Штамм Азия-1 N 2356/14/2018 вируса ящура Aphtae epizooticae типа Азия-1 для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа Азия-1 Российский патент 2021 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано для разработки и изготовления средств диагностики, специфической профилактики ящура типа Азия-1 и контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин.

Ящур является особо опасным, высоко контагиозным вирусным заболеванием сельскохозяйственных и диких парнокопытных и мозоленогих животных.

Опасность болезни обусловлена высокой способностью к быстрому распространению в виде эпизоотий и панзоотий, множественностью путей передачи инфекции, узкой специфичностью иммунитета у животных в пределах одного серотипа.

Возбудитель характеризуется выраженной антигенной вариабельностью: существует 7 типов вируса ящура (О, А, С, Азия-1, SAT-1, SAT-2, SAT-3) и множество топотипов - устойчивых генетических групп, в пределах каждой из которых различают многочисленные генетические линии и сублинии ящура, отличающиеся по генетическим и антигенным свойствам [1].

Высокий уровень генетической изменчивости вируса в пределах одного генотипа приводит к возникновению новых вариантов, которые отличаются по степени вирулентности и иммуногенности от ранее выделенных штаммов вируса ящура.

Антигенная изменчивость вируса ящура возникает в связи с заменами аминокислот в полипептидных фрагментах (антигенных эпитопах), экспонированных на поверхности капсидных белков. Изменения, которые сохраняются в последующем поколении, становятся постоянными и отражаются в модификации нуклеотидной последовательности генома вируса [1, 7, 8].

Изменения антигенных свойств природного изолята вызывают ослабление специфического иммунитета, индуцированного негомологичным антигеном. При этом затрудняется штаммоспецифическая диагностика полученных изолятов вируса ящура. Проблема отбора и подготовка новых производственных штаммов вируса ящура является одной из главных в системе мер профилактики ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики.

Со времени выделения вируса ящура типа Азия-1 в 1954 году, многие исследователи вели с ним научную работу. Основным отличительным признаком вируса ящура типа Азия-1 является большая продолжительность инкубационного периода у зараженных животных. После интрадермолингвального заражения КРС вирусом ящура типа Азия-1 афты появляются через 30-36 часов, генерализация болезни у КРС при заражении наступает на 5 день, но в наибольшей степени тяжесть болезни выражается на 12-14 день [5].

Установлено, что вируса ящура типа Азия-1 способен размножаться в различных системах культивирования. Вирус хорошо репродуцируется в первично-трипсинизированной культуре клеток СП и в перевиваемых линиях культур клеток ВНК-21, ПСГК-30 и IB-RS-2.

В Российской Федерации вспышки ящура типа Азия-1 регистрировались в 2005-06 гг. и в 2016 г. [3, 8].

Известны производственные штаммы вируса ящура типа Азия-1, ранее применявшиеся для специфической профилактики ящура на территории России:

- производственный штамм Азия-1 №48

- штамм вируса ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005

- штамм вируса ящура Азия-1 / Шамир 3/89

В ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2018 г. из проб патологического материала от крупного рогатого скота, отобранных на территории Пакистана, был выделен изолят вируса ящура типа Азия-1.

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный изолят принадлежит к топотипу ASIA, генетической линии Sindh-08 вируса ящура типа Азия-1, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура типа Азия-1.

Учитывая интенсивные торговые связи между Российской Федерацией и странами Западной и Центральной Азии, вероятность риска заноса ящура на территорию России остается очень высокой [8]. В связи с этим возникла необходимость получить новый производственный штамм из эпизоотического изолята вируса ящура серотипа Азия-1 для обеспечения безопасности территории Российской Федерации и сопредельных государств от данного возбудителя.

Проблема, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала производственных штаммов вируса ящура серотипа Азия-1, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и сохраняющих данные свойства после инактивации, пригодных для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин, изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностических тест-систем и высоко иммуногенных вакцинных препаратов.

Указанная проблема решена путем получения штамма вируса ящура типа Азия-1 №2356/14/2018 для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа Азия-1.

Изолят, послуживший источником для получения штамма ВЯ Азия-1 №2356/14/2018, был выделен в 2018 году от больных ящуром КРС на территории Пакистана (экспертиза №2356). Производственный штамм ВЯ Азия-1 №2356/14/2018 получен путем последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток.

Штамм вируса ящура Азия-1 №2356/14/2018 депонирован в Коллекцию штаммов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером: №176- деп /19-66 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма ВЯ Азия-1 №2356/14/2018 для изготовления средств диагностики и профилактики ящура типа Азия-1.

Сущность изобретения отражена на графическом изображении. Представлена дендрограмма, отражающая филогенетические взаимоотношения штамма ВЯ Азия-1 №2356/14/2018 с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура серологического типа Азия-1. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена белка VP1.

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP1 штамма Азия-1 №2356/14/2018 вируса ящура типа Азия-1;

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP1 штамма Азия-1 №2356/14/2018 вируса ящура типа Азия-1.

Штамм Азия-1 №2356/14/2018 вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм ВЯ Азия-1 №2356/14/2018 относится к семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, серотипу Азия-1 и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 22-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм ВЯ Азия-1 №2356/14/2018 относится к серотипу Азия-1. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 штамма ВЯ Азия-1 №2356/14/2018. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм ВЯ Азия-1 №2356/14/2018 принадлежит к генетической линии Sindh-08 топотипа ASIA.

Антигенное родство штамма вируса ящура Азия-1 №2356/14/2018 с производственными штаммами вируса ящура Азия-1 / Шамир 3/89 и Азия-1 №1987/Амурский/2005 изучено в РМН в соответствии с Методическими указаниями по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации [3].

Результаты исследований в РМН представлены в таблице 1. Антигенное соответствие (r₁) составило для ящура Азия-1 /Шамир 3/89 - 0,16; Азия-1 №1987/Амурский/2005 - 0,21.

При значении r₁>0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического вируса, при значении r₁<0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического вируса.

Биотехнологические характеристики

Штамм вируса ящура тип Азия-1 №2356/14/2018 репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21). В течение 20-24 часов инкубирования, урожай вируса в указанных культурах клеток достигает значений от 5,25 до 7,00 lg ТЦД₅₀/см³ (таблица 2). Сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 5 пассажей (срок наблюдения).

Геном и хемотаксономическая характеристики

Штамм Азия-1 №2356/14/2018 вируса ящура является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×10⁶ Д.

Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP_66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10^-18 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм вируса ящура Азия-1 №2356/14/2018 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,4-7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к щелочам, кислотам, формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах (культуры клеток). При испытании было проведено 10 последовательных пассажей штамма ВЯ Азия-1 №2356/14/2018 в перевиваемой суспензионной культуре клеток ВНК-21 (таб. 3). Определение инфекционной активности вируса каждого пассажа проводили в перевиваемой культуре клеток IB-RS-2.

Проведена проверка штамма на стерильность, отсутствие контаминации бактериальной, грибной микрофлорой и микоплазмами, а также посторонними вирусами в ПЦР и ОТ-ПЦР.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1 Оценка биологических свойств штамма вируса ящура Азия-1 №2356/14/2018 при репродукции в монослойных перевиваемых клеточных культурах.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма Азия-1 вируса ящура типа Азия-1 №2356/14/2018, был выделен в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из проб биологического материала, полученных 2018 г. от подозреваемых в заболевании ящуром крупного рогатого скота.

При выделении вируса с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [2].

Биологические и вирусологические методы включали в себя выделение и адаптацию вируса ящура.

Выделение вируса проводили на культуре монослойных перевиваемых линиях клеток ПСГК-30, IB-RS-2, ВНК - 21 с последующей адаптацией (5 пассажей). Культуры клеток выращивали на соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 25 см², отмывали от ростовой среды и заражали 10% суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД₅₀ на клетку), приготовленной в растворе Хенкса с 0,5% гидролизата лактальбумина (ГЛА) и антибиотиками по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов вирусную суспензию предварительно обрабатывали 10% раствором хлороформа. После 30-минутного контакта вируса с клеточной культурой при 37°С во флаконы вносили по 5 см³ поддерживающей среды и инкубировали при 37°С до появления ЦПД на культуре клеток. При наличии ЦПД (округление клеток, повышение их оптической плотности, дегенерация и отделение клеток от стекла) не менее 80-95% клеток, флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей. Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение 20-24 часов проявлялось 90-100% ЦПД в монослое клеточных культур. Адаптация эпизоотического изолята Азия-1 №2356/14/2018 к различным клеточным линиям наступала на уровне третьего пассажа. Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 2.

Данные, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о высокой адаптационной способности штамма вируса ящура Азия-1 №2356/14/2018 к использованным клеточным культурам.

Инактивированный материал исследовали в РСК на наличие антигена вируса ящура, при этом использовали сыворотки ящурные типо- и штаммоспецифические для серологических реакций, производства ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Изолят вируса ящура был исследован в РСК с целью подтверждения его типовой принадлежности (таблица 4).

Приведенные в таблице результаты свидетельствуют о том, что в вирусосодержащем материале экспертизы №2356 в РСК определяется антиген вируса ящура типа Азия-1 в разведении 1:4.

Пример 2. Оценка биологических свойств штамма вируса ящура Азия-1 №2356/14/2018 при репродукции в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21.

Штамм вируса ящура Азия-1 №2356/14/2018 репродуцировали в суспензионной перевиваемой культуре клеток из почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21. В качестве поддерживающей среды использовали раствор Эрла, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого (ФГМС), гидролизата белков крови сухого (ГБКС) и антибиотиков при рН среды 7,4-7,6. Клеточную линию заражали вирусом из расчета 0,001-0,1 ТЦД₅₀/клетка.

Культивирование вируса осуществляли при температуре 35-38°С. Цитопатическое действие вируса, соответствующее 90-100%, достигалось через 20-21 ч. После этого репродукцию вируса ящура прекращали, полученную суспензию контролировали на стерильность и содержание 146S компонента. Концентрация 146S компонентов вируса ящура в суспензии составляла 0,47-1,96 мкг/см³ в зависимости от концентрации клеток, температуры инкубирования и дозы заражения. Значения титра инфекционной активности вируса штамма ВЯ Азия-1 №2356/14/2018 отражены в таблице 5, из данных которой видно, что при концентрации клеток ВНК-21, равной 2,5-4,0 млн клеток/см³, дозе заражения 0,0001-0,1 ТЦД₅₀/клетка и продолжительности репродукции вируса 16-29 ч титр инфекционной активности возбудителя ящура находился в диапазоне 4,25-6,75 lgТЦД₅₀/см³ и концентрация 146S компонента равна 0,47-196 мкг/см³.

Пример 3. Исследование устойчивости к инактивации аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) и стерилизующей очистке полигексаметиленгуанидином (ПГМГ) иммуногенных компонентов (146S частицы) штамма вируса ящура Азия-1 №2356/14/2018.

По окончании цикла репродукции вируса, не прекращая процесса термостатирования, в вируссодержащую суспензию добавляли 15%-ный раствор аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ), подкисленный ледяной уксусной кислотой до рН 8,0-8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии составляла 0,025-0,050%. Инактивацию вируса ящура проводят в течение 24 часов при температуре 36-37°С и рН 7,2-7,6. По окончании инактивации остаток аминоэтилэтиленимина нейтрализовали добавлением тиосульфата натрия. Для флокуляции балластных примесей и инактивации возможных контаминантов в суспензию вносили 10%-ный раствор полигексаметиленгуанидин гидрохлорида (ПГМГ) до концентрации 0,005-0,007%. Флокулированные балластные примеси подвергали седиментации с последующей декантацией.

Результаты исследований по изучению влияния инактивации и очистки антигенного материала с помощью АЭЭИ и ПГМГ на иммуногенные (146S и общий вирусный белок) компоненты штамма вируса ящура типа Азия-1 №2356/14/2018 отражены в таблице 6.

Данные таблицы 6 свидетельствуют о том, что концентрация 146S компонента штамма вируса ящура типа Азия-1 №2356/14/2018 снижается с 2,07±0,10 мкг/см³ (среднее значение после окончания культивирования вируса) до 1,69±0,10 мкг/см³ (среднее значение после окончания процесса инактивирования).

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента Российской Федерации на изобретение «Штамм Азия-1 №2356/14/2018 вируса ящура Aphtae epizooticae типа Азия-1 для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа Азия-1»:

1. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. / Под ред. А.Н. Бурдова. - М., Агропромиздат, 1990, 320 с.

2. Методические рекомендации по выделению и идентификации штаммов вируса ящура /А.А. Гусев, В.М. Захаров, Ж.А. Шажко и др.; ФГУ "ВНИИЗЖ". - Владимир. 2002. - 31 с.

3. Методические указания по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации: утв. Россельхознадзором 13.09.2017 / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2017. - 24 с.

4. Груздев, К.Н. Противоэпизоотические мероприятия при заносе в Россию в 2005 г. ящура экзотического типа Азия-1 // К.Н. Груздев, В.М. Захаров, А.М. Рахманов // Актуальн. пробл. инфекц. патологии и иммунологии животных: матер. Междунар. науч.-практ. конф. - М., 2006. - С. 66-68.

5. Патологоанатомические изменения у крупного рогатого скота при ящуре типа Азия-1 // А.В. Мищенко, В.А. Мищенко, В.Н. Герасимов, В.Н. Курбанов // Ветеринарная патология. - 2005. - №3. - С. 58-60.

6. Пат. РФ №23486908, C12N 7/00, 10.03.2009 г.

7. Первичная структура гена белка вируса ящура серотипа Азия-1 / С.В. Сосновцев, A.M. Онищенко, Н.П. Петров [и др.] // Молек. генетика, микобиология и вирусология. - 1989. - №12. - С. 44-46.

8. Экспертная оценка риска заноса ящура на территорию Российской Федерации из неблагополучных государств / В.М. Гуленкин, А.К. Караулов, Д.А. Лозовой, В.М. Захаров // Ветеринария сегодня. - 2018. - №2. - С. 36-41.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается нового штамма вируса ящура Aphtae epizooticae типа Азия-1 сем. Picornaviridae, рода Aphthovirus, депонированного в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №176 - деп / 19-66 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» штамм Азия-1 №2356/14/2018 вируса ящура. Представленный штамм репродуцируется в перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), в перевиваемой культуре клеток почки свиньи IB-RS-2 и в перевиваемой культуре клеток почки сирийского хомячка ВНК - 21, в течение 20-24 часов инкубирования, урожай вируса, оценивающийся по цитопатическому действию в указанных культурах клеток, достигает значений от 5,25-7,00 lg ТЦД₅₀/см³, сохраняя исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 5-10 пассажей. Представленный штамм может быть использован для контроля антигенной активности противоящурных вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа Азия-1. 1 ил., 6 табл.

Штамм вируса ящура Aphtae epizooticae типа Азия-1, сем. Picomaviridae, род Aphthovirus, депонированный в коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №176 - деп / 19-66 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» штамм Азия-1 №2356/14/2018 вируса ящура для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа Азия-1.