Способ определения частоты и амплитуды модуляции фазы волнового фронта, создаваемого колебаниями мембраны клетки Российский патент 2021 года по МПК G01N21/41 G01B9/02 G01N33/483 

Настоящее изобретение относится к области оптико-электронных измерений, а именно, к интерферометрии фазовых динамических объектов и может быть использовано в биологии и медицине для исследования частоты колебаний формы и показателя преломления живых клеток, которые определяют ее оптическую толщину.

Как известно, для живых клеток характерны локальные колебания мембраны, называемые также фликкер или динамические флуктуации мембраны. Несмотря на длительную историю исследования таких колебаний, и многочисленные работы, посвященные их спектральному анализу и моделированию, молекулярные и клеточные механизмы данного явления до сих пор обсуждаются. Важно, что не подвергается сомнению тот факт, что амплитуда фликкера определяется мембраной и зависит от состояния цитоскелета клетки: изменения упругих свойств комплекса мембраны и цитоскелета или формирования локальных изгибов (выступов) мембраны за счет перестройки спектриновой сети (например, отщепления от узлового комплекса одной из нитей спектрина и образования непланарной конфигурации сети). Также при этом возможно анализировать и характер шума, выделяя определенные частоты колебаний и оценивая с их помощью динамические процессы, протекающие в клетках. Данный процесс весьма сложен и требует значительных человеческих и машинных трудозатрат. Понимание происхождения клетки и определение характеристик колебания ее мембраны могут дать информацию о функциональных состояниях эритроцитов при нормальных и патологических состояниях. Не менее важной задачей является изменение плотности внутри клетки, связанные с синтезом и распадом белка, что также приводит к периодическим изменениям фазы, прошедшего через объект волнового фронта. Разделить влияние колебания мембраны и флуктуаций плотности внутри клетки из оптических измерений практически невозможно, поэтому определяют изменение оптической толщины клетки, характеризующей обе эти величины. Для исследования динамики живых клеток используются различные методы, такие как: фазово-контрастная микроскопия, отраженная интерференционная контрастная микроскопия, рассеяние света, техника, основанная на точечной темнопольной микроскопии. Однако эти методы не являются по своей сути количественными с точки зрения абсолютных измерений и не позволяют исследовать распределение мембранных колебаний и флуктуаций показателя преломления внутри клетки.

В последнее время появляются новые методы визуализации, называемые количественная фазовая микроскопия, которая продемонстрировала свою способность обеспечить точную трехмерную визуализацию прозрачных живых клеток. Использование этого метода для исследования временных колебаний мембраны и плотности внутри клетки представляет собой актуальную задачу, решением которой занимаются научные коллективы в различных странах.

Из уровня техники известны ряд способов исследования колебаний клеточной мембраны, однако наиболее удобными и популярными являются оптические методы на базе интерференционной микроскопии.

Одним из аналогов заявляемого технического решения является способ, определения колебания плотности внутри клетки, что также приводит к модуляции фазы волнового фронта, реализованный в автоматизированном интерференционном микроскопе «Эйрискан» и разработанный на базе микроинтерферометра МИИ-4 по схеме Линника (Тычинский В.П. Когерентная фазовая микроскопия внутриклеточных процессов // Успехи физических наук.- 2001. - Т. 171. - №6.). В качестве источника освещения использовался He-Ne лазер. Интерференционное изображение регистрируется с помощью координатно-чувствительного фотоприемника - диссектора, который представляет собой электронно-оптический преобразователь с внешним фотоэффектом (без накопления заряда) с фотоэлектронным умножителем и магнитным переносом потока электронов в плоскость диафрагмы с малым отверстием. Для автоматизированной расшифровки интерферограмм реализован компенсационный метод. Модуляция фазы опорного пучка излучения производилась с помощью зеркала с пьезоэлементом. Область сканирования изменялась в пределах 5-50 мкм. Максимальный размер изображения 1024×1024 пикселей. Время ввода одного пикселя - 1 мс. Время захвата всего изображения изменяется от 10 с (5×5 мкм) - 16 мин (50×50 мкм). Таким образом, данный микроскоп, имеющий длительное время ввода изображения, позволяет исследовать лишь стационарные фазовые объекты, либо проводить локальные динамические измерения - в нескольких точках для динамических объектов. Основными недостатками данного метода являются: необходимость восстановления фазы интерферограмм, что приводит к дополнительным погрешностям алгоритма; невозможность компенсации собственных фазовых шумов прибора, из-за локальных измерений фазы только в области объекта; недостаточная дискриминационная способность при спектральном анализе, т.к необходимо определять локальный максимум на фоне шумов.

В качестве еще одного аналога заявляемого способа определения частоты и амплитуды модуляции фазы волнового фронта, создаваемого колебаниями мембраны клетки, рассмотрим голографический микроскоп, предназначенный для анализа колебаний мембраны эритроцита и описанный в работе В. Rappaz, et al., Spatial analysis of erythrocyte membrane fluctuations by digital holographic microscopy, Blood Cells Mol. Dis. (2009), doi:10.1016/j.bcmd.2009.01.018. Экспериментальная установка, реализующая данный способ, представляет собой модифицированную конфигурацию интерферометра Маха-Цендера. Свет, прошедший через объект и собираемый объективом, формирует объектную волну, которая пересекается с опорной волной R для получения голограммы, которая регистрируется цифровой камерой. Голограммы записываются в внеосевой геометрии т.е. опорная волна достигает регистратора с небольшим углом падения (угол 1°) относительно направления распространения объектной волны. Процедура реконструкции заключается в численном восстановлении голограммы по цифровому эталону опорного пучка внеосевой геометрии. Такая реконструкция процесса также позволяет исправить аберрацию волнового фронта и восстановить фазу волнового фронта, прошедшего через объект. Для уменьшения шума применяется временное суммирование четырех последовательных изображений, восстановленных с голограмм. Это позволяет частично компенсировать экспериментальный шум (временной сдвиг, вибрацию и т.д.). Для оценки амплитуды мембранных колебаний фазы временные колебания - определяется стандартное отклонение фазы сигнал точки на изображении в течение определенного периода времени регистрации. Для определения частоты колебаний используется спектральный анализ временных рядов. Недостатком данного метода является: во-первых, практически отсутствие компенсации искажений, связанных с фазовыми шумами прибора, во-вторых, наличие существенной погрешности реконструкции фазы из голограммы, связанной с алгоритмами цифрового восстановления голограмм, что приводит к дополнительным фазовым шумам, в-третьих, анализ спектра сигнала и поиск единственного максимума в спектре при наличии шума представляет собой сложную задачу.

Наиболее близким аналогом, или прототипом заявляемого способа можно считать следующий способ измерений флуктуации фазы: Optical Measurement of Cell Membrane Tension, Gabriel Popescu, 1 Takahiro Ikeda, 2 Keisuke Goda, 3 Catherine A. Best-Popescu, 4 Michael Laposata, 4 Suliana Manley, 5 Ramachandra R. Dasari, 1 Kamran Badizadegan, 1, 4 and Michael S. Feldl, PHYSICAL REVIEW LETTERS PRL 97, 218101 (2006). В нем излучение от лазера HeNe коллимируется и разделяется на объектный (S) и опорный (R) каналы, чтобы сформировать модифицированый интерферометр Маха-Цендера. Объектный луч обеспечивает поле освещения для инвертированного микроскопа. Сферическая линза расположена таким образом, что изображение образца формируется в плоскости ПЗС регистратора. Опорное поле коллимируется и расширяется с помощью телескопической системы, состоящей из другого объектива микроскопа и той же линзы плоскости ПЗС регистратора.

Используя высокочастотную пространственную фильтрацию и преобразование Гильберта, в каждой точке интерферограммы реконструируют пространственно изменяющуюся фазу, связанную с изображением клетки. Чтобы подавить собственный фазовый шум, используется система обратной связи, которая блокирует интерферометр на полосе помех следующим образом. Небольшое зеркало отклоняет часть лучей до того, как они достигают регистратора. Два луча, распространяющиеся по оси, пространственно фильтруются апертурой и детектируются фотодиодом. После системы обработки интерферограммы определяют изменения фазы и вырабатывается управляющий сигнал, который корректирует длину опорного плеча через управление пьезо зеркалом, стоящим в опорном канале. Недостатками данного метода является то, что, во-первых, не исключаются погрешности реконструкции фазы, которые приводят к фазовым шумам, во-вторых, сохраняется невысокая дискриминационнось искомой частоты и амплитуды колебаний фазы, т.к. необходим поиск единственного максимума в спектре при наличии шума.

Таким образом среди основных недостатков известных из уровня техники интерфереционных систем, применяемых для определения частоты и амплитуды колебаний фазового фронта, можно выделить следующие три:

1. Определение изменения фазы проводится после реконструкции фазы из интерференционной картины, что приводит к существенному увеличению времени регистрации одного фазового фронта при реконструкции при помощи метода фазовых шагов или повышении погрешности измерений при использовании метода Фурье (Преобразование Гильберта) и уменьшению исследуемой полосы частот колебаний фазы волнового фронта.

2. Влияние внешних воздействий на интерференционную картину, таких как вибрация и периодические смещения оптических элементов, которые называют собственным фазовым шумом прибора. Они также искажают измерения частоты собственных колебаний объекта. Особенно эти вибрации существенно сказываются при настройке интерферометра на полосы конечной ширины, что необходимо для применения метода Фурье или восстановления голограмм при реконструкции фазы.

3. Плохая дискриминационная способность спектра сигнала флуктуации фазы в исследуемой области объекта. Это вызвано тем, что спектр представляет собой локальный максимум на фоне широкого квази белого спектра, вызванного шумами регистратора и ошибками реконструкции фазы, который обладает гармониками, связанными с алгоритмом реконструкции. Существенным также является то, что при анализе низких частот трудно разделить широкий спектр нулевых частот и небольшой локальный максимум искомой частоты.

Техническая проблема, решаемая заявляемым изобретением, состоит в устранении указанных недостатков и одновременно в расширении диапазона измерений частот колебаний фазы волнового фронта, прошедшего через клетку и создаваемого колебаниями мембраны клетки.

Технический результат, который обеспечивается заявляемым изобретением, заключается в повышении точности проводимых измерений частоты и амплитуды мембранных колебаний клетки за счет компенсации воздействия внешних колебаний и повышения дискриминационной способности спектрального анализа, выражающейся в возможности формирования характерного сигнала, определяемого амплитудой и частотой колебаний фазы, в виде двойного максимума и эффективного выявления его в анализируемом спектре.

Заявляемое техническое решение характеризуется следующими существенными отличительными признаками

1. Амплитуда и частота модуляции фазы волнового фронта определяются непосредственно по локальным изменениям интерферограммы, что позволяет избежать погрешностей, связанных с алгоритмами реконструкции фазы из интерферограмм.

2. Внешние фазовые шумы прибора компенсируются за счет смешения информационного и опорного сигналов, что позволяет полностью исключить его влияние непосредственно в процессе измерений.

3. Дополнительная фазовая модуляция информационного и опорного сигналов позволяет существенно повысить дискриминационную способность при анализе спектра и определять амплитуду и частоту колебаний фазы на уровне шумов.

Заявляемый способ определения частоты и амплитуды модуляции фазы волнового фронта, создаваемого колебаниями мембраны клетки, осуществляется следующим образом (см. Фиг. 1). Излучение когерентного источника 1 направляется на светоделитель 2, где делится на два пучка, один из которых проходит через исследуемую клетку 3. Второй попадает на управляемое зеркало 4 и затем через зеркал 9 и светоделитель 8 на регистратор 10.

Исследуемую клетку 3, помещают в сигнальное плечо интерферометра, освещают лазерным излучением таким образом, чтобы область освещения была больше размера объекта. Интерферометр, при помощи зеркала 4, настраивают на полосы бесконечной ширины. На объекте визуально выбирают область, в которой будет определяться амплитуда и частота собственных колебаний. При помощи управляемого зеркала в опорном канале устанавливают фазу опорной волны так, чтобы разность фаз опорного и сигнального канала в этой области была равна нулю. При этом индекс модуляции собственных колебаний m на интерферограмме будет максимальной. Вне объекта выбирают область приблизительно равного размера, сигнал с которой будет служить в качестве опорного.

Изображение объекта проецируют при помощи оптической системы 5 на пространственный фазовый модулятор 6.

Фазовый модулятор модулирует упавшее излучение в выбранной для исследования области объекта с частотой ω_s, а в области вне объекта с частотой ω_r. Модулированное изображение проецируют оптической системой 7 на регистратор 10. На регистратор 10 также направляют опорную волна с фиксированной фазой.

Получившуюся интерферограмму формируют в плоскости регистратора 10 и преобразуют им в электрический сигнал, который в заданной области объекта можно представить в виде следующего выражения:

где U(t)=U₀+U_n(t) - амплитуда сигнала, U₀ - постоянная составляющая амплитуды, U_n(t) - шумовая добавка к амплитуде, m - индекс модуляции полезного сигнала, Ω - круговая частота полезного сигнала, - дрожание плеч интерферометра, - амплитуда дрожания плеч, - ширина спектра дрожания плеч, спектр дрожания плеч имеет максимум в нуле частоты и гауссову огибающую, Ф_s(t) - модуляция сигнального канала, представляет собой одностороннюю пилу с максимумом A_max1, минимумом A_min1 и круговой частотой ω₃, ϕ_s - начальная фаза.

В области вне объекта интерферограмма также преобразуют в электрический сигнал, который можно представить в виде следующего выражения:

где Ф_r(t) - модуляция сигнального канала, представляет собой одностороннюю пилу с максимумом A_max2, минимумом A_min2 и круговой частотой ω_r, ϕ_r - начальная фаза.

Оба сигнала поступают на перемножитель 11 (смеситель) в результате на выходе формируют измеряемый сигнал, который определяется следующим выражением:

Полученный сигнал анализируют в спектранализаторе 12.

Спектральный анализ этого сигнала показывает, что спектр сигнала в районе разностной частоты содержит два ярко выраженных максимума на частотах (Ф_s-Ф_r)±Ω.

При этом в этой области полностью компенсируются шумы, связанные с внешними вибрациями и ошибки связанные с восстановлением фазы из интерферограмм.

На Фиг. 2 представлены результаты моделирования предложенного способа.

На Фиг. 2а Представлены результаты моделирования предложенного способа при частоте колебаний оптической толщины клетки Ω=5 Гц:

Параметры модели приведены ниже:

U₀=1

U_n=0,01

m=0.01;

Ω=2π × 5 Гц

ω_s=2π × 100 Гц

A_max1=πA_min1=-π

ϕ_r=0.6 π

ω_r=2π × 200 Гц

A_max2=πA_min2=-π

Все обозначения приведены выше в тексте.

На Фиг. 2б представлены результаты моделирования предложенного способа при частоте колебаний оптической толщины клетки Ω=100 Гц:

Параметры модели приведены ниже:

Ω=2π × 100 Гц

ω_s=2π × 300 Гц

ω_r=2π × 420 Гц

Остальные параметры такие же как на Фиг. 2а.

Из графиков, приведенных на рисунках видно, что информационный сигнал отстоит от шумовой составляющей и явно выделяется парой частот (ω₁-ω₂)±Ω которые позволяют легко определить частоту и амплитуду колебания оптической толщины клетки.

Результаты моделирования показывают, что предложенный метод позволяет определять частоту и амплитуду модуляции фазы волнового фронта, создаваемого колебаниями мембраны клетки, в широком диапазоне частот и малой амплитуде колебаний с высокой надежностью.

Хотя настоящее изобретение описано на примере конкретных вариантов его осуществления, для специалистов будут ясны возможности многочисленных модификаций данного изобретения, не выходящие за границы объема его правовой охраны, определяемого прилагаемой формулой.

Изобретение относится к области интерферометрии фазовых динамических объектов. Способ определения частоты и амплитуды модуляции фазы волнового фронта, создаваемого колебаниями мембраны клетки, включает разделение излучения когерентного источника на два пучка, один из которых проходит через исследуемый объект и отображается на регистраторе, а второй проходит по опорному каналу и также попадает на регистратор, где оба пучка интерферируют, и по изменению интерференционной картины судят об изменениях фазы волнового фронта. Опорный канал интерферометра в процессе регистрации интерферограммы настраивают таким образом, чтобы значение разности фаз в выбранной области было равно нулю. Часть волнового фронта, прошедшего через исследуемую клетку, направляют оптической системой на фазовый модулятор. Посредством фазового модулятора модулируют прошедшее излучение с частотой ω₁ и глубиной модуляции m₁, затем изображение модулятора проецируют оптической системой на регистратор, при этом для компенсации смещения фазы, вызванного внешними вибрациями, выделяют часть волнового фронта, не прошедшую через объект, и направляют ее той же оптической системой на фазовый модулятор, который модулирует эту часть волнового фронта частотой ω2 и глубиной модуляции m₂. Затем изображение этой части фазового модулятора проецируют на регистратор, полученные два электрических сигнала перемножаются, и результирующий сигнал подвергают спектральному анализу, при этом из спектра сигнала выделяют частоту, равную разности частот модуляции оптического излучения, прошедшего через объект, и оптического излучения, не прошедшего через объект, и вблизи этой частоты ищут симметричную пару частот с противоположным значением фазы, по частотным координатам которых определяют частоту, а по величине – амплитуду модуляции фазы волнового фронта в выбранной области клетки. Технический результат заключается в обеспечении возможности повышения точности измерений частоты и амплитуды мембранных колебаний клетки. 2 ил.

Способ определения частоты и амплитуды модуляции фазы волнового фронта, создаваемого колебаниями мембраны клетки, содержащий следующие шаги:

- излучение когерентного источника делят на два пучка, один из которых проходит через исследуемый объект и отображается на регистраторе, а второй проходит по опорному каналу и также попадает на регистратор, где оба пучка интерферируют, и по изменению интерференционной картины судят о об изменениях фазы волнового фронта,

отличающийся тем, что

- опорный канал интерферометра в процессе регистрации интерферограммы настраивают таким образом, чтобы значение разности фаз в выбранной области было равно нулю,

- часть волнового фронта, прошедшего через исследуемую клетку, направляют оптической системой на фазовый модулятор,

- посредством фазового модулятора модулируют прошедшее излучение с частотой ω₁ и глубиной модуляции m₁, затем изображение модулятора проецируют оптической системой на регистратор,

- при этом для компенсации смещения фазы, вызванного внешними вибрациями, выделяют часть волнового фронта, не прошедшую через объект, и направляют ее той же оптической системой на фазовый модулятор, который модулирует эту часть волнового фронта частотой ω₂ и глубиной модуляции m₂,

- затем изображение этой части фазового модулятора проецируют на регистратор,

- полученные два электрических сигнала направляют на перемножитель, где они перемножаются, и результирующий сигнал подвергают спектральному анализу, при этом из спектра сигнала выделяют частоту, равную разности частот модуляции оптического излучения, прошедшего через объект, и оптического излучения, не прошедшего через объект, и вблизи этой частоты ищут симметричную пару частот с противоположным значением фазы, по частотным координатам которых определяют частоту, а по величине – амплитуду модуляции фазы волнового фронта в выбранной области клетки.