СПОСОБ ИНТЕРФЕРЕНЦИОННОЙ МИКРОСКОПИИ Российский патент 2014 года по МПК G01N21/55 

Настоящее изобретение относится к микроскопии и может быть использовано в биологии, медицине, машиностроении, оптическом приборостроении.

Известны способы интерференционной микроскопии, см., например, М. Франсон «Фазово-контрастный и интерференционный микроскоп», М.: Государственное издательство физико-математической литературы, 1960. Они предназначены для исследования фазовых объектов.

Фазовые объекты, прозрачные для излучения видимого оптического диапазона, широко распространены как в промышленности, так и в биологии и медицине. К ним относятся различные полимерные пленки, кристаллы, оптические микродетали, оптоволоконные изделия, и, наконец, биологические объекты - клетки и др. Эти объекты описываются трехмерным (3D) пространственным распределением показателя преломления, с которым связаны плотность, температура, концентрация и другие физические параметры объекта (Ч. Вест. Голографическая интерферометрия. М.: Мир, 1982).

При изучении фазовых объектов встает задача их визуализации, так как они обычно прозрачны для зондирующего излучения. На сегодняшний день широко известны следующие способы визуализации фазовых микрообъектов:

- способ фазового контраста, называемый также методом Цернике, состоящий в том, что фазовый сдвиг в световом пучке, проходящем через фазовый объект, преобразуется в изменение яркости изображения (Bennett, A., Osterberg, H, Jupnik, H. and Richards, О., Phase Microscopy: Principles and Applications, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1951);

- способ интерференционного контраста, состоящий в том, что световой пучок разделяется на два пучка, один из которых проходит сквозь фазовый объект, а второй минует его; интерференция обоих пучков позволяет обнаружить и измерить оптическую разность хода, внесенную фазовым объектом (Hariharan P., Optical Interferometery, 2^nd ed., Academic Press, 2003);

- способ дифференциально-интерференционного контраста (метод Номарского, DIC), состоящий в том, что поляризованный световой пучок разделяется на два ортогонально поляризованных когерентных пучка, которые проходят через фазовый объект оптическими путями различной длины, сводятся и интерферируют (Murphy, D., Differential interference contrast (DIC) microscopy and modulation contrast microscopy, in Fundamentals of Light Microscopy and Digital Imaging, Wiley-Liss, New York, 2001);

- способ темного поля, состоящий в том, что для формирования изображения фазового объекта регистрируются только световые пучки, рассеянные этим объектом (Роскин Г.И., Микроскопическая техника, М.: Изд. «Советская наука», 1946);

- способ поляризационного контраста, состоящий в том, что анизотропный фазовый объект помещается между двух поляризационных фильтров, плоскость поляризации одного из которых повернута на 90° относительно другого; через второй фильтр проходят только те световые пучки, плоскость поляризации которых оказалась повернутой фазовым объектом (Роскин Г.И., Микроскопическая техника, М.: Изд. «Советская наука», 1946).

Общим недостатком перечисленных и других подобных способов измерения характеристик фазовых объектов является сложность реализации на практике из-за высоких требований к юстировке интерферометра и, как следствие, невысокая надежность и стабильность способа, недостаточно высокая точность измерений.

В настоящее время при исследованиях требуется не только наблюдать и оценивать различные геометрические параметры (площадь, периметр), но и проводить измерения их локальных и интегральных характеристик.

Количественные исследования характеристик фазовых объектов можно проводить с помощью способа интерференционной микроскопии, так как только он позволяет измерять оптическую разность хода (ОРХ). Другие способы позволяют либо визуализировать, либо измерять производную по направлению от ОРХ (метод дифференциально-интерференционного контраста).

Для формирования объектного и опорного пучков в способе интерференционной микроскопии обычно использовались двулучевые схемы интерферометров Майкельсона и Маха-Цендера (А.Н. Захарьевский, А.Ф. Кузнецова. Интерференционные биологические микроскопы. Цитология, 1961).

Основной недостаток двухлучевых схем интерференционной микроскопии состоит в необходимости использования когерентного излучения. Это ведет к большим шумам в интерферограммах и, как следствие, к повышению погрешности реконструкции фазы из интерферограмм. Разнесение в пространстве объектной и опорной ветвей ведет также к тому, что идущие в них лучи по разному реагируют на вибрацию и температурные колебания, что сильно ухудшает виброустойчивость интерференционной микроскопии.

Современная тенденция в интерференционной микроскопии - это переход к некогерентному свету от обычной галогеновой лампы или от светодиода с малой длиной когерентности. Это позволяет существенно уменьшить характерные для когерентного излучения шумы (спекл-шум и т.п.). Применение источников излучения с малой длиной когерентности ведет к необходимости использования схем интерферометров с совмещенными объектной и опорной ветвями. Такие интерферометры обычно скомпенсированы на белый свет, т.е. оптическая разность хода в центре поля зрения равна нулю.

Известен способ интерференционной микроскопии, описанный в работе В. Bhaduri et al. "Diffraction phase microscopy with white light". Optics Letters, Vol.37, №6, PP.1094-1096, 2012. Он заключается в том, что исследуемый микрообъект освещают некогерентным излучением от галогеновой лампы, которое используют для формирования увеличенного изображения микрообъекта в передней фокальной плоскости 4f оптической системы. Излучение, поступившее в 4f оптическую систему, пропускают через дифракционную решетку, которая производит множество пучков, содержащих всю информацию об объекте, а затем направляют эти пучки на первый фурье-объектив и формируют в общей фокальной плоскости излучение в виде совокупности дифракционных порядков. Излучение нулевого порядка дифракции пропускают через амплитудный фильтр пространственных частот, состоящий из точечной диафрагмы, совмещенной с оптической осью, и формируют из него опорный пучок, а излучение более высоких порядков дифракции пропускают через амплитудный фильтр пространственных частот в виде большой прямоугольной диафрагмы, которая полностью пропускает излучение, и формируют из него объектный пучок. Далее излучение направляют на второй фурье-объектив, после которого образуются два плоских пучка под небольшим углом и формируют в задней фокальной плоскости 4f оптической системы интерференционное изображение микрообъекта в полосах конечной ширины, которое регистрируют и используют для вычисления двумерного распределения оптической разности хода излучения.

Данный способ, по сути, представляет собой способ двухлучевой интерферометрии Маха-Цендера, в котором опорный пучок формируется из излучения, прошедшего через точечную диафрагму, а второй объектный - из излучения в 1-ом и более высоких порядках дифракции. Недостаток данного способа интерференционной микроскопии заключается в том, что объектный и опорный пучки формируются на входе в 4f систему и поэтому они проходят разные пути в свободном воздушном пространстве. Следовательно, они по-разному будут подвержены флуктуациям воздуха, что ведет к нестабильности интерференционной картины. Другой недостаток состоит в том, что при расшифровке интерференционной картины и вычислении двумерного распределения оптической разности хода излучения можно применять только алгоритм Фурье. Более точный метод -метод фазового сдвига - требует изменения оптической длины пути одного из пучков опорного или объектного, что трудно сделать в данном способе.

Известен другой способ интерференционной микроскопии, описанный в работе Z.Wang et.al. "Spatial light interference microscopy (SLIM)", Optics Express, Vol.19, No.2, PP.1016-1028, 2011. Он, как и предыдущий способ интерференционной микроскопии, состоит в том, что исследуемый микрообъект освещают некогерентным излучением, которое используют для формирования увеличенного изображения микрообъекта в передней фокальной плоскости 4f оптической системы. Излучение, поступившее в 4f оптическую систему, проходит первый фурье-объектив и направляют на фазовый пространственный фильтр, работающий на отражение, установленный в общей фокальной плоскости 4f оптической системы. Фильтр выполнен в виде чисто фазового пространственно-временного модулятора света, управляемого от компьютера, который сдвигает фазу нерассеянного излучения, сфокусированного вблизи оптической оси, т.е. он работает как переменный фазовый фильтр Цернике. При использовании кольцевой диафрагмы в конденсоре фазовый фильтр также имеет вид кольца. Отраженный от этой части модулятора свет формирует опорный пучок. Свет, который претерпел дифракцию на объекте, отражается от остальной части модулятора и образует объектный пучок. В результате в задней фокальной плоскости 4f оптической системы, в плоскости регистратора, сходятся два плоских пучка под нулевым углом и формируют интерферограмму, аналогичную той, которая получается при настройке интерферометра на бесконечно широкую (нулевую) полосу. Так как один из пучков света сформирован из излучения, рассеянного на объекте, то такую интерферограмму можно рассматривать как голограмму Габора. Для расшифровки интерферограммы используется четыре кадра со сдвигом фазы на π/2. Основной недостаток данного способа интерференционной микроскопии заключается в использовании дорогостоящего фазового пространственно-временного цифрового модулятора света. Другой недостаток связан с тем, что для получения количественной информации о фазовом объекте используется более сложная математическая процедура, чем в обычном методе фазового сдвига. В частности требуется дополнительная регистрация амплитудного изображения, сформированного из рассеянного излучения, нормированного на амплитуду нерассеянного излучения.

Известен способ интерференционной микроскопии, описанный в работе Р. Gishovitz, N.T.Shaked "Compact and portable low-coherence interferometer with off-axis geometry for quantitative phase microscopy and nanoscopy". Optics Express, Vol.21, № 5, PP. 5701-5714, 2013, наиболее близкий к предлагаемому способу интерференционной микроскопии.

Этот способ интерференционной микроскопии заключается в том, что исследуемый микрообъект освещают некогерентным излучением, которое используют для формирования увеличенного изображения микрообъекта в передней фокальной плоскости 4f оптической системы, излучение, поступившее в 4f оптическую систему, направляют на первый фурье-объектив и, не доходя до общей фокальной плоскости 4f оптической системы, делят с помощью светоделителя на два пучка излучения, каждый из которых фокусируют на светоотражательных элементах, а отраженные от этих элементов пучки направляют обратно на светоделитель, причем один из пучков перед фокусировкой пропускают через точечную диафрагму, после обратного прохода через светоделитель пучки излучения направляют на второй фурье-объектив и формируют в задней фокальной плоскости 4f оптической системы интерференционное изображение микрообъекта, которое регистрируют и используют для вычисления двумерного распределения оптической разности хода излучения, прошедшего через микрообъект.

Недостаток данного способа интерференционной микроскопии заключается в трудности юстировки, вызванной тем, что светоделитель формирует два пространственно разделенных световых пучка, оси которых расположены под 90 градусов. Поэтому и два светоотражательных элемента расположены под углом 90 градусов друг к другу. Установить эти элементы точно на одном расстоянии от боковых граней светоделительного кубика очень трудно, это расстояние всегда будет разное, поэтому и всегда будет существовать оптическая разность хода между пучками.

Другой недостаток данного способа интерференционной микроскопии состоит в том, что он основан на внеосевой (off-axis) интерферометрии, т.е. на выходе формируется интерференционное изображение микрообъекта в полосах конечной ширины. В этом случае для автоматической расшифровки интерферограмм и вычисления двумерного распределения оптической разности хода излучения используется алгоритм, основанный на применении двумерного преобразования Фурье к полученному изображению. Для правильной работы данного алгоритма требуется достаточно большое число интерференционных полос, не менее 50 на все поле зрения. В указанной выше работе приведена цифра 48 полос на мм. Для получения такой интерферограммы требуется излучение с достаточно большой длиной когерентности порядка 27 мкм, которое используется в данном способе интерференционной микроскопии. В этом случае полуширина полосы излучения источника света составляет всего 6,7 нм и, как следствие, увеличиваются когерентные шумы.

Еще один недостаток данного способа связан с тем, что в нем используется алгоритм восстановления фазы из интерферограмм, основанный на применении двумерного преобразования Фурье к полученному изображению (М.Takeda, "Fourier fringe analysis and its application to metrology of extreme physical phenomena: a review [Invited]", Appl. Opt., V.52, №1, P.20-29, 2013). Однако метод Фурье ограничен по классу исследуемых объектов, пространственный спектр объектов не может превышать определенной величины, т.е. объекты с большими градиентами показателя преломления или перепадами высоты не восстанавливаются данным методом. Еще один недостаток метода Фурье связан с перекрытием спектров нулевого и более высоких порядков (J.F.Casco-Vasquez et al. "Fourier normalized-fringe analysis by zero-order spectrum suppression using a parameter estimation approach". Opt. Engineering, V.52, №7, 074109, 2013), а также с краевыми дифракционными эффектами. Дело в том, что любая интерферограмма задана в ограниченной области - некоторой бинарной маске, поэтому спектр исследуемого фазового объекта всегда искажен сверткой со спектром этой маски. Так как маска бинарная, то ее спектр широкий и осциллирующий, поэтому на краях области задания объекта возникают сильные искажения в восстановленном фазовом изображении.

Техническая задача, решаемая настоящим изобретением, состоит в уменьшении уровня когерентных шумов, снижении требований к юстировке интерферометра, в повышение стабильности интерферометра, в повышении точности измерений двумерного распределения оптической разности хода.

Решение поставленной задачи в предлагаемом способе интерференционной микроскопии достигается следующим образом: исследуемый микрообъект освещают некогерентным излучением, которое используют для формирования увеличенного изображения микрообъекта в передней фокальной плоскости 4f оптической системы, излучение, поступившее в 4f оптическую систему, направляют на первый фурье-объектив и, не доходя до общей фокальной плоскости 4f оптической системы, делят с помощью светоделителя на два пучка излучения, каждый из которых фокусируют на светоотражательных элементах, а отраженные от этих светоотражательных элементов пучки направляют обратно на светоделитель, причем один из пучков в плоскости фокусировки пропускают через точечную диафрагму, после обратного прохода через светоделитель пучки излучения направляют на второй фурье-объектив и формируют в задней фокальной плоскости 4f оптической системы интерференционное изображение микрообъекта, которое регистрируют и используют для вычисления двумерного распределения оптической разности хода излучения, прошедшего через микрообъект, деление излучения выполняют с помощью светоделителя из двух идентичных призм Дове, склеенных по основаниям призм, так, чтобы полученные пучки имели нулевую разность хода, а их оптические оси были параллельны основаниям призм, далее оба пучка направляют на одно плоское зеркало, нормаль к которому параллельна плоскости, проходящей через оптические оси пучков, и составляет угол α к оптическим осям пучков, причем тот пучок, который прошел через обе призмы Дове, пропускают через точечную диафрагму, установленную в непосредственной близости к плоскому зеркалу, а после обратного прохода через светоделитель пучки излучения направляют на уголковый отражатель, ось симметрии которого параллельна основаниям призм, и регистрируют исходное интерференционное изображение, многократно смещают светоделитель и уголковый отражатель вдоль направления, перпендикулярного основаниям призм, N раз на величины d_i, i=1, 2, 3,…, N и регистрируют N интерференционных изображений, фаза которых по отношению к исходному интерференционному изображению изменяется на величину $$\frac{\text{4}\pi {\text{d}}_{\text{i}}}{\lambda }\text{k(}\alpha \text{)}$$ , где $$\text{k(}\alpha \text{)}=\frac{\text{2tg}\alpha }{{\text{1-tg}}^{\text{2}}\alpha }$$ , λ - длина волны излучения, и по полученному набору из N интерференционных изображений вычисляют двумерное распределение оптической разности хода излучения, прошедшего через микрообъект.

Уменьшение уровня когерентных шумов достигается за счет использования некогерентного источника света с большей, чем у прототипа, полушириной полосы излучения и малой длиной когерентности. Это становится возможным, т.к. в предлагаемом способе деление излучения выполняют с помощью светоделителя из двух идентичных призм Дове, склеенных по основаниям призм, так, чтобы полученные пучки имели нулевую разность хода, т.е. реализуется осевая (on-axis) схема интерферометрии с совмещенными опорным и объектными пучками и длина когерентности может быть уменьшена до нескольких микрон.

Снижение требований к юстировке интерферометра достигается тем, что после деления оптические оси пучков будут параллельны основаниям призм и, соответственно, друг другу, это позволяет направить оба пучка на одно плоское зеркало, и они автоматически пройдут одинаковое расстояние до этого зеркала и будут иметь нулевую разность хода. Т.к. деление излучения выполняется с помощью светоделителя из двух идентичных призм Дове, склеенных по основаниям призм, а сами призмы Дове изготовлены с высокой точностью и их склейка произведена без перекосов и наклонов (Ю.Г. Кожевников. «Оптические призмы», М.: Машиностроение, 1984), то полученные пучки имеют нулевую разность хода на выходе из светоделителя.

Повышение стабильности интерферометра достигается тем, что светоделитель и плоское зеркало жестко закрепляются на общем основании, в результате чего вибрация оказывает одинаковое влияние на узлы интерферометра, что не отражается на результатах измерений.

Повышение точности измерений двумерного распределения оптической разности хода достигается тем, что в предлагаемом способе для автоматической расшифровки интерферограмм реализуется метод фазовых шагов, а не фурье-метод, как в прототипе. Известно, что метод фазовых шагов более точный, чем фурье-метод (см., например, книгу «Interfere gram analysis for optical testing» / Ed. by D. Malacara. Taylor&Francis Group, 2005, главы 7 и 8). Для реализации метода фазовых шагов многократно смещают светоделитель и уголковый отражатель вдоль направления, перпендикулярного основаниям призм, N раз на величины d_i, i=1, 2, 3,…, N и регистрируют N интерференционных изображений, фаза которых по отношению к исходному интерференционному изображению изменяется на величину $$\frac{\text{4}\pi {\text{d}}_{\text{i}}}{\lambda }\text{k(}\alpha \text{)}$$ , где $$\text{k(}\alpha \text{)}=\frac{\text{2tg}\alpha }{{\text{1-tg}}^{\text{2}}\alpha }$$ , λ - длина волны излучения, и по полученному набору из N интерференционных изображений вычисляют двумерное распределение оптической разности хода излучения, прошедшего через микрообъект.

Возможен 2-й вариант интерференционной микроскопии, отличающийся тем, что деление излучения выполняют с помощью светоделителя из двух идентичных зеркальных аналогов призмы Дове, в которых верхнее зеркало выполнено в виде полупрозрачной светоделительной пластины и является общим для обеих призм, а светоделительная грань пластины параллельна оптической оси падающего на него пучка.

Возможен 3-й вариант интерференционной микроскопии, отличающийся тем, что деление излучения выполняют с помощью светоделительного кубика, повернутого относительно оптической оси падающего на него пучка на 45 градусов так, что его светоделительная грань параллельна указанной оптической оси.

Далее предлагаемое изобретение поясняется конкретными примерами его выполнения и прилагаемыми чертежами.

Фиг.1 иллюстрирует принципиальную оптическую схему микроскопа, реализующую предлагаемый способ интерференционной микроскопии. Схема состоит из двух частей: обычного микроскопа светлого поля I и интерференционной приставки II. Микроскоп I состоит из источника некогерентного света 1, например светодиода; собирающего оптического элемента 2, например коллекторной линзы; элемента, ограничивающего поперечное сечение светового пучка 3, например полевой диафрагмы; элемента, формирующего точечный источник света 4, например точечной диафрагмы; оптического элемента 5, формирующего параллельный пучок излучения, например коллимационной линзы; фазового объекта 6; оптического элемента 7, например микрообъектива; светоотражательного элемента 8, например плоского зеркала; оптического элемента 9, например окулярной линзы, формирующего увеличенное изображение в задней фокальной плоскости 10 оптического элемента 9. Интерференционная приставка II включает 4f оптическую систему из оптических элементов 11 и 13, например фурье-объективы, передняя фокальная плоскость которой совмещена с задней фокальной плоскостью 10 микроскопа, а в задней фокальной плоскости 14 которой установлен регистратор 15 изображения, например ПЗС-матрица; светоделитель 16, например, из двух идентичных призм Дове, склеенных по основаниям призм (далее бипризма Дове), расположенный до общей фокальной плоскости 4f системы; плоское зеркало 18; фильтр пространственных частот 19, например точечную диафрагму, который закрепляется в непосредственной близости к плоскому зеркалу 18; уголковый отражатель 12; подвижную платформу 17 с приводом 20, например шаговым двигателем, на которой закреплены бипризма Дове 16 и уголковый отражатель 12.

Фиг.2 более детально показывает ход оптических осей пучков в светоделителе 16 при отражении от зеркала 18 при его наклонном положении.

Фиг.3 более детально показывает ход оптических осей пучков в светоделителе 16 при его смещении относительно первоначального положения и отражении от зеркала 18.

Фиг.4 более детально показывает ход оптических осей пучков после прямого и обратного прохода через светоделитель 16 и уголковый отражатель 12 до и после их одновременного смещения.

На Фиг.1 излучение от некогерентного источника 1 при помощи оптических элементов 2-5 преобразовывается в параллельный пучок, который проходит через фазовый объект 6, расположенный в передней фокальной плоскости оптического элемента 7. Задняя фокальная плоскость элемента 7 совмещена с передней фокальной плоскостью оптического элемента 9. В задней фокальной плоскости 10 оптического элемента 9 строится увеличенное изображение фазового объекта 6. Светоотражательный элемент 8 является вспомогательным для уменьшения конструкции микроскопа.

Задняя фокальная плоскость микроскопа совмещена с передней фокальной плоскостью 4f оптической системы. В ней излучение проходит через первый фурье-объектив 11, затем через светоделитель 16 из двух идентичных призм Дове, склеенных по основаниям призм, за которым в общей фокальной плоскости формируются два одинаковых волновых фронта излучения, комплексная амплитуда которых описывается фурье-спектром пространственных частот фазового объекта 6. Так как светоделитель 16 изготавливается из двух идентичных призм Дове, то излучение полученных двух пучков будет иметь нулевую разность хода, т.е. эти пучки будут когерентными.

В общей фокальной плоскости 4f системы установлено плоское зеркало 18. Пусть вначале это зеркало установлено строго перпендикулярно к падающим пучкам. Пучок, который прошел к зеркалу 18 через обе призмы Дове (на фиг.1 это верхний пучок), пропускают через фильтр пространственных частот 19, выполненный в виде точечной диафрагмы 19, установленной в непосредственной близости к плоскому зеркалу 18. Как будет показано ниже,именно этот пучок остается неподвижным при смещении светоделителя 16, поэтому именно у него устанавливается фильтр пространственных частот 19, пропускающий только нерассеяное излучение, которое, отражаясь от плоского зеркала 18, распространяется в обратном направлении. Из этого излучения формируется опорный пучок. Излучение, которое прошло к зеркалу 18, отразившись от светоделительной грани бипризмы Дове 16 (на фиг.1 это нижний пучок), беспрепятственно отражается от плоского зеркала 18 и распространяется в обратном направлении. Из этого излучения формируется предметный пучок.

Так как плоское зеркало 18 вначале установлено строго перпендикулярно падающим пучкам, то оба пучка автоматически проходят одинаковый оптический путь от светоделителя 16 до плоского зеркала 18 и обратно до светоделителя 16. В отличие от прототипа нет необходимости в выравнивании оптических путей обоих пучков. В предлагаемом способе это происходит автоматически, т.к. для возвращения пучков используется одно плоское зеркало, а не два разнесенных в пространстве, как в прототипе. Таким образом, пучки, которые отразились от плоского зеркала 18, будут также иметь нулевую разность хода, т.е. останутся когерентными.

В обратном ходе отраженные от плоского зеркала 18 пучки совмещаются в пространстве светоделителем 16, проходят через уголковый отражатель 12 и второй фурье-объектив 13, который строит в задней фокальной плоскости 14 изображение фазового объекта 6, фиксируемое регистратором 15. Опорный и объектный пучки имеют нулевую разность хода и образованы из одного пучка света, поэтому они при регистрации образуют интерферограмму фазового объекта 6, аналогичную той, которая образуется в интерферометре, настроенном на бесконечно широкую полосу.

Теперь рассмотрим случай, когда плоское зеркало 18 установлено под небольшим углом α к падающим пучкам, точнее нормаль к плоскому зеркалу 18 параллельна плоскости, проходящей через оптические оси пучков (плоскость рисунка на фиг.1), и составляет угол α к оптическим осям этих пучков. Обратимся к фиг.2, на которой в увеличенном масштабе изображены оптические оси пучков при отражении от плоского зеркала 18 при его наклонном положении. Без ограничения общности пусть плоское зеркало 18 повернуто на угол α, например, относительно точки А, тогда оптические оси AD и B"C отраженных пучков будут распространяться под углом 2α по отношению к осям A'A и B'B падающих пучков. При наклоне плоского зеркала 18 между пучками излучения возникает оптическая разность хода Δ, которая равна

Δ=(В'В"+В"С)-(А'А+AD)=(В'В"-А'А)+(В"С-AD)=ВВ"+(В"С-AD).

Из ΔАВВ" следует, что ВВ"=AB tgα=htgα. Из ΔА'AD и ΔВ'В"С можно записать:

AD=А'А/cos2α, В"С=В'В"/cos2α=(А'А+htgα)/cos2α,

тогда (B"C-AD)=htgα/cos2α и окончательно получим

$$\Delta =htg\alpha +htg\alpha /\cos 2\alpha =htg\alpha (1+\cos 2\alpha )/\cos 2\alpha =2htg\alpha /(1-t{g}^2\alpha )=k(\alpha )h,(1)$$

где угловой коэффициент

$$\text{k(}\alpha \text{)}=\text{2tg}\alpha {\text{/(1-tg}}^{\text{2}}\alpha ).(2)$$

Таким образом, оптическая разность хода между пучками излучения после светоделителя 16 будет прямо пропорциональна расстоянию h между осями пучков после прохода светоделителя. Из фиг.2 также видно, что оптические оси полученных пучков после обратного прохода через светоделитель будут идти под углом 4α, однако после второго фурье-объектива 13 (см. фиг.1) оптические оси этих пучков будут параллельны друг другу и оптической оси 4f системы. Это связано с тем, что наклонное зеркало 18 находится в общей фокальной плоскости 4f системы и все лучи, отраженные от этого зеркала, после фурье-объектива 13 будут параллельны оптической оси 4f системы.

В предлагаемом способе для восстановления фазы из интерферограмм используется метод фазовых шагов. Суть этого метода состоит в регистрации серии интерференционных изображений исследуемого фазового объекта при различном фазовом сдвиге между опорным и объектным пучками. Для внесения этого фазового сдвига необходимо изменять оптическую разность хода между опорным и объектным пучками. В предлагаемом способе эта операция выполняется оригинальным методом, а именно путем смещения светоделителя 16 вдоль направления, перпендикулярного основаниям призм. Покажем, что при таком смещении изменяется оптическая разность хода Δ, т.к. изменяется расстояние h между оптическими осями пучков.

На Фиг.3 показан ход оптических осей пучков при смещении светоделителя 16 и отражении от зеркала 18. Оптическая ось пучка, который проходит через обе призмы Дове, приходит в точку А на плоском зеркале 18, а оптическая ось второго пучка, который отражается от светоделительной грани OO', приходит в точку В. Пусть первоначальное расстояние между этими осями будет равно h₀. При смещении светоделителя 16 вдоль направления, перпендикулярного основаниям призм OO', например вниз на величину d_i, призма займет положение, отмеченное на Фиг.3 штрихованными линиями, а светоделительная грань OO' перейдет в положение СС'. Из Фиг.3 также видно, что оптическая ось пучка, прошедшего обе призмы Дове, не меняет своего положения и она остается в точке А. Это связано с тем, что для данного пучка светоделитель действует как плоско-параллельная пластина. Оптическая же ось второго пучка из положения В сместится в положение В', т.к. светоделительная грань также переместилась и при отражении от нее второй пучок сместится. Расстояние h(d_i) между осями пучков при смещении светоделителя на величину d_i будет равно:

$${\text{h(d}}_{\text{i}}\text{)-AB'}=\text{2AC}=\text{2(AO}+\text{OC)}$$ .

Так как AO=h₀/2, a OC=d_i, то

h(d_i)=h₀+2d_i.

При смещении призмы вверх знак в этом выражении поменяется на противоположный. В общем случае можно записать:

$${\text{h(d}}_{\text{i}}\text{)}={\text{h}}_0\pm {\text{2d}}_{\text{i}}\text{. (3)}$$

Подставляя (3) в (1) получим, что при смещении светоделителя 16 на величину d_i оптическая разность хода Δ изменится следующим образом:

$$\Delta =\text{k(}\alpha \text{)}\times {\text{(h}}_{\text{0}}\pm {\text{2d}}_{\text{i}}\text{)}=\text{k(}\alpha \text{)}\times {\text{h}}_{\text{0}}\pm \text{k(}\alpha \text{)}\times {\text{2d}}_{\text{i}}=\text{k(}\alpha \text{)}\times {\text{h}}_{\text{0}}\pm \Delta {\text{(d}}_{\text{i}}\text{), (4)}$$

где первое слагаемое - это постоянная разность хода, а второе - переменная часть разности хода, равная

$$\Delta {\text{(d}}_{\text{i}}\text{)}=\text{k(}\alpha \text{)}\times {\text{2d}}_{\text{i}}\text{. (5)}$$

Из выражения (4) можно оценить численное значение коэффициента k(α) из следующих соображений. Величина h₀ не может превышать размер апертуры одной призмы Дове и ее можно сделать не более 3 мм. Величина перемещения светоделителя d_i намного меньше h₀. Поэтому для оценок в (4) можно учитывать только первое слагаемое и тогда

$$\text{k(}\alpha \text{)}=\Delta {\text{/h}}_{\text{0}}\text{. (6)}$$

Так как для уменьшения когерентных шумов мы хотим использовать немонохроматический источник излучения, то можно потребовать, чтобы максимальная оптическая разность хода Δ не превышала длину когерентности этого источника, например, равную 3 мкм. Напомним, что в способе, принятом за прототип, длина когерентности больше почти в 10 раз и составляет 27 мкм. Тогда из (6) следует, что

$$k(\alpha )=\frac{3мкм}{3мм}=0,001$$ , а из (2) угол α≤0,03°.

Фаза интерференционного изображения, полученного после смещения светоделителя на величину d_i, по отношению к исходному интерференционному изображению, полученному до смещения светоделителя, изменяется на величину $$\frac{\text{2}\pi }{\lambda }\Delta {\text{(d}}_{\text{i}}\text{)}$$ , где λ - центральная длина волны излучения. Подставляя сюда (5) получим, что фаза меняется на величину

$$\frac{\text{4}\pi {\text{d}}_{\text{i}}}{\lambda }\text{k(}\alpha \text{)}\text{. (7)}$$

Для лучшего восстановления фазового изображения из интерферограммы методом фазовых шагов требуется диапазон изменения фазы от 0 до 4π с шагом π/2. Тогда из (7) следует, что диапазон перемещения светоделителя 16 составит величину λ/k(α)=λ/0.001=1000λ с шагом λ/8k(α)=125λ. Следовательно, для центральной длины волны λ=0.6 мкм диапазон перемещений будет равен 600 мкм, а шаг 75 мкм. Такие перемещения можно выполнить с помощью обычных моторизованных линейных трансляторов на базе шаговых двигателей, например фирмы Vicon Standa, модель 8МТ175, с минимальным шагом или точностью перемещений в 2,5 мкм в диапазоне 5 мм.

Обычно для реализации метода фазовых шагов требуется очень малый диапазон перемещений около 2λ, т.е. в пределах 2-х интерференционных полос с шагом λ/8 и соответствующей точностью перемещений на порядок выше шага перемещений. Для этого используются прецизионные приводы с пьезоэлементами. В нашем же случае можно обойтись более простыми и доступными столиками с линейным перемещением. Это также важное достоинство предлагаемого способа.

Смещение повторяют N раз и по полученному набору из N интерференционных изображений вычисляют двумерное распределение оптической разности хода излучения, прошедшего через микрообъект, с использованием любого из алгоритмов метода фазовых шагов (см., например, электронную книгу Wyant J.C. Phase Shifting Interferometry.nb, 1998, http://www.optics.arizona.edu/fab&test/Fall09/415L_515L/Lab3/Wyants%20PSI.pdf).

Таким образом, мы доказали техническую реализуемость метода фазовых шагов в предлагаемом способе.

Из Фиг.3 видно также, что при смещении светоделителя 16 оптические оси пучков после их обратного прохода через светоделитель также смещаются. Если не предпринять специальных мер, то изображение объекта в плоскости 14 также будет смещаться, чего нельзя допустить для реализации метода фазовых шагов. В этом методе изображение объекта должно быть неподвижным, а смещаются лишь интерференционные полосы по объекту.

Чтобы избежать этого в предлагаемом способе используется дополнительное отражение от уголкового отражателя 12, который также смещается вдоль направления, перпендикулярного основаниям призм одновременно со светоделителем 16 и на ту же величину. Для реализации такого совместного смещения светоделитель - бипризма Дове 16 и уголковый отражатель 12 закреплены на одну подвижную платформу 17 с приводом 20, например шаговым двигателем (см. фиг.1).

Для доказательства этого факта обратимся к Фиг.4, на которой показан ход оптических осей пучков после прямого и обратного прохода через светоделитель 16 и уголковый отражатель 12 до и после одновременного смещения. Из свойства уголкового отражателя видно, что оптическая ось 4f системы не сдвигается и, соответственно, изображения объекта, сформированные в плоскости 14 будут неподвижны.

Работа устройства, реализующего предлагаемый способ, должна выполняться в два этапа. Первый этап - это калибровка интерференционного микроскопа. Оптическая система неидеальна, вследствие чего возникают различного рода аберрации, искажающие изображение исследуемого объекта. Для устранения подобных негативных эффектов на первом этапе восстанавливается фазовое изображение, формируемое оптической системой, без исследуемого фазового объекта.

Второй этап - непосредственно процесс измерений исследуемого фазового объекта 6. Восстановленное фазовое изображение объекта корректируются при помощи фазового изображения, полученного на этапе калибровки, путем вычитания из первого второго фазового изображения. Таким образом полученное фазовое изображение объекта будет свободно от фазовых искажений (аберраций) оптической системы интерференционного микроскопа.

Возможен 2-й вариант осуществления изобретения, когда деление излучения выполняют с помощью светоделителя из двух идентичных зеркальных аналогов призмы Дове (B.C. Нужин и др. «Разработка и изготовление зеркального аналога призмы Дове», Оптический журнал, т.52, №6, стр.70-72), в которых верхнее зеркало выполнено в виде полупрозрачной светоделительной пластины и является общим для обеих призм, а светоделительная грань пластины параллельна оптической оси падающего на него пучка. Такой светоделитель изображен на фиг.5. Светоделительная пластина OO' должна быть выполнена в виде склейки двух идентичных плоскопараллельных прозрачных пластин, на одну из которых нанесено 50%-ное зеркальное покрытие. Это необходимо для того, чтобы выровнять оптическую длину пути пучков на выходе из системы светоделитель 16 - зеркало 18. Использование зеркал в аналоге призмы Дове позволяет уменьшить хроматические аберрации микроскопа, вызванные дисперсией показателя преломления обычных (стеклянных) призм Дове, а также расширить спектральный диапазон используемого излучения от УФ до ИК.

Возможен 3-й вариант интерференционной микроскопии, отличающийся тем, что деление излучения выполняют с помощью светоделительного кубика, повернутого относительно оптической оси падающего на него пучка на 45 градусов так, что его светоделительная грань параллельна указанной оптической оси. Такой светоделитель изображен на фиг.6.

Хотя заявляемый в качестве изобретения способ описан на примере ряда его конкретных вариантов осуществления, для специалистов будут ясны возможности многочисленных модификаций данного способа, не выходящие за границы идеи и объема правовой охраны изобретения, определяемые прилагаемой формулой.

Изобретение относится к микроскопии и может быть использовано в биологии, медицине, машиностроении, оптическом приборостроении для исследования фазовых объектов. Технический результат - уменьшение уровня когерентных шумов, снижение требований к юстировке интерферометра, повышение стабильности результатов измерений, повышение точности измерений. Согласно способу интерференционной микроскопии исследуемый микрообъект освещают некогерентным излучением, которое используют для формирования увеличенного изображения микрообъекта в передней фокальной плоскости 4f оптической системы, делят излучение с помощью светоделителя из двух идентичных призм Дове, склеенных по основаниям призм, и направляют оба пучка на одно плоское зеркало. Пучок, который прошел через обе призмы Дове, пропускают через точечную диафрагму. После обратного прохода через светоделитель оба пучка излучения направляют на уголковый отражатель и регистрируют исходное интерференционное изображение, а затем многократно смещают светоделитель и уголковый отражатель вдоль направления, перпендикулярного основаниям призм. При этом изменяется фаза интерференционных изображений по отношению к исходному и регистрируется набор интерференционных изображений, по которому методом фазовых шагов вычисляют двумерное распределение оптической разности хода излучения, прошедшего через микрообъект. 2 з.п. ф-лы, 6 ил.

1. Способ интерференционной микроскопии, заключающийся в том, что исследуемый микрообъект освещают некогерентным излучением, которое используют для формирования увеличенного изображения микрообъекта в передней фокальной плоскости 4f оптической системы, излучение, поступившее в 4f оптическую систему, направляют на первый фурье-объектив и, не доходя до общей фокальной плоскости 4f оптической системы, делят с помощью светоделителя на два пучка излучения, каждый из которых фокусируют на светоотражательных элементах, а отраженные от этих светоотражательных элементов пучки направляют обратно на светоделитель, причем один из пучков в плоскости фокусировки пропускают через точечную диафрагму, после обратного прохода через светоделитель пучки излучения направляют на второй фурье-объектив и формируют в задней фокальной плоскости 4f оптической системы интерференционное изображение микрообъекта, которое регистрируют и используют для вычисления двумерного распределения оптической разности хода излучения, прошедшего через микрообъект, отличающийся тем, что деление излучения выполняют с помощью светоделителя из двух идентичных призм Дове, склеенных по основаниям призм, так, чтобы полученные пучки имели нулевую разность хода, а их оптические оси были параллельны основаниям призм, далее оба пучка направляют на одно плоское зеркало, нормаль к которому параллельна плоскости, проходящей через оптические оси пучков, и составляет угол α к оптическим осям пучков, причем тот пучок, который прошел через обе призмы Дове, пропускают через точечную диафрагму, установленную в непосредственной близости к плоскому зеркалу, а после обратного прохода через светоделитель оба пучка излучения направляют на уголковый отражатель, ось симметрии которого параллельна основаниям призм, и регистрируют исходное интерференционное изображение, многократно смещают светоделитель и уголковый отражатель вдоль направления, перпендикулярного основаниям призм, N раз на величины d_i, i=1, 2, 3,…, N и регистрируют N интерференционных изображений, фаза которых по отношению к исходному интерференционному изображению изменяется на величину , где λ - длина волны излучения, и по полученному набору из N интерференционных изображений вычисляют двумерное распределение оптической разности хода излучения, прошедшего через микрообъект.

2. Способ интерференционной микроскопии по п.1, отличающийся тем, что деление излучения выполняют с помощью светоделителя двух идентичных зеркальных аналогов призмы Дове, в которых верхнее зеркало выполнено в виде полупрозрачной светоделительной пластины и является общим для обеих призм, а светоделительная грань пластины параллельна оптической оси падающего на него пучка.

3. Способ интерференционной микроскопии по п.1, отличающийся тем, что деление излучения выполняют с помощью светоделительного кубика, повернутого относительно оптической оси падающего на него пучка на 45 градусов так, что его светоделительная грань параллельна указанной оптической оси.