Штамм А 2205/G IV вируса ящура Aphtae epizooticae типа А для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А Российский патент 2022 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, может быть использовано для разработки и изготовления средств диагностики, специфической профилактики ящура типа А и контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин.

Ящур является вирусным, высоко контагиозным заболеванием сельскохозяйственных и диких парнокопытных и мозоленогих животных. Ящур относится к «трансграничным инфекциям», способным к быстрому распространению независимо от национальных границ, имеющим большую эконмическую значимость и влияющих на торговлю и продовольственную безопасность стран.

Возбудитель характеризуется выраженной антигенной вариабельностью. Существует 7 типов вируса ящура (О, А, С, Азия-1, SAT-1, SAT-2, SAT-3) и множество топотипов - устойчивых генетических групп, в пределах каждой из которых различают многочисленные генетические линии вируса ящура, отличающиеся по генетическим и антигенным свойствам [2]. Антигенная изменчивость происходит внутри типов, главным образом в результате процесса ступенчатого «дрейфа», в процессе которого возникает замена аминокислот в полипептидных фрагментах (антигенных эпитопах), экспонированных на поверхности капсидных белков вируса ящура. Изменчивость вируса в пределах одного генотипа приводит к возникновению новых изолятов, которые отличаются по степени вирулентности и иммуногенности от ранее выделенных штаммов вируса ящура. Антигенная изменчивость наиболее выражена у вируса ящура типа А, что приводит к проблемам в специфической профилактики ящура при применении противоящурных вакцин, а также затрудняется штаммоспецифическая диагностика выделенных изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики.

На территории Российской Федерации вспышки ящура имеют спорадический характер и вызваны заносом возбудителя с территории сопредельных стран. Регионы РФ, граничащие с Китаем, Монголией, Азербайджаном и Грузией подвержены очень высокой степени риска заноса ящура [1].

В Российской Федерации вспышки ящура типа А регистрировались в 2013-2014 гг. На территории Забайкальского края и Амурской области был выявлен вирус ящура типа А, относящийся к генетической линии A Asia SEA-97. На территории Карачаево-Черкесской Республики и Краснодарского края вспышки ящура были вызваны вирусом, относящимся к типу А генетической линии Iran 05, сублинии SIS 10, топотипа ASIA [5].

В настоящее время известны производственные штаммы вируса ящура типа А, которые применяются для производства средств специфической профилактики ящура:

- штамм ящура А №550/Азербайджан/64,

- штамм А22 /Ирак 24/64,

- штамм А /Иран/97,

- штамм А /Турция/06,

- штамм А №2155 /Забайкальский/2013,

- штамм А №2166 /Краснодарский/2013,

- штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015.

В ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2020 г. был доставлен изолят вируса ящура типа А, выделенный на территории Арабской Республики Египет от крупного рогатого скота.

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный изолят принадлежит к топотипу AFRICA, генетической линии G IV вируса ящура типа А, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура типа А.

Настоящее изобретение позволяет расширить арсенал производственных штаммов вируса ящура серотипа А, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде, пригодный для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин, изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностических тест-систем и высоко иммуногенных вакцинных препаратов путем получения штамма вируса ящура А 2205/G IV для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А.

Изолят вируса ящура, послуживший источником для получения штамма А 2205/G IV был выделен от крупного рогатого скота на территории Арабской Республики Египет в 2018 г.

Штамм вируса ящура А 2205/G IV депонирован в Коллекцию штаммов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером: №339 - деп/20-127 штамм A 2205/G IV вируса ящура.

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма ВЯ A 2205/G IV для изготовления средств диагностики и профилактики ящура типа А.

Сущность изобретения отражена на графическом изображении. Представлена дендрограмма, отражающая филогенетические взаимоотношения штамма A 2205/G IV вируса ящура с эпизоотическими и вакцинными штаммами серологического типа А. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP1.

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP1 штамма A 2205/G IV вируса ящура типа А;

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP1 штамма A 2205/G IV вируса ящура типа А.

Штамм A 2205/G IV вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм ВЯ A 2205/G IV типа А относится к семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, серотипу А и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм ВЯ A 2205/G IV относится к серотипу А. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 штамма A 2205/G IV вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм A 2205/G IV вируса ящура принадлежит к генетической линии G IV топотипа AFRICA.

Антигенное родство (r₁) штамма A 2205/G IV вируса ящура изучено в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на производственные штаммы вируса ящура А №550/Азербайджан/64, А22 /Ирак 24/64, А /Иран/97, А /Турция/06, А №2155 /Забайкальский/2013, А №2166 /Краснодарский/2013, А №2269/ВНИИЗЖ/2015 в реакции микронейтрализации (РМН). Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации КРС моновалентными вакцинами из производственных штаммов ВЯ типа А, против 100 ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [4].

Значение r₁ в РМН интерпретировали:

при ≥0,3 - исследуемый и производственный штаммы ВЯ являются близкородственными;

при <0,3 - исследуемый образец штамма ВЯ отличается от производственного штамма.

Показатели антигенного родства при изучении штамма A 2205/G IV ВЯ составили r₁ 0,06-0,25, что свидетельствует об отсутствии антигенного родства с производственными штаммами ВЯ типа А (табл. 1).

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм A 2205/G IV вируса ящура является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×10⁶ Д.

Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10^-18 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм вируса ящура A 2205/G IV устойчив к детергентам и органическим растворителям, таким как эфир, хлороформ, фреон, ацетон. Наиболее стабилен при рН 7,4-7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38°С).

Дополнительные признаки и свойства:

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Биотехнологические характеристики

Штамм А 2205/G IV вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомяка (ВНК-21).

При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма ВЯ A 2205/G IV в перевиваемых культурах клеток IB-RS-2, ПСГК-30, ВНК-21. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой культуре клеток IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных - крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исследования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1 Оценка биологических свойств штамма A 2205/G IV вируса ящура при репродукции в монослойных перевиваемых клеточных культурах.

При выделении изолята вируса A 2205/G IV с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [3].

Биологические и вирусологические методы включали в себя выделение и адаптацию вируса ящура к перевиваемым культурам клеток.

Выделение вируса проводили на культуре монослойных перевиваемых линий клеток ПСГК-30, IB-RS-2, ВНК - 21 с последующей адаптацией (5 пассажей). Культуры клеток выращивали на соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 25 см², отмывали от ростовой среды и заражали 10%-ной суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД₅₀ на клетку), приготовленной в растворе Хенкса с 0,5% гидролизата лактальбумина (ГЛА) и антибиотиками по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов вирусную суспензию предварительно обрабатывали 10%-ным раствором хлороформа. После 30-минутного контакта вируса с клеточной культурой при 37°С во флаконы вносили по 5 см³ поддерживающей среды и инкубировали при 37°С до появления ЦПД на культуре клеток. При наличии ЦПД (округление клеток, повышение их оптической плотности, дегенерация и отделение клеток от стекла) не менее 80-95% клеток, флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей. Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение не менее 24 часов проявлялось 90-100% ЦПД в монослое клеточных культур. Адаптация эпизоотического изолята A 2205/G IV к различным клеточным линиям наступала на уровне пятого пассажа. Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 2.

Данные, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о высокой адаптационной способности штамма A 2205/G IV вируса ящура к использованным клеточным культурам.

Пример 2. Оценка биологических свойств штамма A 2205/G IV вируса ящура на крупном рогатом скоте.

Заражение КРС исходным штаммом вируса ящура проводили интрадермолингвально (I пассаж). Адаптацию и наработку штамма A 2205/G IV ВЯ на КРС вели в течение 2 последовательных пассажей. С целью определения инфекционной активности адаптированного штамма, из афт 2 пассажа на КРС получали 10%-ную вирусную суспензию из которой готовили последовательные 10-кратные разведения на ФБР. Подготовленные разведения с 10^-2 по 10^-6 вводили интрадермолингвально в 4 точки по 0,1 см³ двум КРС.

Учет результатов титрования проводили через 28 ч по наличию афт на месте введения разведений ВЯ. Титр инфекционной активности для КРС штамма А 2205/G IV ВЯ, 2 пассаж на КРС, в виде 10%-ной вирусной суспензии из афт КРС на ФБР с глицерином , составил 5,50 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 3. Оценка биологических свойств штамма A 2205/G IV вируса ящура на свиньях.

Заражение свиней исходным штаммом A 2205/G IV ВЯ проводили внутрикожно (I пассаж) в область венчика передних конечностей. Адаптацию и наработку штамма ВЯ на свиньях вели в течение 2 последовательных пассажей. С целью определения инфекционной активности адаптированного штамма из афт 2 пассажа на свиньях, получали 10%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения на ФБР. Подготовленные разведения с 10^-2 по 10^-6 вводили внутрикожно в венчики копытец по 0,1 см³ в 4 точки на каждый палец конечности одного разведения, из расчета 1 разведение на 2 копытца 1 конечности каждому из 2 подопытных подсвинков.

Учет результатов титрования проводили через 28 ч по наличию афт на месте введения разведений. Титр инфекционной активности для свиней штамма А 2205/G IV ВЯ, 2 пассаж на свиньях в виде 10% в/с суспензии из афт свиней на ФБР с глицерином , составил 5,00 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 4. Оценка биологических свойств штамма A 2205/G IV вируса ящура при репродукции в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/2-17.

Штамм вируса ящура A 2205/G IV репродуцировали в суспензионной перевиваемой культуре клеток из почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/2-17. В качестве поддерживающей среды использовали раствор Эрла, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого (ФГМС), гидролизата белков крови сухого (ГБКС) и антибиотиков при рН среды 7,4-7,6. Клеточную линию заражали вирусом из расчета 0,001-0,1 ТЦД₅₀/клетка.

Культивирование вируса осуществляли при температуре 35-38°С в течении 19-20,5 ч до достижения цитопатического действия вируса, соответствующего 90-100%. После этого репродукцию вируса ящура прекращали, полученную суспензию контролировали на стерильность и содержание 146S компонента и общего вирусного белка (ОВБ). Концентрация ОВБ в суспензии составляла 2,13±0,05 мкг/см³. Значения титра инфекционной активности вируса, а также процентное содержание 146S компонента штамма A 2205/G IV вируса ящура отражены в таблице 3, из данных которой видно, что при средней концентрации клеток ВНК-21/2-17, равной 3,10±0,11 млн клеток/см³, дозе заражения 0,005 ТЦД₅₀/кл и продолжительности репродукции вируса 19,5±0,53 ч средний титр инфекционной активности возбудителя ящура равен 6,43±0,17 lg ТЦД₅₀/0,1 см и концентрация 146S компонента составляет 75,60±1,17% (1,61±0,03 мкг/см³).

Пример 5. Оценка типовой специфичности и активности штамма A 2205/G IV вируса ящура

Оценку типовой специфичности и активности штамма A 2205/G IV ВЯ проводили в реакции связывания комплемента (РСК).

К полученному антигену штамма A 2205/G IV ВЯ, взятому в объеме 0,4 см³ в цельном виде и в разведениях 1:2, 1:4, 1:8, добавляли по 0,1 см³ гомологичной и гетерологичных гипериммунных сывороток, полученных на вирус ящура типов А, О, Азия-1 в рабочем (удвоенном) титре и 0,1 см³ комплемента в рабочем разведении. Смесь выдерживали в водяной бане в течение 20 мин при температуре 37°С. Затем вносили по 0,2 см³ гемолитической системы и выдерживали 30 мин при температуре 37°С. Положительный результат реакции соответствовал 100%-ной задержке гемолиза эритроцитов барана («4 креста»). Параллельно проводили контрольные реакции без сыворотки, без комплемента и компонентов реакции.

В качестве реагентов в РСК использовали сыворотки ящурные типоспецифические гипериммунные морских свинок, полученные на производственные штаммы вируса ящура А/Иран/05, О PanAsia 2, Азия-1/Шамир/89, комплемент сухой для РСК, гемолизин (сыворотка гемолитическая), эритроциты барана 2% (взвесь на физиологическом растворе, рН 7,1). В качестве контроля использовали антигены вируса ящура А/Иран/05, О PanAsia 2, Азия-1/Шамир/89.

Из результатов испытания (таблица 4) следует, что штамм A 2205/G IV вируса ящура обладает выраженной типовой специфичностью, относится к вирусу ящура серотипа А и активен в РСК в разведении 1:4.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента Российской Федерации на изобретение «Штамм A 2205/G IV вируса ящура Aphtae epizooticae типа А для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А

1. Анализ эпизоотической ситуации по ящуру в России с 2010 г. по март 2019 г. / В.П. Семакина, Т.П. Акимова, В.А. Мищенко, А.К. Караулов // Ветеринария. - 2019. - №11. - С. 16-20.

2. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. / Под ред. А.Н. Бурдова. - М, Агропромиздат, 1990, 320 с.

3. Методические рекомендации по выделению и идентификации штаммов вируса ящура /А.А. Гусев, В.М. Захаров, Ж.А. Шажко и др.; ФГУ "ВНИИЗЖ". - Владимир. 2002. - 31 с.

4. Методические рекомендации по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации /С.Р. Кременчугская, М.В. Жильцова, Т.К. Майорова; ФГБУ "ВНИИЗЖ". - Владимир: 2012. - 36 с.

5. Эпизоотологические особенности ящура типа А, вызванного гетерологичными штаммами вируса / А.В. Мищенко, В.А. Мищенко, В.В. Дрыгин [и др.] // Ветеринария. - 2014. - №11. - С. 20-24;

Изобретение относится к области биотехнологии и касается нового штамма вируса ящура Aphtae epizooticae типа А сем. Picornaviridae, рода Aphtovirus, депонированного в Коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №339 - деп/20-127 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» штамм A 2205/G - IV типа А вируса ящура. Представленный штамм репродуцируется в перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), в перевиваемой культуре клеток почки свиньи IBRS-2, в перевиваемой культуре клеток почки сирийского хомяка ВНК - 21/2-17 в течение 19-20,5 часов инкубирования, урожай вируса достигает значений 2,13±0,05 мкг/см³ общего вирусного белка, сохраняя исходные характеристики при пассировании в клеточной культуре на протяжении 5-10 пассажей. Представленный штамм может быть использован для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А и для контроля антигенной активности противоящурных вакцин. 4 табл., 2 пр.

Штамм вируса ящура Aphtae epizooticae типа А сем. Picomaviridae, рода Aphthovirus, вида Food-and-mouth disease virus, генотипа A/ASIA/G-IV, депонированный в Государственной коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №339 - деп/20-127 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» штамм «А 2205/G IV» типа А вируса ящура, для изготовления биопрепаратов для диагностики ящура типа А.