ПЕПТИД ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА Российский патент 2019 года по МПК C07K7/08 A61K38/07 A61P25/24 A61P25/28 

Изобретение относится к области биохимии, конкретно к новому биологически активному соединению - пептиду, обладающему лечебным действием против нарушений деятельности головного мозга, таких как болезнь Альцгеймера, и может быть использовано для создания препарата для терапии подобных заболеваний.

Под антидепрессантами понимаются психотропные лекарственные средства, применяемые для лечения депрессии, оказывая влияние на уровень нейромедиаторов, в частности серотонина, норадреналина и дофалина, улучшая настроение пациента, уменьшая тоску, вялость, напряжение и т.п. [wikpendia.org/wik/антидепрессанты]. При этом, поддерживая уровень серотонина, некоторые антидепрессанты способны за счет замедления процессов образования бляшек в головном мозге способствовать улучшению состояния больных болезнью Альцгеймера, особенно перенесших инсульт [http:www.patronage.ru/news].

Болезнь Альцгейметра (БА) представляет собой тяжелое нейродегенеративное заболевание, приводящее к потере памяти, психическим расстройствам и неизбежной смерти. Ее главным отличительным патологическим признаком является развитие изменений цитоскелета в некоторых восприимчивых нейронах. Данные изменения не происходят неизбежно в процессе старения, но если заболевание началось, то спонтанное выздоровление или ремиссии не наблюдаются. Первоначальные изменения коры головного мозга, описанные далее ниже, развиваются в слабо миелинизированной трансэнторинальной области медиальной височной доли. Затем деструктивный процесс развивается по прогнозируемому типу по мере его распространения на другие области коры головного мозга. Локализация образующих сплетение нейронов и тяжесть изменений позволяют дифференцировать шесть стадий в прогрессировании заболевания от I-II стадий, которые клинически не проявляются, до V-VI стадий, которые обозначают полное развитие БА. У относительно небольшого числа пациентов проявляются особенно ранние изменения, указывающие на то, что пожилой возраст не является необходимым условием развития поражений. Соответственно БА является, таким образом, связанным с возрастом, но не зависимым от возраста заболеванием. Относительно причины и механизма развития БА в настоящее время существует ряд теорий, многие из которых связаны с генетическими дефектами.

В настоящее время в медицинской практике применяют препараты для симптоматического лечения БА методами компенсаторной терапии. Использование этих препаратов позволяет в некоторой мере задержать процесс прогрессирования болезни, но не излечить ее.

Наиболее широко применяемым классом препаратов являются ингибиторы холинэстераз (ИХЭ) [Watkins, Р.В. et all. J. Am. Med. Assoc. 1994. V. 271. P. 992-998]. ИХЭ увеличивают время действия нейромедиатора ацетилхолина на постсинаптические рецепторы, что ведет к увеличению холинергической иннервации. Однако, эффективность применения ИХЭ существенно снижается на поздних стадиях БА. Кроме того их применение характеризуются достаточно высокой токсичностью и рядом других негативных побочных эффектов.

Известно применение для симптоматического лечения БА мемантина, модулятора глутаматэргической системы [Raina P. at all // Ann. Intern. Med. 2008. V. 148 (5). P. 379-397]. Наилучшие результаты дает его использование у больных с мягкой и умеренной деменцией альцгеймеровскоготипа. Однако препарат не обеспечивает полного излечивания БА. В частности, недостатки компенсаторной терапии связаны стем то, что разрабатываемые внутри данного направления методы не воздействуют на механизм развития БА. Поэтому интенсивные исследования ведутся по поиску лекарств для радикальной терапии БА, способные не только компенсировать симптоматические нарушения, но и излечивать заболевание.

Одна из современных гипотез предполагает, что пептиды β-амилоидного ряда (βА), в частности βА-(1-42), в результате нарушения обменных процессов способны образовывать скопления в центральной нервной системе в виде амилоидных бляшек, что приводит к разрушению мозговой ткани [Hardy J., Selkoe D.J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 2002. V. 297 (5580). P. 353-356]. В связи с этим, в последние годы активно разрабатываются иммунотерапевтические методы предотвращения развития БА, направленные на коррекцию содержания βА в организме. Инъекции препаратами на основе βА вызывают образование специфических антител, которые способствуют удалению βА из мозга [Shenk D., Barbour R., Dunn W. Immunization with amyloid-β attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse. // Nature. 1999. V. 400(6740). P. 173-177]. Ведущими западными фирмами разработан ряд препаратов [www.affi-ris.com/press_releases/press_release_mimoVAX_dec_11_06.pdf; www.clini-cal-tri-als.gov/ct2/show/NCT00411580], однако, ни один из них не прошел успешно клинические испытания. Исследования были приостановлены в связи с тем, что у 6% пациентов, которые получали инъекцию бета-амилоида, обнаружился асептический менингоэнцефалит [Shenk D. Amyloid-β immunotherapy for Alzheimer's disease: the end of the beginning. // Nat. Rev. Neurosci. 2002. V. 3 (10). P. 824-828; Senior K. Dosing in Phasell trial of Alzheimer's vaccine suspended. Lancet. Neurol. 2002. V. 1 (1). P. 3]. Данные результаты ставят под сомнение безопасность использования препаратов на основе βА в качестве иммунотерапевтических средств.

Вместе с тем, установлено, что структурные и гистопатологические изменения, наблюдаемых в мозге заболевших БА, представляют собой нейрофибриллярные пучки и отложения амилоида. Предполагают, что связывание рецептора конечных продуктов гликозилирования с амилоидом способствует проникновению последнего через гематоэнцефалический барьер центральной нервной системы и накоплению в виде амилоидных бляшек - основной причины болезни Альцгеймера [Leclerc Е., Sturchler Е., Vetter S. The S100B/RAGE Axis in Alzheimer's Disease. Cardiovasc. Psychi-atry Neurol. 2010. V. 2010. P. 1-11]. Главным компонентом наиболее распространенных амилоидных нейритных бляшек является пептид из 40-42 аминокислот, называемый амилоидным пептидом Аβ4 (Price, D.L. andall, Drug Development Research (1985) 5:59-68).

Амилоидный пептид A(34 представляет собой полипептид, который образуется в результате протеолиза мембранных гликопротеинов, обозначаемых белками-предшественниками амилоидного пептида Аβ4 (βАРР). Данные белки-предшественники амилоидного пептида, состоят из от 695 до 770 аминокислот, причем все они кодируются одним и тем же геном.

Идентифицировано два главных варианта амилоидного пептида Аβ4 - пептидыAβ40 и Aβ42, содержащие 40 и 42 аминокислоты, соответственно, которые характеризуются различным тканевым распределением как в физиологических, так и в патологических условиях. Вариант из 42 аминокислот является преобладающей формой в амилоидных бляшках, локализованных в мозге больных БА.В заявке WO 9927944 описано лечение БА путем введения больному пептида Аβ42, однако клинические испытания у 360 больных с диагнозом средней и умеренной БА, при которых амилоидный пептид Аβ42 был использован в качестве антигена, были прекращены после сообщения об энцефалите у некоторых больных [Scrip Daily Online, 25 Feb 2002, S007455320, The Scientist 16[7]: 22, April 1, 2002].

Среди других пептидов, предлагаемых для лечения БА, следует отметить пептиды, разработанные ИБХ РАН и состоящие из последовательности аминокислот Glu-Trp-Asp-Leu-Val-Gly-Ile-Pro-Gly-Lys-Arg-Ser-Glu-Arg-Phe-Tyr-Glu-Cys-Cys-Lys-Glu [RU 2372355, 2009] nAla-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala [RU 2558242, 2015]. Последний может рассматриваться как ближайший аналог по отношению к заявляемому средству. Препарат показал эффективность при воздействии на поведение экспериментальных животных, однако его действие не-достаточно эффективно.

Заявляемое изобретение решает задачу расширения ассортимента препаратов, обладающих лечебным действием против болезни Альцгеймера, в частности, создание препарата, обладающего лечебным действием на больных болезнью Альцгеймера.

Поставленная задача решается за счет применения пептида общей формулы ацетил- D-LYS-LYS-ARG-ARG-амид.

Проведенные исследования показали, что пептид проявляет нормализующую активность на модели БА у крыс, что обусловлено его уникальными первичной структурой и пространственным строением вследствие присутствия аминокислотных остатков в различных стереоконфигурациях.

Тетрапептид получали стандартной технологией пептидного синтеза на твердой фазе [J.M. Stewardand, J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthe-sis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969] с последующим отщеплением защитных групп и очисткой конечного продукта.

Для синтеза пептида в реакционный сосуд загружали 0.2 г аминополимера в 10 мл диметилформамида. Пептидную цепь далее наращивали с С-конца по программе, приведенной в таблице 1.

При положительном нингидриновом тесте, повторяли конденсацию, начиная с п. 3. Полученный пептидил-полимер обрабатывали безводным фтористым водородом и выделяли грубый продукт в соответствии с программой, приведенной в таблице 2.

Полученные грубые продукты подвергали очистке обращенно-фазовой высокоэффективной хроматографией на колонке С18 Nova Pack, 19×300 мм, 300А° в градиенте 2-50% ацетонитрила в 0.1% трифторуксусной кислоте. Содержание пептида - по данным оптической плотности - составляло 99,5%. Аминокислотный состав пептида и его молекулярная масса соответствовали теоретическим.

Структура и гомогенность полученного пептида была подтверждена данными высокоэффективной жидкостной хроматографии, аминокислотного и масс-спектрального анализов.

Свойства тетрапептида иллюстрируются следующими графическими материалами.

На фиг. 1 показано влияние тетрапептида и препарата сравнения донепезила на активность ацетилхолинэстеразы в синаптосомах головного мозга крыс с моделью болезни Альцгеймера. Антиамнестическая активность тетрапептида и донепезила показана на 1-е и 10-е сутки после курса терапии крыс с моделью болезни Альцгеймера (тест «условный рефлекс пассивного избегания»). 1 - донепезил в дозе 1 мг/кг; 2-тетрапептида в дозе 0,1 мг/кг.

На фиг. 2 показано влияние тетрапептида и препарата сравнения донепезила на количество крыс с моделью болезни Альцгеймера, достигших критерия обученности условному рефлексу пассивного избегания на 1-е и 10-е сутки после терапии. (Статистически значимые различия (р>0,05): * - с группой контроля, ^ - с группой патологии.) 1-донепезил в дозе 1 мг/кг, 2-тетрапептидв дозе 0,1 мг/кг, 3 - контроль, 4 - патология,

На фиг. 3 показано влияние тетрапептида и препарата сравнения донепезила на коэффициент массы головного мозга крыс с моделью болезни Альцгеймера. 1 - донепезил в дозе 1 мг/кг, 2 - тетрапептида в дозе 0,1 мг/кг, 3 - контроль, 4 - патология,

На фиг. 4 показано влияние тетрапептида и препарата сравнения донепезила на артерио-венозную разницу содержания глюкозы в крови церебрального бассейна крыс с моделью болезни Альцгеймера. 1-донепезил в дозе 1 мг/кг, 2-тетрапептидв дозе 0,1 мг/кг, 3-контроль, 4-патология,

На фиг. 5 показано влияние тетрапептида и препарата сравнения донепезила на уровень АТФ в головном мозге крыс с моделью болезни Альцгеймера. 1 - донепезил в дозе 1 мг/кг, 2 - тетрапептид в дозе 0,1 мг/кг, 3 - контроль, 4 - патология. Статистически значимые различия (р>0,05): * - с группой контроля, ^ - с группой патологии, ® - с группой донепезила.

На фиг. 6 показано влияние тетрапептида и препарата сравнения донепезила на уровень серотонина в головном мозге крыс с моделью болезни Альцгеймера. 1 - донепезил в дозе 1 мг/кг, 2 - КК-1 в дозе 0,1 мг/кг, 3 - контроль, 4 - патология. Статистически значимые различия (р>0,05): * - с группой контроля, ^ - с группой патологии, ® - с группой донепезила.

На фиг. 7 показано влияние тетрапептида и препарата сравнения донепезила на содержание малонового диальдегида в головном мозге крыс с моделью болезни Альцгеймера. 1 - донепезил в дозе 1 мг/кг, 2 - тетрапептид в дозе 0,1 мг/кг, 3 - контроль, 4 - патология Статистически значимые различия (р>0,05): * - с группой контроля, ^ - с группой патологии, ® - с группой донепезила.

На фиг. 8 показано влияние тетрапептида и препарата сравнения донепезила на содержание восстановленного глутатиона в головном мозге крыс с моделью болезни Альцгеймера. 1 - донепезил в дозе 1 мг/кг, 2 - тетрапептид в дозе 0,1 мг/кг, 3 - контроль, 4 - патология. Статистически значимые различия (р>0,05): * - с группой контроля, ^ - с группой патологии, ® - с группой донепезила.

На фиг. 9 показано влияние тетрапептида и препарата сравнения донепезила на активность супероксиддисмутазы в головном мозге крыс с моделью болезни Альцгеймера. 1 - донепезил в дозе 1 мг/кг, 2 - тетрапептидв дозе 0,1 мг/кг, 3 - контроль, 4 - патология. Статистически значимые различия (р>0,05): * - с группой контроля, ^ - с группой патологии, ® - с группой донепезила.

На фиг. 10 показано влияние тетрапептида и препарата сравнения донепезила на активность каталазы в головном мозге крыс с моделью болезни Альцгеймера. 1 - донепезил в дозе 1 мг/кг, 2 - тетрапептидв дозе 0,1 мг/кг, 3 - контроль, 4 - патология. Статистически значимые различия (р>0,05): * - с группой контроля, ^ - с группой патологии, ® - с группой донепезила.

На фиг. 11 показано влияние тетрапептида и препарата сравнения донепезила на содержание ацетилхолина в гомогенате головного мозга крыс с моделью болезни Альцгеймера. 1 - донепезил в дозе 1 мг/кг, 2 - тетрапептидв дозе 0,1 мг/кг, 3 - контроль, 4 - патология Статистически значимые различия (р>0,05): * - с группой контроля, ^ - с группой патологии, ® - с группой донепезила.

На фиг. 12 показано влияние тетрапептида и препарата сравнения донепезила на активность ацетилхолинэстеразы в синаптосомах головного мозга крыс с моделью болезни Альцгеймера. 1 - донепезил в дозе 1 мг/кг, 2 - тетрапептидв дозе 0,1 мг/кг, 3 - контроль, 4 - патология Статистически значимые различия (р>0,05): * - с группой контроля, ^ - с группой патологии, ® - с группой донепезила.

На фиг. 13 показано влияние тетрапептида и препарата сравнения донепезила на активность ацетилхолинэстеразы в гомогенате целого головного мозга крыс с моделью болезни Альцгеймера. 1 - донепезил в дозе 1 мг/кг, 2 - тетрапептидв дозе 0,1 мг/кг, 3 - контроль, 4 - патология Статистически значимые различия (р>0,05): * - с группой контроля, ^ - с группой патологии, ® -с группой донепезила.

На фиг. 14 показано влияние тетрапептида и препарата сравнения донепезила на активность бутирилхолинэстеразы в гомогенате целого головного мозга крыс с моделью болезни Альцгеймера. 1 - донепезил в дозе 1 мг/кг, 2 - тетрапептидв дозе 0,1 мг/кг, 3 - контроль, 4 - патология. Статистически значимые различия (р>0,05): * - с группой контроля, ^ - с группой патологии, ® - с группой донепезила.

Промышленная применимость иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Моделирование скополамин-индуцированной болезни Альцгеймера.

Использовали белых рандомбредных половозрелых крыс-самцов массой 200-240 г. Формировали группы животных по 7 особей в каждой. 1-я группа - «Контроль», 2-я - «Патология», 3-я - «Препарат сравнения», 4-6-я - «Нейропептиды».

Скополамин вводили животным всех групп кроме группы контроля в/б в дозе 1 мг/кг ежедневно один раз в сутки на протяжении 27 дней. С 28 дня в течение 10 суток животным групп 2 и 3 вводили, соответственно, препарат сравнения и исследуемый препарат. Препараты вводили ежедневно 1 раз в сутки.

В качестве препарата сравнения использован ингибитор АХЭ, внесенный в протоколы оказания медицинской помощи больным с БА России, США и стран ЕС - донепезил, который вводили в/ж в дозе 1 мг/кг. Тетрапептиды вводили и/н в дозе 0,1 мг/кг. Животные группы патологии и/н и в/ж получали 0,9% раствор натрия хлорида в качестве плацебо.

После курсовой терапии препаратами оценивали функциональное состояние ЦНС животных по тестам открытого поля (ОП), экстраполяционного избавления (ЭИ) и условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / Под ред. докт. мед. наук А.Н. Миронова. - Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.; Methods of behavior analysis in neuroscience - London, New York, Washington: CRCPress, 2001. - 329 c.], a также плавательного теста Порсолта (ПТП) [Methods of behavior analysis in neuroscience - London, New York, Washington: CRCPress, 2001. - 329 c.; Porsolt R.D. Depression: A new animal model sensitive to antidepressant treatments / R.D. Porsolt, M. LePichon, M. Oalfre // Nature. - 1977. - Vol.266. - P. 730-732.].

Тесты ОП и ЭИ выполняли на 1 день, ПТП - на второй день, УРПИ - на первый и десятый день после терапии препаратами. Критерий обученности животных УРПИ - пребывание в светлом отсеке прибора УРПИ на протяжении не менее 180 с. Антиамнестическую активность (АА) в тесте УРПИ рассчитывали по формуле Баттлера [Радионова К.С. Оригинальный ноотропный препарат «Ноопепт» устраняет дефицит памяти, вызванный блокадой М- и Н- холинорецепторов у крыс / К.С. Радионова, А.П. Бельник, Р.У. Островская // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2008. - Т. 146., №1. - С. 65-68]. После этого животных выводили из эксперимента введением наркозного препарата с последующей декапитацией. ГМ извлекали и взвешивали, рассчитывали коэффициент массы мозга (КММ). Немедленно после извлечения ГМ замораживали в среде жидкого азота и использовали для дальнейших биохимических и гистохимических исследований. В цельной артериальной (общая сонная артерия) и венозной (венозный синус твердой мозговой оболочки ГМ) крови глюкозо-оксидазным методом определяли уровень глюкозы, рассчитывали артерио-венозную разницу ее содержания (маркер потребления глюкозы). В сыворотке крови определяли уровень молекул средней массы (МСМ) - токсических продуктов биодеградации клеток, повреждающихся при заболевании (дериваты нуклеозидов, пептоиды, соли глюкуроновой кислоты и проч.) [Ковалевский А.Н. Замечания по скрининговому методу определения молекул средней массы / А.Н. Ковалевский, О.Е. Нифантьев // Лаб. дело. - 1989. - №5. - С. 35-39].

Стандартными биохимическими методами определяли содержание и активность ферментов антиоксидантной защиты и продуктов пероксидного окисления липидов - малонового диальдегида (МДА) [Современные методы в биохимии / [под ред. В.Н. Ореховича]. - М.: Медицина, 1977. - 392 с], супероксиддисмутазы (СОД) [Макаревич О. П. Активность супероксиддисмутазы крови в острый период различных заболеваний / О.П. Макаревич, П.П. Голиков // Лаб. дело. - 1983. - №6. - С. 24-27], каталазы [Метод определения активности каталазы / М.А. Королюк, Л.И. Иванова, И.Г. Майорова и др. // Лаб. дело. - 1988. - N 1. - С. 16-19], восстановленного глутатиона [Кочетов Т.А. Практическое руководство по энзимологии. - М.: Наука, 1980. - 280 с].

Содержание ацетилхолина в ткани ГМ определяли по методу [Способ определения ацетилхолина: RU 2256920, 2005], холинэстераз (синаптической и общей ацетилхолинэстеразы, общей бутирилхолинэстеразы) - по методам [Панюков А.И. О применении метода Хестрина для раздельного измерения активности холинэстераз / А.И. Панюков // Вопросы мед. химии. - 1966. - Т. 12. - Выпуск 1. - С. 88-95; HajosE. An improved method for thepreparation of synaptosomal fractions in high purity / E. Hajos // Brain Res. - 1975. - Vol. 93. - №3. - P. 485-489.], серотонина - методом [Atack С.A procedure for the isolation of noradrenaline (together with adrenaline), dopamine, 5-hydroxy tryptamine and histamine from the same tissue sample using as ingle column of strongly acidic cati on exchangeresin 1С Atack, T. Magnusson // ActaPharmacolToxicol (Copenh). - 1978. - Vol. 42 (1). - P. 35-57], аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) - [Ещенко Н.Д. Определение содержания АТФ в тканях // Методы биохимических исследований / Под ред. проф. М.И. Прохоровой. - Ленинград: Из-во ЛГУ, 1982. - с. 256-258].

Количественные данные обрабатывали статистически. Результаты представлены в виде средней и ее стандартной ошибки (М±m). Для оценки статистической значимости межгрупповых различий в зависимости от характера распределения в вариационном ряду использованы t-критерий Стьюдента либо Т-критерий Манна-Уитни. Различия показателей, учитываемых в альтернативной форме, оценивали с использованием углового преобразования Фишера ϕ. Оценка статистической значимости внутригрупповых различий выполнена с использованием парного Уилкоксона. Корреляционный анализ проводили, рассчитывая коэффициент ранговой корреляции Спирмена ρ.

Вывод о нейропротекторной активности тетрапептида делали по интегральной оценке результатов функциональных, биохимических и гистологических тестов.

Результаты влияния препаратов на двигательную, ориентировочно-исследовательскую активность, эмоциональные реакции крыс и их вегетативное сопровождение в тесте ОП приведены в таблице 3.

Как видно из данных табл. 3, исследуемые пептиды восстанавливают ориентировочно-исследовательскую активность крыс с моделью БА. Это проявляется статистически значимым увеличением числа обследованных отверстий в тесте ОП (до 52%, р<0,05). Лучшие результаты были получены для тетрапептида (LYS). Данные свидетельствует о его способности нормализовать поведенческие реакции животных с моделью БА. Также исследуемый фармакологический препарат нормализует эмоциональные реакции крыс в ОП: снижает на 44,7% количество актов груминга (р<0,05), что характеризует его активность как стресс-протекторную.

В тесте ЭИ установлена способность тетрапептида улучшать когнитивные функции крыс с моделью БА (табл. 4).

Примечание. Статистически значимые различия (р<0,05): * - с группой контроля, ^ - с группой патологии.

Тетрапептид статистически значимо по сравнению с группой патологии уменьшает в 3,8 раза время (р<0,05), необходимое животным для подныривания под край цилиндра (избавления) в тесте ЭИ. По этому показателю он на 41,7% превосходит донепезил (р<0,05). Различия между количеством справившихся с заданием (поднырнувших) животных в каждой группе отсутствуют. Способность тетрапептида стимулировать когнитивные функции животных с моделью нейродегенеративного заболевания является одним из проявлений его ноотропной активности.

Другим звеном ноотропного действия тетрапептида, проявляющегося у животных с моделью БА, является его антиамнестическая активность. Результаты теста УРПИ приведены в таблице 5 и на фиг. 1 и 2.

Примечание. Статистически значимые различия (р<0,05): * - с группой контроля, ^ - с группой патологии.

В группе патологии наблюдается типичное для блокады холинергической нейротрансмиссии снижение времени входа в темный отсек прибора, свидетельствующее об амнестическом действии.

Из анализа табл. 5 следует, что тетрапептид увеличивает латентное время входа крыс с моделью БА в темный отсек УРПИ как через 24 часа после его формирования (на 79,5% сравнительно с группой патологии), так и через 10 дней (на 130,9% в сравнении с группой патологии, р<0,05). Увеличение этого показателя на фоне препарата тетрапептида (LYS) свидетельствует о его положительном влиянии на формирование условно-рефлекторного памятного следа у животных (положительное мнемотропное действие). По этому показателю исследуемый препарат тетрапептида превосходит донепезил. АА пептида тетрапептида (LYS) составила на первые сутки 56,5% (фиг. 1), а на десятые - возросла до 81,5%. Аналогичные показатели группы донепезила меньше показателей группы тетрапептида в 2,9 и 1,9 раза соответственно.

Таким образом, исследуемый тетрапептид на модели когнитивного нарушения, обусловленного снижением холинергической трансмиссии, демонстрирует выраженные холинопозитивные свойства. Следствием влияния тетрапептида на центральные холинергические нейроны, принимающие непосредственное участие в рилизинге про- и противовоспалительных цитокинов, могут быть его цитокинопосредованные противовоспалительные свойства.

На первые и десятые сутки после обучения УРПИ в группе патологии все крысы входили в темный отсек прибора в течение менее 3 мин (фиг. 2). Это свидетельствует о гипомнезии, развивающейся вследствие модельной патологии. Донепезил на первые сутки статистически значимо увеличивает число животных, достигших критерия обученности УРПИ до 28,6% (р<0,05 с группой патологии). Однако через десять дней его активность уменьшается до уровня группы патологии. В отличие от донепезила, тетрапептид (LYS) увеличивает этот показатель как на первые, так и на десятые сутки, до 42,9% (р<0,05 с группой патологии) и 14,3% соответственно. Такой результат является проявлением положительного влияния тетрапептида на мнестические функции крыс с моделью БА.

Таким образом, в тесте УРПИ выявлены положительные мнемотропные свойства олигопептидного нейропротектора тетрапептида, проявляющихся у крыс с моделью БА высокой антиамнестической активностью и увеличением числа животных в группе, достигших критерия обученности условному рефлексу.

Тетрапептид проявляет тенденцию к снижению уровня депрессивной симптоматики крыс с моделью БА (табл. 6).

Как следует из анализа данных табл. 6, в группе патологии наблюдается тенденция к развитию депрессивной симптоматики у крыс. Она проявляется снижением латентного времени первой иммобилизации, повышением количества и общей продолжительности актов иммобилизации. Тетрапептид снижает общую продолжительность и количество неподвижных зависаний (иммобилизаций) крыс, а также увеличивает латентный период первой иммобилизации в форме тенденции, что характеризует его активность как антидепрессантную.

Таким образом, по комплексу функциональных тестов ЦНС крыс с моделью БА установлено комплексное ноотропное действие пептида, заключающееся в нормализации ориентировочно-исследовательской деятельности животных в ОП, стимуляции их когнитивных функций, положительном мнемотропном эффекте. Ноотропная активность, выявленная на модели БА, сопровождается его тенденцией к снижению депрессивной симптоматики животных, возникающей на фоне модельной патологии.

Установлена тенденция к нормализации КММ на фоне тетрапептида (фиг. 3). В группе патологии этот показатель статистически незначимо возрастает на 16,7% в сравнении с контролем. Донепезил и тетрапептид также статистически незначимо снижают КММ на 8,0% и 14,3% соответственно (на фоне тетрапептида происходит полная нормализация показателя). Нормализация КММ может происходить также за счет мембраностабилизирующего эффекта тетрапептида [Дейко Р.Д. Влияние потенциального нейропротектора acetyl-D-Lys-Lys-Arg-Arg-amide на нейродеструкцию и нейроапоптоз у крыс при остром нарушении мозгового кровообращения / Р.Д. Дейко, С.Ю. Штрыголь и др. // Вестник фармации. - 2016. - №1(71). - С. 96-102], проявляющегося в случае модельной БА снижением альтерации холинергических нейронов.

Влияние тетрапептида и донепезила на реактивно возникающую оверэкспрессию серотонина является также положительным (фиг. 6). Они снижают уровень этого нейротрансмиттера на 23,8% и 43,2% соответственно. Снижение этого показателя тетрапептидом приводит к его нормализации, о чем свидетельствует отсутствие статистически значимых различий с группой контроля.

Было установлено положительное влияние тетрапептидов на систему антиоксидантной защиты головного мозга крыс при модельной болезни Альцгеймера. Тетрапептид снижает содержание вторичного продукта пероксидного окисления - малонового альдегида (МДА) в головном мозге (фиг. 7). Для препарата сравнения донепезила, напротив, характерно его повышение на 15,9% по сравнению с группой патологии. Снижение этого показателя под влиянием тетрапептида составляет 39,8% по отношению к группе патологии.

Тетрапептид значительно повышает уровень восстановленного глутатиона, статистически значимо снижающийся на 34,3% (р<0,05 с группой контроля) при модельной болезни Альцгеймера (фиг. 8). Увеличение этого показателя на фоне тетрапептида составляет 36,6%.

Выраженное влияние тетрапептид оказывает на активность СОД в головном мозге крыс с моделью БА (фиг. 9). Он повышает этот показатель на 22% в сравнении с таковым в группе патологии, что также способствует повышению антиоксидантной защиты мозга в условиях модели БА.

Как показано на фиг. 10, тетрапептид достоверно в 1,1 раза снижает повышенную активность каталазы, компенсаторно возникающую на фоне модельной БА.

Таким образом, тетрапептид эффективно влияет на систему антиоксидантной защиты головного мозга крыс при модельной БА. Он повышает уровень восстановленного глутатиона и активность СОД при патологии и снижает потребность ГМ в оверэкспрессии каталазы - фермента, разрушающего перекиси, конечные продукты пероксидной модификации белкового и липидного субстрата. Следствием такой его активности является выраженное снижение уровня МДА - промежуточного продукта пероксидной модификации липидов, входящих в значительном количестве в состав биомембраны нейронов. Это является косвенным подтверждением мембраностабилизирующего действия тетрапептида, имеющего место как при цереброваскулярных, так и нейродегенеративных заболеваниях.

Как следует из анализа данных фиг. 11, тетрапептид статистически значимо по сравнению с группами контроля, патологии и донепезила (р<0,05) снижает содержание ацетилхолинэстеразы в головном мозге крыс с моделью БА.

Препарат тетрапептида, как и донепезил, уменьшает активность АХЭ (фиг. 12 и 13) как в синаптосомах, так и в гомогенате целого головного мозга, что сопровождается формированием средней отрицательной связи между активностью этого фермента и содержанием ацетилхолинэстеразы в ткани головного мозга. При этом тетрапептид значительно повышает сниженную в мозге животных с моделью БА активность бутирилхолинэстеразы, которая, однако, не участвует в инактивации ацетилхолина (фиг. 14).

Таким образом, установлено влияние исследуемого пептида на активность ацетилхолинэстеразы и содержание ацетилхолина в головном мозге. Он снижает как количество АХ, так и активность ацетилхолинэстеразы, инактивирующей ацетилхолин. Это сопровождается повышением когнитивных и мнестических функций крыс с моделью БА.

Пример 3. Исследование андидепрессантных свойств тетрапептида на модели резерпиновой депрессии.

Эксперимент был выполнен на 16 белых половозрелых рандомбредных крысах-самцах массой 180-220 г. Оценивали антидепрессантную активность нейропротектора тетрапептида (LYS) в дозе 0,02 мг/кг интраназально (и/н). В качестве препарата сравнения использовали классический трициклический антидепрессант имипрамин в дозе 15 мг/кг (мелипрамин, EGIS, Венгрия) внутрибрюшинно (в/б). Эксперимент выполняли в 2 этапа. На 1 этапе интактных животных распределяли по группам: 1 - группа контроля (n=5), 2 - группа «имипрамин» (15 мг/кг в/б, n=6), 3 - группа «тетрапептида (LYS)» (0,02 мг/кг и/н, n=5). За 25-30 мин до начала эксперимента животным вводили соответствующий препарат. Животным группы контроля в/б и и/н вводили 0,9% раствор NaCl в объеме, эквивалентном объему лекарственных средств. После этого у животных всех групп в тесте открытое поле (ОП) в течение 3 мин оценивали локомоторную (количество пересеченных квадратов), ориентировочно-исследовательскую (количество вертикальных стоек и обследованных отверстий) активность, а также эмоциональные реакции (фекальные болюсы, уринации, груминг). Показатели депрессивности у животных (латентное время иммоблизации, количество ее эпизодов, а также их совокупная продолжительность) оценивали в плавательном тесте Порсолта (ПТП) в течение 6 мин. В последующие 2 суток все препараты вводили в тех же дозах 1 раз в день, последний раз - за 30 мин до депрессогенного симпатолитикарезерпина. Резерпин вводили на 3 сутки (2 этап эксперимента) в дозе 4 мг/кг в/б (в виде стабилизированной твином-80 суспензии). Через 6-7 ч оценивали показатели животных всех 3 групп в ОП и ПТП.

Результаты обрабатывали статистически. В случае нормального распределения данных использовали параметрический t-критерий Стьюдента, в случае его отсутствия - непараметрический Т-критерий Манна-Уитни. При учете результатов в альтернативной форме (наличие/отсутствие признака) применяли угловое преобразование Фишера ϕ. Парный Вилкоксона использовали для внутригрупповой статистической оценки изменений показателей тестов животных до и после моделирования депрессии. Результаты считали статистически значимыми при р≤0,05. Результаты теста ОП приведены в табл. 7.

Примечание. И - интактные животные, Р - резерпиновая депрессия; р≤0,05: * - с группой контроля, ^ - с группой имипрамина, ® - между показателем до и после моделирования депрессии; в скобках - % изменения показателя животных с резерпиновой депрессией против соответствующего показателя интактных животных.

Как следует из данных табл. 7, у интактных животных тетрапептид снижает все виды активности в ОП, а также эмоциональные реакции. Имипрамин также проявляет тенденцию к снижению локомоторной и ориентировочно-исследовательской активности интактных животных. Уровень эмоциональных реакций под его влиянием, наоборот, возрастает (в 2,9 раза, р<0,05 по сравнению с группой контроля). Таким образом, в условиях ОП у животных без депрессии тетрапептида проявляет седативные свойства, более выраженные, чем у препарата сравнения имипрамина.

Резерпин вызывает у животных ярко выраженную модельную депрессию (табл. 7), характеризующуюся снижением двигательной (на 70%, р<0,05 против показателя интактных животных), ориентировочно-исследовательской активности (на 93,2%, р<0,05 против показателя интактных животных), а также тенденцией к повышению уровня эмоциональных реакций в 1,9 раза. Сумма всех видов активности снижается на 97% (р<0,05). На фоне имипрамина степень этих нарушений незначительно уменьшается. Локомоторная активность снижается на 79,2% (р<0,05 против показателя интактных животных), а ориентировочно-исследовательская - на 76,5% (р<0,05 против показателя интактных животных). Уровень эмоциональных реакций снижается недостоверно в 1,6 раза (р>0,05 против показателя интактных животных), но сумма всех видов активности уменьшается достоверно (на 69,2%, р<0,05), хотя и не так выражено, как в контроле. Снижение показателей локомоторной и ориентировочно-исследовательской активности у животных с резерпиновой депрессией, получавших лечение тетрапептидом, является наименее выраженным. Он уменьшает количество пересеченных квадратов лишь в виде тенденции на 15%, а ориентировочно-исследовательскую активность - на 20,7% (р>0,05 против показателя интактных животных). Сумма всех видов активности на фоне тетрапептида снижается статистически незначимо на 29,3% (р>0,05 против показателя интактных животных). Наименее выраженное снижение всех видов активности по сравнению с группой контроля и имипрамина свидетельствует об антагонизме тетрапептида с депрессогенным действием резерпина. Статистически значимо снижается только сумма показателей эмоциональных реакций и ее вегетативного сопровождения в 9 раз (р<0,05 против показателя интактных животных), в то время как у животных без лечения, наоборот, повышается.

В таблице 8 показано, что по результатам ПТП тетрапептида проявляет антидепрессантные свойства как у интактных животных, так и у животных с резерпиновой депрессией. Антидепрессантные свойства тетрапептида у интактных животных заключаются в его способности статистически значимо повышать латентное время иммобилизации (в 3,5 раза по сравнению с контролем, р<0,05), снижать количество эпизодов неподвижности и их общую продолжительность (в 11,5 и 16,1 раза соответственно, р<0,05 с контролем).

Примечание. И - интактные животные, Р - резерпиновая депрессия; * - статистически значимые различия с группой контроля (р≤0,05), в скобках - % изменения показателя животных с резерпиновой депрессией против соответствующего показателя интактных животных.

У животных, получавших имипрамин, статистически значимо снижается только количество эпизодов неподвижности (р<0,05 относительно контроля), а ее латентное время и общая продолжительность изменяются лишь в виде тенденции. Это соответствует хорошо известному факту постепенного развития специфического эффекта классических антидепрессантов, в том числе трициклиических, к которым относится имипрамин. Таким образом, исследуемый пептид характеризуется не только ярко выраженным по силе, но и быстро развивающимся антидепрессантным эффектом.

На фоне резерпиновой депрессии тетрапептид также проявляет статистически значимый антидепрессантный эффект относительно группы контроля. Как и в случае с интактными животными, тетрапептид повышает латентное время иммобилизации в 4,5 раза (р<0,05 относительно контроля), снижет количество эпизодов иммобилизациив 2,6 раза (р<0,05 относительно контроля) и ее общую продолжительность в 3,6 раза (р<0,05 относительно контроля). По этим показателям активность олигопептида превосходит таковую имипрамина.

Таким образом, установлено, что тетрапептид проявляет выраженные антидепрессантные свойства как у интактных животных, так и при резерпиновой депрессии. Это дает основания предположить, что он благоприятно модулирует моноаминергическую трансмиссию в головном мозге, как в норме, так и при модельной патологии, вызванной резерпином.

Анализ полученных результатов показал, что тетрапептид вводимый интраназально в дозе 0,1 мг/кг в течение 10 дней 1 раз в сутки, демонстрирует устойчивый ноотропный эффектна скополамин-индуцированной модели болезни Альцгеймера. Последний проявляется высокой антиамнестической активностью тетрапептида в тесте условного рефлекса пассивного избегания, сохраняющейся в течение не менее 10 суток, его способностью стимулировать когнитивные функции животных в тесте экстраполяционного избавления, нормализовать поведенческую активность в тесте открытого поля (улучшать ориентировочно-исследовательскую активность и уменьшать реакцию животных на стресс). При этом установлена тенденция к уменьшению проявлений депрессивной симптоматики крыс на фоне лечения тетрапептидом.

Нейропротекторные свойства в условиях модели БА проявляются тенденцией к снижению коэффициента массы головного мозга, повышением уровня церебрального серотонина, оптимизацией углеводного обмена в головном мозге (улучшением утилизации глюкозы и увеличением уровня АТФ). Продемонстрированы выраженные антиоксидантные свойства тетрапептида, проявляющиеся уменьшением количества продуктов пероксидного окисления липидов в головном мозге, повышением активности ферментов антиоксидантной защиты (супероксиддисмутаза) или снижением их компенсаторной гиперактивности (каталаза).

Установлены выраженные антидепрессантные свойства тетрапептида, проявляющиеся как у интактных животных, так и у животных с моделью резерпин-индуцированной депрессии. У последних они проявляются статистически достоверной редукцией депрессивной симптоматики (иммобилизации).

По комплексу выявленных фармакологических свойств тетрапептид перспективен для дальнейшего клинического примененияв качестве ноотропного, нейропротекторного и антидепрессантного средства.

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, и может быть использовано для терапии болезни Альцгеймера. Предложено применение пептида общей формулы ацетил-D-LYS-Lys-ARG-ARG-амид для лечения болезни Альцгеймера. Использование изобретения позволяет достичь устойчивого ноотропного эффекта на скополамин-индуцированной модели болезни Альцгеймера. 8 табл., 14 ил., 3 пр.

Применение пептида общей формулы ацетил- D-LYS-Lys-ARG-ARG-амид для лечения болезни Альцгеймера.