Настоящее изобретение относится к микроскопии, а более точно касается способа оптической томографии трехмерных микрообъектов и микроскопа для его осуществления. Изобретение может быть использовано в биологии, медицине, материаловедении.
Большинство биологических объектов является достаточно прозрачными для излучения оптического диапазона. С точки зрения физической оптики такой объект является амплитудно-фазовым объектом и его внутренняя структура описывается трехмерными пространственными распределениями показателя преломления и коэффициента поглощения. Измерение этих оптических неоднородностей играет важную роль в исследовании таких распространенных микрообъектов, как живые биологические клетки. Эти измерения не требуют окрашивания клеток, введения флуоресцентных меток и т.п. С показателем преломления и коэффициентом поглощения связаны различные физические параметры клеток, например их плотность и концентрация различных веществ внутри клетки. По распределению показателя преломления можно определить вес сухих веществ в клетке и в ее органеллах, места локализации инородных веществ в клетке, например лекарств. Можно наблюдать динамические процессы в клетке, так как она остается живой, в частности, процессы синтеза и распада белков. Можно также определять традиционные морфологические параметры клеток.
Микроскопия амплитудно-фазовых объектов распадается на две задачи. Первая - это задача количественной визуализации изображений, т.е. использование таких методов формирования изображений прозрачных или полупрозрачных объектов, которые несут количественную информацию об их структуре. Вторая - формирование или реконструкция двумерных изображений внутренних сечений трехмерных объектов. Для чисто фазовых микрообъектов такие изображения должны нести количественную информацию о пространственном распределении показателя преломления, а для амплитудно-фазовых - еще и о коэффициенте поглощения.
Для фазовых и амплитудных объектов изображение, формируемое микроскопом с помощью какого-либо контраста, не совпадает с томографической проекцией, а связано с ней нелинейным образом. Только для флуоресцентного объекта его изображение совпадает (линейно связано) с проекцией, так как искомой характеристикой является пространственное распределение интенсивности излучения флуорофора.
В микроскопии для получения изображений внутренних сечений трехмерных объектов разработано несколько различных способов:
1. Микроскопия широкого поля зрения с последующей цифровой обработкой (деконволюцией).
2. Конфокальная сканирующая микроскопия.
3. Томографическая микроскопия.
При этом под двумерным изображением внутреннего сечения трехмерного фазового или амплитудно-фазового объекта понимают двумерную карту локальных значений показателя преломления и коэффициента поглощения.
Известен способ (A. Erhardt, G. Zinser, D. Komitowski D., J. Bille, "Reconstructing 3-D light-microscopic images by digital image processing" Appl. Opt. , 1985, vol. 24, n 2, pp. 194-200), основанный на цифровом восстановлении изображений внутренних сечений микрообъекта путем решения трехмерного уравнения. Способ заключается в том, что формируют трехмерное изображение трехмерного микрообъекта с помощью обычного микроскопа с широким полем зрения. Производят сканирование плоскости регистрации в области формирования изображения вдоль оптической оси микроскопа и последовательно регистрируют набор различных двумерных сечений трехмерных изображений. Далее полученные изображения совместно обрабатывают, используя дополнительную информацию о трехмерной функции рассеяния точки микроскопа. Этот подход предполагает, что трехмерный объект можно представить в виде суммы независимых двумерных сечений. Такая модель применима только для самосветящихся флуоресцентных объектов, так как только для них интенсивность света в любой точке его изображения складывается из интенсивностей света от соответствующих точек внутри объекта. Для фазовых и амплитудных объектов данный подход не применим.
Способ конфокальной сканирующей микроскопии (Handbook of Biological Confocal Microscopy, ed. by J.B.Pawley, Plenum Press, New-York and London, 1990) был специально разработан для повышения селективных свойств микроскопов по глубине трехмерных объектов. Способ заключается в том, что формируют изображение точечного источника света внутри микрообъекта, сканируют полученное изображение по всем трем направлениям, переотображают его в плоскость точечной диафрагмы, выполняют пространственную фильтрацию рассеянного света с помощью указанной точечной диафрагмы и производят регистрацию прошедшего света с помощью точечного фотодетектора. Полученные данные последовательно отображают на трехмерной сетке, соответствующей фиксированным положениям изображения точечного источника света внутри объекта при сканировании. Как и в первом случае, этот способ применим в основном для флуоресцентных объектов. Основной эффект заключается в устранении (уменьшении) вклада от рассеянного объектом света. Но даже для флуоресцентных объектов конфокальная микроскопия формирует изображения внутренних сечений лишь в некотором приближении. Это связано с тем, что в конфокальном микроскопе объект зондируется коническим пучком, вершина которого находится внутри объекта. Интегрирование информации выполняется по лучам, проходящим через эту вершину и равномерно заполняющим конус. В конфокальном микроскопе регистрируется суммарная интенсивность света от лучей, прошедших через эту вершину.
Известны попытки комбинации конфокальной микроскопии с дифференциальным интерференционным контрастом (ДИК) при исследовании фазовых объектов (Т. Wilson, "Differential phase imaging in confocal microscopy", Proc. SPIE, 1993, Vol. 2083, pp. 132-138). Однако такой способ позволяет получать лишь качественные, а не количественные данные. Это связано, в первую очередь, с нелинейностью ДИК - изображений относительно градиента фазы. Во-вторых, такие изображения, как и в предыдущем случае, дают суммарную картину, а не искомое распределение показателя преломления.
В патенте США N 5162648 предложено соединить конфокальный сканирующий микроскоп с интерференционным контрастом путем введения опорного пучка света. Однако этот микроскоп предназначен для исследования профиля поверхности непрозрачных отражающих объектов и он не может быть применен для исследования трехмерных прозрачных или полупрозрачных объектов.
Для исследования трехмерных фазовых и/или амплитудных микрообъектов необходимо применять методы восстановления изображений по проекциям, т.е. методы компьютерной томографии. В этом случае микроскоп выступает в роли устройства для визуализации и регистрации количественной информации о проекционных данных под различными углами зондирования объекта.
Наиболее близким к заявляемому является способ оптической томографии трехмерных объектов (Т. Noda, S. Kawata, S. Minami, "Three-dimensional phase-contrast imaging by a computed-tomography microscope", Appl. Optics, 1992, Vol. 31, N5, pp. 670-674).
Способ заключается в том, что формируют изображение точечного источника света в передней фокальной плоскости освещающего микрообъектива (конденсора), сканируют полученное изображение в указанной плоскости по круговой траектории с последующим формированием пучка света, зондирующего микрообъект, размещенный на прозрачном предметном стекле, под различными углами относительно оптической оси микрообъектива. Затем последовательно при всех угловых положениях пучка света выполняют в задней фокальной плоскости отображающего микрообъектива пространственную фильтрацию прошедшего через объект пучка света, формируют изображения микрообъекта, регистрируют полученные изображения и производят их совместную томографическую обработку.
Основной недостаток данного способа заключается в том, что по нему нельзя получить количественные данные о трехмерном распределении показателя преломления для произвольных фазовых объектов. Он применим только для фазовых объектов с малыми изменениями показателя преломления. Это вызвано тем, что в данном способе для формирования изображения микрообъекта может использоваться только метод фазового контраста, причем может применяться только одна из разновидностей метода фазового контраста, в которой используется непрозрачный край круглой диафрагмы в качестве визуализирующего (режекторного) ножа и наклонное освещение объекта. Поэтому по такому способу можно реализовать только одну круговую траекторию сканирования изображения точечного источника света в передней фокальной плоскости освещающего микрообъектива. Этот факт также накладывает ограничения на качество получаемых томограмм, так как ограничивает набор возможных траекторий.
Наиболее подходящим для исследования фазовых объектов является интерференционный контраст. Поэтому для исследования пространственного распределения показателя преломления фазовых микрообъектов предлагается использовать метод компьютерной томографии в сочетании с оптической микроскопией и интерференционным методом визуализации проекций в реальном времени.
Известен микроскоп (A. Erhardt, G.Zinser, D.Komitowski D., J. Bille, "Reconstructing 3-D light-microscopic images by digital image processing" Appl. Opt., 1985, vol.24, N2, pp.194-200), содержащий расположенные последовательно вдоль оптической оси исследуемый микрообъект, микрообъектив, окуляр и регистрирующее устройство. Центр микрообъекта расположен в передней фокальной плоскости микрообъектива, задняя фокальная плоскость которого совмещена с передней фокальной плоскостью окуляра. Регистрирующее устройство располагают вблизи задней фокальной плоскости окуляра так, что оно может перемещаться вдоль оптической оси устройства. При таком конфокальном расположении оптических элементов в пространстве изображений (в области около задней фокальной плоскости окуляра) формируется трехмерное изображение микрообъекта с одинаковым увеличением изображений различных продольных сечений, отличающихся глубиной расположения внутри микрообъекта. При сканировании регистрирующего устройства вдоль оптической оси регистрируются двумерные изображения различных сечений трехмерного объекта. Далее полученные изображения совместно обрабатывают, используя дополнительную информацию о трехмерной функции рассеяния точки микроскопа. Этот подход предполагает, что трехмерный объект можно представить в виде суммы независимых двумерных сечений. Такая модель применима только для самосветящихся флуоресцентных объектов, так как для них интенсивность света в любой точке его изображения складывается из интенсивностей света от соответствующих точек внутри объекта. Для фазовых и амплитудных объектов данный подход не применим.
Известен конфокальный сканирующий микроскоп (Handbook of Biological Confocal Microscopy, ed. by J.B.Pawley, Plenum Press, New-York and London, 1990), содержащий расположенные последовательно вдоль оптической оси микроскопа точечный источник света, линзу-конденсор, микрообъект, микрообъектив, точечную диафрагму и регистрирующее устройство. Причем линза-конденсор расположена на таком расстоянии от источника света, что она формирует изображение этого источника внутри микрообъекта, а микрообъектив переносит это изображение в плоскость точечной диафрагмы. Поэтому данная диафрагма полностью пропускает свет от тех точек внутри микрообъекта, которые находятся в оптически сопряженной плоскости. Регистрирующее устройство, расположенное сразу за диафрагмой, детектирует интенсивность прошедшего света. Свет от других точек внутри микрообъекта, которые находятся вне данной плоскости, будет фокусироваться вне плоскости диафрагмы. Следовательно, через диафрагму будет проходить лишь малая часть света от этих точек и их вклад в результирующий сигнал регистрирующего устройства будет мал. Поэтому конфокальный сканирующий микроскоп обладает лучшей избирательной способностью по глубине микрообъекта, чем обычный микроскоп. Для получения информации от других точек необходимо сканирование микрообъекта относительно изображения точечного источника света в трех направлениях. Как и в первом случае, этот микроскоп применим в основном для флуоресцентных объектов. Основной недостаток данного микроскопа заключается в том, что получаемые на нем изображения несут суммарную информацию об оптических характеристиках микрообъекта вдоль набора лучей, лежащих внутри конуса, вершина которого совпадает с положением изображения точечного источника света внутри микрообъекта.
По этой же причине комбинация конфокального сканирующего микроскопа с дифференциальным интерференционным контрастом (Т. Wilson, "Differential phase imaging in confocal microscopy", Proc. SPIE, 1993, vol. 2083, pp. 132-138) и даже введение опорного пучка, как в патенте США 5162648, не дает локальных количественных данных о фазовом объекте, а формирует некоторую суммарную (по конусу лучей) картину о показателе преломления.
Наиболее близким по технической сущности, принятым за прототип, является микроскоп для оптической томографии трехмерных микрообъектов (Т. Noda, S. Kawata, S. Minami, "Three-dimensional phase-contrast imaging by a computed-tomography microscope", Appl. Optics, 1992, vol. 31, N 5, pp. 670-674), который содержит расположенные последовательно источник света, устройство сканирования изображения источника света, линзу-конденсор, предметное стекло для размещения исследуемого трехмерного микрообъекта, микрообъектив, визуализирующую диафрагму, окуляр, регистрирующее устройство и блок томографической обработки. Устройство сканирования изображения источника света формирует в передней фокальной плоскости линзы-конденсора движущееся по круговой траектории изображение точечного источника света. Поэтому микрообъект зондируется параллельным пучком света, распространяющимся под некоторым углом к оптической оси микроскопа. Микрообъект размещен в передней фокальной плоскости микрообъектива, в задней фокальной плоскости которого располагается круглая визуализирующая диафрагма. Микрообъектив и окуляр составляют конфокальную пару, т.е. задняя фокальная плоскость микрообъектива и передняя фокальная плоскость окуляра совпадают. В задней фокальной плоскости окуляра размещено регистрирующее устройство. Радиус траектории сканирования изображения источника света и радиус визуализирующей диафрагмы должны быть согласованы. Они подбираются так, что параллельный пучок света после зондирования микрообъекта фокусируется микрообъективом на край визуализирующей диафрагмы. Поэтому при зондировании фазового микрообъекта, данная диафрагма действует как непрозрачный нож Фуко, применяемый для визуализации фазовых микрообъектов. Наклонное зондирование микрообъекта позволяет получить информацию о различных проекциях микрообъекта, которые далее поступают в блок томографической обработки.
Устройство сканирования изображения источника света выполнено в виде двух неподвижных переотображающих линз и вращающейся призмы Пехана, которая смещает изображение источника света в поперечном (по отношению к оптической оси микроскопа) направлении на некоторую величину.
Основной недостаток данного микроскопа заключается в том, что в нем реализуется только фазоконтрастный метод визуализации изображений фазовых микрообъектов. Этот метод не дает количественных данных о проекциях произвольных фазовых микрообъектов. Еще один недостаток состоит в том, что в данном микроскопе может быть использована только одна траектория сканирования в виде окружности, а для повышения качества томографической обработки требуются другие типы траекторий.
В основу настоящего изобретения положена задача разработать способ оптической томографии трехмерных микрообъектов и микроскоп, обеспечивающие восстановление количественных данных о трехмерном пространственном распределении показателя преломления и/или коэффициента поглощения исследуемого трехмерного микрообъекта при одновременном повышении чувствительности измерений и качестве восстановленных изображений.
Поставленная задача решается тем, что в способе оптической томографии трехмерных микрообъектов, заключающемся в том, что формируют изображение источника света в передней фокальной плоскости микрообъектива, сканируют полученное изображение в указанной плоскости с последующим формированием пучка света, зондирующего исследуемый трехмерный микрообъект под различными углами относительно оптической оси микрообъектива, последовательно формируют при всех угловых положениях пучка света изображения исследуемого микрообъекта, регистрируют полученные изображения и производят их совместную томографическую обработку, согласно изобретению, дополнительно формируют изображение источника света в передней фокальной плоскости второго микрообъектива с последующим формированием опорного пучка света, а при формировании изображений исследуемого трехмерного микрообъекта пучок света, отраженный от микрообъекта или прошедший микрообъект и затем отраженный обратно, вновь направляют на указанный выше микрообъектив, совмещают полученные изображения исследуемого трехмерного микрообъекта с опорным пучком света, в результате чего получают интерференционные картины, по которым измеряют амплитудно-фазовые характеристики изображений исследуемого трехмерного микрообъекта, на основании которых определяют трехмерное пространственное распределение показателя преломления и/или коэффициента поглощения микрообъекта.
Выделение опорного пучка света необходимо для реализации метода интерференционного контраста, то есть для получения интерференционных картин микрообъекта. Только этот метод визуализации позволяет измерять количественные характеристики (амплитуду и фазу) пучка света, зондирующего объект. Метод фазового контраста, который используется в прототипе, не позволяет измерять указанные характеристики и не может использоваться для микрообъектов, вызывающих большие изменения фазы светового пучка.
Использование отраженного пучка света при формировании изображения микрообъекта позволяет расширить класс исследуемых микрообъектов и повысить чувствительность измерений. Например, можно исследовать микрообъекты, отражающие или рассеивающие зондирующий пучок света в обратном направлении. А в способе, взятом за прототип, при формировании изображений микрообъекта можно использовать только пучок света, прошедший через микрообъект в прямом направлении.
В предлагаемом способе можно также исследовать микрообъекты, размещенные на предметном стекле с зеркальным покрытием. В этом случае зондирующий пучок света отражается от указанного покрытия и повторно зондирует микрообъект. Поэтому суммарный фазовый набег и/или поглощение увеличивается, что ведет к повышению чувствительности измерений.
В предлагаемом способе используется один и тот же объектив для формирования пучка света, зондирующего объект, и для формирования изображений микрообъекта, в отличие от способа, взятого за прототип, в котором используются два микрообъектива. Уменьшение количества микрообъективов ведет также к упрощению процедуры юстировки оптической схемы и уменьшению фазовых и амплитудных шумов.
Совмещение полученных изображений с опорным пучком света с образованием интерференционных картин микрообъекта, по которым измеряют амплитудно-фазовые характеристики изображений микрообъекта, позволяет измерить количественные значения фазы и амплитуды изображений микрообъекта по его интерференционным картинам, а именно фазовые и амплитудные проекции микрообъекта.
Полученные в результате всех перечисленных операций фазовые и амплитудные проекции микрообъекта используются для томографической обработки и восстановления количественных значений трехмерного пространственного распределения, соответственно, показателя преломления и коэффициента поглощения микрообъекта.
Для формирования отраженного пучка света микрообъект размещают на предметном стекле с зеркальным покрытием, что позволяет повысить чувствительность измерений и уменьшить количество угловых положений пучка света при сканировании, что, в конечном счете, ведет к сокращению времени сканирования.
В способе, взятом за прототип, можно использовать только пучок света, прошедший один раз через микрообъект в прямом направлении. Поэтому его чувствительность по меньшей мере в два раза меньше, а количество требуемых угловых положений пучка света в два раза больше, что ведет к увеличению времени сканирования.
Целесообразно между зеркальным покрытием предметного стекла и микрообъектом размещать слой оптически прозрачного вещества.
Это позволяет пространственно разделить изображения объекта и его зеркального отражения, что ведет к улучшению качества томографической обработки.
Сканирование изображения источника света в предлагаемом способе осуществляют по произвольной двумерной траектории.
В известном способе возможна только одна траектория сканирования изображения источника света - в виде окружности, радиус которой определяется числовой апертурой микрообъектива. Это вызвано особенностью фазоконтрастного метода визуализации изображений прозрачных объектов, используемого в способе-прототипе. В этом способе применяется одна из разновидностей метода фазового контраста, в которой используются непрозрачный край круглой диафрагмы поля зрения микрообъектива в качестве визуализирующего (режекторного) ножа и наклонное освещение объекта. В предлагаемом способе сканирование изображения источника света может осуществляться по произвольной двумерной траектории, так как в нем применяется интерференционный метод регистрации изображений прозрачных объектов, который не накладывает никаких ограничений на вид траектории сканирования. Могут быть реализованы траектории в виде прямой, креста, квадрата, спирали, набора концентрических окружностей или квадратов. Как показывают результаты численного моделирования, наиболее оптимальными для томографии с ограниченным углом обзора являются траектории в виде спирали, набора концентрических окружностей или квадратов. Качество восстановленных изображений при таких траекториях выше, чем для траектории в виде окружности.
Для измерения амплитудно-фазовых характеристик изображений микрообъекта предпочтительно регистрировать по меньшей мере три интерференционные картины при соответственно трех различных оптических длинах пути, проходящих опорным пучком света.
В предлагаемом способе для измерения амплитудно-фазовых характеристик изображений микрообъекта по его интерференционным картинам предлагается использовать метод фазовых шагов. Этот метод предполагает регистрацию по меньшей мере трех интерференционных картин при соответственно трех различных оптических длинах пути, проходящих опорным пучком света, что позволяет автоматизировать процесс измерения амплитудно-фазовых характеристик изображений микрообъекта.
При использовании иммерсионного микрообъектива микрообъект размещают в среде, показатель преломления которой по существу равен показателю преломления иммерсионной жидкости для микрообъектива.
Для повышения пространственного разрешения изображений и увеличения угла обзора микрообъекта необходимо использовать микрообъективы с большой числовой апертурой. Такими характеристиками обладают так называемые иммерсионные микрообъективы. Для уменьшения влияния рефракции света на границе микрообъекта его также обычно помещают в некоторую инертную среду, как правило жидкую, показатель преломления которой близок к показателю преломления микрообъекта. Если показатель преломления этой среды не будет равен показателю преломления иммерсионной жидкости для микрообъектива, то на границе этих двух сред будет происходить преломление света и уменьшение эффективного угла обзора микрообъекта. При равенстве показателей преломления среды и иммерсионной жидкости преломления не будет и достигается максимальный угол обзора.
В качестве источника света предпочтительно использовать протяженный источник пространственно-когерентного квазимонохроматического света.
При использовании такого источника света улучшается качество формируемых изображений по сравнению с точечным источником света, который используется в способе, взятом за прототип. Это вызвано тем, что при формировании суммарной интерференционной картины от протяженного источника происходит усреднение случайных шумов в изображениях отдельных элементарных интерферограмм. Это связано с тем, что они образованы с помощью пучков света, прошедших через различные участки оптических элементов микроскопа. В результате это приводит к уменьшению шумовой составляющей в проекциях.
Поставленная задача решается также тем, что микроскоп для оптической томографии трехмерных микрообъектов, содержащий источник света, устройство сканирования изображения источника света, предметное стекло для размещения на нем исследуемого трехмерного микрообъекта, отображающий канал, содержащий окуляр и регистрирующее устройство, и блок томографической обработки, согласно изобретению, дополнительно содержит светоделитель, предназначенный для формирования двух идентичных предметного и опорного каналов, каждый из которых образован микрообъективом и зеркалом, расположенным в его задней фокальной плоскости, и для формирования отображающего канала, расположенного по направлению распространения пучков света, отраженных от зеркала предметного канала и от зеркала опорного канала и светоделителя, при этом зеркало предметного канала является предметным стеклом, а окуляр установлен в отображающем канале так, что его передняя фокальная плоскость совпадает с передними фокальными плоскостями микрообъективов предметного и опорного каналов, а в задней фокальной плоскости окуляра расположено регистрирующее устройство.
Предметный канал, сформированный благодаря использованию в предлагаемом микроскопе светоделителя, предназначен для зондирования исследуемого микрообъекта и формирования его изображения, а опорный канал необходим для создания опорного пучка и образования интерференционной картины, по которой можно измерить количественные данные об амплитудно-фазовых характеристиках изображения микрообъекта. Отсутствие светоделителя и двух идентичных предметного и опорного каналов в микроскопе-прототипе не позволяет на нем реализовать интерференционный контраст и, соответственно, получать количественные данные об амплитудно-фазовых характеристиках изображения микрообъекта.
Каждый из каналов образован микрообъективом и зеркалом, расположенным в его задней фокальной плоскости. Такое расположение зеркал необходимо для достижения максимального угла обзора исследуемого микрообъекта и формирования контрастной интерференционной картины при использовании протяженного пространственно-некогерентного источника света. Микрообъект должен быть расположен в непосредственной близости от зеркала предметного канала. Только в этом случае в плоскости регистрирующего устройства формируется контрастное интерференционное изображение микрообъекта.
Отображающий канал микроскопа расположен по направлению распространения пучков света, отраженных от зеркал обоих каналов и светоделителя. При этом окуляр установлен в отображающем канале так, что его передняя фокальная плоскость совпадает с задними фокальными плоскостями микрообъективов обоих каналов, а в задней фокальной плоскости окуляра расположено регистрирующее устройство. Только такое расположение окуляра относительно микрообъективов, которое называется конфокальным, обеспечивает одинаковый размер изображений сечений микрообъекта, отличающихся различной глубиной расположения.
Если в микроскопе зеркало опорного канала установлено с возможностью возвратно-поступательного перемещения вдоль оптической оси опорного канала, то таким образом достигается возможность автоматической расшифровки интерферограмм методом фазовых шагов и измерения количественных данных об амплитудно-фазовых характеристиках изображения микрообъекта.
Если зеркало опорного канала закрепить на пьезоэлементе, то его (зеркала) перемещение вдоль оптической оси опорного канала может выполняться по команде от компьютера за короткий промежуток времени. В результате повышается скорость расшифровки интерферограмм. Она может проводиться в телевизионном темпе.
Устройство сканирования изображения источника света в микроскопе целесообразно выполнить в виде двухкоординатного механизма перемещения, на котором закреплен источник света, и неподвижного объектива, причем перемещение выполняется в плоскости, перпендикулярной оптической оси указанного объектива. Благодаря двухкоординатному перемещению может реализовываться любая траектория сканирования, а не только круговая, как это предусмотрено в микроскопе, взятом за прототип. В качестве источника света может использоваться компактный светодиод или полупроводниковый лазер.
Если в микроскопе используется стационарный источник света, то устройство сканирования изображения источника света можно выполнить в виде гибкого световода, светофильтра, линзы-конденсора, формирующей изображение источника света в плоскости входного торца световода, двухкоординатного механизма перемещения, на котором закреплен выходной торец световода, и неподвижного объектива, причем перемещение выполняется в плоскости, перпендикулярной оптической оси указанного объектива. Применение гибкого световода позволяет использовать различные типы источников света, в том числе лазеры. При перемещении световода будет нарушаться также пространственная когерентность пучка света, что положительно скажется на качестве формируемых микроскопом интерференционных картин. С помощью смены светофильтров легко выбрать требуемую длину волны света.
Устройство сканирования изображения источника света в микроскопе может состоять из зеркала и линзы, закрепленных на однокоординатном механизме перемещения, плоскопараллельной прозрачной пластины, закрепленной на механизме вращения, и неподвижного объектива, причем зеркало расположено так, что оптические оси падающего и отраженного от него пучков света перпендикулярны, а направление перемещения зеркала и линзы и ось вращения пластины параллельны оптической оси падающего пучка света. Такое устройство сканирования позволяет уменьшить энергетические потери светового пучка и плавно менять размер источника света.
В микроскопе, в котором источником света служит светящаяся область экрана электронно-лучевой трубки, устройство сканирования изображения источника света может представлять собой устройство развертки электронного луча указанной трубки. В таком устройстве отсутствуют движущиеся механические узлы. Оно обеспечивает большую скорость сканирования и возможность управления от компьютера.
В дальнейшем предлагаемое изобретение поясняется конкретными примерами его выполнения и прилагаемыми чертежами, на которых:
фиг.1 изображает принципиальную схему микроскопа для оптической томографии трехмерных микрообъектов;
фиг. 2 - ход лучей при размещении исследуемого трехмерного микрообъекта на предметном стекле с зеркальным покрытием;
фиг.3 - эквивалентную схему зондирования исследуемого трехмерного микрообъекта, размещенного на предметном стекле с зеркальным покрытием.
фиг. 4 - вариант выполнения устройства сканирования в виде двухкоординатного механизма перемещения и неподвижного объектива;
фиг. 5 - вариант выполнения устройства сканирования, содержащего гибкий световод, светофильтр, линзу-конденсор, двухкоординатный механизм перемещения и неподвижный объектив;
фиг. 6 - вариант выполнения устройства сканирования в виде зеркала и линзы с однокоординатным механизмом их перемещения, плоскопараллельной прозрачной пластины и неподвижного объектива.
Микроскоп, реализующий предлагаемый способ томографии трехмерных объектов, содержит источник 1 (фиг. 1) света с устройством 2 сканирования изображения источника света, светоделитель 3, который делит оптическую схему микроскопа на два идентичных канала 4 и 5. Предметный канал 4 образован микрообъективом 6 и расположенным в его задней фокальной плоскости зеркалом 7, служащим предметным стеклом, на котором размещают исследуемый трехмерный микрообъект 8. На зеркало 7 может быть нанесен слой 9 оптически прозрачного вещества, например окиси кремния.
Опорный канал 5 образован микрообъективом 10 и расположенным в его задней фокальной плоскости зеркалом 11, которое может быть закреплено на пьезоэлементе 12 с возможностью возвратно-поступательного перемещения в продольном направлении.
По направлению распространения пучков света, отраженных от зеркал 7 и 11 и светоделителя 3, сформирован отображающий канал 13, в котором установлен окуляр 14, передняя фокальная плоскость которого совпадает с передними фокальными плоскостями 15 и 16 соответственно микрообъективов 6 и 10, то есть окуляр 14 образует с ними конфокальные пары. В задней фокальной плоскости окуляра 14, служащей выходной плоскостью микроскопа, размещено регистрирующее устройство 17, соединенное с блоком 18 томографической обработки.
На фиг. 2 более детально изображена часть схемы освещения исследуемого трехмерного микрообъекта 8, размещенного на предметном стекле с зеркальным покрытием, а на фиг. 3 - эквивалентная схема зондирования такого микрообъекта.
Устройство 2 (фиг.4) сканирования изображения источника света состоит из двухкоординатного механизма 19 перемещения источника 1 света и неподвижного объектива 20, причем перемещение выполняется в плоскости, перпендикулярной оси 21 указанного объектива 20. В качестве источника 1 света могут использоваться малогабаритные светодиоды или полупроводниковые лазеры. В качестве двухкоординатного механизма 19 перемещения может применяться известный двухкоординатный электромеханический столик, управляемый от компьютера, на котором можно запрограммировать любую двумерную траекторию сканирования изображения источника 1 света.
На фиг. 5 изображено устройство 2 сканирования изображения источника света, которое состоит из расположенных последовательно линзы-конденсора 22, светофильтра 23, гибкого световода 24, двухкоординатного механизма 25 перемещения, на котором закреплен выходной участок световода 24, и неподвижного объектива 27. В этом устройстве может использоваться стационарный (неподвижный) источник 1 света большого размера, например, ртутная лампа. Линза-конденсор 22 формирует изображение источника 1 света в плоскости неподвижно закрепленного входного торца световода 24. Таким образом вводится оптическое излучение в световод 24. Выходной участок 26 световода 24, из которого выходит оптическое излучение, закреплен на двухкоординатном механизме 25 перемещения. При перемещении этого выходного участка 26 световода 24 в плоскости, перпендикулярной оптической оси неподвижного объектива 27, происходит сканирование изображения источника света.
Применение гибкого световода 24 позволяет использовать различные типы источников 1 света, в том числе лазеры. При перемещении световода 24 будет нарушаться также пространственная когерентность пучка света, что положительно скажется на качестве формируемых микроскопом интерференционных картин. С помощью смены светофильтров 23 легко выбрать требуемую длину волны света.
На фиг.6 изображено устройство 2 сканирования изображения источника света, которое состоит из расположенных последовательно зеркала 28, линзы 29, закрепленных на однокоординатном механизме 30 перемещения, плоскопараллельной прозрачной пластины 31, закрепленной на механизме 32 вращения, и неподвижного объектива 33. Зеркало 28 расположено так, что оптические оси падающего и отраженного от него пучков света перпендикулярны. Направление перемещения зеркала 28 и линзы 29 совпадает с направлением оптической оси падающего пучка света. Ось 34 вращения пластины 31 также параллельна оптической оси падающего пучка света. Пусть в начальном положении оптическая ось отраженного пучка света совпадает с оптической осью неподвижного объектива 33. При одновременном перемещении зеркала 28 и линзы 29 вдоль оптической оси падающего пучка света происходит смещение оптической оси отраженного пучка света в одном (на фиг.6 - горизонтальном) направлении относительно оптической оси неподвижного объектива 33. Это эквивалентно поперечному смещению источника 1 света относительно оптической оси этого объектива, поэтому его изображение также будет смещаться. Вращение плоскопараллельной прозрачной пластины 31 вокруг оси 34 приводит к дополнительному смещению оптической оси отраженного пучка света в другом (на фиг.6 - вертикальном) направлении. Регулируя величину смещения по обоим направлениям, можно реализовать любую двумерную траекторию сканирования изображения источника 1 света. Такое устройство 2 сканирования может применяться с любым источником 1 света и позволяет плавно менять его размер.
В микроскопе в качестве источника 1 света может использоваться светящаяся область экрана электронно-лучевой трубки. Тогда устройство 2 сканирования изображения источника света совпадает с устройством развертки электронного луча указанной трубки. В таком устройстве отсутствуют движущиеся механические узлы. Оно обеспечивает большую скорость сканирования и возможность управления от компьютера. Для повышения длины когерентности излучения такого источника света необходимо использовать электронно-лучевую трубку с экранами, покрытыми люминофорами из редкоземельных металлов (Коржов Е.И. и др. "Многоканальный голографический коррелятор интенсивности квазимонохроматической ЭЛТ", журнал "Автометрия", 1987 г., N 2, стр. 8-17).
Предлагаемый способ оптической томографии трехмерных микрообъектов осуществляют следующим образом.
Излучение от источника 1 света, пройдя устройство 2 сканирования изображения источника света, направляют на светоделитель 3 и осуществляют выделение в канале 5 опорного пучка света. С помощью указанного устройства 2 формируют изображение источника 1 света в передней фокальной плоскости 15 микрообъектива 6. После микрообъектива 6 формируется пучок света, который зондирует исследуемый микрообъект 8 под некоторым углом к его оптической оси. Отраженный от зеркала 7 или от самого микрообъекта 8 пучок
света вновь направляется в микрообъектив 6 и далее на светоделитель 3 и окуляр 14. С помощью светоделителя 3 сюда же направляют опорный пучок света и в плоскости регистрирующего устройства 17 совмещают его с изображением микрообъекта 8. В результате интерференции возникает картина, по которой измеряют амплитудно-фазовые характеристики полученного изображения микрообъекта 8. Далее все эти операции повторяют при другой позиции сканирования изображения источника 1 света в передней фокальной плоскости 15 микрообъектива 6. Производят совместную томографическую обработку всех полученных амплитудно-фазовых характеристик изображений микрообъекта 8 и определяют трехмерное пространственное распределение показателя преломления и/или коэффициента поглощения микрообъекта 8.
Рассмотрим более подробно, как формируются изображения микрообъекта 8 при различных позициях сканирования изображения источника 1 света, например, в точках A', B', C' (фиг. 1). При каждом новом положении изображения источника 1 света создается своя интерференционная картина микрообъекта 8. Пусть в точке B' изображение источника 1 света находится на оптической оси, а источники A' и C' на некотором расстоянии от нее. Предположим, что источник 1 света - точечный.
Проследим вначале за ходом лучей (сплошные линии на фиг. 1), которые участвуют в формировании интерференционной картины только от точки B'. Так как изображение источника 1 света формируется в передних фокальных плоскостях 15, 16 микрообъективов 6 и 10, то микрообъект 8 и зеркала 7, 11 освещаются параллельными пучками. Отраженное от зеркал 7, 11 излучение распространяется в обратном направлении и после светоделителя 3 создает элементарную интерференционную картину во всей области перекрытия пучков опорного и предметного каналов 4 и 5. Таким образом, эта картина интерференции для точечного источника света не локализована в какой-либо определенной плоскости.
Окуляр 14 должен быть расположен на фокусном расстоянии от плоскостей 15, 16 для того, чтобы микрообъективы 6, 10 образовывали с ним конфокальную пару. Это условие необходимо для достижения одинакового масштаба изображений различных продольных плоскостей микрообъекта 8. Только при таком расположении окуляра 14 отображающий канал 13 микроскопа будет инвариантен к сдвигу вдоль оптической оси.
Ход лучей при формировании интерференционных картин от других позиций сканирования изображения точечного источника 1 света, смещенных относительно оптической оси в поперечном направлении, например, в точку A', аналогичен только что рассмотренному. Поэтому на фиг. 1 приведены пунктирными линиями лишь оси пучков света от этих источников, а на фиг. 2 изображена более детально часть схемы освещения микрообъекта 8. Из фиг. 1, 2 следует, что для положения изображения источника 1 света в точке A' после микрообъективов 6 и 10 распространяются уже наклонные к оптической оси параллельные пучки света. Угол θ наклона зависит от расстояния A'B'. Максимальный угол наклона определяется числовой апертурой микрообъективов 6, 10 и размером микрообъекта 8. Причем микрообъект 8 должен весь находиться в области пересечения этих пучков. Из фиг.2 видно, что размер этой области зависит от расположения зеркала 7 и достигает своего наибольшего значения при размещении его точно в задней фокальной плоскости микрообъектива 6. Соответственно, зеркало 11 опорного канала 5 также должно находиться в задней фокальной плоскости микрообъектива 10. Отраженное от зеркал 7, 11 и светоделителя 3 излучение преобразуется окуляром 14 в параллельные пучки и направляется под некоторым углом друг к другу в плоскость регистрирующего устройства 17. Так как эти пары пучков образованы из одного и того же изображения источника 1 света в точке A', то такие пучки когерентны и при регистрации в любой плоскости в пространстве изображений микроскопа создают свою нелокализованную интерференционную картину. Точно так же образуется интерференционная картина для любого другого точечного источника 1 света вокруг данной точки A'. Получим уравнение данной интерференционной картины.
Пусть функция f(x,y,z) описывает трехмерный микрообъект, который можно заключить в шар радиуса po. Эта функция связана с трехмерным пространственным распределением показателя преломления n(x,y,z) следующим соотношением:
f(x,y,z) = [n(x,y,z)-n0]p0/λ, (1)
где no - показатель преломления окружающей объект среды, λ - средняя длина волны квазимонохроматического излучения. Предполагаем, что начало координат помещено в центр объекта (шара радиуса po). Так как у нас микрообъект расположен на или вблизи зеркальной поверхности (пусть плоской), то его можно записать в виде следующей суммы (см. фиг.3):
g(x,y,z) = f(x,y,z-po) + f(x,y,po-z). (2)
Отсюда следует, что томография исходного объекта (1), расположенного у зеркальной поверхности, сводится к томографии составного объекта (2).
Особенности заключаются в том, что функция (2) - четная по координате z и область ее задания представляет собой два соприкасающихся шара.
Для того, чтобы повысить качество томографической реконструкции такого составного объекта, мы предлагаем пространственно разделить микрообъект 8 и его зеркальное изображение с помощью слоя 9 оптически прозрачного вещества, нанесенного на зеркало 7, служащее предметным стеклом.
Так как плоскость регистрирующего устройства 17 (фиг. 1) параллельна плоскости (x, y), то мы регистрируем следующие двумерные параллельные проекции:
где (θ,ϕ) - угловые координаты оптической оси зондирующего пучка.
Отсюда следует отличительная особенность "зеркальной" томографии, которая заключается в том, что проекции для углов (θ,ϕ) и (θ,ϕ+π) идентичны. Этот факт следует из свойства взаимной обратимости лучей в оптике. Действительно, из фиг. 2 видно, что при перестановке местами падающего и отраженного от зеркала 7 пучков вид проекции не изменится. Отсюда следует, что диапазон углов зондирования по ϕ можно ограничить интервалом (0 π ). Диапазон углов по θ ограничен числовой апертурой микрообъектива: для 100-кратного микрообъектива он может достигать 90 градусов.
Для повышения пространственного разрешения изображений и увеличения угла обзора микрообъекта 8 необходимо использовать микрообъективы 6 с большой числовой апертурой. При использовании такого микрообъектива 6 между ним и покровным стеклом (на фиг. не показано), под которым находится микрообъект 8, размещена прозрачная жидкость, например вода или масло. Микрообъект 8 также размещают в некоторой прозрачной среде, жидкой, вязкой или иногда даже твердой, например в канадском бальзаме. Обычно показатель преломления этой среды меньше показателя преломления иммерсионной жидкости. Поэтому на границе этих двух сред будет происходить преломление света и уменьшение эффективного угла обзора микрообъекта 8. При равенстве по существу показателей преломления среды и иммерсионной жидкости преломления пучка света на границе не будет и тогда достигается максимальный угол обзора.
При настройке микроскопа, например, на полосы конечной ширины, параллельные оси x, уравнение элементарной интерферограммы можно записать в виде
где α - угол между осями предметного и опорного пучков для данного положения точечного источника. Таким образом, элементарная интерферограмма представляет собой интерферограмму проекции (3).
В случае использования протяженного источника 1 света его можно представить в виде набора точечных источников, некогерентных между собой. Каждый такой точечный источник создает свою интерференционную картину, которая описывается уравнением (4). Для такого источника 1 в пространстве изображений формируется непрерывный набор из пар плоских когерентных пучков (предметного и опорного), несущих информацию о своей элементарной интерферограмме. Однако между собой эти пары волн некогерентны. Следовательно, при регистрации элементарные интерферограммы будут суммироваться по интенсивности. Так как плоскость регистрирующего устройства 17 и плоскости размещения зеркал 7, 11 оптически сопряжены, то оси пучков из всего набора точечных источников будут пересекаться в одной точке, лежащей в плоскости фокусировки изображения зеркал 7, 11. Таким образом, только в этой плоскости элементарные интерференционные картины от каждого точечного источника будут складываться без смещения. Поэтому в данной плоскости будет наблюдаться наиболее контрастная интерференционная картина. В любой другой плоскости такие элементарные картины будут смещены друг относительно друга, и видность полос суммарной интерферограммы уменьшится. Это говорит о том, что область локализации интерференционных полос в схеме с протяженным источником 1 пространственно-некогерентного света совпадает с плоскостью изображения зеркал 7, 11 предметного и опорного каналов 4 и 5.
Так как точечные источники некогерентны между собой, то интерферограмма I(x, y) для протяженного источника 1 света будет формироваться как сумма из элементарных интерферограмм (4). Для непрерывного набора источников можно записать
I(x,y) = ∫∫(x,y;θ,ϕ)sinθdθdϕ. (5)
Область интегрирования в (5) определяется угловыми размерами источника.
Из (5), (4) следует, что даже в области локализации интерференционных полос (плоскость 12) они имеют не единичный контраст, так как в (5) суммируются интерферограммы разных проекций, поэтому для увеличения контраста желательно уменьшать угловой размер источника света, но при этом могут появиться когерентные шумы в изображении интерферограммы.
При формировании суммарной интерферограммы (5) от протяженного источника 1 происходит усреднение случайных шумов в изображениях отдельных элементарных интерферограмм. Это связано с тем, что они образованы с помощью пучков света, прошедших через различные участки оптических элементов микроскопа. В результате это приводит к уменьшению шумовой составляющей в проекциях. При дальнейшем увеличении размера источника будет, во-первых, уменьшаться контраст интерференционных полос и, во-вторых, изменится характер проекционных данных. Для источника малых, но конечных размеров проекционные данные представляют собой сумму интерферограмм проекций из небольшого диапазона углов зондирования и лишь в некотором приближении их можно принять за проекцию. Аналогичная ситуация возникает в любой оптической системе регистрации проекционных данных, имеющей конечную числовую апертуру.
Таким образом, при выборе размера источника 1 необходимо поддерживать разумный компромисс между качеством изображения интерферограммы и достоверностью описания проекционных данных с помощью уравнения проекции (3).
Измерение амплитудно-фазовых характеристик изображений микрообъекта 8 производится по полученным интерференционным картинам. Для автоматической расшифровки интерферограмм мы используем метод фазовых шагов (P. Hariharan, B. F. Oreb., N. Brown, Opt. Commun., 1982, vol. 41, N 6, pp. 393-396). Суть этого метода заключается в том, что регистрируют по меньшей мере три, в нашем случае четыре, интерференционные картины при различных оптических длинах пути, проходящих опорным пучком света. В более общем виде уравнение интерферограммы (5) можно записать в следующем виде:
где A - интенсивность фона; B - видность полос; k = 0, 1, 2, 3; d - фазовый сдвиг между опорным и предметным пучками,
Ψ(x,y;θ,ϕ) = Ф(x,y;θ,ϕ)+xsinα.
При различных значениях k и, соответственно, фазового сдвига, определяемого величиной kd, регистрируется несколько интерферограмм Ik. Физически данный фазовый сдвиг между опорным и объектным пучками вносится с помощью возвратно-поступательного перемещения зеркала 11 вдоль оптической оси опорного канала 5. В частности, это зеркало 11 может быть закреплено на пьезоэлементе 12, управляемом от компьютера. Мы используем самокалибрующийся алгоритм, при котором наряду с A, B, Ψ и величина d также является неизвестной (P. Hariharan, B.F. Oreb., N. Brown, Opt. Commun., 1982, vol. 41, N 6, pp. 393-396). При регистрации 4-х интерференционных картин мы получаем следующие системы уравнений:
Решение этой системы уравнений относительно Ψ для каждой точки (x,y) можно записать в виде:
На первом этапе вычисляется фазовая характеристика изображения микрообъекта 8 по формуле (7) в интервале значений от 0 до 2 π, в результате чего получают так называемую "несшитую" фазу. Второй этап состоит в устранении разрывов в распределении фазы, т.е. "сшивка" фазы. Третий этап заключается в устранении наклона в распределении фазы, связанного с регистрацией интерферограмм в полосах конечной ширины, т.е. в переходе от Ψ(x,y)kΦ(x,y). Таким образом, метод расшифровки не зависит от угла α, т.е. от количества и ориентации опорных интерференционных полос. Для устранения наклона, связанного с наблюдением в полосах конечной ширины, из распределения сшитой фазы вычитается линейная функция от переменных x,y, коэффициенты в которой подбираются по методу наименьших квадратов. При решении системы уравнений (6) одновременно вычисляются и амплитудные характеристики A, B изображения микрообъекта 8.
Для устранения влияния фазовых искажений, вызванных несовершенством оптических элементов микроскопа, после записи изображений микрообъекта можно зарегистрировать интерференционные картины без микрообъекта для тех же углов зондирования. Вычитая полученные "фазовые" изображения фона из аналогичных изображений микрообъекта, мы достигаем повышения их качества.
Полученные амплитудно-фазовые характеристики изображений микрообъекта 8 под различными углами используются для определения трехмерного пространственного распределения показателя преломления и/или коэффициента поглощения микрообъекта 8 с использованием методов томографии. Например, могут использоваться итерационные методы реконструкции трехмерных томограмм по двумерным проекциям или метод свертки и обратного проецирования. При реконструкции томограмм в ограниченном диапазоне углов важно правильно выбрать угловую траекторию зондирования микрообъекта 8 (зависимость (θ,ϕ) ) и общее количество проекций. Как показано выше, угловая траектория зондирования определяется траекторией сканирования изображения источника 1 света. В предлагаемом способе сканирование изображения источника света может осуществляться по произвольной двумерной траектории, так как в нем применяется интерференционный метод регистрации изображений прозрачных объектов, который не накладывает никаких ограничений на вид траектории сканирования. Могут быть реализованы траектории в виде прямой, креста, квадрата, спирали, набора концентрических окружностей или квадратов. Как показывают результаты численного моделирования, наиболее оптимальной для томографии с ограниченным углом обзора являются траектории в виде спирали, набора концентрических окружностей или квадратов. Качество восстановленных изображений при таких траекториях выше, чем для траектории в виде окружности.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| СПОСОБ ИНТЕРФЕРЕНЦИОННОЙ МИКРОСКОПИИ | 2013 |
|
RU2536764C1 |
| ИНТЕРФЕРЕНЦИОННЫЙ МИКРОСКОП | 2013 |
|
RU2527316C1 |
| СПОСОБ КОНФОКАЛЬНОЙ СКАНИРУЮЩЕЙ ТРЕХМЕРНОЙ МИКРОСКОПИИ И КОНФОКАЛЬНЫЙ СКАНИРУЮЩИЙ ТОМОГРАФИЧЕСКИЙ МИКРОСКОП | 1999 |
|
RU2140661C1 |
| ФАЗОВО-ИНТЕРФЕРЕНЦИОННЫЙ МОДУЛЬ | 2013 |
|
RU2539747C1 |
| Установка для измерения микрорельефа поверхности с использованием метода фазовых шагов | 2018 |
|
RU2677239C1 |
| Способ определения координат изменения структуры клетки по фазовым изображениям | 2021 |
|
RU2761480C1 |
| СПОСОБ ИЗМЕРЕНИЯ ФОРМЫ ПОВЕРХНОСТИ ТРЕХМЕРНОГО ОБЪЕКТА | 2011 |
|
RU2472108C1 |
| Способ определения частоты и амплитуды модуляции фазы волнового фронта, создаваемого колебаниями мембраны клетки | 2020 |
|
RU2743973C1 |
| УСТРОЙСТВО ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ ФОРМЫ ПОВЕРХНОСТИ ТРЕХМЕРНОГО ОБЪЕКТА | 2011 |
|
RU2474787C1 |
| ДВУХКАНАЛЬНЫЙ ДИФРАКЦИОННЫЙ ФАЗОВЫЙ МИКРОСКОП | 2015 |
|
RU2608012C2 |
Томографию микрообъекта осуществляют с помощью микроскопа, содержащего источник света, устройство сканирования изображения источника света, светоделитель, опорный и предметный каналы, отображающий канал и блок томографической обработки. Предметный и опорный каналы образованы соответствующим микрообъективом и зеркалом, расположенным в его задней фокальной плоскости. Зеркало предметного канала является предметным стеклом. Передние фокальные плоскости окуляра и микрообъективов совпадают. Сканируют изображение источника света в передней фокальной плоскости микрообъектива предметного канала. Формируют изображение источника света в передней фокальной плоскости микрообъектива опорного канала. Отраженный от микрообъекта или прошедший микрообъект и затем отраженный обратно пучок света вновь направляют на микрообъектив. Совмещают полученные изображения микрообъекта с опорным пучком света. По полученным интерференционным картинам измеряют амплитудно-фазовые характеристики изображений микрообъекта и определяют трехмерное пространственное распределение показателя преломления и/или коэффициента поглощения микрообъекта. Обеспечивается получение количественных данных о трехмерном пространственном распределении показателя преломления и/или коэффициента поглощения, а также повышение чувствительности измерений. 2 с. и 13 з.п.ф-лы, 6 ил.
| APPLIED OPTICS, 1992, V.31, N 5, P.670 - 674 | |||
| Пневматический привод стеклоочисти-ТЕля ТРАНСпОРТНОгО СРЕдСТВА | 1978 |
|
SU821256A1 |
| US 5619371 A, 08.01.1998 | |||
| Прибор для очистки паром от сажи дымогарных трубок в паровозных котлах | 1913 |
|
SU95A1 |
| RU 2062445 C1, 20.06.1996. | |||
