Штамм O N 2356/Пакистан/2018 вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа O/ME-SA/PanAsia2 для изготовления биопрепаратов для диагностики ящура Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 C12N7/00 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, может быть использовано для разработки и изготовления специфических средств для диагностики ящура генотипа O/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 и оценки антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин.

Ящур - высоко контагиозное, особо опасное заболевание сельскохозяйственных и диких парнокопытных животных, ежегодно наносящее огромный экономический ущерб во всем мире. Ящур относится к «трансграничным инфекциям», способным к быстрому распространению независимо от национальных границ, имеющим большую экономическую значимость и влияющих на торговлю и продовольственную безопасность стран.

Возбудитель характеризуется выраженной антигенной вариабельностью. Существует 7 типов вируса ящура (О, А, С, Азия-1, SAT-1, SAT-2, SAT-3) и множество топотипов - устойчивых генетических групп (линий), в пределах каждой из которых различают многочисленные линии вируса ящура, отличающиеся по генетическим и антигенным свойствам [1].

В настоящее время тип О является очень распространенным во всем мире. Вспышки, вызванные вирусом ящура (далее ВЯ) типа О, ежегодно регистрируют в странах Азиатско-Тихоокеанского региона, Центральной Азии, Среднего Востока, в том числе граничащих с Российской Федерацией.

На территории Российской Федерации вспышки ящура имеют спорадический характер и вызваны заносом возбудителя с территории сопредельных стран, так как отдельные регионы РФ граничат с эндемичными по ящуру странами - Китаем, Монголией и подвержены очень высокой степени риска заноса инфекционного агента с территории данных государств [6].

В связи с этим, особое значение представляет изучение эпизоотических изолятов вируса ящура, отобранных от больных животных на территории стран, неблагополучных по ящуру, граничащих с РФ, либо имеющих тесные экономические и социальные связи. Наибольшую опасность представляет ящур, обусловленный вирусом, отличающимся в антигенном отношении от производственных штаммов. Распространение ящура, вызванного антигенно измененным возбудителем, может затруднить диагностику болезни, усложнить купирование очагов ящура, снизить или полностью аннулировать эффективность профилактической вакцинации.

Одним из свойств вируса ящура является непрерывная антигенная изменчивость внутри типов возбудителя данного заболевания, в процессе которой возникает замена аминокислот в полипептидных фрагментах (антигенных эпитопах), экспонированных на поверхности капсидных белков вирусных частиц. Изменчивость вируса в пределах одного генотипа приводит к возникновению новых изолятов, которые отличаются по степени вирулентности и иммуногенности от ранее выделенных штаммов вируса ящура. Антигенная изменчивость широко выражена у вируса ящура типа О, что приводит к проблемам в штаммоспецифической диагностике изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых диагностических средств.

В Российской Федерации вспышки ящура типа О регистрировались начиная с 2000 по 2021 гг. на территории Приморского, Хабаровского, Забайкальского краев, Амурской, Оренбургской областей, Республики Башкирия. Вспышки болезни были вызваны вирусом ящура типа О, генотипов: O/SEA/Mya-98, O/ME-SA/PanAsia, O/ME-SA/Ind-2001.

В настоящее время известны штаммы вируса ящура типа О, которые применяются для производства средств диагностики ящура:

- штамм вируса ящура O1 Маниса (генотип O/SEA/Mya-98);

- штамм вируса ящура О №1734/Приморский/2000 (генотип О/МЕ-SA/PanAsia),

- штамм вируса ящура О №2147/Приморский/12 (генотип O/ME-SA/PanAsia),

- штамм вируса ящура О №2212/Приморский/14 (генотип O/SEA/Mya-98),

- штамм вируса ящура О №2311/Забайкальский/2016 (генотип O/ME-SA/Ind-2001),

- штамм вируса ящура О №2047/Саудовская Аравия/2008 (генотип О/МЕ-SA/PanAsia2).

Для изготовления высокоспецифичных и высокочувствительных диагностических тест-систем для выявления вируса ящура генотипа О/МЕ-SA/PanAsia2 применяется производственный штамм О №2047/Саудовская Аравия/2008, однако, в последние годы в странах Юго-Восточной Азии и Ближнего Востока стали возникать вспышки ящура, вызванные новым генотипом O/ME-SA/PanAsia2^ANT-10. При этом известные штаммы, в том числе О №2047/Саудовская Аравия/2008, не дают возможности создать высокоспецифичных и высокочувствительных тест-систем для проведения диагностики ящура, причиной которого являются изоляты, относящиеся к генотипу вируса O/ME-SA/PanAsia2^ANT-10.

В 2018 г. на территории Исламской Республики Пакистан от крупного рогатого скота с клиническими признаками ящура был отобран патологический материал, который поступил для научных исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ». Изолят вируса ящура «О РК18/12», послуживший источником для получения штамма О №2356/Пакистан/2018, был выделен в культуре клеток IB-RS-2. По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей, выделенный изолят принадлежит к вирусу ящура типа О топотипа ME-SA генетической линии PanAsia 2 новой су 6 линии ANT-10.

Настоящее изобретение путем получения штамма О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура для изготовления биопрепаратов для диагностики ящура генотипа O/ME-SA/PanAsia2^ANT-10, позволит расширить арсенал производственных штаммов вируса ящура типа О, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде, пригодный для изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностических тест-систем для диагностики вируса ящура в «полевых» пробах биологического/патологического материала и получения диагностических препаратов для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин.

Штамм О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №415 - деп / 22-49 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура для изготовления биопрепаратов для диагностики ящура генотипа O/ME-SA/PanAsia2^ANT-10.

Сущность изобретения отражена на графическом изображении:

Фиг. 1. - Представлена дендрограмма, отражающая филогенетические взаимоотношения штамма О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура с эпизоотическими изолятами и вакцинными штаммами вируса ящура серологического типа О. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP₁.

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP₁ штамма О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура генотипа О/МЕ-SA/PanAsia2^ANT-10;

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP1 штамма О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура генотипа О/МЕ-SA/PanAsia2^ANT-10.

Штамм О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами:

Морфологические признаки

Штамм О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура относится к семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, типу О и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 23-24 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура относится к генотипу O/ME-SA/PanAsia2^ANT-10. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной сывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP₁ штамма О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура принадлежит к генотипу О/МЕ-SA/PanAsia2^ANT-10 (Фиг. 1).

Антигенное родство (r₁) штамма О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура изучено в его перекрестном исследовании в РМН с референтными, моновалентными сыворотками, полученными на производственные штаммы вируса ящура:

- штамм вируса ящура O1 Манисса (генотип O/SEA/Mya-98);

- штамм вируса ящура О №1734/Приморский/2000 (генотип О/МЕ-SA/PanAsia),

- штамм вируса ящура О №2147/Приморский/12 (генотип О/МЕ-SA/PanAsia),

- штамм вируса ящура О №2212/Приморский/14 (генотип O/SEA/Mya-98),

- штамм вируса ящура О №2311/Забайкальский/2016 (генотип О/МЕ-SA/Ind-2001),

- штамм вируса ящура О №2047/Саудовская Аравия/2008 (генотип О/МЕ-SA/PanAsia2).

Титр референтных сывороток крови, полученных путем иммунизации КРС моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура типа О, против 100 ТЦЦ₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса ящура [4].

Значение r₁ в РМН интерпретировали:

при ≥ 0,3 - исследуемый и производственный штаммы ВЯ являются близкородственными;

при < 0,3 - исследуемый образец штамма ВЯ отличается от производственного штамма.

Показатели антигенного родства при изучении штамма О №2356/Пакистан/2018 составили r₁ от 0,14 до 0,26, что свидетельствует об отсутствии антигенного родства штамма О №2356/Пакистан/2018 в отношении производственных штаммов вируса ящура (табл. 1).

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 8,08×10⁶ Д.

Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP_66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов. Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10^-18 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура устойчив к детергентам и органическим растворителям, таким как эфир, хлороформ, фреон, ацетон. Наиболее стабилен при рН 7,4-7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Штамм чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38°С). Устойчив к низким температурам. Оптимальная температура хранения вируса минус 40-70°С.

Дополнительные признаки и свойства:

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для домашних и диких парнокопытных животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Биотехнологические характеристики

Штамм О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомяка (ВНК-21).

При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура в перевиваемых культурах клеток IB-RS-2, ПСГК-30, ВНК-21. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой культуре клеток IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных - крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исследований, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Оценка биологических свойств штамма О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура при репродукции в монослойных перевиваемых клеточных культурах

Для выделения штамма О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура из пробы патологического (афтозного) материала с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических и вирусологических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [3].

Выделение вируса ящура проводили в монослойных перевиваемых клеточных линиях ПСГК-30, IB-RS-2, ВНК-21 с последующей адаптацией к данным культурам клеток на протяжении 5 последовательных пассажей. Культуры клеток выращивали на питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 25 см². Перед применением культуру клеток отмывали от ростовой среды и инакулировали 10%-ную суспензию афтозного материала, приготовленную в растворе Хэнкса с 0,5% гидролизата лактальбумина (ГЛА) и антибиотиками по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов афтозную суспензию предварительно обрабатывали 10%-ным раствором трихлорметана. После контакта вируса ящура с клеточной культурой в течение 30 мин при температуре 37±0,5°С во флаконы вносили по 5 см³ соответствующей каждой культуре клеток, поддерживающей среды и инкубировали при температуре 37±0,5°С до появления цитопатического действия (ЦПД) в клеточном монослое. При наличии ЦПД не менее чем у 90% клеток (округление клеток, повышение их оптической плотности, дегенерация и отделение клеток от поверхности стенки флакона), флаконы с вирусным материалом подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси трихлорметаном и центрифугированию при скорости 3000 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующего пассажа. Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение не менее 24 часов проявлялось 90-100% ЦПД в монослое культуры клеток. Адаптация штамма О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура к различным клеточным линиям наступала на уровне пятого пассажа. Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 2.

Пример 2. Изучение биологических свойств, определение инфекционной активности штамма О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура на крупном рогатом скоте и получение диагностического препарата для оценки протективной активности противоящурных вакцин

Для изучения биологических свойств штамма О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура, крупному рогатому скоту (КРС) интрадермалингвально инокулировали культуральную вирусную суспензию в 4 точки в объеме 0,1 см³. Проявление клинических признаков ящура учитывали по наличию афтозных поражений. При проведении первого пассажа видимые и хорошо сформированные первичные афты, характерные для ящура, в ротовой полости у КРС наблюдали через 28 часов после заражения. Сформировавшиеся в ротовой полости КРС афты отбирали для получения вируссодержащей суспензии. Для получения II пассажа КРС интрадермалингвально вводили 10%-ю вирусную суспензию, полученную из афтозного материала первого пассажа. При проведении второго пассажа, клинические признаки ящура у КРС появились через 21 час после заражения.

Диагностический препарат штамма О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура для оценки иммуногенной активности противоящурной вакцины получали путем отбора афт II пассажа. С целью определения инфекционной активности штамма О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура из афт II пассажа получали 10%-ную вирусную суспензию на ФБР с равным объемом стерильного глицерина, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения с применением фосфатного буферного раствора (рН 7,4-7,6). Подготовленные разведения с 10^-2 по 10^-6 вводили интрадермолингвально в 4 точки на разведение препарата, по 0,1 см³ двум КРС. Учет результатов титрования проводили через 24 ч по наличию афт на месте введения разведений вируса. Титр инфекционной активности для КРС диагностического препарата штамма О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура (II пассаж) в виде 10%-ной вирусной суспензии из афт КРС на ФБР с глицерином составил 6,25 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 3. Изучение биологических свойств, определение инфекционной активности штамма О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура на свиньях и получение диагностического препарата для оценки иммуногенной активности противоящурных ветеринарных препаратов

Исследование биологических свойств штамма О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура проводили путем внутрикожного заражения свиней культуральной суспензией ВЯ штамма №2356/Пакистан/2018 в область венчика передних конечностей. Адаптацию штамма О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура на свиньях осуществляли в течение 2 последовательных пассажей. Видимые и хорошо сформированные первичные афты, характерные для ящура, на месте введения вируса наблюдали через 24 часа после заражения.

Диагностический препарат штамма О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура для оценки иммуногенной активности противоящурной вакцины для свиней получали путем отбора афт II пассажа. С целью определения инфекционной активности адаптированного штамма из афт II пассажа на свиньях получали 10%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения с применением ФБР (рН 7,4-7,6). Подготовленные разведения с 10^-2 по 10^-6 вводили внутрикожно в венчики копытец по 0,1 см³ в 4 точки на каждый палец конечности одного разведения, из расчета 1 разведение на 2 копытца одной конечности каждому из 2 подопытных подсвинков.

Учет результатов титрования проводили через 24 ч по наличию афт на месте введения разведений вирусной суспензии. Титр инфекционной активности диагностического препарата штамма вируса ящура О №2356/Пакистан/2018 (2 пассаж) в виде 10% вирусной суспензии из афт от свиней на ФБР с равным объемом глицерина составил 5,75 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 4. Исследование биологических свойств штамма О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура при репродукции в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH

Штамм О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура репродуцировали в суспензионной перевиваемой культуре клеток из почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH. В качестве поддерживающей среды использовали раствор Эрла, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого (ФГМС), гидролизата белков крови сухого (ГБКС) и антибиотиков при рН среды 7,50-7,65. Клеточную линию заражали вирусом из расчета 0,001-0,100 ТЦД₅₀/клетка.

Культивирование вируса осуществляли при температуре 37±1°С в течении 12-14 ч до достижения 90-100% цитопатического действия вируса в культуре клеток. После этого репродукцию вируса ящура прекращали, полученную суспензию контролировали на стерильность и содержание общего вирусного белка (ОВБ) и иммуногенного 146S компонента. Значения ОВБ, концентрации 146S компонента штамма О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура и титра его инфекционной активности составляли при средней концентрации клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, равной 4,10±0,20 млн клеток/см³, дозе заражения 0,005 ТЦД₅₀/клетка и продолжительности репродукции вируса 13,0±1,0 ч титр инфекционной активности возбудителя ящура штамма О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура (при тестировании в клеточной линии IB-RS-2) был равен 7,40±0,14 lg ТЦД₅₀/см³, по данным количественной РСК, концентрация ОВБ составила 3,15±0,12 мкг/см³, 146S компонента - 2,15±0,08 мкг/см³ (68,4%). Содержание 146S компонента также опосредованно исследовали экспресс-методом ОТ-ГЩР-РВ, с помощью которого определили, что концентрация полных вирусных частиц составила 3,10-3,13 мкг/см³, что коррелировало с данными реакции связывания комплемента.

Пример 5. Получение и оценка типовой специфичности и активности штаммоспецифического антигена штамма О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура для серологических исследований

Антиген штамма О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура для серологических реакций получали путем концентрирования инактивированной вируссодержащей суспензии, полученной на культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH. Полученную вируссодержащую суспензию концентрировали в 100 раз добавлением полиэтиленгликоля 8-10% от объема. Полученный концентрат фасовали во флаконы и высушивали методом сублимации под вакуумом.

Оценку типовой специфичности и активности антигена штамма О №2356/Пакистан/2018 ВЯ проводили в реакции связывания комплемента (РСК).

К полученному антигену штамма О №2356/Пакистан/2018, взятому в объеме 0,4 см³ в цельном виде и в разведениях 1:2, 1:4, 1:8, добавляли по 0,1 см³ гомологичной и гетерологичных гипериммунных сывороток, полученных на вирус ящура типов А, О, Азия-1 в рабочем (удвоенном) титре и 0,1 см³ комплемента в рабочем разведении. Смесь выдерживали в водяной бане в течение 20 мин при температуре 37°С. Затем вносили по 0,2 см³ гемолитической системы и выдерживали 30 мин при температуре 37°С. Положительный результат реакции соответствовал 100%-ной задержке гемолиза эритроцитов барана (++++ - «4 креста»). Параллельно проводили контрольные реакции без сыворотки, без комплемента и специфических компонентов реакции.

Результаты исследования типовой специфичности и активности штамма О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура в РСК представлены в таблице 3.

В РСК использовали сыворотки ящурные типоспецифические гипериммунные морских свинок, полученные на следующие производственные штаммы вируса ящура: А/Иран/05, O/ME-SA/PanAsia2, Азия-1/Шамир/89.

Таким образом, антиген штамма О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура обладает выраженной типовой специфичностью, относится к вирусу ящура генотипа O/ME-SA/PanAsia2^ANT-10, активен в РСК в разведении 1:8 с гипериммунной штаммоспецифической сывороткой и может применяться в качестве контрольного образца (положительный контроль) при проведении исследований по обнаружению антигена вируса ящура методом РСК в соответствии с ГОСТ 25384-82 [2].

Пример 6. Получение типоспецифической гипериммунной сыворотки для выявления антигена вируса ящура типа О методом РСК и ИФА

Для иммунизации морских свинок использовали антиген из штамма О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура, репродуцированный в монослойной культуре клеток ПСГК-30. Вируссодержащую суспензию концентрировали в 100 раз добавлением 8-10% полиэтиленгликоля (ПЭГ) м.м. 6000, очищали от балластных примесей добавлением 10% хлороформа. Очищенный вирус инактивировали аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) в концентрации 0,025-0,05% при значении рН 8,0-8,3.

Инактивированный концентрат антигена в смеси с равным объемом масляного адъюванта типа неполного адъюванта Фрейнда вводили морским свинкам в объеме 1,0 см³ внутримышечно. Через 21 и 7 дней проводили 2-ю и 3-ю иммунизацию и через 10 дней после последнего введения антигена животных обескровливали для получения сыворотки крови [5].

Индивидуальные пробы сыворотки крови проверяли на типовую специфичность и активность в РСК и ИФА в соответствии с методическими рекомендациями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [3].

После этого готовили серию диагностического препарата, путем смешивания типоспецифичных индивидуальных проб сыворотки одинаковой активности. Штаммовую специфичность серийного препарата определяли в одно- и двусторонних реакциях с гомо- и гетерологичными антигенами в реакции связывания комплимента (РСК) и методом иммуноферментного анализа (ИФА).

После консервирования азидом натрия (1:5000) полученную сыворотку фасовали во флаконы по 1,0 см³ и высушивали методом сублимации под вакуумом.

Способом, описанным выше, была изготовлена серия типоспецифической гипериммунной сыворотки, характеристика которой представлена в таблице 4.

Таким образом, полученная на штамм О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура типоспецифическая гипериммунная сыворотка специфична, активна с гомологичным антигеном в РСК в разведении 1:32 и в ИФА в разведении 1:1000 и может применяться в исследованиях по обнаружению антигена вируса ящура методом РСК в соответствии с ГОСТ 25384-82 [2].

Источники информации

1. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. / Под ред. А.Н. Бурдова. - М., Агропромиздат, 1990, 320 с.

2. ГОСТ 25384-82 Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики ящура.

3. Методические рекомендации по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура / С.Р. Кременчугская, С.Н. Фомина, А.В. Мищенко; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир, 2017. - 38 с.

4. Методические рекомендации по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации / С.Р. Кременчугская, М.В. Жильцова, Т.К. Майорова; ФГБУ "ВНИИЗЖ". - Владимир: 2012. - 36 с.

5. Методические рекомендации по получению штаммоспецифических гипериммунных поликлональных сывороток для диагностики ящура в ИФА /А.А. Фунтиков, Е.Н. Калинина, К.С. Малкова, С.Р. Кременчугская, С.Н. Фомина/ ФГБУ «ВНИИЗЖ» - Владимир: 2019. - 49 с.

6. Филогенетическая характеристика изолятов вируса ящура типа О, выделенных в Российской Федерации / Д.А. Лозовой, А.В. Щербаков, В.М. Захаров, С.Н. Фомина // Ветеринария. - 2018. - №5. - С 3-8.

--->

Перечень последовательностей

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="FMDV strain O 2356

Pakistan 2018.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.1.2" productionDate="2022-11-08">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-11-08</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>470</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-11-08</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI &quot;ARRIAH&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Фомина Светлана

Николаевна</InventorName>

<InventorNameLatin>Fomina S.N.</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Штамм О №2356/Пакистан/2018 вируса

ящура типа О для специфической диагностики ящура </InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>639</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..639</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accacctccacaggtgagtcagctgaccccgtgactgccactgttgaaa

actacggtggtgaaacacaggtccagagacgccagcacacggacgtctcgttcatattggacagatttgt

gaaagtaacaccaaaagaccaaattaatgtgttggacctgatgcaaacccctgctcacactttggtgggc

gcactccttcgcaccgccacatactacttcgcagatttagaggtggcagtgaagcacgaggggaacctca

cttgggtccccaacggggcgcccgaggcagcgttggacaacaccaccaatccaacggcttaccacaaggc

accgctcactcgtcttgcactaccctacacggcaccacaccgtgtcttggccaccgtttacaacggggct

tgcaagtacagcgagagccatgcaaccaatgtgagaggagatttgcaagtgttggcccaaaaggcagcga

gggcattacctacttccttcaactacggtgccatcaaagctacccgggtgaccgaactgctttaccgcat

gaagagggctgaaacatactgcccccgacctcttctggccatccacccgagtgaagcaagacacaagcaa

aagatagtggcacctgtaaaacaactcctg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>213</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..213</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSTGESADPVTATVENYGGETQVQRRQHTDVSFILDRFVKVTPKDQIN

VLDLMQTPAHTLVGALLRTATYYFADLEVAVKHEGNLTWVPNGAPEAALDNTTNPTAYHKAPLTRLALPY

TAPHRVLATVYNGACKYSESHATNVRGDLQVLAQKAARALPTSFNYGAIKATRVTELLYRMKRAETYCPR

PLLAIHPSEARHKQKIVAPVKQLL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, и касается нового штамма вируса ящура Aphtae epizooticae типа О семейства Picornaviridae, рода Aphthovirus, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №415 - деп / 22-49 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ». Представленный штамм репродуцируется в перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30, в перевиваемой культуре клеток почки свиньи IBRS-2, сохраняя исходные характеристики при пассировании в клеточной культуре на протяжении 5 пассажей. В перевиваемой культуре клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH, при инкубировании в течение 12-14 часов титр инфекционной активности штамма О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура равен 7,40±0,14 lg ТЦД₅₀/см³, концентрация общего вирусного белка составляет 3,15±0,12 мкг/см³, 146S компонента - 2,15±0,08 мкг/см³ (68,4%). Штамм О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура при изучении на восприимчивых животных показал высокую инфекционную активность, которая на КРС составила 6,25 lg ИД₅₀/0,1 см³, на свиньях - 7,75 lg ИД₅₀/0,1 см³. Представленный штамм может быть использован для изготовления биопрепаратов для диагностики ящура генотипа O/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 и для контроля антигенной активности противоящурных вакцин. 1 ил., 4 табл., 6 пр.

Штамм О №2356/Пакистан/2018 вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа O/ME-SA/PanAsia2^ANT-10, семейства Picornaviridae, род Aphthovirus, депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №415 - деп / 22-49 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» и предназначенный для изготовления биопрепаратов для диагностики ящура.