15 мг/кг (мелипрамин, EGIS, Венгрия) внутрибрюшинно (в/б). Эксперимент выполняли в 2 этапа. На 1 этапе интактных животных распределяли по группам: 1 - группа контроля (n=5), 2 - группа «имипрамин» (15 мг/кг в/б, n=6), 3 - группа «тетрапептида (LYS)» (0,02 мг/кг и/н, n=5). За 25-30 мин до начала эксперимента животным вводили соответствующий препарат. Животным группы контроля в/б и и/н вводили 0,9% раствор NaCl в объеме, эквивалентном объему лекарственных средств. После этого у животных всех групп в тесте открытое поле (ОП) в течение 3 мин оценивали локомоторную (количество пересеченных квадратов), ориентировочно-исследовательскую (количество вертикальных стоек и обследованных отверстий) активность, а также эмоциональные реакции (фекальные болюсы, уринации, груминг). Показатели депрессивности у животных (латентное время иммоблизации, количество ее эпизодов, а также их совокупная продолжительность) оценивали в плавательном тесте Порсолта (ПТП) в течение 6 мин. В последующие 2 суток все препараты вводили в тех же дозах 1 раз в день, последний раз - за 30 мин до депрессогенного симпатолитикарезерпина. Резерпин вводили на 3 сутки (2 этап эксперимента) в дозе 4 мг/кг в/б (в виде стабилизированной твином-80 суспензии). Через 6-7 ч оценивали показатели животных всех 3 групп в ОП и ПТП.

Результаты обрабатывали статистически. В случае нормального распределения данных использовали параметрический t-критерий Стьюдента, в случае его отсутствия - непараметрический Т-критерий Манна-Уитни. При учете результатов в альтернативной форме (наличие/отсутствие признака) применяли угловое преобразование Фишера ϕ. Парный Вилкоксона использовали для внутригрупповой статистической оценки изменений показателей тестов животных до и после моделирования депрессии. Результаты считали статистически значимыми при р≤0,05. Результаты теста ОП приведены в табл. 3.

Примечание. И - интактные животные, Р - резерпиновая депрессия; р≤0,05: * - с группой контроля, ^ - с группой имипрамина, ® - между показателем до и после моделирования депрессии; в скобках - % изменения показателя животных с резерпиновой депрессией против соответствующего показателя интактных животных.

Как следует из данных табл. 3, у интактных животных тетрапептид снижает все виды активности в ОП, а также эмоциональные реакции. Имипрамин также проявляет тенденцию к снижению локомоторной и ориентировочно-исследовательской активности интактных животных. Уровень эмоциональных реакций под его влиянием, наоборот, возрастает (в 2,9 раза, р<0,05 по сравнению с группой контроля). Таким образом, в условиях ОП у животных без депрессии тетрапептида проявляет седативные свойства, более выраженные, чем у препарата сравнения имипрамина.

Резерпин вызывает у животных ярко выраженную модельную депрессию (табл. 3), характеризующуюся снижением двигательной (на 70%, р<0,05 против показателя интактных животных), ориентировочно-исследовательской активности (на 93,2%, р<0,05 против показателя интактных животных), а также тенденцией к повышению уровня эмоциональных реакций в 1,9 раза. Сумма всех видов активности снижается на 97% (р<0,05). На фоне имипрамина степень этих нарушений незначительно уменьшается. Локомоторная активность снижается на 79,2% (р<0,05 против показателя интактных животных), а ориентировочно-исследовательская - на 76,5% (р<0,05 против показателя интактных животных). Уровень эмоциональных реакций снижается недостоверно в 1,6 раза (р>0,05 против показателя интактных животных), но сумма всех видов активности уменьшается достоверно (на 69,2%, р<0,05), хотя и не так выражено, как в контроле. Снижение показателей локомоторной и ориентировочно-исследовательской активности у животных с резерпиновой депрессией, получавших лечение тетрапептидом, является наименее выраженным. Он уменьшает количество пересеченных квадратов лишь в виде тенденции на 15%, а ориентировочно-исследовательскую активность - на 20,7% (р>0,05 против показателя интактных животных). Сумма всех видов активности на фоне тетрапептида (LYS) снижается статистически незначимо на 29,3% (р>0,05 против показателя интактных животных). Наименее выраженное снижение всех видов активности по сравнению с группой контроля и имипрамина свидетельствует об антагонизме тетрапептида (LYS) c депрессогенным действием резерпина. Статистически значимо снижается только сумма показателей эмоциональных реакций и ее вегетативного сопровождения в 9 раз (р<0,05 против показателя интактных животных), в то время как у животных без лечения, наоборот, повышается.

В таблице 8 показано, что по результатам ПТП тетрапептида проявляет антидепрессантные свойства как у интактных животных, так и у животных с резерпиновой депрессией. Антидепрессантные свойства тетрапептида у интактных животных заключаются в его способности статистически значимо повышать латентное время иммобилизации (в 3,5 раза по сравнению с контролем, р<0,05), снижать количество эпизодов неподвижности и их общую продолжительность (в 11,5 и 16,1 раза соответственно, р<0,05 с контролем).

Примечание. И - интактные животные, Р - резерпиновая депрессия; * - статистически значимые различия с группой контроля (р<0,05), в скобках - % изменения показателя животных с резерпиновой депрессией против соответствующего показателя интактных животных.

У животных, получавших имипрамин, статистически значимо снижается только количество эпизодов неподвижности (р<0,05 относительно контроля), а ее латентное время и общая продолжительность изменяются лишь в виде тенденции. Это соответствует хорошо известному факту постепенного развития специфического эффекта классических антидепрессантов, в том числе трициклиических, к которым относится имипрамин. Таким образом, исследуемый пептид характеризуется не только ярко выраженным по силе, но и быстро развивающимся антидепрессантным эффектом.

На фоне резерпиновой депрессии тетрапептид (LYS) также проявляет статистически значимый антидепрессантный эффект относительно группы контроля. Как и в случае с интактными животными, тетрапептид повышает латентное время иммобилизации в 4,5 раза (р<0,05 относительно контроля), снижет количество эпизодов иммобилизации в 2,6 раза (р<0,05 относительно контроля) и ее общую продолжительность в 3,6 раза (р<0,05 относительно контроля). По этим показателям активность олигопептида превосходит таковую имипрамина.

Таким образом, установлено, что тетрапептид проявляет выраженные антидепрессантные свойства как у интактных животных, так и при резерпиновой депрессии. Это дает основания предположить, что он благоприятно модулирует моноаминергическую трансмиссию в головном мозге, как в норме, так и при модельной патологии, вызванной резерпином.

Пример 2. Влияние тетрапептида на поведение животных со скополамин-индуцированной болезнью Альцгеймера.

Использовали белых рандомбредных половозрелых крыс-самцов массой 200-240 г. Формировали группы животных по 7 особей в каждой. 1-я группа - «Контроль», 2-я - «Патология», 3-я - «Препарат сравнения», 4-6-я - «Нейропептиды».

Скополамин вводили животным всех групп кроме группы контроля в/б в дозе 1 мг/кг ежедневно один раз в сутки на протяжении 27 дней. С 28 дня в течение 10 суток животным групп 2 и 3 вводили, соответственно, препарат сравнения и исследуемый препарат. Препараты вводили ежедневно 1 раз в сутки.

В качестве препарата сравнения использован ингибитор АХЭ, внесенный в протоколы оказания медицинской помощи больным с БА России, США и стран ЕС - донепезил, который вводили в/ж в дозе 1 мг/кг. Тетрапептид вводили и/н в дозе 0,1 мг/кг. Животные группы патологии и/н и в/ж получали 0,9% раствор натрия хлорида в качестве плацебо.

После курсовой терапии препаратами оценивали функциональное состояние ЦНС животных по тестам открытого поля (ОП), экстраполяционного избавления (ЭИ) и условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / Под ред. докт. мед. наук А.Н. Миронова. - Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.; Methods of behavior analysis in neuroscience - London, New York, Washington: CRCPress, 2001. - 329 c.], a также плавательного теста Порсолта (ПТП) [Methods of behavior analysis in neuroscience - London, New York, Washington: CRCPress, 2001. - 329 c.; Porsolt R.D. Depression: A new animal model sensitive to antidepressant treatments / R.D. Porsolt, M. LePichon, M. Oalfre // Nature. - 1977. - Vol. 266. - P. 730-732].

Тесты ОП и ЭИ выполняли на 1 день, ПТП - на второй день, УРПИ - на первый и десятый день после терапии препаратами. Критерий обученности животных УРПИ - пребывание в светлом отсеке прибора УРПИ на протяжении не менее 180 с. Антиамнестическую активность (АА) в тесте УРПИ рассчитывали по формуле Баттлера [Радионова К.С. Оригинальный ноотропный препарат «Ноопепт» устраняет дефицит памяти, вызванный блокадой М- и Н-холинорецепторов у крыс / К.С. Радионова, А.П. Бельник, Р.У. Островская // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2008. - Т. 146., №1. - С. 65-68]. После этого животных выводили из эксперимента введением наркозного препарата с последующей декапитацией. ГМ извлекали и взвешивали, рассчитывали коэффициент массы мозга (КММ). Немедленно после извлечения ГМ замораживали в среде жидкого азота и использовали для дальнейших биохимических и гистохимических исследований. В цельной артериальной (общая сонная артерия) и венозной (венозный синус твердой мозговой оболочки ГМ) крови глюкозо-оксидазным методом определяли уровень глюкозы, рассчитывали артерио-венозную разницу ее содержания (маркер потребления глюкозы). В сыворотке крови определяли уровень молекул средней массы (МСМ) - токсических продуктов биодеградации клеток, повреждающихся при заболевании (дериваты нуклеозидов, пептоиды, соли глюкуроновой кислоты и проч.) [Ковалевский А.Н. Замечания по скрининговому методу определения молекул средней массы / А.Н. Ковалевский, О.Е. Нифантьев // Лаб. дело. - 1989. - №5. - С. 35-39].

Количественные данные обрабатывали статистически. Результаты представлены в виде средней и ее стандартной ошибки (М±m). Для оценки статистической значимости межгрупповых различий в зависимости от характера распределения в вариационном ряду использованы t-критерий Стьюдента либо Т-критерий Манна-Уитни. Различия показателей, учитываемых в альтернативной форме, оценивали с использованием углового преобразования Фишера ϕ. Оценка статистической значимости внутригрупповых различий выполнена с использованием парного Уилкоксона. Корреляционный анализ проводили, рассчитывая коэффициент ранговой корреляции Спирмена ρ.

Вывод о нейропротекторной активности тетрапептида делали по интегральной оценке результатов функциональных, биохимических и гистологических тестов.

Результаты влияния препаратов на двигательную, ориентировочно-исследовательскую активность, эмоциональные реакции крыс и их вегетативное сопровождение в тесте ОП приведены в таблице 5.

Как следует из данных табл. 5, исследуемые пептиды восстанавливают ориентировочно-исследовательскую активность крыс с моделью БА. Это проявляется статистически значимым увеличением числа обследованных отверстий в тесте ОП (до 52%, р<0,05). Лучшие результаты были получены для тетрапептида. Данные свидетельствует о его способности нормализовать поведенческие реакции животных с моделью БА. Также исследуемый фармакологический препарат нормализует эмоциональные реакции крыс в ОП: снижает на 44,7% количество актов груминга (р<0,05), что характеризует его активность как стресс-протекторную.

В тесте ЭИ установлена способность тетрапептида улучшать когнитивные функции крыс с моделью БА (табл. 5).

Примечание. Статистически значимые различия (р<0,05): * - с группой контроля, ^ - с группой патологии.

Тетрапептид статистически значимо по сравнению с группой патологии уменьшает в 3,8 раза время (р<0,05), необходимое животным для подныривания под край цилиндра (избавления) в тесте ЭИ. По этому показателю он на 41,7% превосходит донепезил (р<0,05). Различия между количеством справившихся с заданием (поднырнувших) животных в каждой группе отсутствуют. Способность тетрапептида стимулировать когнитивные функции животных с моделью нейродегенеративного заболевания является одним из проявлений его ноотропной активности.

Другим звеном ноотропного действия тетрапептида, проявляющегося у животных с моделью БА, является его антиамнестическая активность. Результаты теста УРПИ приведены в таблице 6.

Примечание. Статистически значимые различия (р<0,05): * - с группой контроля, ^ - с группой патологии.

В группе патологии наблюдается типичное для блокады холинергической нейротрансмиссии снижение времени входа в темный отсек прибора, свидетельствующее об амнестическом действии.

Из анализа табл. 6 следует, что тетрапептид увеличивает латентное время входа крыс с моделью БА в темный отсек УРПИ как через 24 часа после его формирования (на 79,5% сравнительно с группой патологии), так и через 10 дней (на 130,9% в сравнении с группой патологии, р<0,05). Увеличение этого показателя на фоне препарата тетрапептида (LYS) свидетельствует о его положительном влиянии на формирование условно-рефлекторного памятного следа у животных (положительное мнемотропное действие). По этому показателю исследуемый препарат тетрапептида превосходит донепезил. АА пептида тетрапептида составила на первые сутки 56,5%, а на десятые - возросла до 81,5%. Аналогичные показатели группы донепезила меньше показателей группы тетрапептида в 2,9 и 1,9 раза соответственно.

Таким образом, исследуемый тетрапептид на модели когнитивного нарушения, обусловленного снижением холинергической трансмиссии, демонстрирует выраженные холинопозитивные свойства. Следствием влияния тетрапептида на центральные холинергические нейроны, принимающие непосредственное участие в рилизинге про- и противовоспалительных цитокинов, могут быть его цитокин-опосредованные противовоспалительные свойства.

На первые и десятые сутки после обучения УРПИ в группе патологии все крысы входили в темный отсек прибора в течение менее 3 мин. Это свидетельствует о гипомнезии, развивающейся вследствие модельной патологии. Донепезил на первые сутки статистически значимо увеличивает число животных, достигших критерия обученности УРПИ до 28,6% (р<0,05 с группой патологии). Однако через десять дней его активность уменьшается до уровня группы патологии. В отличие от донепезила, тетрапептид увеличивает этот показатель как на первые, так и на десятые сутки, до 42,9% (р<0,05 с группой патологии) и 14,3% соответственно. Такой результат является проявлением положительного влияния тетрапептида на мнестические функции крыс с моделью БА.

Таким образом, в тесте УРПИ выявлены положительные мнемотропные свойства олигопептидного нейропротектора тетрапептида, проявляющихся у крыс с моделью БА высокой антиамнестической активностью и увеличением числа животных в группе, достигших критерия обученности условному рефлексу.

Тетрапептид проявляет тенденцию к снижению уровня депрессивной симптоматики крыс с моделью БА.

Как следует из анализа данных табл. 7, в группе патологии наблюдается тенденция к развитию депрессивной симптоматики у крыс. Она проявляется снижением латентного времени первой иммобилизации, повышением количества и общей продолжительности актов иммобилизации. Тетрапептид снижает общую продолжительность и количество неподвижных зависаний (иммобилизаций) крыс, а также увеличивает латентный период первой иммобилизации в форме тенденции, что характеризует его активность как антидепрессантную.

Изобретение относится к области биохимии, конкретно к новому биологически активному соединению - пептиду с антидепрессантной активностью, и может быть использовано для создания препарата для терапии депрессивного состояния больных путем применения для данных целей тетрапептида, представляющего собой ацетил-D-LYS-LYS-ARG-ARG-амид. Установлены выраженные антидепрессантные свойства препарата, проявляющиеся как у интактных животных, так и у животных с моделью резерпин-индуцированной депрессии. 7 табл., 2 пр.

Применение пептида общей формулы ацетил-D-Lys-Lys-Arg-Arg-амид в качестве антидепрессантного средства.