9-[2-(4-ИЗОПРОПИЛФЕНОКСИ)ЭТИЛ]АДЕНИН, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИДЕПРЕССАНТНЫМ И ПРОТИВОСТРЕССОРНЫМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2014 года по МПК A61K31/52 A61P25/24 

Изобретение относится к области медицины, в частности к производному аденина, обладающему выраженным антидепрессантным и противострессорным действием, который может быть использован для лечения широко распространенных нервно-психических заболеваний.

Согласно прогнозам Всемирной организации здравоохранения к 2025-2030 годам смертность от депрессий выйдет на 1-е место в мире, опередив среди других причин смертности сердечно-сосудистые, онкологические и инфекционные заболевания. Уже сейчас депрессия является одной из наиболее серьезных проблем здравоохранения. В современном мире депрессия становится все более распространенным и все более длительно текущим расстройством. Высокая частота депрессий и их негативное влияние на качество жизни продемонстрировано у больных с различными патологиями, включая онкологические заболевания, ВИЧ-инфекцию, вирусные гепатиты, кожные заболевания, ревматоидный артрит, язвенную болезнь. У пожилых больных особенно проблематично сочетание депрессии с соматическими заболеваниями. Наконец, депрессия является одной из главных причин суицида [Wittchen Н., Jacobi F., Rehm J. The size and burden of mental disorders and other disorders of the brain in Europe 2010 // Eur. Neuropsychopharmacol. - 2011. - Vol.21. - No. 9. - P.655-679].

Несмотря на то что к настоящему времени создан широкий ряд психотропных препаратов различных химических групп, проблема фармакотерапии депрессии далеко не решена. Многие из известных транквилизаторов, антидепрессантов и анксиолитиков отличаются либо низкой терапевтической активностью, либо наличием значительного числа нежелательных побочных эффектов. Например, назначение большинства современных антидепрессантов при курсовой терапии в адекватных терапевтически дозах приводит к положительному клиническому эффекту только у 65-75% больных. При этом антидепрессанты обладают рядом существенных недостатков: длительным латентным периодом действия, недостаточной широтой и стойкостью терапевтического эффекта, высокой вероятностью развития побочных эффектов, риском токсических эффектов при передозировке. В связи с этим по-прежнему актуальным остается создание психотропных препаратов, обладающих поливалентным действием, сочетающих собственно антидепрессивную активность со способностью положительно влиять на интеллектуально-мнестические функции и психическое состояние пациента, имеющих короткий латентный период действия и достаточную терапевтическую широту, обладающих минимумом побочных эффектов.

В свою очередь, стресс, по современным представлениям, лежит в основе огромного числа заболеваний и может привести как к новым болезням, так и к обострению хронических заболеваний, вызвать соматические, психоневрологические расстройства и множественные нейроэндокринные нарушения. Этиологическими факторами патогенеза стрессорных поражений могут быть бытовые, производственные, природные, техногенные, дорожно-транспортные происшествия, террористические акты или их угроза и многое другое [Международная классификация болезней, 10-й пересмотр (МКБ-10). Классификация психических и поведенческих расстройств. - С.-П.: Оверлайд, 1994]. Согласно данным Всемирной организации здравоохранения, ежегодно более 160 миллионов людей в мире подвергаются действию тяжелых психотравмирующих факторов, следствием чего являются различные психоневрологические и психосоматические патологии [Ursano R.S., Boldenberg M., Zhang I. Posttraumatic stress disorder and traumatic stress: from bench to bedside, from war to disaster // Ann. N.-Y. Acad. Sci. - 2010. - Vol.1208. - P.72-81].

Для предупреждения и лечения стрессорных заболеваний применяют антидепрессанты и анксиолитики, однако в 50% случаев такая терапия не обеспечивает должного эффекта [Ravindran I.N., Stein М.В. Pharmacotherapy of post-traumatic stress disorder // Carr. Top. Behav. Neurosci. - 2010. - Vol.2. - P.505-525], что определяет необходимость продолжения поиска новых более эффективных фармакологических средств для предупреждения и лечения психоневрологических и психосоматических патологий, связанных с тяжелыми стрессорными воздействиями.

Целью изобретения является разработка нового психотропного лекарственного средства, обладающего антидепрессантным действием и способного подавлять стрессиндуцированные морфосоматические, когнитивные и психоэмоциональные нарушения.

Сущность изобретения заключается в использовании 9-[2-(4-изопропилфенокси)этил]аденина формулы:

в качестве средства, обладающего антидепрессантным и противострессорным действием.

9-[2-(4-Изопропилфенокси)этил]аденин (лабораторный шифр BMA-99-82) относится к известным производным пурина, обладающим высокой активностью в отношении цитомегаловируса человека in vitro [Патент России №2233842 (2003) // Петров В.И., Озеров А.А., Новиков М.С., Покровский В.И., Покровский В.В., Де Клерк Э., Бальзарини Я. Производные пурина, обладающие противовирусной активностью (МПК C07D 473/34, A61K 31/52, A61P 31/12)]. При проведении углубленных доклинических исследований этого соединения с целью создания на его основе противовирусного лекарственного средства нами была выявлена выраженная психофармакологическая активность, в частности, антидепрессантное и противострессорное действие.

Для оценки противострессорного действия 9-[2-(4-изопропилфенокси)-этил]аденина были использованы следующие методы:

Оценка общесоматического статуса животных:

1. Изучение динамики массы тела.

2. Наблюдение за поведением животных в домашней клетке с оценкой реакции на тактильные, болевые, звуковые раздражители.

Оценка эмоционального статуса животных:

1. Тест принудительного неизбегаемого плавания по Порсольту [Андреева Н.И. Методические указания по изучению антидепрессантной активности фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М.: ИИА «Ремедиум», 2000. - С.121-126].

2. Тест потребления/предпочтения раствора сахарозы (ШПС). [Саркисова К.Ю., Фоломкина А.А. Влияние селективного ингибитора обратного захвата серотонина флуоксетина на симптомы депрессивноподобного поведения у крыс линии WAG/RIJ // Журн. высш. нервн. деятельн. - 2010. - Т.60. - №1. - С.98-108].

3. Тест «Открытое поле» (ОП) [Воронина Т.А., Середенин С.Б. Методические указания по изучению транквилизирующего (анксиолитического) действия фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М.: ИИА «Ремедиум», 2005. - С.126-130].

4. Тест «Приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) [Воронина Т.А., Середенин С.Б. Методические указания по изучению транквилизирующего (анксиолитического) действия фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М.: ИИА «Ремедиум», 2005. - С.126-130].

5. Тест определения порога спровоцированной немотивированной агрессии [Козловский В.Л., Прахье И.В. Влияние блокаторов кальциевых каналов на эффекты антидепрессантов // Эксперим. клинич. фармакол. - 1996. - Т.59. - №5. - С.9-11].

Оценка когнитивных функций:

1. Тест «условная реакция пассивного избегания» (УРПИ) [Воронина Т.А., Островская Р.У. Методические указания по изучению ноотропной активности фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М.: ОАО Издательство «Медицина», 2005. - С.295-308].

2. Тест «экстраполяционного избавления» (ТЭИ) [Воронина Т.А., Островская Р.У. Методические указания по изучению ноотропной активности фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - С.295-308].

Оценка выраженности стрессобусловленных морфосоматических изменений:

1. Определение степени инволюции лимфоидных органов - тимуса и селезенки.

2. Определение степени гипертрофии надпочечников.

3. Определение степени изъязвления слизистой оболочки желудка.

Следующие примеры иллюстрируют сущность изобретения.

Пример 1. Влияние 9-[2-(4-изопропилфенокси)этил]аденина на общесоматический статус стрессированных животных.

Для оценки антистрессорного действия была выбрана модель комбинированного воздействия нескольких стрессирующих факторов. Такая модель позволяет одновременно получить у животных нарушения общесоматического статуса, выраженную «триаду Селье» - инволюцию лимфоидных органов (тимуса и селезенки), гипертрофию надпочечников и изъязвление слизистой оболочки желудка, а также нарушения психоэмоционального состояния (тревожно-депрессивных, агрессивных) и когнитивной функции. В исследовании использовалась жесткая модель с иммобилизацией и поочередным воздействием громкого звука, пульсирующего света и вибрации, что, безусловно, является воздействием исключительно угрожающего или даже катастрофического характера, способного вызвать дистресс у любого экспериментального животного. В качестве препаратов сравнения были использованы антидепрессанты имипрамин и сертралин и анксиолитик с ноотропным действием фенибут.

Моделирование стрессорных повреждений у экспериментальных животных проводилось в установке, представляющей темную камеру шириной 28 см, длиной 36 см и высотой 28 см, разделенную на 6 изолированных отсеков одинакового объема и рассчитанную на одновременное стрессирование от 1 до 6 экспериментальных животных, закрепленную на наклонной под углом 10° плоской металлической платформе. Платформа оборудована электроприводом, совершающим качательные движения с регулируемой частотой от 1 до 50 колебаний в мин. Камера снабжена непрозрачной крышкой, в стенке камеры по периметру расположены вентиляционные отверстия, обеспечивающие циркуляцию воздуха. Крышка камеры оснащена источником звукового шума и 3 источниками света, расположенными на высоте 28 см. Источники света снабжены реле-прерывателем с временем срабатывания каждые 2 с, что позволяет получить пульсирующий свет. Крыс помещают в изолированные отсеки и в течение 30 мин подвергают воздействию различных стрессирующих факторов: пульсирующего света, громкого звука и вибрации. Установка позволяет производить комбинирование нескольких стрессорных раздражителей. Для моделирования у животных тяжелых стрессорных нарушений соматического, психоневрологического и когнитивного статуса они подверглись длительному хроническому неизбегаемому стрессированию в течение 10 дней (ежедневно по 30 мин) со сменой разномодальных стрессорных раздражителей каждые 5 мин. Смена раздражителей производится по стахостической схеме таким образом, чтобы каждое последующее стрессирующее воздействие было непредсказуемым для животных. Например, в первый день стрессирования последовательность раздражителей следующая: первые 5 мин - вибрация, вторые 5 мин - резкий громкий звук, третьи 5 мин - пульсирующий свет, четвертые 5 мин - вибрация и звук, пятые 5 мин - вибрация и свет, шестые 5 мин - звук и свет. Далее во второй день стрессирования наносятся раздражители, начиная с того, который был вторым в первый день, в третий день - с того, который в первый день был третьим и так далее. В таких условиях длительного неизбегаемого непредсказуемого стрессирующего воздействия для животных создаются условия эмоционального стресса и фрустрации, приводящие к формированию отчаяния, терминологически определяемого как «выученная беспомощность» и проявляющегося в развитии стойкого тревожно-депрессивного состояния, нарушения когнитивной функции, выраженных морфосоматических изменений. Всего было использовано 6 групп по 8 животных - 48 животных (самцы крыс). Исследуемое соединение и препараты сравнения вводили животным на фоне уже развившихся психоневрологических, когнитивных и морфосоматических поражений с первым введением через 24 ч после последнего стрессирования 10-дневным курсом (ежедневно перорально однократно) в следующих дозах: ВМА-99-82 - 30 мг/кг, имипрамин - 15 мг/кг, сертралин - 10 мг/кг и фенибут - 25 мг/кг. Указанные дозы являются наиболее эффективными по результатам ранее проведенных экспериментальных исследований и на основе анализа литературы. Оценка поведенческих нарушений у животных с использованием психофармакологических тестов выполнена после однократного введения веществ, а затем повторно после 10-дневного курсового введения веществ (тесты выполнялись через 45 мин после последнего введения).

При выполнении каждой серии экспериментов в течение всего времени наблюдения фиксировали динамику изменения массы тела у животных опытных и контрольных групп путем ежедневного взвешивания на электронных весах в одно и то же время - непосредственно перед введением изучаемого соединения. Затем рассчитывали средние показатели массы тела животных по группам. Кроме того, ежедневно учитывали визуально фиксируемые показатели общесоматического статуса животных:

1. Общее состояние, внешний вид (состояние слизистых оболочек - окраска, отечность, наличие и характер выделений; состояние шерстяного покрова - шерсть взъерошенная или гладкая, блестящая или тусклая); поведение животных в домашней клетке (активность, наличие агрессивных атак, наличие ауто- и аллогруминга).

2. Нервно-мышечная возбудимость: реакция на внешние раздражители - звуковые (постукивание по клетке), тактильные (прикосновение), болевые (сдавление кончика хвоста).

3. Функциональное состояние вегетативной нервной системы: птозы, особенности уринации и дефекации, саливация.

4. Порог болевой чувствительности у животных методом раздражения лап электрическим током.

Результаты, суммирующие общесоматическое состояние стрессированных животных, представлены в табл.1 и 2.

Таблица 1 Динамика массы тела у стрессированных животных Группы животных Масса тела (г) 1 день введения 2 день введения 3 день введения 4 день введения 5 день введения 6 день введения 7 день введения 8 день введения 9 день введения Контроль интактный 329±18 321±16 319±15 316±16 317±14 318±11 320±14 324±14 329±14 Контроль + стресс 285±30 270±23 274±21 276±20 282±24 288±25 288±23 289±24 292±26 ВМА-99-82 288±11 308±12 315±5 317±16 318±13 324±15 327±15 332±15 327±14 Имипрамин 278±17 274±17 268±16 264±13 271±112 274±14 283±14 283±14 286±13 Сертрлин 282±17 268±15 264±19 267±19 275±18 285±16 289±15 297±16 301±16 Фенибут 302±23 305±26 304±23 309±18 311±24 316±23 314±29 31±27 320±22

Таблица 2 Порог болевой чувствительности у стрессированных животных на фоне введения соединения ВМА-99-82 и препаратов сравнения Регистрируемые показатели (M±m) Экспериментальные группы Контроль интактный Контроль+стресс ВМА-99-82 Имипрамин Сертралин Фенибут Порог вокализации, В 30,3±2,4 22,7±2,2# 32,7±2,8* 28,3±2,0 25,3±2,1 29,6±2,0 Примечание: здесь и далее # - p<0,05; ## - p<0,01 - статистическая значимость различий по сравнению с показателем группы животных «Контроль интактный» соответствующего дня исследования; * - p<0,05; ** - p<0,01 - статистическая значимость различий по сравнению с показателем группы животных «Контроль+стресс» соответствующего дня исследования (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Ньюмена-Кейлса).

Хроническое 10-дневное стрессовое воздействие приводило к ухудшению общего состояния животных всех опытных групп. При визуальном осмотре по окончании стрессирования кожа и слизистые крыс имели физиологическую окраску, рефлексы были живыми, однако шерстяной покров выглядел неопрятно, был взъерошен. Поведение крыс характеризовалось общим неспецифическим возбуждением и невротизацией. У животных, подвергшихся хроническому стрессорному воздействию, отмечался частый ауто- и аллобарберинг (характеризующий стресс у грызунов), в результате которого на шерстяном покрове крыс наблюдались участки очаговой аллопеции (чаще на мордочке вокруг носа, боках и дорсальной поверхности шеи, у некоторых особей была выгрызена часть вибрисс). На взятие и перемещение домашних клеток животные реагировали вокализацией, локомоторным возбуждением, принятием оборонительных и агрессивных поз и агрессивными атаками на решетки клеток. Реакции на внешние раздражители отражали явления возбуждения и гиперчувствительности: на тактильное, болевое и звуковое раздражение крысы реагировали резким вздрагиванием, вокализацией и попытками атаковать экспериментатора. Агрессивность стрессированных крыс проявлялась и без предъявления им внешних раздражителей - при наблюдении за поведением крыс в домашних клетках у животных часто отмечались конфронтации. Помимо этого, тревожность и возбуждение животных выражались в совершении частых вертикальных стоек и кратковременного груминга. Состояние животных на момент окончания хронического стрессорного воздействия можно оценить как «средней тяжести».

Интактные контрольные крысы на протяжении всей экспериментальной серии с моделированием «выученной беспомощности» сохраняли удовлетворительное состояние, нормальную поведенческую активность и адекватную реакцию на внешние раздражители. Внешний вид животных данной группы был опрятным, у них была сохранной мотивация к поведению умывания и чистки (грумингу). Цвет кожи и слизистых, корнеальные рефлексы, фотореакция зрачков на свет, частота и характер уринаций и дефекаций у данных животных не имели очевидных патологических изменений. Шерстяной покров выглядел опрятно, часто отмечался продолжительный «комфортный» аутогруминг.

Курсовое лечебное введение изучаемого вещества способствовало нивелированию явлений невротизации животных. У животных, получавших соединение ВМА-99-82, в динамике исследования постепенно уменьшалась выраженность возбуждения и гиперреактивности в отношении внешних раздражителей. Животные реже вокализировали, реже наблюдались агрессивные атаки и позы. Нормализовалась поведенческая активность в клетке, уменьшалась локомоторная активность, появлялся продолжительный груминг. К 10-му дню введения исследуемого вещества животные стали выглядеть более опрятно, их состояние нормализовалось и было удовлетворительным.

Животные, которым вводили соединение ВМА-99-82, отличались меньшей выраженностью возбуждения и агрессивности в сравнении с контрольной стрессированной группой животных. По окончании стрессирования они не проявляли агрессивных атак в клетке и при нанесении внешних раздражителей выглядели более опрятно. Их реакция на тактильные, звуковые и болевые раздражители практически не отличалась от таковой у интактных контрольных крыс. Меньшая выраженность стрессобусловленной симптоматики у животных данной группы может быть следствием противострессорного действия изучаемого вещества.

В данной серии экспериментов у животных, получавших курсовое лечебное введение эталонных веществ с антидепрессантной активностью - имипрамина, сертралина и фенибута, отмечались различные варианты динамики массы тела (табл: 1). Животные всех этих опытных групп в процессе повторяющихся актов стрессирования теряли в массе в среднем на 13-15% по сравнению с исходными показателями, что является следствием хронического стресса. У животных группы «Контроль+стресс» со второго дня после прекращения стрессирования масса постепенно увеличивалась, что отражает улучшение состояния и снижение проявлений стресса, однако до последнего дня наблюдения оставалась статистически значимо меньшей, чем у животных интактного контроля. У крыс, которые получали имипрамин и сертралин, в первые три-четыре дня после окончания стрессового воздействия масса тела умеренно снижалась, а к четвертому дню стабилизировалась и начинала расти с 5-6 дня, а после прекращения стрессирования средние показатели массы у животных этих групп уже не отличались от показателей интактного контроля. У животных, которым вводили лечебным курсом фенибут, так же как и в случае ВМА-99-82, отмечались стабильные прибавки массы тела в динамике в течение всего периода наблюдения.

В группе животных «Контроль+стресс» отмечалось статистически значимое по сравнению с интактными крысами снижение порога болевой чувствительности, что может быть следствием общей невротизации животных и повышением эмоциональной реакции на боль (табл.2). У животных, получавших однократно соединение ВМА-99-82 и имипрамин, порог болевой чувствительности был статистически значимо выше, чем у группы «Контроль+стресс», что может быть результатом противострессорного влияния веществ.

Пример 2. Влияние 9-[2-(4-изопропилфенокси)этил]аденина на эмоциональное состояние стрессированных животных.

Тест принудительного неизбегаемого плавания по Порсольту. Установка для выполнения теста - цилиндр из прозрачного акрилового пластика диаметром 20 см, высотой 45 см (производитель ООО «Открытая Наука», Москва, Россия). Классический вариант теста осуществляется в 2 этапа. На 1-м этапе интактные животные подвергаются стрессированию без введения исследуемых соединений. Крыс на 15 мин помещают в емкость, заполненную водой с температурой 17-19°C до такого уровня, чтобы животные не могли опираться задними лапами и хвостом о дно. 2-й этап начинается через 24 ч с введения исследуемых веществ с учетом пика их действия, затем животных вновь помещают в емкость с водой при тех же условиях, что и в первый день, регистрируя в течение 300 с показатели депрессивного поведения: латентный период иммобилизации (скорость развития депрессивного состояния); время нахождения крыс в состоянии иммобилизации (животные пассивно плавают в воде со слегка поднятой головой) - поведенческий коррелят отчаяния, одно из патогномоничных проявлений тревоги и депрессии, обусловленных истощением вследствие стрессорного воздействия. Увеличение латентного периода иммобилизации, снижение ее длительности, уменьшение продолжительности пассивного плавания, увеличение продолжительности активного плавания и количества прыжков под влиянием исследуемого соединения по сравнению с контрольной группой расценивается как наличие у него выраженных противострессорных свойств.

Тест потребления/предпочтения раствора сахарозы (П/ПС). Тест альтернативного выбора сахароза/вода принят для оценки поведения переживания удовольствия у животных. Потребление животными сладкого 20% раствора сахарозы является гедоническим показателем, широко используемым для оценки чувствительности животных к подкреплению, вызывающему чувство удовольствия. Для выполнения теста животных на 1 ч помещают по одному в клетки (после предварительной 8-часовой водной и пищевой депривации), в которых в условиях свободного выбора им предъявляют две поилки: одну с 20% раствором сахарозы, другую с обычной водой. Потребление сахарозы и воды определяют как разницу в массе поилок до и после тестирования. Вычисляют также коэффициент потребления сахарозы (КПС) в г/100 г массы тела животного по формуле: КПС=фактическое потребление сахарозы (г)×100/фактическая масса животного (г). Помимо этого, оценивают предпочтение сахарозы (ПС) в % к общему потреблению жидкости по формуле: ПС=потребление сахарозы (г)×100%/суммарное потребление жидкости (сахароза+вода) (г). Сниженное потребление сахарозы свидетельствует о появлении признаков ангедонии, которая является надежным показателем депрессивного состояния животных, обусловленного стрессом или иным повреждающим фактором. Уменьшение общего потребления жидкости расценивается как результат подавления одной из жизненно важных мотиваций. Увеличение потребления и предпочтения сахарозы, а также сохранение мотивации утоления жажды при моделировании стрессорных воздействий на животных является показателем противострессорного действия.

Тест «Открытое поле» (ОП). Методика открытого поля используется для изучения влияния вещества на показатели спонтанного индивидуального поведения животных (двигательную, ориентировочно-исследовательскую активность и эмоциональный статус), позволяет выявить нарушения их психоэмоционального состояния. Эксперимент проводится в круглой арене диаметром 97 см с высотой стенок 42 см. Пол камеры разделен черной краской на 25 равных квадратов размером 5×5 см с выделением центральной зоны поля. Пол камеры оснащен 16 отверстиями диаметром 2 см (производитель ООО «Открытая Наука», Москва, Россия). Камера освещается лампой мощностью 90 Лк, расположенной над центром поля на высоте 150 см. Крысу помещают в центр камеры хвостом к экспериментатору и наблюдают за ее поведением в течение 3 мин. В тесте регистрируются: латентный период выхода из центра поля, число пересеченных квадратов на периферии, число пересеченных ярко освещенных квадратов, количество вертикальных стоек - пристеночных и свободных, количество заглядываний в отверстия, количество уринаций и дефекаций, число актов кратковременного (до 5 с) груминга. Латентный период выхода из центра поля (время от момента помещения животного в установку для проведения теста до выхода его из центральной зоны поля) является показателем скорости ориентировочных реакций, количество пересеченных квадратов характеризует спонтанную двигательную активность животных, сумма стоек и заглядываний в отверстия - суммарную ориентировочно-исследовательскую активность. Пристеночные стойки являются показателем тревожного поведения, настороженности, свободные стойки характеризуют спокойное исследовательское поведение, чем меньше животные совершают пристеночных стоек и больше свободных, тем ниже у них уровень тревожности. Число посещений центральной ярко освещенной зоны (аверсивной для норных грызунов) также свидетельствует об уровне тревожности животного (чем меньше тревожность - тем их больше, и наоборот). Поведение животного при умывании и чистке (груминг) отражает степень его эмоционального напряжения: частый кратковременный (до 5 с) - тревожное состояние, редкий и продолжительный - состояние комфорта. Вегетативные показатели стресса (число болюсов дефекации и уринации) также характеризуют эмоциональное напряжение животных. Уменьшение числа пристеночных стоек, актов кратковременного груминга, числа болюсов дефекации и уринации в сочетании с увеличением количества свободных стоек, посещений центра поля у животных, получающих испытуемые вещества, по сравнению с группой контрольных стрессированных животных свидетельствует о его противострессорном действии.

Тест «Приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ). Методика приподнятого крестообразного лабиринта используется для изучения влияния вещества на выраженность эмоциональной реакции страха и тревоги у испытуемых животных и выявления антистрессорной и/или анксиолитической активности. Она основана на предпочтении грызунами темных нор, естественного страха нахождения на открытых площадках и падения с высоты. При стрессорном воздействии в зависимости от его силы и продолжительности у животных может наблюдаться усиление тревоги и страха. Эксперимент проводится в установке (лабиринте) из неламинированного поливинилхлорида серого цвета, состоящей из центральной площадки размером 14×14 см, от которой крестообразно расходятся под прямым углом четыре рукава размерами 50×14 см каждый. Два противоположных рукава - открытые с высотой борта 1 см, и два - закрытые, темные, ограниченные по бокам бортами высотой 30 см. Лабиринт устанавливается на крестовину алюминиевой тележки высотой 55 см, шириной 100 см (производитель ООО «Открытая Наука», Москва, Россия). Тестируемое животное помещают на центральную площадку лабиринта головой к открытому рукаву и в течение 3 мин ведут наблюдение за ним. В тесте регистрируются: время пребывания животных на центральной площадке, в открытых и закрытых рукавах, количество стоек в закрытых и открытых рукавах, число свешиваний с открытых рукавов и количество заходов в центральную зону, открытые и закрытые рукава. Пересечение крысой границ какого-либо отсека задними лапами определялось как заход животного в отсек лабиринта. Увеличение времени нахождения в светлых рукавах, числа заходов в них, вертикальных стоек в открытых рукавах и свешиваний с них свидетельствует о наличии противострессорного и анксиолитического эффекта у исследуемого вещества. Продолжительность пребывания на центральной площадке позволяет оценить скорость принятия решения животным. Общая двигательная активность оценивается по общему числу заходов в открытые, закрытые рукава и центр лабиринта.

Тест определения порога спровоцированной немотивированной агрессии. Оценку выраженности агрессивного поведения крыс проводили в паре животных, формируемой случайным образом. Крыс парами высаживали на электродный пол стандартной камеры из органического стекла размером 27,5×27,5×40 см, на который с помощью стимулятора подается напряжение постепенно увеличивающейся амплитуды, начиная с 20 В. Напряжение подается периодами по 3 с, разделенными паузами в 1 с. Если после трех предъявлений стимула одной интенсивности агрессивные реакции не возникают, напряжение увеличивается на 1 В и продолжается стимуляция до возникновения агрессии в ответ не менее чем на три импульса одной силы. Это напряжение считается пороговым. Регистрация напряжения тока, спровоцировавшего драку в паре животных, является объективным критерием, отражающим порог спровоцированной агрессии. Агрессивной реакцией считают такое поведение крыс, при котором они обе встают на задние лапы мордами друг к другу и стараются нанести удары передними и задними конечностями и укусить друг друга. Для веществ с анксиолитическим и антидепрессивным действием характерно повышение порога агрессивности - антиагрессивное действие.

Суммарные данные о влиянии соединения ВМА-99-82 и препаратов сравнения на эмоциональный статус у стрессированных животных (с «выученной беспомощностью») представлены в таблицах 3-10.

В тесте Порсолта у животных группы «Контроль+стресс» отмечалось выраженное депрессивное состояние: статистически значимо снижался латентный период иммобилизации и показатели активного избегания аверсивной ситуации - количество прыжков и длительность активного плавания, а также увеличивалось время иммобильности (табл.3 и 4). Соединение ВМА-99-82, а также все изученные препараты сравнения статистически значимо уменьшали проявления депрессивного состояния у животных - увеличивали латентный период иммобилизации, количество прыжков и время активного плавания, уменьшали длительность иммобильности. По выраженности этого эффекта соединение ВМА-99-82 было сопоставимо с сертралином и незначительно превосходило имипрамин и фенибут. Необходимо отметить, что на данной модели депрессии эффективность всех изученных веществ возрастала на фоне их курсового лечебного применения. Влияние соединения ВМА-99-82 на большинство показателей депрессивного поведения при повторном тестировании после курсового применения переставало быть статистически значимым, что может быть следствием уменьшения выраженности депрессивного состояния у контрольной группы животных («Контроль+стресс»).

Таблица 3 Выраженность депрессивного поведения в тесте Порсолта у стрессированных животных на фоне введения ВМА-99-82 и препаратов сравнения Регистрируемые показатели (M±m) Экспериментальные группы Контроль интактный Контроль+стресс ВМА-99-82 Имипрамин Сертралин Фенибут 1-кратное введение Латентный период иммобилизации, с 96,7±6,6 53,2±4,5 75,8±6,2* 77,1±6,5* 63,5±5,6 66,2±8,1 Длительность иммобилизации, с 44,0±4,0 101,3±7,8 77,5±5,5* 59,3±4,8** 74,3±5,8* 83,0±7,6** 10-дневное введение Латентный период иммобилизации, с 89,5±8,1 74,8±6,6 91,2±6,3 125,3±9,4** 96,2±6,3* 90,3±8,8* Длительность иммобилизации, с 49,5±4,1 81,5±5,2## 64,1±5,0* 47,3±3,5** 61,4±5,0 73,2±5,8**

Результаты исследования показали, что у животных с «выученной беспомощностью» развивается выраженное подавление гедонической мотивации, характерное для депрессии, выражающееся в статистически значимом снижении коэффициента потребления и процента предпочтения 20% раствора сахарозы (табл.5). Соединение ВМА-99-82, а также все препараты сравнения статистически значимо увеличивали потребление и процент предпочтения сахарозы у животных, что также свидетельствует о наличии у них антистрессорного действия. По выраженности данного эффекта соединение ВМА-99-82 было сопоставимо с сертралином, имипрамином и фенибутом. Выраженное антидепрессивное действие изучаемого вещества на модели стрессиндуцированной депрессии «выученная беспомощность» может быть следствием как собственно антидепрессивного эффекта, так и его противострессорной активности.

Таблица 4 Выраженность активного поведения избегания аверсивной ситуации в тесте Порсолта у стрессированных животных на фоне введения ВМА-99-82 и препаратов сравнения Регистрируемые показатели (M±m) Экспериментальные группы Контроль интактный Контроль + стресс ВМА-99-82 Имипрамин Сертралин Фенибут 1-кратное введение Количество прыжков 10,8±0,9 4,7±0,8## 8,0±0,7* 9,5±0,6** 6,3±0,8 7,9±0,6 Длительность активного плавания, с 138,7±9,4 79,3±5,4# 120,2±9,3** 153,5±10,2** 108,3±8,7* 132,0±11,0* 10-дневное введение Количество прыжков 8,7±0,9 7,2±0,8 6,8±0,7 11,5±0,8** 10,2±0,8* 6,5±1,0 Длительность активного плавания, с 122,5±8,6 95,3±7,3# 115,7±10,7 166,5±10,8** 153,5±11,4** 119,0±9,6

В тесте «Открытое поле» хроническое стрессирование и формирование «выученной беспомощности» приводило к повышению уровня тревожности у животных контрольной группы («Контроль+стресс»), что выражалось в статистически значимом уменьшении числа заходов в центр, увеличении количества пристеночных стоек, актов кратковременного груминга и фекальных болюсов у животных (табл.6). Все изученные препараты сравнения после однократного и в большей степени после курсового введения увеличивали у животных число заходов в центр, уменьшали количество пристеночных стоек, актов кратковременного («тревожного») груминга и фекальных болюсов у животных - подавляли проявления тревожности, обусловленной стрессорным воздействием. В данном тесте в наибольшей степени анксиолитические свойства были выражены у фенибута.

Соединение ВМА-99-82 также уменьшало выраженность проявлений тревоги у животных с «выученной беспомощностью» - проявляло умеренные анксиолитические свойства, при этом статистически значимое влияние на показатели тревожности в «Открытом поле» оно оказывало при первом тестировании после однократного введения. При повторном тестировании в «Открытом поле» после курсового введения показатели теста у животных, получавших ВМА-99-82 не имели статистически значимых различий как с интактным контролем, так и с группой «Контроль+стресс».

Таблица 5 Выраженность гедонической мотивации в тесте потребления/предпочтения сахарозы у стрессированных животных на фоне введения ВМА-99-82 и препаратов сравнения Регистрируемые показатели (M±m) Экспериментальные группы Контроль интактный Контроль + стресс ВМА-99-82 Имипрамин Сертралин Фенибут 5-дневное введение Коэффициент потребления сахарозы (г/100 г массы тела) 4,7±0,6 1,3±0,2## 3,7±0,5** 2,8±0,6* 4,2±0,3** 3,4±0,3 Потребление (предпочтение) сахарозы в % к общему потреблению жидкости 82,3±4,1 36,2±3,5## 55,5±3,4** 48,7±3,2* 54,7±2,8** 49,0±3,1 9-дневное введение Коэффициент потребления сахарозы (г/100 г массы тела) 3,5±0,4 2,2±0,4# 3,3±0,5 3,8±0,6* 3,5±0,3 * 3,5±0,4 Потребление (предпочтение) сахарозы в % к общему потреблению жидкости 68,0±4,3 47,7±3,9## 63,5±4,1** 65,5±5,1* 77,2±4,3 ** 58,0±5,2

Таблица 6 Выраженность локомоторного и исследовательского поведения в «Открытом поле» у стрессированных животных после введения ВМА-99-82 и препаратов сравнения Регистрируемые показатели (M±m) Экспериментальные группы Контроль интактный Контроль + стресс ВМА-99-82 Сертралин Имипрамин Фенибут Число пересеченных центральных квадратов 30,5±2,2 15,5±1,3## 24,0±1,8** 19,2±1,6 20,2±1,2* 20,2±1,2 Число пересеченных пристеночных квадратов 6,5±0,7 12,2±0,7## 6,8±0,5 6,7±0,8 8,7±0,4* 7,3±0,6 Число заходов в центр 1,5±0,2 0,3±0,2## 0,7±0,2 0,8±0,2 0,8±0,3 1,2±0,3 Число пристеночных стоек 3,7±0,3 5,2±0,5# 3,5±0,3 * 3,7±0,3* 4,5±0,4 3,3±0,3 Число актов кратковременного груминга 2,7±0,3 7,2±0,6## 5,0±0,5* 5,3±0,5* 5,8±0,7 3,9±0,9 Кол-во фекальных болюсов 2,7±0,3 5,8±0,5## 2,5±0,3** 4,5±0,4 5,0±0,6 2,7±0,7

У животных, получавших соединение ВМА-99-82, наблюдалось в сравнении с контрольной группой больше выходов в центральную зону, большее число пересеченных центральных квадратов и значительно меньше пристеночных стоек, пересеченных периферийных квадратов (табл.6), число актов кратковременного груминга и фекальных болюсов. Полученные данные свидетельствуют о том, что соединение ВМА-99-82 уменьшает явления дистресса, который четко наблюдается у животных контрольной группы, подвергнутых хроническому комбинированному стрессированию.

В «Приподнятом крестообразном лабиринте» у стрессированных животных контрольной группы («Контроль+стресс») также отмечались выраженные поведенческие нарушения, характеризующие высокую тревожность: статистически значимо уменьшалось время пребывания в открытых рукавах, число заходов в них и свешиваний с открытых рукавов, увеличивалось число выглядываний из закрытых рукавов (оценок риска) (табл.7). Соединение ВМА-99-82 (преимущественно при тестировании после однократного применения), а также все препараты сравнения (в большей степени при тестировании после курсового введения) уменьшали выраженность перечисленных проявлений тревоги у животных. По степени предупреждения и устранения тревожной симптоматики в данном тесте соединение ВМА-99-82 незначительно уступало фенибуту и было сопоставимо с имипрамином и сертралином.

Помимо перечисленного, при оценке эмоционального статуса у стрессированных животных группы «Контроль+стресс» в тесте немотивированной агрессии, спровоцированной электроболевым раздражением, отмечалось статистически значимое снижение порога агрессивной реакции, что согласуется с результатами визуальных наблюдений за поведением животных в домашней клетке (табл.8). Соединение ВМА-99-82, а также все препараты сравнения увеличивали данный показатель, то есть подавляли агрессивность у животных. По выраженности данного эффекта изучаемое вещество превосходило сертралин и фенибут и было сопоставимо с имипрамином.

Таблица 7 Выраженность поведенческих проявлений тревожности в «Приподнятом крестообразном лабиринте» у стрессированных животных на фоне введения ВМА 99-82 и препаратов сравнения Регистрируемые
показатели (M±m) Экспериментальные группы Контроль интактный Контроль+стресс ВМА-99-82 Сертралин Имипрамин Фениоут 1-кратное введение Длительность пребывания в открытых рукавах, с 37,7±4,0 14,5±1,6## 30,2±1,8* 17,7±1,3 19,5±1,3* 23,3±1,6 Кол-во заходов в открытые рукава 2,7±0,3 1,3±0,2## 2,2±0,2* 2,2±0,3* 1,7±0,3 1,6±0,2 Количество свешиваний с открытых рукавов 2,5±0,4 0,3±0,2## 1,8±0,5* 0,8±0,4 1,7±0,5* 2,1±0,3 Количество выглядываний из закрытых рукавов 2,7±0,3 5,5±0,4## 4,8±0,5 4,5±0,6 5,0±0,4 3,9±0,4 10-дневное введение Длительность пребывания в открытых рукавах, с 49,2±3,8 32,0±3,0## 51,5±3,5 57,7±5,4** 46,3±4,4* 43,2±3,3 Кол-во заходов в открытые рукава 3,3±0,3 1,8±0,2## 2,3±0,3 2,8±0,3* 2,3±0,4 2,1±0,2 Количество свешиваний с открытых рукавов 3,8±0,5 2,3±0,4# 3,2±0,3 2,8±0,5 4,9±0,5** 4,1±0,5 Количество выглядываний из закрытых рукавов 2,2±0,3 3,7±0,3## 3,1±0,4 2,8±0,4 3,0±0,5 2,9±0,3

Таблица 8 Порог спровоцированной немотивированной агрессии у стрессированных животных на фоне введения ВМА-99-82 и препаратов сравнения Регистрируемые показатели (M±m) Экспериментальные группы Контроль интактный Контроль + стресс ВМА-99-82 Сертралин Имипрамин Фенибут 4-дневное введение Порог агрессивной реакции, В 38,1±2,9 20,4±1,5## 31,3±2,6** 25,3±1,1* 26,7±1,1* 28,3±1,8* 9-дневное введение Порог агрессивной реакции, В 31,0±1,6 26,8±±1,7 34,3±2,1* 35,7±1,6* 35,3±2,0* 32,6±3,1

Пример 3. Влияние 9-[2-(4-изопропилфенокси)этил]аденина на когнитивную функцию стрессированных животных.

Для изучения когнитивных функций было использовано два методических подхода: тест условной реакции пассивного избегания и тест экстраполяционного избавления.

Тест «Условная реакция пассивного избегания» (УРПИ). Обучение животных проводилось в установке, состоящей из двух смежных отсеков, один из которых размером 60×40×40 см открыт сверху и ярко освещен (90 Лк). Другая камера с электрифицированным полом меньшего размера (15×15×15 см) - затемненная, закрытая со всех сторон и имеющая отверстие (8×8 см) для сообщения с большим отсеком. Эксперимент выполнялся в два этапа: на первом этапе осуществляется выработка у животных условного рефлекса пассивного избегания, на втором этапе через 24 ч определяется сохранность памятного следа. Во время обучения тестируемое животное помещается на середину площадки освещенного отсека хвостом к отверстию в темный отсек. В течение 3 мин за животным ведется визуальное наблюдение. После каждого захода в темный отсек животному наносится электроболевое раздражение (40 B, 3 импульса по 1 с, с интервалом 0,5 с). Животных, не заходящих в темную камеру за это время, из опыта исключали. На этапе обучения животных регистрируются следующие показатели: время от момента помещения животного в середину площадки до первого захода в темный отсек (латентный период первого захода) и количество заходов в него. Определение сохранности памятного следа выполняется таким же образом, как на первом этапе выработки условного рефлекса пассивного избегания: в течение 3 мин ведется визуальное наблюдение за обученным животным, помещенным в ту же установку, однако в случае захода животного в темный отсек электроболевая стимуляция не выполняется. В эксперименте сравнивается латентный период первого захода животных в темный отсек и количество заходов в него при воспроизведении памятного следа с аналогичными показателями при обучении. Увеличение латентного периода первого захода в темный отсек, уменьшение числа заходов в него, а также уменьшение общего времени нахождения в темном отсеке, регистрируемого при воспроизведениях навыка, указывают на обученность животного и сохранность в памяти информации об аверсивности темного отсека.

Тест «Экстраполяционного избавления» (ТЭИ). Обучение животных проводилось в цилиндрической пластиковой емкости (диаметр 35 см, высота 45 см), снабженной съемным внутренним цилиндром из прозрачного акрилового пластика (диаметр 9 см, высота 23 см), зафиксированным в центре внешней емкости при помощи специальных креплений (производитель ООО «Открытая Наука», Москва, Россия). Внешняя емкость заполняется водой с температурой 16-18°C до такого уровня, чтобы края внутреннего цилиндра в зафиксированном положении были погружены в нее на 2,5 см. Эксперимент выполняется в два этапа: на первом этапе у животных вырабатывается условный рефлекс избавления от аверсивной среды, на втором этапе через 24 ч осуществляется проверка сохранности навыка экстраполяционного избавления. Во время обучения тестируемое животное помещалось в аквариум под колпак. В течение 3 мин за ним велось визуальное наблюдение. Животные подныривают под края колпака и избавляются, таким образом, от аверсивной водной среды. Не решившие задачу животные из опыта исключаются. На этапе обучения животных регистрируются следующие показатели: время от момента погружения животного в воду до начала активного плавания (латентный период двигательной активности), время иммобилизации (животное пассивно плавает в воде со слегка поднятой головой, все четыре конечности неподвижны), количество прыжков в колпаке (активные попытки выпрыгнуть из воды) и время от момента погружения животного в воду до подныривания под края колпака (латентный период подныривания). На этапе воспроизведения показатели регистрируются в течение 3 мин аналогично. В эксперименте сравниваются показатели, определяющие степень обученности животного и состояние памяти: латентный период подныривания животного при обучении и воспроизведении навыка экстраполяционного избавления (чем значительнее он уменьшается при воспроизведении навыка, тем больше обученность животного и сохраннее памятный след). У животных, подвергшихся стрессу, особенно тяжелому и много раз повторяющемуся, отмечается не только тревожно-депрессивное состояние, но и снижение когнитивной функции.

Результаты оценки когнитивных функций у стрессированных животных представлены в табл.9 и 10.

У животных, подвергшихся длительному стрессорному воздействию (группа «Контроль + стресс»), отмечались выраженные когнитивные нарушения в тестах УРПИ и ТЭИ: статистически значимое уменьшение латентного периода первого захода в темный отсек в тесте УРПИ и увеличение латентного периода подныривания в ТЭИ при воспроизведениях рефлексов. Соединение ВМА-99-82 и сертралин способствовали улучшению обучаемости и памяти у животных в УРПИ, однако статистически значимого улучшения когнитивных функций при их применении не отмечалось.

Таблица 9 Обучаемость и память у стрессированных животных в тесте «Условная реакция пассивного избегания» на фоне введения ВМА-99-82 и препаратов сравнения Регистрируемые показатели (M±m) Экспериментальные группы Контроль интактный Контроль + стресс ВМА-99-82 Имипрамин Сертралин Фенибут Этап выработки рефлекса Латентный период первого захода 23,5±3,7 83,3±3,3# 49,0±5,3* 84,5±,1* 67,8±5,6* 54,1±7,1* Кол-во заходов 0,7±0,2 0,8±0,2 0,8±0,3 0,2±0,2 0,7±0,2 0,7±0,3 Воспроизведение через 24 часа (после однократного введения) Латентный период первого захода 158,8±13,9 100,2±25,3 143,5±23,2 126,8±23,9 127,7±20,5 130,0±14,2 Кол-во заходов 0,8±0,3 0,3±0,2 0,3±0,2 0,8±0,4 0,5±0,3 0,3±0,3* Кол-во животных, зашедших в темный отсек, % 17 67# 33* 50* 33* 33* Воспроизведение (10-дневное введение) Латентный период первого захода 132,9±21,1 71,8±21,7 139,2±27,3 103,7±24,3 129,2±23,0 130,2±16,3* Кол-во заходов 0,7±0,3 1,7±0,4 0,6±0,4 1,3±0,5 1,0±0,5 0,6±0,4* Кол-во животных, зашедших в темный отсек, % 50 83# 50* 67* 50* 50*

Тенденция к уменьшению выраженности когнитивных нарушений у животных на фоне введения этих препаратов может быть связана с их положительным влиянием на эмоциональный статус, который также имеет значение при формировании следа памяти. У стрессированных животных с «выученной беспомощностью», получавших исследуемое вещество, по сравнению с животными контрольной группы («Контроль+стресс») отмечалось более активное поведение в тесте экстраполяционного взаимодействия. Они быстрее находили избавление от аверсивной среды (быстрее подныривали) и в период обучения и при воспроизведении после однократного и десятидневного введения. По показателю «Влияние веществ на время экстраполяции» соединение ВМА-99-82 превосходило все препараты сравнения: имипрамин, сертралин и фенибут. Имипрамин при этом, напротив, оказывал негативное влияние на выработку и воспроизводимость условных рефлексов избегания аверсивного фактора.

Таблица 10 Влияние ВМА-99-82 и препаратов сравнения на время «экстраполяционного избавления» Регистрируемые показатели (M±m) Экспериментальные группы Контроль интактный Контроль + стресс ВМА-99-82 Имипрамин Сертралин Фенибут   Этап выработки рефлекса 41,5±3,4 146,2±21,4## 103,5±17,3 137,8±19,1 114,3±20,9* 111,4±10,6* Воспроизведение (1-кратное введение) Латентный период подныривания 28,8±3,9 137,7±22,5## 90,3±18,8* 130,7±22,1 105,7±23,7 94,3±7,2
* Воспроизведение (10-дневное введение) 17,8±2,3 108,3±23,2## 73,5±11,5* 118,3±27,6 76,8±21,6 81,6±6,6*

Пример 4. Влияние 9-[2-(4-изопропилфенокси)этил]аденина на выраженность стрессобусловленных морфосоматических изменений.

Крысы после выполнения поведенческих тестов через 10 дней после стрессирования подвергались эвтаназии под эфирным наркозом, вскрывались, после чего извлекались надпочечники, тимус, селезенка и желудок. На аналитических весах проводилось взвешивание надпочечников, тимуса и селезенки с определением относительной массы в мг/100 г веса животного. Желудок вскрывался по малой кривизне и промывался, подсчитывалось число эрозий и язв на слизистой оболочке, определялась степень ее поражения по следующей шкале:

1 балл - единичные эрозии,

2 балла - множественные эрозии,

3 балла - единичные язвы,

4 балла - единичные эрозии и единичные язвы,

5 баллов - множественные эрозии и единичные язвы,

6 баллов - множественные язвы.

Другая группа животных подвергалась эвтаназии непосредственно через 30-60 мин после последнего стрессирования.

Результаты оценки стрессиндуцированных морфосоматических нарушений у животных с «выученной беспомощностью» представлены в табл.11 и 12.

Хронический стресс, приводящий к развитию состояния «выученной беспомощности» у животных, сопровождался характерными для стресса морфосоматическими нарушениями. Так, у стрессированных животных контрольной группы («Контроль + стресс») статистически значимо увеличивался коэффициент массы надпочечников, уменьшался коэффициент массы тимуса и селезенки, увеличивалась степень язвенного поражения слизистой желудка. Перечисленные изменения у стрессированных животных, эвтаназия которых осуществлялась сразу после последнего сеанса стрессирования, были выражены в статистически значимо большей степени, чем у животных спустя 10 дней, что говорит о развитии процесса реабилитации у последних. Соединение ВМА-99-82 при профилактическом и в меньшей степени при лечебном введении статистически значимо уменьшало выраженность изменений всех перечисленных показателей, что свидетельствует о наличии у данного вещества противострессорной активности. Препараты сравнения также способствовали уменьшению выраженности стрессиндуцированных морфосоматических нарушений у животных, однако по эффективности уступали изучаемому веществу.

Таблица 11 Выраженность стрессиндуцированной гипертрофии надпочечников и язвенного поражения слизистой желудка у животных с «выученной беспомощностью» на фоне введения ВМА-99-82 и препаратов сравнения Экспериментальные группы Коэффициент массы надпочечников (мг/100 г массы) M±m Степень язвенного поражения слизистой желудка M±m Контроль интактный 14,5±0,8 0,5±0,2 Контроль+стресс (спустя 30-60 мин) 26,0±1,5##* 4,2±0,4##* Контроль+стресс 20,6±1,8# 2,8±0,4## ВМА-99-82 15,3±0,8* 1,3±0,3* Имипрамин 16,8±1,2* 1,3±0,3* Сертралин 16,7±1,5* 2,2±0,3

Фенибут 15,1±0,6* 1,0±0,4* Таблица 12 Выраженность стрессиндуцированной инволюции лимфоидных органов у животных с «выученной беспомощностью» на фоне введения ВМА-99-82 и препаратов сравнения Экспериментальные группы Коэффициент массы тимуса (мг/100 г массы) M±m Коэффициент массы селезенки (мг/100 г массы) M±m Контроль интактный 73,8±6,5 444,3±39,6 Контроль+стресс (спустя 30-60 мин) 51,7±4,2# 263,6±17,8##* Контроль+стресс 56,5±3,1# 322,0±13,8# ВМА-99-82 76,4±6,9* 367,0±22,0* Имипрамин 67,4±3,3* 331,6±28,7 Сертралин 73,4±4,4* 343,3±21,7 Фенибут 70,2±5,9 348±28,1

Пример 5. Изучение антидепрессантных свойств 9-[2-(4-изопропил-фенокси)этил]аденина на модели хемоиндуцированной резерпиновой депрессии.

Однократное внутрибрюшинное введение резерпина в дозе 4 мг/кг вызывает ухудшение общего состояния животных, которое выражается в развитии отчетливых вегетативных нарушений, а также в снижении поведенческой активности, вялости и заторможенности. У всех животных после введения резерпина отмечается уменьшение числа актов груминга, что сопровождается снижением опрятности, шерсть животных выглядит грязной, особенно в области гениталий и ануса, что связано с развитием диареи и усиленного мочеиспускания.

Для всех животных была характерна олигокинезия, у некоторых крыс отмечался периодический генерализованный мелкоразмашистый тремор всего тела. Помимо этого, у всех животных, получавших резерпин, снижалась чувствительность к звуковым, тактильным и болевым раздражителям, по сравнению с группой контрольных интактных животных. Так, интактные контрольные крысы при приближении экспериментаторов проявляли беспокойство - активно перемещались по домашней клетке, часто демонстрировали вертикальные стойки и акты кратковременного груминга, характеризующего поведение настороженности и тревоги. Все перечисленные поведенческие элементы у крыс, подвергшихся введению резерпина, были подавлены - животные были равнодушны к хэндлингу, при проверке болевой чувствительности большинство крыс на сдавление кончика хвоста реагировали вздрагиванием в отличие от интактных контрольных, которые демонстрировали вокализацию и побежку. Перечисленные явления: вялость, заторможенность, снижение поведенческой активности и эмоционального реагирования, уменьшение чувствительности к внешним раздражителям (звуковым, тактильным, болевым), а также дискинезии, зарегистрированные у животных, подвергшихся введению резерпина, являются следствием нейролептического действия последнего. В целом, общее состояние у животных, получивших однократно резерпин в дозе 4 мг/кг, можно оценить как состояние «средней тяжести».

При дальнейшем наблюдении у животных всех опытных групп по мере увеличения продолжительности лечебного введения антидепрессантов общее состояние прогрессивно ухудшалось. Уже с 4-го дня лечебного введения всех изученных антидепрессантов - имипрамина (15 мг/кг), амитриптилина (15 мг/кг), флуоксетина (20 мг/кг), сертралина (10 мг/кг), венлафаксина (10 мг/кг) и пароксетина (10 мг/кг) состояние животных можно было охарактеризовать как тяжелое. У животных всех опытных групп нарастали вялость и заторможенность, снижался уровень реагирования на внешние раздражители, прогрессировали симптомы дискинезии с развитием паркинсонического синдрома. Дискинетические проявления у животных характеризовались наличием олигокинезии, про- и ретропульсивных движений. Возрастала выраженность тремора, который к 7-му дню введения практически у всех животных всех опытных групп становился постоянным, а у животных, получавших имипрамин, амитриптилин, флуоксетин и пароксетин (10 мг/кг), он приобретал характер крупноразмашистого. Помимо перечисленного, у крыс всех опытных групп нарастала ригидность мышц, проявлявшаяся в первую очередь в «симптоме горбатости» (животные приобретали сгорбленный вид за счет ригидности мышц туловища), который количественно выражался в уменьшении длины тела от шеи до основания хвоста по сравнению с интактными контрольным крысами в среднем на 3 см и более. Животные приобретали способность длительное время сохранять искусственно приданную им позу, что является следствием развития каталепсии (табл.13). Каталепсию оценивали у животных на 7 день введения веществ количественным методом: регистрировали время удержания передних лап на перекладине высотой 10 см при трех постановках в искусственную позу в течение 1 мин (попытки придать искусственную позу животному повторяли не более трех раз). Статистически значимо увеличивали каталептогенный эффект резерпина имипрамин и в меньшей степени пароксетин, флуоксетин, амитриптилин, остальные препараты сравнения проявили тенденцию к усилению данного эффекта резерпина. У животных, которым вводили соединение ВМА-99-82 в дозе 30 мг/кг, каталепсии выявлено не было.

Таблица 13 Выраженность каталепсии у животных с депрессией, вызванной введением резерпина на фоне курсового введения ВМА-99-82 и препаратов сравнения Регистрируемые показатели (M±m) Экспериментальные группы Контроль интактный Контроль+депрессия Имипрамин Пароксетин Флуоксетин Сертралин Венлафаксин Амитриптилин ВМА-99-82 Время удержания позы (с) 9,8±1,5 26,0±3,3** 42,8±4,0***# 39,5±4,6***# 40,2±3,7***# 34,2±3,1*** 29,8±3,6*** 38,7±4,1***# 13,7±1,9

Такое нарастание выраженности нейролептического эффекта на фоне курсового лечебного введения антидепрессантов крысам, получившим резерпин, характеризует наличие лекарственного взаимодействия между резерпином и данными препаратами, которое может иметь как фармакокинетический, так и фармакодинамический характер.

Интактные контрольные крысы на протяжении всей экспериментальной серии с моделированием «резерпиновой депрессии» сохраняли удовлетворительное состояние, нормальную поведенческую активность и адекватную реакцию на внешние раздражители. Внешний вид животных данной группы был опрятным, у них была сохранной мотивация к поведению умывания и чистки (грумингу).

У животных группы «Контроль + депрессия», которые получали однократно резерпин в дозе 4 мг/кг, а также у животных, получавших в течение 7 дней после введения резерпина соединение ВМА-99-82, на протяжении всего исследования сохранялось состояние средней тяжести, а к 7-му дню состояние оценивалось как удовлетворительное. У них не отмечалось нарастания вялости, заторможенности, дискинетических явлений, умеренно были выражены каталепсия и ригидность мышц («симптом горбатости» по выраженности соответствовал 1 баллу и отмечался у 4 животных из 6 в группе «Контроль + депрессия» и у 2 животных из 6 в группе введения соединения ВМА-99-82). У животных данных групп проявилась тенденция к редукции перечисленных явлений к 7-му дню исследования: симптомы сохранялись, но были менее выражены, чем в первые дни исследования.

Подобное положительное влияние соединения ВМА-99-82 было выявлено при исследовании динамики массы тела животных с «резерпиновой депрессией», порога их болевой чувствительности, развитием у животных выраженных вегетативных нарушений в виде блефароптоза, диареи и усиленного мочеиспускания. Таким образом, соединение ВМА-99-82 способствует уменьшению выраженности нейролептического эффекта резерпина в отличие от всех других изученных антидепрессантов, которые оказывают потенцирующее влияние на данный эффект резерпина. Разнонаправленное влияние соединения ВМА-99-82 и изученных антидепрессантов на действие резерпина позволяет предполагать наличие у них разных механизмов действия.

В тесте принудительного неизбегаемого плавания по Порсолту у животных группы «Контроль + депрессия» отмечалось статистически значимое изменение показателей, характеризующих выраженность депрессивного поведения у животных (табл.14): уменьшение латентного периода иммобилизации и увеличение ее продолжительности, которые сохранялись на протяжении всего исследования, что свидетельствует о развитии стойкого депрессивного состояния у животных, подвергшихся действию резерпина. Лечебное введение соединения ВМА-99-82 и всех изученных антидепрессантов сопровождалось статистически значимым увеличением латентного периода иммобилизации (то есть снижением скорости развития депрессивного состояния) и уменьшением ее длительности (подавлением состояния отчаяния), что указывает на наличие у них антидепрессивного действия.

Таблица 14 Выраженность депрессивного поведения в тесте Порсолта у животных с резерпиновой депрессией на фоне введения ВМА-99-82 и препаратов сравнения Регистрируемые показатели (M±m) Экспериментальные группы Контроль интактный Контроль+депрессия Имипрамин Пароксетин Флуоксетин Сертралин Венлафаксин Амитриптилин ВМА-99-82 1-кратное введение Латентный период иммобилизации, с 145,0±8,4 46,5±5,7 85,5±9,0** 87,5±7,2** 67,3±5,3* 70,5±6,7* 97,5±8,2** 75,7±6,5* 74,7±7,1* Длительность иммобилизации, с 76,3±6,0 152,3±9,3 87,8±6,4** 101,3±6,9** 124,5±6,8* 119,1±9,0* 93,2±5,7** 115,3±6,2** 123,5±6,2* 7-дневное введение Латентный период иммобилизации, с 136,0±9,4 41,2±5,3 70,7±5,8** 72,5±7,3** 47,5±4,3 76,0±6,9** 111,7±8,7** 73,0±7,4** 68,7±7,1* Длительность иммобилизации, с 85,2±4,8 145,2±9,0 108,5±7,9* 87,7±4,9** 110,3±6,0** 107,3±9,4* 73,7±6,7** 126,2±7,5 111,7±7,0*

Кроме того, у животных группы «Контроль + депрессия» в тесте Порсолта статистически значимо по сравнению с интактным контролем снижались показатели активного поведения избегания аверсивной ситуации - количество прыжков и время активного плавания, что также характеризует наличие у них стойкого депрессивного состояния. У крыс всех опытных групп, получавших все препараты сравнения, указанные показатели статистически значимо увеличивались после однократного введения веществ, что также указывает на наличие у них антидепрессивного действия. По окончании курсового лечебного введения всех использованных препаратов сравнения время активного плавания и количество прыжков у животных уменьшались как по сравнению с интактным контролем, так и по сравнению с группой «Контроль + депрессия» на фоне общего снижения локомоторной активности, связанного с развитием нейролептического синдрома. У животных, которым водили соединение ВМА-99-82, наблюдалось статистически значимое увеличение данных показателей преимущественно на фоне однократного применения. После курсового применения ВМА-99-82 значения данных показателей были сопоставимы с аналогичными показателями интактного контроля.

При повторном выполнении теста через 7 дней после введения резерпина выраженность депрессивного состояния у крыс группы «Контроль + депрессия» уменьшалась, что может быть следствием уменьшения эффекта резерпина в связи с его элиминацией. Необходимо отметить, что при выполнении теста по окончании курсового введения препаратов сравнения проявилась тенденция к снижению выраженности антидепрессивного эффекта, которая в наибольшей степени наблюдалась у флуоксетина, амитриптилина, имипрамина и сертралина, в меньшей степени - у венлафаксина, пароксетина. Снижение эффективности препаратов сравнения в тесте Порсолта после их курсового применения коррелировала с выраженностью нейролептического синдрома у животных. Поскольку изучаемое вещество не потенцировала нейролептический эффект резерпина, уменьшение антидепрессивного действия ВМА-99-82 после его курсового применения может быть связано с тем, что на этапе тестирования по окончании экспериментальной серии снижалась сама выраженность резерпиновой депрессии.

Пример 6. Исследование лекарственной безопасности 9-[2-(4-изопропил фенокси)этил]аденина.

Изучение острой, подострой, хронической и специфической токсичности было проведено в соответствии с [Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У. Хабриева. - М.: ОАО Издательство «Медицина», 2005. - 832 с.].

Эксперименты по определению острой токсичности были проведены на половозрелых белых мышах и крысах, сформированных в опытные и контрольные группы. Опытным животным 9-[2-(4-изопропилфенокси)-этил]аденин, растворенный в 50% водном растворе диметилсульфоксида, вводили в токсических дозах однократно внутрибрюшинно и интрагастрально. Контрольным животным вводили в идентичных объемах диметилсульфоксид, разведенный в соотношении 1:1 дистиллированной водой. Наблюдение за животными вели в течение 2-х недель. По результатам исследований установлены границы ЛД₅₀ для соединения ВМА-99-82, которые оказались равными на мышах: при интрагастральном введении - 992,4 мг/кг у самок и 1034,9 мг/кг у самцов; при внутрибрюшинном введении - 943,1 мг/кг у самок и 962,8 мг/кг у самцов. При исследовании на крысах величина ЛД₅₀ соединения ВМА-99-82 при интрагастральном введении оказалась одинаково равной 4811,7 мг/кг у самок и самцов, и при внутрибрюшинном введении - 3957,9 мг/кг у самок и самцов. С учетом полученных результатов исследований и классификации токсичности веществ [Саноцкий И.В. Методы определения токсичности и опасности химических веществ (Токсикометрия). - М.: «Медицина», 1970. - 343 с.] соединение ВМА-99-82 можно отнести к классу малотоксичных лекарственных веществ.

При изучении кумулирующих свойств 9-[2-(4-изопропил-фенокси)этил]аденина при интрагастральном введении по методу Ю.С. Кагана и В.В. Станкевича [Каган Ю.С. Кумуляция. Критерии и методы ее оценки. Прогнозирование хлорорганических интоксикаций. - В кн.: Принципы и методы установления предельно допустимых концентраций веществ в воздухе производственных помещений // М.: «Медицина», 1970. - С.49-65] выраженной кумуляции у соединения ВМА-99-82 не обнаружено.

При ежедневном однократном внутрижелудочном введении крысам в дозах 10 мг/кг, 75 мг/кг и 150 мг/кг в течение 1 месяца 9-[2-(4-изопропилфенокси)этил]аденин не оказывает патологического действия на основные гомеостатические константы, то есть является безопасным. При введении крысам соединения в дозе 300 мг/кг обнаружены негативные сдвиги (восстанавливающиеся в период после отмены) в общем состоянии, приросте массы тела, периферической крови, функциональной активности печени и почек. Гибели животных в этой группе не наблюдалось, патоморфологическими исследованиями показано мишенеобразное действие вещества в дозе 300 мг/кг на печень и почки. По результатам хронических исследований установлено, что соединение ВМА-99-82 при внутрижелудочном введении крысам в течение 3 месяцев в дозах 10 и 75 мг/кг не оказывает токсического действия на основные гомеостатические константы животных. Отдельные электрокардиографические, гематологические и биохимические изменения, выявленные в период введения вещества крысам, не выходили за рамки физиологических норм. Изменения формы поведения крыс, получавших соединение в дозе 150 мг/кг, а также сдвиги содержания в периферической крови эритроцитов, гемоглобина и нарушение функциональной активности печени и почек свидетельствуют о наличии негативного влияния вещества в этой дозе на гемопоэз, органы детоксикации и выведения. На основании проведенных исследований можно заключить, что соединение ВМА-99-82 при длительном внутрижелудочном введении крысам в дозах от 10 до 75 мг/кг не оказывает патологического действия на основные гомеостатические константы, то есть является безопасным.

При изучении репродуктивной токсичности установлено, что 9-[2-(4-изопропилфенокси)этил]аденин при курсовом 2-месячном внутрижелудочном введении крысам самкам и самцам в дозах 10 и 150 мг/кг не оказывает негативного влияния на их репродуктивную функцию. Выявлено, что под действием соединения в дозе 10 мг/кг у самцов и самок активируется половое поведение, при этом под действием вещества в дозе 150 мг/кг половое поведение у самцов снижается, но не изменяется у самок. Под действием испытуемой субстанции у самцов не изменяется индекс сперматогенеза и оплодотворяющая функция сперматозоидов, но улучшается функция семяродного эпителия. Соединение ВМА-99-82 в дозах 10 и 150 мг/кг при 2-недельном введении крысам самкам активирует процептивное и рецептивное половое поведение, не влияет на овуляторную цикличность, способствует активации сроков наступления зачатия и проявляет тенденцию положительного влияния на эмбриогенез. В исследованиях по изучению эмбрио- и фетотоксического действия, регистрируемого в антенатальном периоде развития, соединение ВМА-99-82 вводили беременным крысам с 6 по 16 дни беременности внутрижелудочно в дозах 10, 75 и 150 мг/кг; с 1 по 6 дни беременности и с 16 по 19 дни беременности в дозе 150 мг/кг. В исследованиях по изучению антенатального повреждающего действия, регистрируемого в постнатальном периоде развития, соединение ВМА-99-82 вводили внутрижелудочно беременным крысам с 6-го дня беременности и до родов в дозе 150 мг/кг. По результатам исследований установлено отсутствие эмбрио- и фетотоксического действия вещества в антенатальном и постнатальном периодах развития. Соединение ВМА-99-82 не изменяет эмбриональную гибель плодов, не угнетает качество антенатального развития эмбрионов, не нарушает процессы физического и полового развития потомства крысят, регистрируемых в постнатальный период.

9-[2-(4-Изопропилфенокси)этил]аденин в условной терапевтической дозе 10 мг/кг, равной более 1/400 ЛД₅₀ при внутрижелудочном введении крысам самкам и самцам, а также при десятикратном увеличении терапевтической дозы не оказывает отрицательного влияния на аллергологический статус экспериментальных животных как при однократном, так и при курсовом введении и не способствует развитию аллергических и псевдоаллергических реакций.

Проведено изучение иммунотоксического действия 9-[2-(4-изопропилфенокси)этил]аденина. При введении мышам BALB/c внутрижелудочно в дозах 10 мг/кг и 300 мг/кг соединение ВМА-99-82 существенно не влияло на массу тела животных в течение двухнедельного срока наблюдений. Показано также, что испытуемое соединение не приводило к заметным сдвигам в массе и клеточности лимфоидных органов - тимуса и селезенки при его 14-дневном введении мышам. Также выявлено, что соединение ВМА-99-82 в дозах 10 мг/кг и 300 мг/кг не оказывало существенного влияния на показатели гуморального иммунитета животных: не выявлено статически значимых различий в титрах гемагглютининов у животных опытных и контрольных групп. Испытуемое соединение при двухнедельном применении в терапевтической и максимальной дозах не оказывало заметного влияния на клеточный иммунитет, а также на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов и нейтрофилов периферической крови мышей BALB/c.

Проведенные испытания способности 9-[2-(4-изопропилфенокси)этил]-аденина к мутагенному действию в тесте Эймса показали, что само соединение и его метаболиты в концентрациях от 0,1 мкг до 1000 мкг на чашку не индуцируют генных мутаций в клетках индикаторных штаммов Salmonella typhimurium ТА 100, ТА98 и ТА97. Изучение соединения ВМА-99-82 в цитогенетическом тесте показало, что как при однократном (в дозе 100 мг/кг), так и при курсовом (в дозе 10 мг/кг пятикратно и в дозе 100 мг/кг пятикратно) внутрижелудочном введении мышам оно не вызывает увеличения доли клеток с поврежденными хромосомами.

При изучении фармакологической кинетики 9-[2-(4-изопропил-фенокси)этил]аденина разработан метод его количественного определения, позволяющий определять соединение в биологических пробах с высокой чувствительностью и селективностью. Чувствительность метода 1 мкг/мл, время удерживания 7-7,5 минут, средняя ошибка измерения менее 15%. Фармакокинетические параметры соединения VMA-99-82 при внутривенном введении: Т_1/2=11,02 ч, MRT=9,56 ч, AUC=74,96 мкг×ч/мл, Cl=0,667 л/ч×кг, Vd=10,61 л/кг. При пероральном введении: Т_1/2=6,106 ч, МТТ=8,523 ч, AUC=49,43 мкг×ч/мл, Cl=1,011 л/ч×кг, Vd=8,912 л/кг. Абсолютная биодоступность составила 65,9%.

Таким образом, 9-[2-(4-изопропилфенокси)этил]аденин обладает выраженным противострессорным действием, в значительной мере устраняет стрессиндуцированные психоэмоциональные, когнитивные и морфосоматические нарушения. В целом ряде тестов соединение ВМА-99-82 превосходит по выраженности противострессорного действия препараты сравнения: антидепрессанты имипрамин и сертралин, анксиолитик с ноотропным действием фенибут, а также обладает самостоятельной антидепрессантной активностью. Есть основания считать, что лекарственные средства с таким спектром психотропного действия найдут широкое применение в клинической практике.

Изобретение относится к области медицины. Предложено лекарственное средство, обладающее антидепрессантным и противострессорным действием. Средство представляет собой известный противовирусной активностью 9-[2-(4-изопропилфенокси)этил]аденина. Технический результат: разработано психотропное средство, способное подавлять стрессиндуцированные морфосоматические, когнитивные и психоэмоциональные нарушения, а также обладающее самостоятельной антидепрессантной активностью. Изобретение может быть использовано для предупреждения и лечения психоневрологических и психосоматических патологий, связанных с тяжелыми стрессорными воздействиями. 14 табл., 6 пр.

Лекарственное средство, обладающее антидепрессантным и противострессорным действием, представляющее собой 9-[2-(4-изопропилфенокси)этил]аденин формулы