КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ БОТУЛИНИЧЕСКИЙ ТОКСИН Российский патент 2021 года по МПК A61K38/48 A61K47/36 A61Q19/08 A61Q19/00 A61K38/16 A61K31/728 

Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей (а) ботулинический токсин и (b) несшитую гиалуроновую кислоту, и ее применению для лечения или предотвращения дистонии, спастического состояния и/или морщин. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу косметического разглаживания или предотвращения морщин, включающему стадию введения настоящей композиции.

Уровень техники

Термин «ботулинический нейротоксин» (BoNT) можно считать обобщающим понятием для группы из нескольких очень схожих нейротоксичных белков. Природный ботулинический нейротоксин продуцирует анаэробная и спорообразующая бактерия Clostridium botulinum и редко другие виды Clostridium, такие как С. butyricum, С. barati и С. argentinense. В настоящее время существует восемь различных серотипов данного токсина, известных как типы А, В, C₁, С₂, D, Е, F и G. Некоторые из этих типов, такие как А, В, Е и F, являются токсичными для людей, в то время как типы С, D и G чаще вызывают токсические реакции, например, у птиц, лошадей, крупного рогатого скота и приматов.

Комплексы ботулинического токсина существуют в форме высокомолекулярных белковых комплексов, содержащих два компонента; а именно: нейротоксиновый компонент, действующий паралитически, и ассоциированный нетоксичный бактериальный белковый компонент, который можно рассматривать как белок оболочки, содержащий гемагглютининовые и негемагглютининовые белки. Молекулярная масса комплексов ботулинического токсина варьируется для отдельных серотипов ботулинического токсина А, В, C₁, С₂, D, Е, F и G от примерно 300 кДа до примерно 900 кДа. С точки зрения терапевтического применения белок оболочки, как известно, не имеет значимой функции и не способствует нейротоксическим свойствам. Нейротоксиновый компонент экспрессируется в виде неактивного одноцепочечного предшественника (нерасщепленного полипептида) с молекулярной массой для всех известных серотипов ботулинического токсина, составляющей примерно 150 кДа. Этот одноцепочечный предшественник активируется посредством протеолитического расщепления с образованием двухцепочечного белка, связанного дисульфидным мостиком. Белок легкой цепи с массой примерно 50 кДа содержит каталитический домен, представляет собой цинксодержащую металлопротеиназу и действует как цинк-зависимая эндопептидаза.

Белок тяжелой цепи с массой примерно 100 кДа содержит домен транслокации и рецептор-связывающий домен. Тяжелая цепь опосредует связывание с пресинаптическими холинергическими нервными окончаниями, в частности, с пресинаптической частью концевой пластинки двигательного нерва или нервно-мышечного соединения, и интернализацию токсина внутрь клетки.

С точки зрения вышеизложенного, при транспортировке к нервно-мышечному соединению рецептор-связывающий домен тяжелой цепи обеспечивает холинергическую специфичность и связывает токсин с пресинаптическими рецепторами. Впоследствии нейротоксин может проникать в нервную клетку посредством рецепторно-опосредованного эндоцитоза и находиться внутри эндоцитозных пузырьков нервных клеток. При повышении кислотности пузырька легкая цепь перемещается в цитоплазму и отщепляется. Легкая цепь белка является частью, которая действует как цинк-зависимая эндопептидаза, способна расщеплять различные белки, участвующие в механизме слияния пузырьков, и предотвращает экзоцитоз пузырьков. В частности, токсичный фрагмент легкой цепи способен расщеплять один или более белков, которые образуют белковый комплекс SNARE, в зависимости от серотипа BoNT, при этом комплекс SNARE формируется из SNAP-25, синтаксина и VAMP. Комплекс SNARE обычно сливается с мембраной, и таким образом нейромедиатор ацетилхолин может покинуть клетку. При высвобождении нейромедиатора ацетилхолина в синаптическую щель нервный импульс передается в мышцу, что дает мышце сигнал к сокращению. Поскольку расщепление белка с образованием указанного комплекса, например, BoNT/A, по существу препятствует образованию комплекса SNARE, высвобождение ацетилхолина прекращается. Следовательно, передача между нервом и мышцей блокируется, что в конечном итоге вызывает паралич (ботулизм).

Однако, несмотря на высокую токсичность, ботулинический токсин применяют в качестве одобренного активного фармацевтического ингредиента с начала 1980-х годов, в частности, при лечении определенных двигательных нарушений, таких как спазм глазных век (блефароспазм) или кривошея (спастическая кривошея). Кроме того, ботулинический токсин применяют в области косметической медицины, например, при эстетическом лечении. Кроме того, предполагается, что лечение межбровных морщин дополнительно оказывает психологическое воздействие. В частности, такое лечение, как известно, уменьшает симптомы, связанные с основным депрессивным расстройством.

Ботулинические нейротоксины по своей природе нестабильны, особенно в щелочных условиях. Кроме того, как известно, они являются термолабильными. В связи с этим имеющиеся на рынке ботулинические нейротоксины часто хранятся в форме высушенного под вакуумом или лиофилизированного материала и часто дополнительно содержат вспомогательные вещества, добавляемые для поддержания целостности и эффективности ботулинического нейротоксина во время хранения и возможного последующего восстановления.

При вышеупомянутых медицинских и косметических показаниях ботулинический нейротоксин обычно вводят приблизительно каждые 3 месяца. Чтобы обеспечить более желательный режим дозирования, в US 2012/014532 А1 предложены составы-депо, в которых, как полагают, ботулинический токсин находится в подкожной области в течение более длительного времени. Согласно разделу «Примеры» указанной заявки гиалуроновая кислота, применяемая в составах, представляет собой по существу сшитую гиалуроновую кислоту, полученную из не сшитой гиалуроновой кислоты с более низкой молекулярной массой и сшивающего агента, такого как диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола. Однако предлагаемые выше составы с пролонгированным высвобождением по-прежнему подлежат улучшению в свете их применения. В частности, наполнители в составе согласно US 2012/014532 могут оставаться в месте введения в течение длительного времени.

Таким образом, задачей настоящего изобретения является преодоление вышеописанных недостатков. В частности, задачей настоящего изобретения является создание улучшенного состава с ботулиническим нейротоксином, обеспечивающего пролонгированное действие ботулинического токсина. В частности, необходимо предложить такой состав, который обеспечивает отсутствие остатков от предыдущего введения к моменту следующего введения. Кроме того, необходимо предотвратить или по меньшей мере значительно снизить нежелательные побочные эффекты.

Задачи настоящего изобретения были неожиданно решены посредством определенной композиции, содержащей (а) ботулинический нейротоксин типа А и (b) несшитую гиалуроновую кислоту со средней молекулярной массой от 2,5 МДа до 4,5 МДа, а также с помощью определенных режимов дозирования указанной композиции.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что композиция согласно настоящему изобретению позволяет применять неожиданно высокие количества ботулинического нейротоксина, тогда как в традиционных ботулинических составах для достижения вышеупомянутого действия нельзя просто увеличить дозу ботулинического токсина для увеличения количества, которое поглощается клеткой. Это связано с тем, что значительная часть ботулинического токсина должна быстро достигать системного кровотока через лимфатический дренаж или непосредственно через венозную систему. При достижении системного кровотока ботулинический токсин может перейти на соседнюю ткань и вызвать побочные эффекты на соответствующем участке. Например, передозировка традиционного состава ботулинического токсина, вводимого в межбровную морщину, может привести к опущению верхнего века. Согласно настоящему изобретению теперь можно вводить значительно более высокие количества ботулинического нейротоксина без применения состава-депо, и он остается в месте введения в течение дней, недель или месяцев.

Краткое описание изобретения

В настоящем изобретении предложена композиция, содержащая (а) ботулинический нейротоксин, и (b) несшитую гиалуроновую кислоту, предпочтительно имеющую среднюю молекулярную массу от 2,5 МДа до 4,5 МДа и/или характеристическую вязкость от 2,7 до 3,3 м³/кг.

Кроме того, в настоящем изобретении предложена такая композиция для применения для лечения дистонии, при этом вводят от 220 до 500 единиц ботулинического нейротоксина, для применения для лечения спастического состояния, при этом вводят от 500 до 1000 единиц ботулинического нейротоксина, или для применения для лечения морщин, при этом вводят от 40 до 50 единиц ботулинического нейротоксина.

Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ косметического разглаживания или предотвращения морщин у млекопитающего, предпочтительно, морщин, являющихся следствием обширной мимической активности, при этом указанный способ включает (i) введение композиции согласно настоящему изобретению и (ii) повторение введения через от 4 до 9 месяцев.

Наконец, предметом настоящего изобретения является косметическое применение композиции согласно настоящему изобретению, предпочтительно для морщин, являющихся следствием мимической активности, причем применяемая композиция содержит от 40 до 50 единиц ботулинического нейротоксина.

Краткое описание чертежей

На Фиг. 1 показана цифровая оценка абдукции конечностей мышей, получивших инъекции 0,8 мл композиции согласно сравнительному примеру (квадраты) или 1,6 мл композиции согласно примеру 1 (круги) в правую икроножную мышцу.

На Фиг. 2 показана цифровая оценка абдукции конечностей мышей, получивших инъекции 0,8 мл композиции согласно сравнительному примеру (квадраты) или 2,5 мл композиции согласно примеру 1 (кресты) в правую икроножную мышцу.

Подробное описание изобретения

Композиция согласно настоящему изобретению содержит (а) ботулинический нейротоксин в качестве компонента.

В предпочтительном варианте реализации компонент (а) представляет собой ботулинический нейротоксин типа В. (BoNT/B). Ботулинический нейротоксин типа В демонстрирует каталитическое поведение для расщепления на везикуло-ассоциированном мембранном белке 2 (VAMP 2).

В альтернативном предпочтительном варианте реализации компонент (а) представляет собой ботулинический нейротоксин типа Е. (BoNT/E). Ботулинический нейротоксин типа Е также расщепляет 25 кД (килодальтон) синаптосомально-ассоциированный белок 25, SNAP-25, но он нацелен на другие аминокислотные последовательности в этом белке по сравнению, например, с ботулиническим нейротоксином типа А. Ботулинический нейротоксин типа Е включает восемь подтипов, от BoNT/E1 до B0NT/E8, и может присутствовать также в качестве рекомбинантного ботулинического нейротоксина. Последовательность и получение ботулинического нейротоксина типа Е раскрыты, например, в WO 2014/068317. В частности, приведена ссылка на Seq. ID №1, 2 и 3.

В конкретном предпочтительном варианте реализации композиция согласно настоящему изобретению включает (а) ботулинический нейротоксин типа А в качестве компонента.

Комплекс ботулинического нейротоксина типа А предпочтительно содержит нейротоксиновый компонент массой примерно 150 кДа, который можно разделить на описанную выше легкую цепь (примерно 50 кДа) и тяжелую цепь (примерно 100 кДа) и необязательно на один или более белков оболочки, таких как гемагглютининовый или негемагглютининовый белки. В предпочтительном варианте реализации комплекс ботулинического нейротоксина типа А может иметь молекулярную массу от 300 кДа до 900 кДа, особенно 300, 600 или 900 кДа. В качестве альтернативы предпочтительный комплекс ботулинического нейротоксина типа А включает нейротоксиновый компонент и другие белки, такие как гемагглютининовый или негемагглютининовый белки.

Ботулинический нейротоксин типа А считается очень токсичным соединением. Значения LD₅₀ у мышей составляют от примерно 30 пг/кг при внутривенном введении до примерно 3 нг/кг при вдыхании. Дозирование ботулинического токсина связано с биологической активностью и измеряется в биологических единицах (Е), соответственно в мышиных единицах (MU), причем одна биологическая единица (Е) соответствует одной мышиной единице (MU). Одна биологическая единица (Е) соответствует количеству токсина, вводимого в брюшную полость, при этом данное количество достаточно велико, чтобы вызвать гибель 50% группы самок мышей Swiss Webster, каждая из которых имеет массу тела от 18 до 20 граммов.

Как упоминалось выше, ботулинический нейротоксин типа А может быть получен из культур Clostridium botulinum. Белок может быть осажден из культуральной среды и очищен с применением нескольких стадий центрифугирования, осаждения и адсорбции. Очищенный токсин можно хранить при -70°С, и затем размораживать без потери эффективности токсина. Раствор твердого токсина и стерильного изотонического солевого раствора можно хранить в холодильнике не более четырех часов без потери его эффективности. Такое восстановление можно осуществлять путем добавления определенного количества 0,9% солевого раствора к определенному количеству ботулинического токсина с тем, чтобы получить определенную концентрацию ботулинического нейротоксина типа А в объеме, который обычно дозируется в единицах/мл.

В одном варианте реализации настоящее изобретение охватывает изоформы, гомологи, ортологи и паралоги ботулинического токсина, которые демонстрируют по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% и не более 60%, не более 70%, не более 80%, не более 90%, не более 100% идентичности последовательности с ботулиническим токсином дикого типа, например, ботулиническим токсином А дикого типа. Идентичность последовательности может быть рассчитана с применением любого алгоритма, подходящего для получения достоверных результатов, например, с применением алгоритма FASTA (W.R. Pearson & D.J. Lipman PNAS (1988) 85: 2444-2448). Идентичность последовательности может быть рассчитана путем сравнения двух полипептидов или двух доменов, таких как два LC-домена, или их фрагментов. Модифицированные и рекомбинантные ботулинические токсины также входят в объем настоящего изобретения. Однако настоящее изобретение также относится к ботулиническим токсинам, которые являются химически модифицированными, например, путем пэгилирования, гликозилирования, сульфатирования, фосфорилирования или любой другой модификации, в частности, одной или более поверхностных или гидрофильных аминокислот. Модифицированные, рекомбинантные формы, изоформы, гомологи, ортологи, паралоги и мутанты, пригодные для применения в настоящем изобретении, являются биологически активными, т.е. способными перемещаться в нейроны и расщеплять белки комплекса SNARE (например, SNAP25) с оказанием парализующего действия на мышцы.

Композиция согласно настоящему изобретению дополнительно содержит гиалуроновую кислоту в качестве компонента (b). Гиалуроновая кислота представляет собой гликозаминогликан, который может быть представлен следующей структурной формулой:

Таким образом, гиалуроновую кислоту можно рассматривать как полимер дисахаридов, причем указанные дисахариды состоят из двух производных глюкозы, а именно: D-глюкуроновой кислоты и D-N-ацетилглюкозамина. В указанном дисахариде глюкуроновая кислота связана β(1→3)-гликозидной связью с N-ацетилглюкозамином, который, в свою очередь, связан β(1→4)-гликозидной связью со следующей глюкуроновой кислотой.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что композиция согласно настоящему изобретению должна содержать гиалуроновую кислоту определенного качества. Гиалуроновая кислота для применения в настоящем изобретении имеет довольно высокую молекулярную массу, причем высокая молекулярная масса обеспечивается не сшивкой, а линейными цепями, имеющими соответствующую длину.

В целом, в настоящем изобретении гиалуроновая кислота, применяемая в качестве компонента (b), представляет собой несшитую гиалуроновую кислоту. В предпочтительном варианте реализации гиалуроновая кислота имеет среднюю молекулярную массу от 2,5 МДа до 4,5 МДа, предпочтительно от 2,7 до 4,2 МДа, более предпочтительно от 3,0 до 4,0 МДа, в частности от 3,3 до 3,8 МДа.

Среднюю молекулярную массу гиалуроновой кислоты рассчитывают по определенной характеристической вязкости. Следовательно, ее можно назвать «средневязкостной молекулярной массой».

Характеристическую вязкость гиалуроновой кислоты измеряют согласно Европейской Фармакопее 6, 0, 2, 2.9, используя капиллярный вискозиметр Уббелоде при 20°С и воду в качестве растворителя. Соответствующую среднюю молекулярную массу М рассчитывают в соответствии с соотношением Марка-Хаувинка [η]=KM^a, где η представляет собой характеристическую вязкость, log(K) представляет собой точку пересечения с осью ординат, и а представляет собой тангенс угла наклона. Для несшитой гиалуроновой кислоты а предпочтительно может составлять 0,7.

В предпочтительном варианте реализации гиалуроновая кислота (b) может характеризоваться (вместо или в дополнение к вышеупомянутой молекулярной массе) ее характеристической вязкостью. Предпочтительно характеристическая вязкость составляет от 2,7 до 3,3 м³/кг, более предпочтительно от 2,80 до 3,20 м³/кг, еще более предпочтительно от 2,90 до 3,15 м³/кг, в частности примерно 3,09 м³/кг. Вязкость определяют как описано выше.

Следует отметить, что в настоящем изобретении термин «несшитая гиалуроновая кислота» включает все ее фармацевтически приемлемые соли, гидраты и/или сольваты. Предпочтительно несшитая гиалуроновая кислота присутствует в форме натриевой соли.

В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения индекс полидисперсности несшитой гиалуроновой кислоты может составлять от 1,0 до 5,0, предпочтительно от 1,1 до 4,0, более предпочтительно от 1,2 до 3,5, еще более предпочтительно от 1,3 до 3,0, особенно от 1,4 до 2,5, в частности от 1,5 до 2,0.

С точки зрения химии диспергируемость можно рассматривать как меру гетерогенности размеров молекул или частиц. В однородном образце объекты имеют одинаковый размер, форму или массу. Индекс полидисперсности (PDI) или просто индекс дисперсности представляет собой меру распределения молекулярной массы в данном образце полимера, и рассчитывается по следующей формуле:

PDI=M_w/M_n,

где

M_w представляет собой среднемассовую молекулярную массу и M_n представляет собой среднечисловую молекулярную массу.

M_w и M_n могут быть определены с применением гель-проникающей хроматографии (GPC).

В предпочтительном варианте реализации данная композиция может содержать от 2 до 4 единиц, предпочтительно от 2,2 до 3,8 единиц, более предпочтительно от 2,4 до 3,6 единиц ботулинического нейротоксина, предпочтительно ботулинического нейротоксина типа А, на миллиграмм несшитой гиалуроновой кислоты.

В альтернативном предпочтительном варианте реализации данная композиция может содержать от 20 до 40 единиц, предпочтительно от 22 до 38 единиц, более предпочтительно от 24 до 36 единиц ботулинического нейротоксина, предпочтительно ботулинического нейротоксина типа А, на миллиграмм несшитой гиалуроновой кислоты.

Композиция согласно настоящему изобретению может содержать различные другие фармацевтически приемлемые вещества, например, соли, агенты для удаления свободных радикалов, агенты для стабилизации нейротоксина, ингибиторы кристаллизации, сахара, аминокислоты, витамины, анестетики, поверхностно-активные вещества, модификаторы тоничности и подобные. Термин «фармацевтически приемлемый» в настоящем документе относится к таким соединениям или веществам, которые подходят для контакта с тканями млекопитающих, особенно людей. Термин «содержит» в настоящем документе охватывает как открытый термин «включает», так и закрытый термин «состоит (из)».

В варианте реализации композиция согласно настоящему изобретению предпочтительно содержит

c) соль

d) агент для стабилизации нейротоксина

e) ингибитор кристаллизации,

f) буфер и/или

агент для удаления свободных радикалов.

Соль (с) может представлять собой любую физиологически приемлемую соль, предпочтительно натриевую соль, более предпочтительно хлорид натрия.

Агент для стабилизации нейротоксина (d) можно рассматривать как соединение, которое стабилизирует ботулинический нейротоксин, предпочтительно белок ботулинического нейротоксина типа А, и предотвращает разложение указанного белка. Примеры представляют собой белки, такие как сывороточный альбумин человека (HSA) и желатин, причем HSA является предпочтительным.

В альтернативном предпочтительном варианте реализации настоящая композиция не содержит какого-либо агента для стабилизации нейротоксина, предпочтительно не содержит сывороточный альбумин человека (HSA).

Ингибитор кристаллизации (е) представляет собой вещество, которое предотвращает кристаллизацию нейротоксина, например, на стадии лиофилизации. Примеры ингибиторов кристаллизации представляют собой сахара, такие как глюкоза, фруктоза, галактоза, трегалоза, сахароза и мальтоза. Предпочтительными являются глюкоза, фруктоза и сахароза, в частности, сахароза.

Буферы (f) представляют собой вещества, которые применяют для обеспечения определенного значения рН, когда композиция находится в форме раствора, предпочтительно водного раствора, для достижения безболезненного введения, например, посредством инъекции. Предпочтительно, когда композиция находится в форме водного раствора, буферы обеспечивают значение рН от 6,1 до 7,6, предпочтительно от 6,2 до 7,2, более предпочтительно от 6,3 до 7,1 и в частности от 6,5 до 7,0. Буферы могут представлять собой, например, фосфатные буферы, цитратно-фосфатные буферы, лактатные буферы, ацетатные буферы и подобные.

Соединение, которое предотвращает или замедляет разрушение ботулинического токсина, можно рассматривать как агент для удаления свободных радикалов . Примеры агентов для удаления свободных радикалов представляют собой полиолы, такие как глицерин, и сахарные спирты, такие как маннит, инозит, лактит изомальт, ксилит, эритрит и сорбит.

В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения композиция не содержит маннит.

В одном варианте реализации настоящая композиция предпочтительно может содержать:

а) от 20 до 40 единиц ботулинического нейротоксина, предпочтительно ботулинического нейротоксина типа А

b) от 2,5 до 9 мг несшитой гиалуроновой кислоты

c) от 3,6 до 20 мг соли, предпочтительно хлорида натрия

d) от 0 до 1,5 мг или от 0,2 до 1,5 мг агента для стабилизации нейротоксина, предпочтительно сывороточного альбумина человека

e) от 0,4 до 0,94 мг ингибитора кристаллизации

f) от 0,3 до 0,6 мг буфера, предпочтительно фосфатного буфера

от 20 до 40 мг агента для удаления свободных радикалов.

Вышеупомянутая композиция предпочтительно может существовать в форме лиофилизата, таким образом, композиция может храниться без потери эффективности ботулинического нейротоксина, предпочтительно ботулинического нейротоксина типа А. Композиция, содержащая лиофилизированный ботулинический нейротоксин, предпочтительно ботулинический нейротоксин типа А, может быть получена путем восстановления лиофилизата стерильным солевым раствором. Восстановление предпочтительно осуществляют 0,9% солевым раствором, предпочтительно в количестве 1 мл. Концентрация водной композиции предпочтительно может находиться в следующих диапазонах:

a) от 20 до 40 единиц ботулинического нейротоксина, предпочтительно ботулинического нейротоксина типа А, на мл

b) от 0,25 до 0,9% масс./об. гиалуроновой кислоты

c) от 0,36 до 2,0% масс./об. соли, предпочтительно хлорида натрия

d) от 0 до 0,15% масс/об. или от 0,02 до 0,15% масс/об. агента для стабилизации нейротоксина, предпочтительно сывороточного альбумина человека

е) от 0,04 до 0,094% масс/об. ингибитора кристаллизации

f) от 0,03 до 0,06% масс./об. буфера, предпочтительно фосфатного буфера

от 2,0 до 4,0% масс/об. агента для удаления свободных радикалов.

В альтернативном варианте реализации настоящая композиция предпочтительно может содержать:

a) от 200 до 400 единиц ботулинического нейротоксина, предпочтительно ботулинического нейротоксина типа А

b) от 2,5 до 9 мг несшитой гиалуроновой кислоты

c) от 3,6 до 20 мг соли, предпочтительно хлорида натрия

d) от 0 до 15 мг или от 0,2 до 1,5 мг агента для стабилизации нейротоксина, предпочтительно сывороточного альбумина человека

e) от 4 до 9,4 мг ингибитора кристаллизации

f) от 0,3 до 0,6 мг буфера, предпочтительно фосфатного буфера

от 200 до 400 мг агента для удаления свободных радикалов.

Вышеупомянутая альтернативная композиция предпочтительно может существовать в форме лиофилизата, таким образом, композиция может храниться без потери эффективности ботулинического нейротоксина, предпочтительно ботулинического нейротоксина типа А. Композиция, содержащая ботулинический нейротоксин, предпочтительно ботулинический нейротоксин типа А, может быть получена путем восстановления лиофилизата стерильным солевым раствором. Восстановление предпочтительно осуществляют 0,9% солевым раствором, предпочтительно в количестве 1 мл. Концентрация водной композиции предпочтительно может находиться в следующих диапазонах:

a) от 200 до 400 единиц ботулинического нейротоксина, предпочтительно ботулинического нейротоксина типа А, на мл

b) от 0,25 до 0,9% масс./об. гиалуроновой кислоты

c) от 0,36 до 2,0% масс./об. соли, предпочтительно хлорида натрия

d) от 0 до 1,5% масс/об. или от 0,2 до 1,5% масс/об. агента для стабилизации нейротоксина, предпочтительно сывороточного альбумина человека

е) от 0,4 до 0,94% масс./об. ингибитора кристаллизации

f) от 0,03 до 0,06% масс/об. буфера, предпочтительно фосфатного буфера

от 20 до 40% масс/об. агента для удаления свободных радикалов.

В предпочтительном варианте реализации настоящая композиция может содержать две подкомпозиции. Первая подкомпозиция предпочтительно может содержать компоненты a), d), е) и в форме лиофилизата, который восстанавливают для применения посредством 0,9% стерильного солевого раствора. В альтернативном предпочтительном варианте реализации первая подкомпозиция в форме лиофилизата не содержит сывороточного альбумина человека (HSA). Вторая подкомпозиция предпочтительно может содержать водный раствор компонентов b) и f). Обе подкомпозиции предпочтительно могут быть объединены для получения настоящей композиции перед ее применением.

В предпочтительном варианте реализации композиция согласно настоящему изобретению может находиться в виде готовой для применения композиции, т.е. настоящая композиция может находиться в форме, которая может быть непосредственно введена пациенту. В предпочтительном варианте реализации композиция может находиться в форме предварительно заполненной пробирки или шприца, причем предварительно заполненную пробирку или шприц предпочтительно можно хранить при температуре от 0° до 15°С, более предпочтительно от 2 до 10°С.

При нахождении форме восстановленного раствора настоящая композиция может предпочтительно иметь динамическую вязкость от 1,5 до 4 Па⋅с, предпочтительно от 1,7 до 3,8 Па⋅с, более предпочтительно от 2,0 до 3,0 Па⋅с, определенную при 25°С и с применением частоты колебаний 1 Гц. Данная вязкость раствора делает возможным применение, например, путем инъекции иглой от 25 до 32 калибра.

Комплексную вязкость определяли с применением реометра Anton Paar MCR 302. Частота колебаний варьировалась от 10 Гц до 0,1 Гц. При 1 Гц и 25°С определяли комплексную вязкость, которая составляет 2,31-2,45 Па⋅с, G' составляет 8,9485-9,5135 и tan(δ) составляет 1,279-1,282.

Кроме того, при нахождении в форме восстановленного раствора настоящая композиция может предпочтительно иметь осмоляльность от 200 до 400 миллиосмоль на литр, предпочтительно от 250 до 370 миллиосмоль на литр, в частности от 270 до 325 миллиосмоль на литр. Предпочтительно осмоляльность может быть определена согласно Европейской Фармакопее 6,0, раздел 2.2.35.

Еще одним предметом настоящего изобретения является композиция согласно настоящему изобретению для применения для лечения дистонии, при котором вводят предпочтительно от 200 до 500 единиц ботулинического нейротоксина, предпочтительно ботулинического нейротоксина типа А. Более предпочтительно можно применять от 220 до 480, от 240 до 460, от 260 до 440, от 280 до 420, от 300 до 400, от 320 до 380 или от 340 до 380 единиц или любую их комбинацию, например, от 240 до 380 единиц.

Дистонию описывают как патологическое состояние, которое характеризуется дисфункцией тонуса мышц. Считается, что дистония является экстрапирамидным гиперкинезом. Дистония может приводить к постоянным непроизвольным сокращениям (скелетных) мышц. Эта дисфункция выражается в крайнем напряжении и несогласованности тела. Дистония может возникать, например, вследствие генетического дефекта, например, как независимая картина болезни (первичная дистония), а также наряду с другими заболеваниями (вторичная дистония), такими как болезнь Паркинсона, или в результате инсульта. В зависимости от степени распространения дистония может быть дифференцирована на три типа:

- фокальная дистония, при которой поражена только одна часть тела,

- сегментарная дистония, при которой поражены более одной части тела,

- генерализованная дистония, при которой поражен весь организм.

Примерами фокальной дистонии являются ларингеальная дистония (дистония голосовых связок) или цервикальная дистония (отклонение оси головы/шеи), или цервикальная дистония также может рассматриваться как сегментарная дистония, блефароспазм (неконтролируемое моргание века), оромандибулярная дистония (поражение области рта и/или жевательной мышцы) и спастическая дисфония (поражение голосовых связок). Примером генерализованной дистонии является синдром Сегавы, который характеризуется аномалиями положения ног.

В одном варианте реализации настоящую композицию для применения при лечении дистонии вводят парентерально, предпочтительно в форме инъекции. Указанную инъекцию предпочтительно можно вводить в пораженную часть тела или вблизи нее, причем инъекция предпочтительно является подкожной или внутримышечной, в частности внутримышечной.

Еще одним предметом настоящего изобретения является композиция согласно настоящему изобретению для применения для лечения спастического состояния, при котором предпочтительно вводят от 500 до 1000 единиц ботулинического нейротоксина, предпочтительно ботулинического нейротоксина типа А. Более предпочтительно можно применять от 550 до 950, от 600 до 900, от 650 до 850 или от 700 до 800 единиц или любую их комбинацию, например, от 600 до 850 единиц.

Спастическое состояние можно описать как увеличенное внутреннее напряжение (скелетных) мышц. Первопричиной спастического состояния является повреждение областей центральной нервной системы, ответственных за движения, причем данные области представляют собой головной мозг и спинной мозг, в частности пирамидный тракт первого мотонейрона. Наиболее распространенной причиной спастического состояния является гипоксическое повреждение двигательной области головного мозга при церебральном инфаркте. Монопарез представляет собой спастический паралич одной мышцы или одной конечности. Примеры мышц, которые могут быть спастически парализованы, представляют собой лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, плечелучевую мышцу, двуглавую мышцу плеча, квадратный пронатор, круглый пронатор, длинный сгибатель большого пальца кисти, короткий сгибатель большого пальца кисти, мышцу, противопоставляющую большой палец кисти. Парапарез характеризуется параличом обеих ног. Гемипарез описывает паралич конечностей одной половины тела или одной половины лица (гемифациальный спазм). Наконец, спастический тетрапарез относится к спастическому параличу всех четырех конечностей, при котором также могут быть поражены мышцы шеи и глубокие мышцы.

В одном варианте реализации настоящую композицию для применения для лечения спастического состояния вводят парентерально, предпочтительно в форме инъекции. Указанную инъекцию предпочтительно можно вводить в пораженную часть тела или вблизи нее, причем инъекция предпочтительно является подкожной или внутримышечной, в частности внутримышечной.

Еще одним предметом настоящего изобретения является композиция согласно настоящему изобретению для применения для лечения морщин, в котором предпочтительно вводят от 40 до 55 единиц ботулинического нейротоксина, предпочтительно ботулинического нейротоксина типа А. Более предпочтительно можно применять от 42 до 52, от 43 до 49, от 44 до 48 или от 45 до 47 единиц или любую их комбинацию, например, от 43 до 50 единиц. Лечение морщин ботулиническим токсином может оказывать психологическое воздействие. В частности, как известно, люди, страдающие депрессиями, чувствуют себя менее подавленными после лечения морщин, в частности межбровных морщин, путем инъекции ботулинического токсина.

В одном варианте реализации данную композицию для применения для лечения морщин вводят парентерально, предпочтительно в форме инъекции. Указанную инъекцию можно предпочтительно вводить в соответствующие морщины или вблизи них, причем межбровная морщина является предпочтительной. Предпочтительно инъекция является подкожной.

Еще одним предметом настоящего изобретения является данная композиция для применения для лечения заболеваний или состояний, связанных с гиперактивной холинергической иннервацией мышц или желез внешней секреции, при этом вводят от 20 до 1500 единиц, предпочтительно от 100 до 800 единиц ботулинического нейротоксина, предпочтительно ботулинического нейротоксина типа А.

Термин «гиперактивная холинергическая иннервация» в настоящем документе относится к синапсу, который характеризуется необычно высоким количеством высвобождения ацетилхолина в синаптическую щель. «Необычно высокий» относится к увеличению, например, не более 25%, не более 50% или более, относительно к эталонной активности, которая может быть получена, например, при сравнении высвобождения с тем же параметром в синапсе того же типа, но не находящемся в гиперактивном состоянии, при котором дистония мышцы может быть показателем гиперактивного состояния. «Не более 25%» означает, например, от примерно 1% до примерно 25%. Способы выполнения необходимых измерений известны в данной области техники.

Иллюстративные заболевания или состояния, связанные с гиперактивной холинергической иннервацией мышц или желез внешней секреции, включают, например, Синдром Фрея, синдром «крокодиловых слез», подмышечный гипергидроз, подошвенный гипергидроз, гипергидроз головы и шеи, гипергидроз тела, ринорею, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, гиперсаливацию, слюнотечение, сиалорею, спастические состояния и велопалатинную миоклонию, миоклонию, миокимию, ригидность, мышечные судороги легкой степени, наследственный тремор подбородка, парадоксальную активность жевательных мышц, спазм жевательных мышц, гипертрофическую бранхиальную миопатию (hypertrophic branchial myopathy), гипертрофию жевательной мышцы, гипертрофию передней большеберцовой мышцы, нистагм, осциллопсию, надъядерный паралич взора, парциальную непрерывную эпилепсию, планирующуюся операцию по поводу спастической кривошеи, паралич отведения голосовой связки, не поддающуюся лечению мутационную дисфонию, дисфункцию верхнего эзофагального сфинктера, гранулему голосовой складки, заикание, синдром Жиля де ла Туретта, миоклонию среднего уха, защитное закрытие гортани (protective larynx closure), нарушение речи после ларингэктомии, защитное опущение верхнего века, заворот века, дисфункцию сфинктера Одди, псевдоахалазию, двигательные эзофагальные нарушения, не являющиеся ахалазией, вагинизм, послеоперационное обездвиживание, тремор, дисфункцию мочевого пузыря, гемифациальный спазм, дискинезию при реиннервации, синдром мышечной скованности, столбняк, гиперплазию предстательной железы, лечение ожирения, детский церебральный паралич, ахалазию и анальные трещины.

В одном варианте реализации данную композицию для применения для лечения заболеваний или состояний, связанных с гиперактивной холинергической иннервацией мышц или желез внешней секреции, можно предпочтительно вводить парентерально, предпочтительно в форме инъекции. Указанную инъекцию предпочтительно можно вводить в соответствующую часть тела или вблизи нее. Предпочтительно инъекция является внутримышечной или подкожной.

В предпочтительном варианте реализации композиция согласно настоящему изобретению остается в месте введения не дольше 24 часов после введения. Это означает, что после введения композиция удаляется из места инъекции, разрушается и/или метаболизируется в течение 24 часов. Кроме того, предпочтительно, чтобы композиция согласно настоящему изобретению оставалась в месте введения в течение по меньшей мере 10 часов после введения, то есть в предпочтительном варианте настоящая композиция находится в месте введения в течение по меньшей мере от 10 часов до не более 24 часов, предпочтительно по меньшей мере от 11 часов до не более 22 часов, более предпочтительно по меньшей мере от 12 часов до не более 20 часов после введения.

В предпочтительном варианте реализации данной композиции ботулинический нейротоксин типа А высвобождается в течение 12 часов после введения. Высвобождение ботулинического нейротоксина типа А из данной композиции составляет по меньшей мере 50%, то есть от 50% до 100%, предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80%, особенно по меньшей мере 90% в течение 12 часов. Высвобождение ботулинического нейротоксина типа А из композиции в течение вышеуказанного периода гарантирует, что ботулинический нейротоксин типа А становится доступным для соответствующей нервной клетки без значительной потери эффективности вследствие системного удаления токсина. Это означает, вопреки изложенному в US 2012/0141532, что композиция согласно настоящему изобретению не является составом-депо, который находится в течение недель или более в месте введения. Наоборот настоящее изобретение основано на концепции, что пролонгированное действие ботулинического нейротоксина получают даже в том случае, если токсин высвобождается в течение довольно короткого периода времени по сравнению с US 2012/0141532.

В отличие от настоящего изобретения, доступные в настоящее время композиции ботулинического токсина с непролонгированным высвобождением обычно применяют каждые от 6 до 12 недель. Такое частое применение ботулинического токсина обычно нежелательно, т.е., как известно, такое частое применение создает устойчивость. Например, как известно, вторичные пациенты с отсутствием реакции появляются вследствие присутствия нейтрализующих анти-тел.

Следовательно, в другом предпочтительном варианте реализации композицию согласно настоящему изобретению вводят с применением более предпочтительного режима дозирования. Композицию согласно настоящему изобретению предпочтительно можно вводить каждые четыре-девять месяцев, предпочтительно каждые пять-семь месяцев, более предпочтительно примерно каждые шесть месяцев. Однако, по сравнению с вышеуказанным уровнем техники, данная композиция не основана на образовании депо, из которого непрерывно высвобождается ботулинический нейротоксин. Вместо этого, как описано выше, ботулинический токсин предпочтительно высвобождается из композиции в течение 12 часов и абсорбируется нервными клетками. Кроме того, как указано выше, примерно через 24 часа оставшиеся части настоящей композиции начинают разрушаться или выводиться системно, таким образом, через несколько дней оставшиеся в месте введения части настоящей композиции отсутствуют.

Еще одним предметом настоящего изобретения является способ косметического разглаживания или предотвращения морщин у млекопитающего, предпочтительно морщин, являющихся следствием обширной мимической активности, при этом указанный способ включает:

(i) введение композиции согласно настоящему изобретению, и

(ii) повторение введения через 4-9 месяцев.

Морщины можно рассматривать как складку, бороздку или сморщенность на коже. Морщины, являющиеся следствием обширной мимической активности, могут в значительной степени относиться к морщинам, которые видны на лице соответствующего млекопитающего, предпочтительно человека. Примерами морщин являются морщинки (furrows), межбровные морщины, «гусиные лапки», морщины в уголках рта, морщины на подбородке, окологубные морщины, складки на щеках, «складки марионетки», морщины вокруг линии губ, складки на лбу, межбровные морщины, «кроличьи морщины», носогубные складки, морщины под глазами и складки на подбородке. Стадия (i) введения композиции согласно настоящему изобретению может предпочтительно включать введение данной композиции посредством инъекции. Инъекцию можно предпочтительно осуществлять посредством инъекционной иглы, предпочтительно иглы для инъекций размером от 27 до 35 калибра, предпочтительно от 30 до 33 калибра. Данную композицию можно предпочтительно вводить в зону соответствующей морщины(морщин) или вблизи нее. Инъекция может быть подкожной или внутримышечной, в частности, подкожной. Предпочтительно композицию согласно настоящему изобретению вводят в межбровные морщины, горизонтальные морщины, «гусиные лапки», окологубные складки, «морщины грусти» (mental ceases), ямочку в подбородке и/или платизмальные тяжи.

Ботулинический токсин можно вводить в тот же день или в последующий день лечения. Например, во время первого сеанса лечения можно вводить первую часть дозы. Эта первая часть предпочтительно представляет собой субоптимальную часть, то есть часть, которая полностью не удаляет морщины или кожные складки. Во время одного или нескольких сеансов лечения можно вводить оставшуюся часть общей дозы.

Стадия (и) повторения введения через 4-9 месяцев может предпочтительно включать введение настоящей композиции с применением тех же условий/устройств, которые описаны выше. При повторном введении настоящей композиции клеткам становится доступной дополнительная доза ботулинического токсина, и кожа на соответствующем участке предпочтительно остается в косметически сглаженном состоянии. В альтернативном варианте реализации введение повторяют через 5-7 или 5-8 месяцев.

В предпочтительном варианте реализации настоящего способа данная композиция для введения содержит от 40 до 55 единиц ботулинического нейротоксина, предпочтительно ботулинического нейротоксина типа А. Более предпочтительно можно применять от 42 до 52, от 43 до 49, от 44 до 48 или от 45 до 47 единиц или любую их комбинацию, например, от 43 до 50 единиц. Способы, распространенные в данной области техники для разглаживания или предотвращения морщин, включают введение примерно 20 единиц нейротоксина. Как известно, применение композиций, содержащих большее количество нейротоксина, значительно увеличивает риск нежелательных побочных эффектов, таких как опущение, например, опущение верхнего века. Однако в данном способе такие отрицательные побочные эффекты могут не наблюдаться, и клеткам становится доступным большее количество нейротоксина, что приводит к увеличенной эффективности. Аналогично приведенным выше объяснениям, в настоящем косметическом способе ботулинический нейротоксин А предпочтительно высвобождается из настоящей композиции в течение 12 часов.

Еще одним предметом настоящего изобретения является косметическое применение настоящей композиции для разглаживания или предотвращения морщин, предпочтительно, морщин, являющихся следствием мимической активности, в котором применяемая композиция содержит от 40 до 55 единиц ботулинического нейротоксина, предпочтительно нейротоксина типа А. Более предпочтительно можно применять от 42 до 52, от 43 до 49, от 44 до 48 или от 45 до 47 единиц или любую их комбинацию, например, от 43 до 50 единиц.

Как указано выше, композиции из уровня техники, как известно, содержат примерно 20 единиц ботулинического нейротоксина при косметическом применении для разглаживания или предотвращения появления морщин. Благодаря высокому количеству ботулинического нейротоксина, составляющему от 40 до 55 единиц, предпочтительно, нейротоксина типа А, содержащегося во введенной композиции, для соответствующих клеток становится доступным большее количество единиц ботулинического токсина, и применение настоящей композиции для разглаживания или предотвращения морщин обеспечивает длительный эффект нейротоксина, введенного с настоящей композицией.

Настоящее изобретение может быть проиллюстрировано с помощью следующих примеров:

Примеры

1. Получение композиций Пример 1

Получали две субъединицы композиции.

Субъединица 1: Лиофилизат, содержащий 50 единиц ботулинического нейротоксина типа А, 25 мг сывороточного альбумина человека (HSA) и 1,18 мг сахарозы, восстанавливали с применением 1 мл 0,9% солевого раствора.

Субъединица 2: Готовили раствор, содержащий 1 мл воды, 14 мг несшитой гиалуроновой кислоты, имеющей среднюю молекулярную массу примерно 3,8 кДа, 34 мг маннита, 3,0 мг глицерина, 0,6 мг фосфатного буфера.

Субъединицы смешивали таким образом, что один мл полученной водной композиции содержал:

Ботулинический нейротоксин типа А 25 единиц Несшитая гиалуроновая кислота 7 мг Сывороточный альбумин человека (HSA) 0,125 мг Сахароза 0,59 мг Маннит 17,0 мг Глицерин 1,5 мг Фосфатный буфер 0,3 мг Хлорид натрия 4,5 мг

Сравнительный пример

Сравнительную композицию получали следующим образом: лиофилизат, содержащий 50 единиц ботулинического нейротоксина типа А, 25 мг сывороточного альбумина человека (HSA) и 1,18 мг сахарозы восстанавливали с применением 1 мл 0,9% солевого раствора.

Таким образом, полученная водная композиция содержит:

Ботулинический нейротоксин типа А 50 единиц Сывороточный альбумин человека (HSA) 0,25 мг Сахароза 1,18 мг Хлорид натрия 0,9 мг

2. Сравнение эффективности

2.1 Двум группам по 10 мышей в каждой посредством инъекции в правую икроножную мышцу вводили по 0,8 мл композиции в соответствии со сравнительным примером или по 1,6 мл композиции в соответствии примером 1, при этом оба примера содержали 40 единиц ботулинического нейротоксина типа А. В обеих группах смертность не наблюдалась. Незначительные признаки системной токсичности отмечались на 2-10 день в одинаковой степени в обеих группах.

Как видно из Фигуры 1, максимальный балл составляет 4 (балл DAS), что указывает на полный паралич задней лапы. Время между началом паралича и максимальным параличом составляло один день. Продолжительность паралича для достижения уровня ЕС50 (балл 2 DAS) у мыши составляла примерно 12 дней для сравнительной композиции и примерно 30 дней для композиции согласно настоящему изобретению. Таким образом, композиция согласно настоящему изобретению обеспечивала неожиданное пролонгирующее действие без увеличения побочных эффектов.

2.2 Повторяли сравнение соответствии с вышеприведенным пунктом 2,1, в котором мышам, обработанным настоящей композицией, вводили 2,5 мл композиции в соответствии с примером 1, то есть 62,5 единиц ботулинического нейротоксина типа А. В обеих группах смертность не наблюдалась. Незначительные признаки системной токсичности отмечались на 2-10 день в обеих группах в одинаковой степени.

Фигура 2 иллюстрирует пролонгирующее действие, обеспечиваемое композицией согласно настоящему изобретению, без увеличения побочных эффектов.

Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей (а) ботулинический токсин и (b) несшитую гиалуроновую кислоту, и ее применению для лечения или предотвращения дистонии, спастического состояния и/или морщин. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу косметического разглаживания или предотвращения морщин, включающему стадию введения настоящей композиции. Описана композиция для предотвращения или лечения заболевания или состояния, которое может быть предотвращено или вылечено с помощью ботулинического нейротоксина А, содержащая a) 2-4 или 20-40 единиц ботулинического нейротоксина А на миллиграм несшитой гиалуроновой кислоты, b) 2,5-9 мг несшитой гиалуроновой кислоты, имеющей среднюю молекулярную массу от 2,5 до 4,5 МДа, где заболевание или состояние выбрано из фокальной, сегментарной или генерализованной дистонии, спастического состояния или морщин, и где индекс полидисперсности несшитой гиалуроновой кислоты составляет от 1,1 до 4,0. Технический результат - создание улучшенного состава с ботулиническим нейротоксином, обеспечивающего пролонгированное действие ботулинического токсина, предотвращение или по меньшей мере значительное снижение нежелательных побочных эффектов. 5 н. и 7 з.п. ф-лы, 1 пр., 2 ил.

1. Композиция для предотвращения или лечения заболевания или состояния, которое может быть предотвращено или вылечено с помощью ботулинического нейротоксина А, содержащая

a) 2-4 или 20-40 единиц ботулинического нейротоксина А на миллиграм несшитой гиалуроновой кислоты,

b) 2,5-9 мг несшитой гиалуроновой кислоты, имеющей среднюю молекулярную массу от 2,5 до 4,5 МДа,

где заболевание или состояние выбрано из фокальной, сегментарной или генерализованной дистонии, спастического состояния или морщин; и

где индекс полидисперсности несшитой гиалуроновой кислоты составляет от 1,1 до 4,0.

2. Композиция по п. 1, которая дополнительно содержит

c) соль,

d) необязательно агент для стабилизации нейротоксина,

e) ингибитор кристаллизации,

f) буфер и/или

g) агент для удаления свободных радикалов.

3. Композиция по любому из пп. 1, 2, в которой указанная композиция имеет динамическую вязкость от 1,5 до 4 Па·с, определенную при 25°C с применением частоты колебаний, составляющей 1 Гц.

4. Применение композиции по любому из пп. 1-3 для лечения или предотвращения фокальной, сегментарной или генерализованной дистонии, при котором вводят от 200 до 500 единиц ботулинического нейротоксина А.

5. Применение композиции по любому из пп. 1-3 для лечения или предотвращения спастического состояния, при котором вводят от 500 до 1000 единиц ботулинического нейротоксина А.

6. Применение композиции по любому из пп. 1-3 для предотвращения или лечения морщин, при котором вводят от 40 до 50 единиц ботулинического нейротоксина А.

7. Применение по любому из пп. 4-6, в котором указанная композиция остается в месте введения не более 24 часов после введения.

8. Применение по любому из пп. 4-6, в котором ботулинический нейротоксин А высвобождается в течение 12 часов.

9. Применение по любому из пп. 4-6, в котором композицию вводят каждые 4-9 месяцев.

10. Способ косметического разглаживания или предотвращения морщин у млекопитающего, включающий:

(i) введение композиции по пп. 1-3 и

(ii) повторение введения через 4-9 месяцев.

11. Способ по п. 10, в котором указанная композиция содержит от 40 до 50 единиц ботулинического нейротоксина А.

12. Способ по п. 10 или 11, в котором морщины обусловлены мимической активностью.