ОКИСЛЕННЫЕ КАРОТИНОИДЫ И ИХ КОМПОНЕНТЫ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ НЕКРОТИЧЕСКОГО ЭНТЕРИТА Российский патент 2021 года по МПК A61K31/12 A61P1/00 A61P31/00 A23K10/10 

Ссылка на родственные заявки

Согласно настоящей заявке испрашивается преимущество и приоритет в соответствии с предварительной заявкой на выдачу патента США №62/153587, поданной 28 апреля 2015 г. и имеющей название "Применение полностью окисленного бета-каротина и способы профилактики некротического энтерита" ("Use of Fully Oxidized Beta Carotene and Methods for Preventing Necrotic Enteritis"). Все из указанных ссылок полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.

Область техники

Настоящее изобретение относится к применению окисленных каротиноидов, таких как окислительно трансформированные каротиноиды, такие как полностью окисленные каротиноиды, такие как бета-каротин ("ОхВС"), их компоненты и сополимеры каротиноида и кислорода и содержащие их композиции и/или продукты, для профилактики и/или снижения риска развития некротического энтерита (NE) и уменьшения интенсивности ассоциированных состояний, таких как ассоциированные состояния желудочно-кишечного тракта. Настоящее изобретение также относится к связанным с ними способам, применениям и наборам.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Некротический энтерит

Некротический энтерит (NE) часто встречается у сельскохозяйственной птицы, такой как куры, утки и индейки. Чаще всего он встречается у цыплят-бройлеров в возрасте приблизительно 2-5 недель или у племенных кур и кур-несушек в возрасте приблизительно 12-16 недель, но также может встречаться у других животных, таких как лошади, овцы, свиньи, крупный рогатый скот и рыба. Он может вызывать внезапную смерть с клиническими признаками или без них или потерю жизнеспособности, сниженную эффективность использования кормов, потерю аппетита и потребления корма, сниженный прирост массы или потерю массы, диарею, многоочаговую гиперемию, кровотечения тонкой кишки, тонкостенный кишечник, сливной некроз слизистой, внезапную смерть, увеличенную смертность, сниженную скорость и однородность роста. Основной патоген, ассоциированный с NE, представляет собой Clostridium perfringens. Провоцирующие факторы включают в себя без ограничения воздействия окружающей среды, подавление иммунного ответа, сопутствующий кокцидиоз, вызванный инфекцией видов Eimeria, состав рациона, недостаток питания, бактериоцины, коллагенолитические ферменты и факторы адгезии и производящие токсины штаммы, такие как Clostridium perfringens.

Как указано выше, некротический энтерит (NE) был обнаружен у многих животных, включая в себя различных птиц, таких как сельскохозяйственные птицы. Он широко встречается у коммерческих кур-бройлеров, если их выращивают без применения противомикробных стимуляторов роста.

Коэффициент заболеваемости NE на фермах по производству бройлеров без антибиотиков выросла с 13,6% в 2008 г. до приблизительно 97,3% в 2011 г. (Н-K Jang, Chonbuk National University).

Clostridium Perfringens

В здоровых популяциях кур-бройлеров С. perfringens часто находится в диапазоне от 10² до 10⁴ колониеобразующих единиц (CFU) на грамм кишечного содержимого тонкой кишки с содержаниями, потенциально зависящими от одноразового или кумулятивного бактериального заражения. Содержание С. perfringens у пораженных NE птиц является повышенным - начиная с нормы у здоровых птиц, когда оно начинает становиться неуравновешенным, а затем логарифмически нарастает, иногда достигая 10⁷ колониеобразующих единиц (CFU) на грамм или больше к моменту достижения ими рыночной массы.

Современные способы лечения включают в себя применение таких антибиотиков, как пенициллины (например, феноксиметил пенициллин, амоксициллин), которые можно поместить в питьевую воду, или бацитрацин в корме (например, 100 ppm). Также иногда используют неомицин и эритромицин. Курс лечения, например, для находящегося в воде препарата, как правило, составляет 3-5 дней и для находящегося в корме препарата - 5-7 дней в зависимости от тяжести.

Такие антибиотики, как пенициллин и бацитрацин, также использовали в корме в качестве профилактического средства.

Во многих странах государственная нормативно-правовая база и рыночные условия препятствуют общепринятому применению многих антибиотиков, а применение не содержащих антибиотиков кормов является тенденцией. По этой причине тенденцией является и рост NE.

Существует потребность минимизировать эффекты NE, например, у кур-бройлеров, например, путем защиты их от инфекции (например, для профилактики NE) или снижения содержаний бактерий С. perfringens.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Согласно некоторым аспектам настоящее изобретение относится к способу применения окисленных каротиноидов или содержащих окисленный каротиноид композиций или продуктов, таких как окислительно трансформированные каротиноиды, полностью окисленные каротиноиды, их компоненты и сополимеы каротиноида и кислорода и содержащие их композиции и/или продукты, для профилактики и/или снижения риска развития некротического энтерита (NE) и уменьшения интенсивности ассоциированных состояний, таких как ассоциированные состояния желудочно-кишечного тракта. Согласно некоторым аспектам содержащие полностью окисленный каротиноид продукты выбраны из группы, содержащей следующее: полностью окисленный бета-каротин (ОхВС), полностью окисленный ликопин, OxLyc; полностью окисленный лютеин, OxLut; и полностью окисленный кантаксантин, OxCan. Согласно другим аспектам также используют сополимеры каротиноида и кислорода и содержащие их композиции или продукты. Согласно другим аспектам настоящее изобретение относится к применению вышеупомянутых окисленных каротиноидов и композиций для профилактики NE и/или минимизации его эффектов или ассоциированных состояний, например, путем снижения содержаний и/или профилактики увеличения или поддержания низких содержаний бактерий С. perfringens для минимизации эффекта или снижения риска развития NE или ассоциированных состояний. Согласно одному варианту осуществления окисленные каротиноиды и композиции согласно настоящему изобретению не показывают бактерицидных или бактериостатических или противомикробных/антибактериальных свойств. Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения или содействия лечению NE. В частности, согласно некоторым аспектам настоящее изобретение описывает способ применения окисленных каротиноидов, таких как окислительно трансформированные каротиноиды, такие как полностью окисленные каротиноиды, такие как полностью окисленный бета-каротин (ОхВС), их компоненты и сополимеры каротиноида и кислорода и содержащие их композиция и/или продукты, для профилактики субклинических инфекций с NE - заболеванием, которое может нелегко обнаруживаться владельцем птицеводческого предприятия, но все же оказывает негативное влияние на здоровье птиц, например, может наблюдаться в сниженном потреблении корма, сниженной эффективности использования кормов или отрицательных оценках здоровья кишечника.

Согласно другим аспектам настоящее изобретение относится к окислительно трансформированным каротиноидам, таким как полностью окисленные каротиноиды, их компоненте и сополимеры каротиноида и кислорода и содержащий их композицит и/или продукты, для устойчивости к NE и ассоциированным состояниям, выздоровления от него или его преодоления или поддержания здорового состояния с учетом воздействия или потенциального воздействия ассоциированного с NE возбудителя, такого как С. perfringens.

Согласно другим аспектам настоящее изобретение относится к композициям, добавкам, премиксам, кормам (или другим кормовым продуктам), и наборам, содержащим окисленные каротиноиды, окислительно трансформированные каротиноиды, такие как полностью окисленные каротиноиды, такие как полностью окисленный бета-каротин (ОхВС), их компоненты и сополимер каротиноида и кислорода и содержащие их композиции и/или продукты, и способам и применениям для профилактики и/или минимизации эффекта NE или ассоциированных состояний, например, путем снижения содержаний бактерий С. perfringens и/или профилактики увеличения или поддержания низких содержаний бактерий С. perfringens для минимизации эффекта или снижения риска развития NE или ассоциированных состояний.

Дополнительные аспекты и преимущества настоящего изобретения станут очевидными, принимая во внимание представленное ниже описание. Тем не менее следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, наряду с тем что они указывают на предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, приведены только для иллюстрации, поскольку различные изменения и модификации в пределах сущности и объема настоящего изобретения станут очевидными специалистам в настоящей области техники из настоящего подробного описания.

Краткое описание фигур

Настоящее изобретение ниже будет описано по отношению к графическим материалам, на которых:

На фигуре 1 проиллюстрированы макроскопические поражения кишечника, являющиеся результатом NE, с использованием известного способа оценки их тяжести в баллах, где: "0" отсутствие обширного поражения; "1" представляет собой тонкостенную или рыхлую тонкую кишку и многоочаговую гиперемию и кровотечения; "2" представляет собой диссеминированную тяжелую гиперемию и кровотечения и фокальный некроз или изъязвление; "3" представляет собой тонкостенный кишечник, тяжелый некроз, сливной некроз слизистой оболочки; и "4" представляет собой тонкостенный кишечник, обширный некроз, отслоение слизистой оболочки.

Фигура 2. Анализ GPC (гель-проникающая хроматография) полностью окисленного β-каротина, ликопина, кантаксантина и лютеина. (А) ОхВС, (В) OxLyc, (С) OxCan и (D) OxLut. Поглощение УФ излучения подвергали мониторингу при 220-400 нм. Если они показаны, вертикальные линии соответствуют времени элюирования полиэфирных стандартов молекулярной массы (показаны выбранные маркеры). Граница пропускания колонки составляет приблизительно 10000 Да. Острый пик при приблизительно 5 мин в GPC OxLyc указывает на присутствие полимеров с молекулярными массами > 10000 Да.

Фигура 3. Спектры FTIR (инфракрасная спектроскопия на основе преобразования Фурье) (А) ОхВС, (В) OxLyc, (С) OxCan и (D) OxLut, полученные с использованием либо дисков NaCl и литья пленки из раствора CHCl₃, либо дисков KBr.

Фигура 4. Определение экспрессии рецептора CD 14 по отношению к ОхВС (А) полностью окисленного ликопина (OxLyc), и (В) фракций полимера ОхВС и мономера норизопреноида. Клетки ТНР-1 обрабатывали в течение 24 часов с указанными концентрациями соединений.

Подробное описание настоящего изобретения

"Животное" означает любого животного, предрасположенного к NE, включая в себя без ограничения людей, собак, кошек, лошадей, овец, свиней, крупный рогатый скот, сельскохозяйственную птицу (включая в себя без ограничения кур (таких как бройлер и несушки), утки и индейки) и рыбу.

"Количество, достаточное" или "эффективное количество" означает количество окисленных каротиноидов, таких как окислительно трансформированный каротиноид, или полностью окисленный каротиноид, или полимер каротиноида и кислорода, или их фракционированный(е) компонент(ы), или содержащие их композиции, необходимое для профилактики и/или усиления способности противостоять NE и ассоциированным состояниям, выздоравливать или преодолевать их или поддерживать здоровое состояние с учетом воздействия или потенциального воздействия ассоциированного с NE возбудителя, такого как С. perfringens. Эффективное количество окисленного каротиноида или композиции согласно настоящему изобретению, используемое для осуществления на практике способов согласно настоящему изобретению, варьирует в зависимости от способа введения, типа животного, массы тела и общего состояния здоровья животного. В конечном итоге, осуществляющий лечение медицинский специалист, такой как врач, или ветеринар, или специалист по уходу за животными (включая в себя фермеров, техников, специалистов, хорошо осведомленных или обладающих навыками в настоящей области техники) примет решение в отношении соответствующего количества и режима введения доз. Такое количество носит название "количество, достаточное" или "эффективное количество".

"Ассоциированные с некротическим энтеритом состояния" включают в себя без ограничения симптомы или патологии желудочно-кишечного тракта, такие как сниженный аппетит, сниженная скорость прироста массы, сниженная эффективность использования кормов или поражения кишечника.

Используемый в настоящем документе термин "каротиноид" относится к встречающимся в природе пигментам терпеноидной группы, которые можно обнаружить в растениях, водорослях, бактериях и у определенных животных, таких как птицы и моллюски. Каротиноиды включают в себя без ограничения каротины, которые представляют собой углеводороды (т.е. не содержащие кислород) и их кислородсодержащие производные (т.е. ксантофиллы). Примеры каротиноидов включают в себя ликопин; α-каротин; γ-каротин; β-каротин; зеаксантин; эхиненон; изозеаксантин; астаксантин; кантаксантин; лютеин; цитранаксантин; сложный этиловый эфир β-апо-8'-каротиновой кислоты; такие гидроксикаротиноиды, как аллоксантин, апокаротенол, астацин, астаксантин, капсантин, капсорубин, каротиндиолы, каротинтриолы, каротенолы, криптоксантин, β-криптоксантин, декапреноксантин, эпилютеин, фукоксантин, гидроксикаротеноны, гидроксиэхиненоны, гидроксиликопин, лютеин, ликоксантин, нейроспорин, фитоен, фитофлюоен, родопин, сфероиден, торулен, виолаксантин и зеаксантин; и карбоновые каротиноиды, такие как апокаротиновая кислота, β-апо-8'-каротиновая кислота, азафрин, биксин, карбоксилкаротины, кроцетин, диапокаротиновая кислота, нейроспораксантин, норбиксин и ликопеноевая кислота.

Используемые в настоящем документе термины "сополимер каротиноида и кислорода", "сополимер каротиноида" и "полимер" относятся к каротиноиду, который представляет собой непредельное соединение, которое было окислено на своих реакционноспособных двойных связях путем самопроизвольной реакции с молекулярным кислородом, давая в результате сополимеры каротиноида с кислородом в качестве основного продукта и который отделен и выделен из своих побочных продуктов - норизопреноидов.

Используемый в настоящем документе термин "содержащий" является синонимом "включая в себя", и они являются включающими или неограничивающими и не исключают дополнительные, не перечисленные элементы или стадии способов.

Используемый в настоящем документе термин "состоящий из" является ограничивающим и, при условии соблюдения доктрины эквивалентов, исключает какой-либо элемент, стадию или ингредиент, не указанные в пункте формулы изобретения.

Используемый в настоящем документе термин "полностью окисленный каротиноид" относится к каротиноиду, который представляет собой непредельное соединение, которое было полностью окислено на своих реакционноспособных двойных связях путем самопроизвольной реакции с молекулярным кислородом, давая в результате смесь сополимеров каротиноида с кислородом и норизопреноидных продуктов разложения. Согласно некоторым аспектам полностью окисленный каротиноид можно выбрать из ОхВС, полностью окисленного В-каротина; OxLyc, полностью окисленного ликопина; OxLut, полностью окисленного лютеина; и ОхСап, полностью окисленного кантаксантина, полученных путем окисления выделенного исходного каротиноида, которые называются «полученные синтетически» в отличие от «полученных из природного источника» продуктов).

"Полностью окисленный бета-каротин" ("ОхВС" - который также иногда называется в литературе по бренду Avivagen Inc. OxC-beta™) представляет собой сложную смесь продуктов, образованных путем полного, самопроизвольного окисления β-каротина, и содержит преобладающее количество соединений - сополимеров β-каротина и кислорода. Используемый в настоящем документе термин относится к композиции полностью окисленного каротиноида, полученного из синтетического, коммерческого продукта чистого В-каротина, содержащего приблизительно 85% по массе сополимеров β-каротина и кислорода и приблизительно 15% низкомолекулярных продуктов разложения, носящих название норизопреноиды.

Используемый в настоящем документе термин "природный" или "полученный из природного источника" относится к растительным источникам (включая в себя растения или их части, причем их части могут включать в себя без ограничения семена, листья и стебли, фрукты и овощи) или микроорганизмы. "Природный продукт" или "полученный из природного источника продукт" относится к продуктам, полученным путем обработки природных источников окисленных каротиноидов, таким как сополимеры каротиноида и кислорода и содержащие их композиции. Их получают путем обработки природных источников при условиях окислительной полимеризации. Такие природные источники могут включать в себя, но не обязательно ограничиваются следующим: морковь, томаты, люцерна, спирулина, шиповник, сладкий перец, перец чили, паприка, сладкий картофель, кормовая капуста, шпинат, водоросли, пырей, календула, моринга масличная и красное пальмовое масло.

"Окислительно трансформированный каротиноид" относится к каротиноиду, который прореагировал с вплоть до 6-8 молярными эквивалентами кислорода или эквивалентным количеством кислорода от другого окисляющего средства, давая в результате смесь продуктов окислительного расщепления с очень низкой молекулярной массой и большую часть олигомерного материала (т.е. компонента окислительно трансформированного каротиноида, характеризующегося медианной молекулярной массой, составляющей приблизительно 900 Да). Полученная реакция производит смесь, которая включает в себя молекулярные виды, характеризующиеся молекулярными массами, находящимися в диапазоне, составляющем от приблизительно 100 до 8000 Да. Считают, что олигомерный материал образован с помощью многочисленных возможных химических рекомбинаций различных образующихся при окислении фрагментов. Способы получения окислительно трансформированного каротиноида описаны в патенте США №5475006 и заявке на выдачу патента США №08/527039, которые включены в настоящий документ посредством ссылки.

Используемый в настоящем документе термин "окисленный каротиноид" включает в себя каротиноид, который был окислен, такой как "окислительно трансформированный каротиноид", "полностью окисленный каротиноид" и "сополимер каротиноида и кислорода" и их компоненты, которые приводят к требуемым активностям, дают в результате содержащие их композиции и продукты, такие как продукты и композиции, содержащие сополимер каротиноида и кислорода.

"Фармацевтическая композиция" означает композицию, содержащую окисленные каротиноиды, окислительно трансформированный каротиноид, полностью окисленный каротиноид или их фракционированный компонент или сополимер каротиноида и кислорода или содержащий сополимер каротиноида и кислорода продукт, и составленную с одним или несколькими вспомогательными веществами фармацевтической квалификации таким способом, который соответствует требованиям государственного органа, регулирующего производство и продажу фармацевтических средств как часть терапевтической схемы лечения или профилактики заболевания у млекопитающего (например, произведенная согласно требованиям GMP (Надлежащая практика организации производства) и подходящая для введения человеку). Фармацевтические композиции можно составить, например, для перорального введения в единичной лекарственной форме (например, таблетке, капсуле, капсуловидной таблетке, желатиновой капсуле или сиропе); для местного введения (например, в виде крема, геля, лосьона или мази); для внутривенного введения (например, в виде стерильного раствора, не содержащего дисперсных эмбол и в системе растворителей, подходящей для внутривенного применения); или в любом другом составе, описанном в настоящем документе.

"Каротиноиды - провитамин А" или "PVA" относятся к тем каротиноидам, а именно α-, β- и γ-каротинам и β-криптоксантину, которые способны превращаться путем окисления в витамин A. "OxPVA" относится к окисленным каротиноидам - провитамину А.

"Лечение" относится к введению композиции для профилактических и/или терапевтических целей. "Профилактика заболевания" относится к профилактическому лечению животного, которое еще не заболело, но которое предрасположено или иным образом подвержено риску конкретного заболевания. "Лечение заболевания" или применение для "терапевтического лечения" относится к введению лечения животному, уже страдающему от заболевания для улучшения или стабилизации состояния животного. Таким образом, в пунктах формулы изобретения и вариантах осуществления настоящего изобретения лечение представляет собой введение животному либо для терапевтических, либо профилактических целей. Терапию согласно настоящему изобретению можно проводить отдельно или в сочетании с другой терапией. Используемый в настоящем документе термин "подверженный риску" относится к животным, склонным к слабому здоровью, заболеванию, восприимчивости к инфекциям, проблемам с подвижностью суставов, сниженным уровням активности и/или плохому качеству шерсти.

Окисленные каротиноиды

Различные благоприятные эффекты на здоровье приписываются употребляемым в пищу каротиноидам. Некоторые являющиеся провитамином А каротиноиды, включая в себя α- и β-каротины и β-криптоксантин, обеспечивают благоприятные эффекты, связанные с их относящимися к витамину А активностями. Тем не менее не так легко объяснить другие, не относящиеся к витамину А благоприятные эффекты как являющихся провитамином А каротиноидов, так и других каротиноидов, которые не могут превращаться в витамин А.

Каротиноиды представляют собой желтые, оранжевые и красные пигменты, синтезируемые растениями. Существует свыше 600 известных каротиноидов, которые состоят из двух классов, называемых каротины, которые представляют собой исключительно углеводороды, и ксантофиллы, которые представляют собой каротины, замещенные одним или несколькими атомами кислорода. β-Каротин и ликопин представляют собой примеры распространенных каротинов, тогда как лютеин, зеаксантин и кантаксантин представляют собой распространенные примеры ксантофиллов. Наиболее распространенные каротиноиды в рационах жителей Северной Америки представляют собой α-каротин, β-каротин, β-криптоксантин, лютеин, зеаксантин и ликопин.

Все каротиноиды образованы из 8 изопреновых звеньев, и каждая молекула каротиноида содержит 40 атомов углерода. Структурно каротиноиды принимают форму полиеновой углеводородной цепи, которая иногда заканчивается на одном или обоих концах кольцом. Каротиноиды, которые содержат незамещенные β-иононовые кольца (включая в себя β-каротин, α-каротин, β-криптоксантин и γ-каротин), обладают активностью витамина А (что означает, что они могут превращаться в ретиналь). Напротив, лютеин, зеаксантин и ликопин не характеризуются активностью витамина А.

На протяжении долгих лет было принято, что не относящиеся к витамину А активности объясняли действиями самого каротиноида, часто в качестве антиоксиданта. Тем не менее недавнее исследование ставит под сомнение роль антиоксиданта, по меньшей мере в отношении ингибирования канцерогенеза, и указывает на работу других механизмов.

Хотя давно известно, что добавление кислорода по своей природе благоприятствует самопроизвольному окислению в высокой степени непредельных соединений, преобладающее участие и значимость окислительной полимеризации каротиноидов неожиданно оставались незамеченными до публикаций авторов настоящего изобретения (также см. патенты США №№5475006; 7132458; 8211461; патентные публикации США №№2011-0217244; 2013-0131183 и 2013-0156816). Более того, исследования с использованием композиции полностью окисленного β-каротина (которая называется ОхВС, активный ингредиент в брендированных продуктах ОхС-beta™ от Avivagen Inc.), полученной с помощью самопроизвольной реакции β-каротина с кислородом в растворителе, как и в случае с аналогично образованным полностью окисленным ликопином, выявили, что полимерная фракция отвечает за иммунологическую активностью, которая включает в себя способность примировать и усиливать функцию врожденного иммунитета, а также ограничивать воспалительные процессы. Удлиненная система линейных сопряженных двойных связей, представленная в β-каротине, является общей для всех каротиноидов, поэтому предполагают, что другие каротиноиды будут вести себя аналогичным образом в своих самопроизвольных реакциях с молекулярным кислородом, и этим можно объяснить не относящиеся к витамину А эффекты как являющихся провитамином А каротиноидов (α-, β- и γ-каротинов и β-криптоксантина), так и более многочисленных каротиноидов, которые не могут превращаться в витамин А.

Кроме того, учитывая повсеместное распространение каротиноидов, включая в себя в особенности β-каротин, и их известную склонность к потере во время обработки пищи, неясно, происходит ли и в какой степени окисление и, в частности, сополимеризация природным образом в продуктах питания, и можно ли этим объяснить эту потерю. Авторы настоящего изобретения идентифицировали и разработали содержащие сополимер каротиноида и кислорода продукты/композиции из природных источников, которые отличаются от полностью окисленных каротиноидов, для способов, применений, композиций и наборов согласно настоящему изобретению.

Авторы настоящего изобретения обнаружили кормовые продукты (такие как источники растительного происхождения), содержащие сополимеры каротиноида и кислорода, раскрытые в настоящем документе, с прогнозируемыми не относящимися к витамину А иммунологическими активностями. Например, согласно одному примеру, описанному в настоящем документе, химическую природу соединения, выделенного из морковного порошка (исходно обогащенного β-каротином) подтверждали путем сравнения данных элементного анализа, GPC (гель-фильтрация), ИК-излучения, термолиза GC-MS (газовая хроматография - масс-спектрометрия) и УФ-анализа с данными от ОхВС. Данные элементного анализа, IR и GPC соединений, выделенных таким же образом из других высушенных продуктов питания, подтвердили их природу сополимера с кислородом.

Авторы настоящего изобретения в настоящем документе раскрывают, что каротиноиды, трансформированные в полимерные соединения, обладают ранее непризнанным полезным потенциалом в способах, применениях, композициях и наборах согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту осуществления продукты, содержащие сополимер(ы) каротиноида и кислорода, получены из продуктов, богатых каротиноидами in situ, в отличие от выделенных или синтетических каротиноидов.

Героновая кислота, низкомолекулярный маркер присутствия сополимеров β-каротина и кислорода, встречается в распространенных свежих или высушенных продуктах питания, включая в себя морковь, томаты, сладкий картофель, паприку, шиповник, морские водоросли, люцерну и молоко, на уровнях, включая в себя приблизительно тысячный диапазон, от низких содержаний в частях на миллиард в свежих продуктах до частей на миллион в высушенных продуктах питания. Сополимеры, выделенные из некоторых высушенные продуктах питания, например, морковный порошок, томатный порошок, спирулиновый порошок, порошок из шиповника, порошок из паприки, порошок из морских водорослей и порошок из пырея, достигают содержаний, составляющих части на тысячу - сравнимых с исходными содержаниями каротиноида. In vivo биологическая активность добавки - сополимеров β-каротина и кислорода - была ранее документально зарегистрирована на уровне частей на миллион, что указывает на то, что определенные продукты характеризуются такой активностью.

Полученные авторами настоящего изобретения данные о том, что окисление и ассоциированные продукты реакции будут обнаружены в гораздо более сложном окружении, в котором каротиноиды встречаются в природе, а именно в определенных источниках растительного происхождения, таких как фрукты и овощи, и определенные микроорганизмы (водоросли, грибы и бактерии), не являлись очевидными или предсказуемыми ввиду сложного микроокружения и многих других потенциально реакционноспособных соединений в биологическом материале, которые могут отклонять любую начинающуюся реакцию окисления каротиноида по множеству других путей с различными продуктами, полученными в результате.

Согласно одному аспекту настоящего изобретения содержащие сополимер каротиноида и кислорода продукты, выделенные таким образом из высушенных кормовых продуктов растительного происхождения, не содержат другие предполагаемые низкомолекулярные продукты разложения каротиноидов (например, включая в себя героновую кислоту в продуктах, которые, как предполагают, содержат соединения разложения окислением В-каротина). Это отличается от полностью окисленных каротиноидов (таких как ОхВС, OxLyc, OxLut или OxCan), которые содержат такие продукты.

Согласно другому варианту осуществления растительный источник выбран из группы, состоящей из следующего: морковь, томат, люцерна, спирулина, шиповник, сладкий перец, перец чили, паприка, сладкий картофель, кормовая капуста, шпинат, морские водоросли, пырей, календула, моринга масличная и красное пальмовое масло. Согласно другому варианту осуществления источники представляют собой продукты растительного происхождения, которые представляют собой порошки, например, морковный порошок, томатный порошок, спирулиновый порошок, порошок из шиповника, порошок из паприки, порошок из морских водорослей и пырейный порошок.

Согласно одному варианту осуществления источник - микроорганизм выбран из группы, состоящей из следующего: бактерии, дрожжи, грибы и водоросли, такие как спирулина⁴⁴ и ее генетически модифицированные формы, которые усиливают каротиноиды и, следовательно, потенциал к образованию сополимеров каротиноида и кислорода. Согласно некоторым дополнительным вариантам осуществления микроорганизмы выбраны из группы следующих видов: водоросли: Spirulina, Dunaliella, Haematococcus, Murielopsis. Грибы: Blakeslea trispora. Дрожжи: Xanthophyllomyces dendrorhous, Rhodotorula glutinis. Бактерии: Sphingomonas.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что соединения ОхВС - сополимеры β-каротина и кислорода, используемые в примерах, являются полезными в применениях, способах, композициях и наборах, описанных в настоящем документе, приводят к ожиданию того, что аналоги сополимера в пищевых продуктах будут обеспечивать биоактивности с аналогичными последствиями. In situ окисление употребляемых с пищей каротиноидов, являющееся результатом окислительных процессов, нарастающих по интенсивности во время переваривания фруктов или овощей, также может по меньшей мере частично обуславливать переменную и в несколько раз более низкую активность витамина А β-каротина в пищевых продуктах по сравнению с β-каротином из добавок. Окислительное разрушение β-каротина и установленная путем наблюдений потеря активности могут фактически представлять собой усиление иммунологической активности посредством образования сополимера.

Авторы настоящего изобретения разработали путь усиления количества сополимера каротиноида и кислорода в источнике и/или получения источника с известными и стабильными количествами сополимера каротиноида и кислорода для облегчения унифицированного дозирования известных эффективных количеств для достижения требуемых результатов.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает получение содержащих сополимер каротиноида и кислорода продуктов in situ, не начиная с выделенных каротиноидов в качестве источника, и получение продуктов, содержащих стабильные содержания сополимеров каротиноида и кислорода, которые характеризуются достигаемыми в результате благоприятными эффектами для животных, описанными в настоящем документе, включая в себя благоприятные эффекты, относящиеся к NE. Согласно одному аспекту сополимеры каротиноида и кислорода из природных источников не содержат (или минимально содержат) продукты разложения.

Способы и применения

Как описано в настоящем документе, настоящее изобретение характеризуется некоторыми применениями, относящимися к применению окисленных каротиноидов или содержащих окисленный каротиноид композициям или продуктам, таким как окислительно трансформированные каротиноиды, полностью окисленные каротиноиды (такие как ОхВС), их компоненты или их фракционированные компоненты, такие как компоненты, содержащие компонент, содержащий сополимер каротиноида и кислорода. Они включают в себя без ограничения следующие применения:

А. Восстановление прироста массы

Согласно настоящему изобретению проиллюстрировано, что окисленные каротиноиды или содержащие окисленный каротиноид композиции или продукты, такие как окислительно трансформированные каротиноиды, полностью окисленные каротиноиды (такие как ОхВС), их компоненты или их фракционированные компоненты, такие как компоненты, содержащие компонент, содержащий сополимер каротиноида и кислорода, такой как ОхВС, можно использовать для улучшения конечной средней массы тела при низких содержаниях порядка частей на миллион (ppm) в корме, с восстановлением до содержания в группе незараженных птиц. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу применения окисленных каротиноидов или содержащих окисленный каротиноид композиций или продуктов, таких как окислительно трансформированные каротиноиды, полностью окисленные каротиноиды (такие как ОхВС), их компоненты или их фракционированные компоненты, такие как компоненты, содержащие компонент, содержащий сополимер каротиноида и кислорода, такой как ОхВС, для защиты от потерь продуктивности, вызванных нагрузками субклинических заболеваний, ассоциированных с С. perfringens и/или NE, у кур-бройлеров. Можно использовать окисленные каротиноиды или содержащие окисленный каротиноид композиции или продукты, такие как окислительно трансформированные каротиноиды, полностью окисленные каротиноиды (такие как ОхВС), их компоненты или их фракционированные компоненты, такие как компоненты, содержащие компонент, содержащий сополимер каротиноида и кислорода, такой как ОхВС, как описано в настоящем документе, для "восстановления" прироста массы до уровня, который был бы достигнут, если бы не было заболевания, NE или инфекции С. perfringens.

B. Защита от поражения кишечника

Баллы поражения кишечника вследствие инфекции NE являлись значительно повышенными в группах лечения с помощью ОхВС по сравнению с группой птиц, не получавших лечение, при этом получавшая 2 ppm ОхВС группа показала наибольшее улучшение. Другие окисленные каротиноиды или содержащие окисленный каротиноид композиции или продукты, такие как окислительно трансформированные каротиноиды, полностью окисленные каротиноиды (такие как ОхВС), их компоненты или их фракционированные компоненты, такие как компоненты, содержащие компонент, содержащий сополимер каротиноида и кислорода, можно использовать аналогично.

В связи с этим, согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к способу применения окисленных каротиноидов или содержащих окисленный каротиноид композиций или продуктов, таких как окислительно трансформированные каротиноиды, полностью окисленные каротиноиды (такие как ОхВС), их компоненты или их фракционированные компоненты, такие как компоненты, содержащие компонент, содержащий сополимер каротиноида и кислорода, для защиты от (а) поражения кишечника в течение NE у сельскохозяйственной птицы, такой как куры-бройлеры, вызванного инфекцией С. perfringens.

C. Снижение патогенной нагрузки

Количество бактерий С. perfringens в кале снижалось с помощью окисленных каротиноидов или содержащих окисленный каротиноид композиций или продуктов, таких как окислительно трансформированные каротиноиды, полностью окисленные каротиноиды (такие как ОхВС), их компоненты или их фракционированные компоненты, такие как компоненты, содержащие компонент, содержащий сополимер каротиноида и кислорода, или согласно одному варианту осуществления ОхВС, зависимым от дозы образом. Таким образом, настоящее изобретение можно использовать для поддержания баланса бактерий в кишечнике, таком как кишечник цыпленка-бройлера, и предотвращения избыточного роста бактерий С. perfringens.

D. Профилактика и улучшение NE

Низкие содержания порядка ppm окисленных каротиноидов или содержащих окисленный каротиноид композиций или продуктов, таких как окислительно трансформированные каротиноиды, полностью окисленные каротиноиды (такие как ОхВС), их компоненты или их фракционированные компоненты, такие как компоненты, содержащие компонент, содержащий сополимер каротиноида и кислорода, или согласно одному варианту осуществления ОхВС, в корме могут вносить вклад в профилактику и улучшение NE при коммерческом разведении кур-бройлеров и, как предполагают, характеризуются положительным эффектом в улучшении продуктивности в течение периода откорма.

Е. Применение окисленных каротиноидов или содержащих окисленный каротиноид композиций или продуктов, таких как окислительно трансформированные каротиноиды, полностью окисленные каротиноиды (такие как ОхВС), их компоненты или их фракционированные компоненты, такие как компоненты, содержащие компонент, содержащий сополимер каротиноида и кислорода, вместо антибиотиков для контроля NE и инфекции С. perfringens.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу поддержания у сельскохозяйственной птицы (такой как куры-бройлеры) хорошего состояния здоровья (такого как состояние здоровья незараженных особей) под угрозой заражения, такого как NE и С. perfringens, с использованием окисленных каротиноидов или содержащих окисленный каротиноид композиций или продуктов, таких как окислительно трансформированные каротиноиды, полностью окисленные каротиноиды (такие как ОхВС), их компоненты или их фракционированные компоненты, такие как компоненты, содержащие компонент, содержащий сополимер каротиноида и кислорода, вместо противомикробного средства. Применение противомикробных средств у сельскохозяйственной птицы было широко связано с остатками лекарственных средств в пищевых продуктах и размножением устойчивых к действию антибиотиков патогенов в пищевых продуктах и окружающей среде. В связи с этим существует давление на владельцев птицеводческих предприятий для снижения применения ими антибиотиков. Окисленные каротиноиды или содержащие окисленный каротиноид композиции или продукты, такие как окислительно трансформированные каротиноиды, полностью окисленные каротиноиды (такие как ОхВС), их компоненты или их фракционированные компоненты, такие как компоненты, содержащие компонент, содержащий сополимер каротиноида и кислорода. Согласно одному варианту осуществления ОхВС продемонстрировал в настоящем документе, что он не характеризуется ни бактерицидными, ни бактериостатическими свойствами и, следовательно, не является противомикробным средством, что делает его применимой альтернативой антибиотикам для профилактики или борьбы с NE и С. perfringens у сельскохозяйственной птицы, такой как куры-бройлеры.

Животные

Способ можно использовать у животных, особенно сельскохозяйственной птицы и согласно другому варианту осуществления кур-бройлеров, несушек и индеек, которые предрасположены к заражению С. perfringens и/или NE.

Окисленные каротиноиды, такие как ОхВС, композиции и способы введения и наборы

ОхВС представляет собой продукт полного аутоокисления бета-каротина, процесса, который дает в результате новую композицию, не характеризующуюся активностью бета-каротина, витамина А или агониста рецептора ретиноевой кислоты. Преимущественно он образован путем процесса сополимеризации кислорода, который дает в результате хорошо охарактеризованный, стабильно воспроизводимый продукт, состоящий в основном из сополимеров β-каротина и кислорода.

Структурно полимеры ОхВС, по-видимому, представляют собой менее полимеризованную форму спорополленина, биополимера, встречающегося в экзинах спор и пыльцы. С тех пор эти полимеры были идентифицированы как образующиеся путем аутоокисления множественных каротиноидов, включая в себя не только бета-каротин, но также кантаксантин, лютеин и ликопин. В полной мере ожидается, что другие каротиноиды, такие как астаксантин, преимущественно подвергаются такому же процессу полимеризации.

Химический анализ указывает на то, что синтезированная версия является в высокой степени аналогичной полимерам, встречающимся в природе в различных пищевых продуктах, кормах и фураже (неопубликованные данные; рукопись в подготовке).

ОхВС получают в большом количестве путем нагревания раствора синтетического бета-каротина в растворителе "GRAS", в атмосфере чистого кислорода до тех пор, пока поглощение кислорода не станет намного более медленным по мере достижения заданной конечной точки. Были установлены способы QC/QA (контроля и гарантии качества) производства, и производительность производства чистого активного средства (в настоящее время нацеленная на применения в кормах для сельскохозяйственных животных) в настоящее время исчисляется в десятках метрических тонн в год. ОхВС поставлялся для использования у бройлеров в виде 10% концентрата, полученного распылительной сушкой раствора ОхВС на кукурузный крахмал с образованием однородного продукта - "премикса". Большие или меньшие концентрации активного ингредиента можно использовать для перемалывания в корма или другие дозированные препараты при требуемых уровнях введения. Другие полностью окисленные каротиноиды можно получить аналогичным образом.

ОхВС, а также другие окисленные каротиноиды согласно настоящему изобретению, можно составить вместе с кормом или ввести отдельно от корма, одновременно или нет.

Согласно одному варианту осуществления окисленные каротиноиды или содержащие окисленный каротиноид композиции или продукты, такие как окислительно трансформированные каротиноиды, полностью окисленные каротиноиды (такие как ОхВС), их компоненты или их фракционированные компоненты, такие как компоненты, содержащие компонент, содержащий сополимер каротиноида и кислорода, вводят или подают с кормом в эффективном количестве во время свободного потребления животным корма. Согласно одному варианту осуществления окисленные каротиноиды или содержащие окисленный каротиноид композиции или продукты, такие как окислительно трансформированные каротиноиды, полностью окисленные каротиноиды (такие как ОхВС), их компоненты или их фракционированные компоненты, такие как компоненты, содержащие компонент, содержащий сополимер каротиноида и кислорода, вводят или подают с кормом в свободном режиме или с интервалами или согласно другому варианту осуществления один раз в день, согласно другому варианту осуществления два раза в день, согласно еще одному варианту осуществления несколько раз в день и при этом количество окисленных каротиноидов доводят до требуемого количества в зависимости от распорядков кормления животных.

Согласно одному варианту осуществления количества окисленных каротиноидов или содержащих окисленный каротиноид композиций или продуктов, таких как окислительно трансформированные каротиноиды, полностью окисленные каротиноиды (такие как ОхВС), их компоненты или их фракционированные компоненты, такие как компоненты, содержащие компонент, содержащий сополимер каротиноида и кислорода, составляют 2 ppm-30 ppm или согласно другому варианту осуществления от 2 до 15 ppm, до 10 ppm, до 8 ppm или до 6 ppm, обеспеченные через короткие промежутки времени. Согласно другому, предпочтительному варианту осуществления из экспериментальных результатов можно сделать вывод, что 2 ppm-4 ppm, введенные с кормом в течение более длительного промежутка времени, могут обеспечить оптимальный эффект при сохранении рентабельности для владельца птицеводческого предприятия. PPM относится к частям активного ингредиента (например, окисленного каротиноида) на миллион частей рациона или корма.

Окисленные каротиноиды или содержащие окисленный каротиноид композиции или продукты, такие как окислительно трансформированные каротиноиды, полностью окисленные каротиноиды (такие как ОхВС), их компоненты или их фракционированные компоненты, такие как компоненты, содержащие компонент, содержащий сополимер каротиноида и кислорода или согласно одному варианту осуществления ОхВС или их очевидные химические эквиваленты, можно вводить с помощью любого способа, который осуществляет контакт указанного активного средства с местами действия средства в организме субъекта или пациента, чтобы производить терапевтический эффект, в частности благоприятный эффект, более конкретно пролонгированный благоприятный эффект. Активные ингредиенты можно вводить одновременно или последовательно и в любом порядке в различные моменты времени для обеспечения требуемых благоприятных эффектов. Соединение и композицию согласно настоящему изобретению можно составить для замедленного высвобождения, для доставки локально или системно. В пределах компетенции квалифицированного врача или ветеринара находится выбор формы и пути введения, которые оптимизируют эффекты композиций и лечения согласно настоящему изобретению для обеспечения терапевтических эффектов, в частности благоприятных эффектов, более конкретно пролонгированных благоприятных эффектов.

Согласно одному варианту осуществления введение окисленных каротиноидов или содержащих окисленный каротиноид композиций или продуктов, таких как окислительно трансформированные каротиноиды, полностью окисленные каротиноиды (такие как ОхВС), их компоненты или их фракционированные компоненты, такие как компоненты, содержащие компонент, содержащий сополимер каротиноида и кислорода, включает в себя один способ, который осуществляет контакт указанного активного средства с местами действия средства in vivo или в организме цыпленка-бройлера или другого животного, чтобы производить требуемый или терапевтический эффект, в зависимости от обстоятельств. В связи с этим предусмотрено введение окисленных каротиноидов или содержащих окисленный каротиноид композиций или продуктов, таких как окислительно трансформированные каротиноиды, полностью окисленные каротиноиды (такие как ОхВС), их компоненты или их фракционированные компоненты, такие как компоненты, содержащие компонент, содержащий сополимер каротиноида и кислорода, в место действия - напрямую или посредством способа доставки (например, составы замедленного высвобождения, носители для доставки, которые приводят к сайт-направленной доставке в кишечник или требуемое место в организме). Согласно одному варианту осуществления окисленные каротиноиды или содержащие окисленный каротиноид композиции или продукты, такие как окислительно трансформированные каротиноиды, полностью окисленные каротиноиды (такие как ОхВС), их компоненты или их фракционированные компоненты, такие как компоненты, содержащие компонент, содержащий сополимер каротиноида и кислорода, можно использовать в количестве, составляющем приблизительно 1-30 ppm согласно одному варианту осуществления, согласно другому варианту осуществления в течение 2 недель в количестве 30 ppm, согласно другому варианту осуществления в количестве, составляющем 2-6 ppm для 'непрерывного применения' (включение в нормальный рацион), или как иным образом описано в настоящем документе. Описанные выше вещества можно составить в подходящие композиции для введения животным, таким как куры-бройлеры, в биологически совместимой форме, подходящей для введения in vivo. Под "биологически совместимой формой, подходящей для введения in vivo" подразумевается форма вещества, подлежащего введению, в которой любые токсические эффекты компенсируются терапевтическими эффектами. Вещества можно вводить в живые организмы, включая в себя таких животных, как сельскохозяйственная птица, согласно другому варианту осуществления куры, согласно другому варианту осуществления куры-бройлеры, несушки или индейки.

Таким образом, согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к применению окисленных каротиноидов или содержащих окисленный каротиноид композиций или продуктов, таких как окислительно трансформированные каротиноиды, полностью окисленные каротиноиды (такие как ОхВС), их компоненты или их фракционированные компоненты, такие как компоненты, содержащие компонент, содержащий сополимер каротиноида и кислорода, в получении лекарственного средства для применений, указанных в настоящем документе. Согласно одному варианту осуществления терапевтически эффективное количество окисленных каротиноидов или содержащих окисленный каротиноид композиций или продуктов, таких как окислительно трансформированные каротиноиды, полностью окисленные каротиноиды (такие как ОхВС), их компоненты или их фракционированные компоненты, такие как компоненты, содержащие компонент, содержащий сополимер каротиноида и кислорода, или фармацевтической композиции согласно представленному в настоящем документе описанию вводят нуждающемуся в этом пациенту. Нуждающийся в этом пациент представляет собой любое животное, которое может получить пользу от окисленных каротиноидов или содержащих окисленный каротиноид композиций или продуктов, такие как окислительно трансформированные каротиноиды, полностью окисленные каротиноиды (такие как ОхВС), их компоненты или их фракционированные компоненты, такие как компоненты, содержащие компонент, содержащий сополимер каротиноида и кислорода, и их эффектов согласно представленному в настоящем документе описании.

Активные вещество можно вводить общепринятым способом, например, с помощью инъекции (подкожной, внутривенной и т.д.), перорального введения, ингаляции, нанесения на слизистую оболочку, местного нанесения, трансдермального введения, введения в желудок, введения в кишечник или ректального введения. В зависимости от пути введения активное вещество можно покрыть материалом для защиты соединения от действия ферментов, кислот и других естественных условий, которые могут инактивировать соединение. Согласно одному варианту осуществления окисленные каротиноиды или содержащие окисленный каротиноид композиции или продукты, такие как окислительно трансформированные каротиноиды, полностью окисленные каротиноиды (такие как ОхВС), их компоненты или их фракционированные компоненты, такие как компоненты, содержащие компонент, содержащий сополимер каротиноида и кислорода, вводят с помощью корма для животного или с использованием других техник, известных в настоящей области техники.

Описанные в настоящем документе композиции можно получить с помощью per se известных способов получения фармацевтически приемлемых композиций, которые можно вводить субъектам, при которых эффективное количество активного вещества комбинируют в смеси с фармацевтически приемлемой несущей средой или носителем. Подходящие несущие среды или носители описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985 или Remington's The Sciences and Practice of Pharmacy, 21^st Edition", (University of the Sciences in Philadelphia, 2005) или Handbook of Pharmaceutical Additives (составители Michael and Irene Ash, Gower Publishing Limited, Aldershot, England (1995)). Исходя из этого, композиции включают в себя, хотя и не исключительно, растворы веществ в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми несущими средами, носителями или разбавителями, и могут содержаться в забуференных растворах с подходящим значением рН и/или могут являтьсяизоосмотическими по отношению к физиологическим жидкостям. В этой связи можно сделать ссылку на патент США №5843456.

Корма и кормовые продукты, добавки и премиксы

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к кормам (таким как корма для животных/корма для сельскохозяйственной птицы) или кормовым продуктам, содержащим окисленные каротиноиды или содержащие окисленный каротиноид композиции или продукты, такие как окислительно трансформированные каротиноиды, полностью окисленные каротиноиды (такие как ОхВС), их компоненты или их фракционированные компоненты, такие как компоненты, содержащие компонент, содержащий сополимер каротиноида и кислорода, которые можно смешать с кормовым продуктом и вводить с кормом животному в количестве, эффективном для лечения и/или профилактики NE и/или минимизации его эффектов или ассоциированных состояний, например, путем снижения содержаний бактерий С. perfringens.

При получении кормового продукта согласно настоящему изобретению окисленные каротиноиды или содержащие окисленный каротиноид композиции или продукты, такие как окислительно трансформированные каротиноиды, полностью окисленные каротиноиды (такие как ОхВС), их компоненты или их фракционированные компоненты, такие как компоненты, содержащие компонент, содержащий сополимер каротиноида и кислорода, необязательно смешивают с объемообразующим средством перед добавлением к кормовому продукту. Объемообразующие средства включают в себя без ограничения крахмал, белок, жиры и их смеси. Желательно, чтобы объемообразующее средство было выбрано из кукурузного крахмала, молочной сыворотки, муки, сахара, соевого жмыха, мальтодекстрина и гуаровой камеди. Кормовые продукты согласно настоящему изобретению также могут включать в себя антиоксиданты для профилактики дальнейшего окисления окислительно трансформированного каротиноида или его компонента. Окисление можно предотвратить путем введения в кормовой продукт таких встречающихся в природе антиоксидантов, как витамин Е, витамин С и токоферол, или таких синтетических антиоксидантов, как бутилированный гидрокситолуол, бутилированный гидроксианизол, третичный бутилгидрохинон, пропилгаллат или этоксихин. Количество антиоксидантов, вводимых таким способом, зависит от таких требований, как состав продукта, условия транспортировки, способы упаковки и требуемый срок годности.

Согласно некоторым аспектам кормовые продукты согласно настоящему изобретению включают в себя без ограничения хлебобулочные изделия, напитки, питьевые смеси, диетические батончики, печенье и корма для животных. Корм для животных может представлять собой сухой или полувлажный корм для домашних животных, или корм для сельскохозяйственного животного, такой как корм для лошадей, корм для свиней (например, корм для доращивания свиней/стартерный корм для свиней, финишный корм для свиней или корм для племенного стада свиней), корм для сельскохозяйственной птицы (например, корм для сельскохозяйственной индейки, корм для сельскохозяйственных бройлеров или корм для племенной сельскохозяйственной птицы), корм для овец, корм для крупного рогатого скота (например, корм для молочного скота или корм для мясного скота) или корм для рыбы (например, корм для тиляпии, корм для сома, корм для форели или корм для лосося).

Корма для животных, как правило, составляют для обеспечения питательных веществ в соответствии с промышленными стандартами. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения предусмотрены корма для животных, содержащие одно или несколько из следующего: окисленные каротиноиды или содержащие окисленный каротиноид композиции или продукты, такие как окислительно трансформированные каротиноиды, полностью окисленные каротиноиды (такие как ОхВС), их компоненты или их фракционированные компоненты, такие как компоненты, содержащие компонент, содержащий сополимер каротиноида и кислорода. Корма можно составить из разнообразия различных кормовых ингредиентов, которые выбирают в соответствии с рыночной ценой и доступностью. Соответственно, некоторые компоненты корма можно заменить с течением времени. Для обсуждений составов кормов для животных и норм NRC (Национальный научно-исследовательский совет) см. Church, Livestock Feeds and Feeding, O&B Books, Inc., Corvallis Oreg. (1984) и Feeds and Nutrition Digest, Ensminger, Oldfield and Heineman eds., Ensminger Publishing Corporation, Clovis, Calif. (1990), которые включены в настоящий документ посредством ссылки.

Другие ингредиенты можно добавить к корму для животных при необходимости для стимуляции здоровья и роста животного. Ингредиенты включают в себя без ограничения сахара, сложные углеводы, аминокислоты (например, аргинин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан, валин, тирозин, аланин, аспарагиновая кислота, глютамат натрия, глицин, пролин, серии и цистеин, среди прочего), витамины (например, тиамин, рибофлавин, пиридоксин, ниацин, ниацинамид, инозитол, холин хлорид, пантотенат кальция, биотин, фолиевая кислота, аскорбиновая кислота и витамины А, В, K, D, Е, среди прочего), минералы, белок (например, мясная мука, рыбная мука, яичная масса или яичный порошок, рыбные гидролизаты, концентрат сывороточного белка), масла (например, соевое масло), кукурузный крахмал, кальций, неорганический фосфат, сульфат меди и хлорид натрия. Любые лекарственные ингредиенты, известные в настоящей области техники, также можно добавить в корм для животных, включая в себя без ограничения антибиотики и гормоны. В отношении добавления витаминов, минералов и антибиотиков в корма для животных см. Church, Livestock Feeds and Feeding, O&B Books, Inc., Corvallis Oreg. (1984).

Любые кормовые смеси для животных, известные в настоящей области техники, можно использовать согласно настоящему изобретению, включая в себя без ограничения фураж, такой как ежа сборная, тимофеевка, овсяница тростниковая, плевел, люцерна, эспарцет, виды клевера и горошка, такие зерновые корма, как кукуруза, пшеница, ячмень, сорго, тритикале, рожь, канола и соевые бобы, пожнивные остатки, зерна злаков, побочные продукты бобовых и другие сельскохозяйственные побочные продукты. В ситуациях, когда полученный корм необходимо обработать или законсервировать, корм можно обработать с помощью окислительно трансформированного каротиноида, его компонента или фракционированного окислительно трансформированного каротиноида перед обработкой или консервированием. Желательно, чтобы корм для животных согласно настоящему изобретению включал в себя шрот из экстрагированных семян рапса, муку из жмыха семян хлопчатника, соевую муку или кукурузную муку.

Обработка может включать в себя сушку, просеивание, измельчение, гранулирование, брикетирование, прессование, раскатывание, темперирование, помол, растрескивание, вспенивание, экструзию, микронизацию, обжаривание, производство хлопьев, варку и/или воспламенение. Например, гранулированный корм получают вначале путем смешивания компонентов корма, а затем прессования и экструдирования компонентов корма через пресс-форму с нагреванием и давлением. Корма для животных согласно настоящему изобретению можно гранулировать, как описано, например, в MacBain, Pelleting Animal Feed, American Feed Manufacturers Association, Arlington, Va. (1974), включенной в настоящий документ посредством ссылки.

Согласно другим вариантам осуществления настоящее изобретение относится к премиксам или добавкам, которые содержат и которые можно вводить или принимать отдельно или в комбинации с кормом или кормовым продуктом или водой и/или смешивать с ними в соответствующих соотношениях/количествах с получением требуемого содержания продукта на основе окисленного каротиноида, содержащего сополимер, для применения у животного.

Наборы

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к набору, содержащему следующее:

(i) окисленные каротиноиды или содержащие окисленный каротиноид композиции или продукты, такие как окислительно трансформированные каротиноиды, полностью окисленные каротиноиды, их компоненты, такие как компоненты, содержащие компонент, содержащий сополимер каротиноида и кислорода, и сополимер каротиноида и кислорода, и содержащие их композиции и/или продукты; и

(ii) необязательно инструкции для применения в профилактике и/или снижении риска развития некротического энтерита (NE) и уменьшении интенсивности ассоциированных состояний, таких как ассоциированные состояния желудочно-кишечного тракта, и/или для лечения животного, характеризующегося наличием или подверженного риску некротического энтерита или подверженного воздействию С. perfringens.

Настоящее изобретение описано в следующих примерах, которые представлены для содействия пониманию настоящего изобретения, и которые не следует рассматривать как ограничивающие каким бы то ни было образом объем настоящего изобретения, определяемый в формуле изобретения, которая следует после них.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1 - Получение полностью окисленного бета-каротина (ОхВС)

ОхВС представляет собой продукт полного аутоокисления бета-каротина, процесса, который дает в результате новую композицию, не характеризующуюся активностью бета-каротина, витамина А или агониста рецептора ретиноевой кислоты. Преимущественно он образован путем процесса сополимеризации кислорода, который дает в результате хорошо охарактеризованный, стабильно воспроизводимый продукт, состоящий в основном из сополимеров β-каротина и кислорода, который более полно описан в Burton et al. (1995 и 2014). Структурно полимеры ОхВС, по-видимому, представляют собой менее полимеризованную форму спорополленина, биополимера, встречающегося в экзинах спор и пыльцы.

ПРИМЕР 2 - Получение кормов для животных с ОхВС

Используемые в настоящем изобретении корма для животных, полученные путем включения ОхВС в виде 10% (масс./масс.) премикса с другими ингредиентами корма, содержали следующее:

Используемые вещества:

- ОхВС (Avivagen, Canada), группы 3, 4 и 5 (таблица 4)

- Бацитрацин (BS Bacitrex 100, Korea), группа 6 (таблица 4)

- Виргиниамицин (Stafac-20, Bayer Korea, Korea), группа 7 (таблица 4)

- Вещества добавляли к основному коммерческому рациону, как указано в таблице 4

ПРИМЕР 3 - Профилактический эффект ОхВС на модель заражения некротическим энтеритом с использованием цыпленка-бройлера

Некротический энтерит (NE) встречается в большом масштабе у коммерческих кур-бройлеров, когда их выращивают без применения противомикробных стимуляторов роста. Настоящее справочное исследование разработали для оценки профилактического эффекта ОхВС (продукта для животноводства OxC-beta™ от Avivagen Inc., Canada) в модели субклинического некротического энтерита у кур-бройлеров. ОхВС оценивали в отношении его способности благоприятно воздействовать на различные параметры здоровья и продуктивности бройлеров, включая в себя уровень выживаемости (смертности), клинические признаки, массу тела, прирост массы, поражения кишечника и определение количества бактерий по сравнению с зараженной, не получившей лечение контрольной группой.

Материалы и методы:

1. Животные

Всего 280 однодневных цыплят-бройлеров Росс, полученных от коммерческой инкубаторной станции, использовали в настоящем исследовании. Цыплят вакцинировали против ньюкаслской болезни (вируса ньюкаслской болезни) в инкубаторной станции.

2. Содержание птиц и установка

Птиц выращивали в блоках-изоляторах в течение всего экспериментального периода.

- В настоящем исследовании использовали изоляторы для цыплят, оснащенные вентиляционной системой.

- На каждую группу лечения приходился 1 блок-изолятор, и в каждый блок-изолятор помещали 20 цыплят в день исследования-1 (таблица 1). Исследование проводили в двух параллельных повторностях с 7 блоками-изоляторами на повторность.

- Температуру внутри изолятора регулировали для поддержания оптимальных температур для бройлеров.

- В день исследования-1 насчитывали по 20 цыплят на каждый изолятор. В день исследования-10 пять самых маленьких цыплят в каждом изоляторе подвергали эвтаназии и оценивали в отношении обширных поражений тонкой кишки и определения количества С. perfringens в содержимом кишечника. Оценку в день-10 проводили для подтверждения отсутствия поражения NE или патогенных содержаний С. perfringens до экспериментального заражения в день-14. После дня исследования-10 в каждом изоляторе находились 15 птиц, и этих птиц использовали в относящейся к заражению части исследования.

- Цыплят оценивали и взвешивали индивидуально, следовательно, каждая птица представляет экспериментальную единицу.

^а Цыплят с массой ниже 40 г исключали из исследования вследствие высокого уровня смертности, прогнозируемого для цыплят с пониженной массой.

^b В эксперименте использовали 280 цыплят из общего количества 400, и количество цыплят на группу в день-1 составляло 20.

3. Кормление

Основной рацион, используемый в настоящем исследовании, представляет собой стандартный коммерческий корм для бройлеров. Стандартный рацион дополняли соответствующими содержаниями ОхВС или антибиотика, как указано в таблице 4. В настоящем исследовании не использовали средства против кокцидий, включенные в корм. Модель субклинического некротического энтерита у кур индуцировали путем заражения с помощью С. perfringens (CP-13), выделенных из реального случая некротического энтерита у цыпленка-бройлера. Заражение проводили с помощью перорального зонда два раза в день с приблизительно 1×10⁷ КОЕ/мл в дни 14, 15 и 16. Согласно одному варианту осуществления 10% премикс ОхВС на крахмале вводили в корм вместе с другими ингредиентами.

• Программа кормления

Авторы настоящего изобретения применяли такую же программу кормления и состав, как на коммерческих фермах по разведению кур-бройлеров (таблица !)•

Экспериментальные корма давали непрерывно в течение 2 8-дневного периода исследования и воду давали ad libitum в течение всего эксперимента.

Формулу основного коммерческого корма, используемого в настоящем исследовании, можно увидеть в таблице 1 выше.

• Заражение

Введение штамма Clostridium perfringens СР-013, чтобы индуцировать модель субклинического NE.

Всех птиц, за исключением группы 1, перорально заражали два раза с помощью приблизительно 10⁷ КОЕ/мл С. perfringens в дни 14, 15 и 16 (таблица 3).

Штамм для экспериментального заражения характеризовался генами сра и cpb2, но являлся отрицательным в отношении гена токсина netB.

См. Shojadoost с соавт., 2012, в отношении подробного описания способов индуцировать NE у сельскохозяйственной птицы.

• Макроскопические поражения - оценка в баллах

Баллы обширных (макроскопических) поражений оценивали с использованием критериев согласно Prescott (1978), при этом баллы находились в диапазоне по шкале от 0 (отсутствие обширного поражения) до 4 (наиболее тяжелое обширное поражение)

Обширные поражения в кишечном тракте классифицировали следующим образом: 0, отсутствие обширных поражений; 1+, тонкостенная или рыхлая тонкая кишка; 2+, фокальный некроз; 3+, увеличенные очаги некроза; 4+, тяжелый, обширный некроз, типичный для реальных случаев заболевания (фигура 1).

См. Prescott с соавт., 1978, в отношении подробного описания шкалы оценки поражения.

• Определение количества бактерий

Количество Clostridium perfringens измеряли в виде колониеобразующих единиц на грамм кала, собранного из тонкой кишки после вскрытия.

Кратко, 250 мкл образца кала загружали в первую лунку каждого ряда в 96-луночном планшете и 10-кратные серийные разведения производили с использованием многоканальной пипетки путем переноса 20 мкл из колонки в 180 мкл середы в колонке, перемешивая 10 раз и повторяя процесс; наконечник пипетки заменяли между разведениями.

После этого пять повторностей по 10 мкл из каждого из пяти выбранных разведений помещали на агаровую среду с использованием многоканальной пипетки.

Планшеты оставляли высыхать и затем помещали в термостат для бактериальных культур.

См. Chen с соавт., 2003 в отношении подробного описания способов определение количества бактерий.

• Схемы эксперимента и параметры (см. таблицы 4 и 5)

^а Настоящее исследование проводили в двух параллельных повторностях, при этом каждая повторность состояла из 7 блоков-изоляторов.

^b В день исследования-1 в каждом изоляторе находились 20 цыплят, 5 цыплят удаляли в день исследования-10 для предшествующей экспериментальному заражению оценки маркеров NE.

Результаты:

3.1 Уровень выживаемости (смертности) и клинические признаки

• После экспериментального заражения CP (дни 14-16) наблюдали отсутствие смертности (фактически мертвые животные) или клинических признаков (тяжелое угнетенное состояние, сниженный аппетит, нежелание двигаться, диарея и взъерошенные перья) у всех птиц (см. таблицы 6 и 7).

3.2 Средняя масса тела и прирост массы

После экспериментального заражения Clostridium perfringens (дни 14-16) средняя масса тела в получавших лечение с помощью ОхВС группах значимо (Р<0,05) увеличивалась относительно зараженной, не получавшей лечение группы птиц (G2). Получавшая лечение с помощью 2 ppm ОхВС группа (G3) характеризовалась самым высоким общим приростом массы (дни 1-28) среди трех доз ОхВС. Лечение с помощью ОхВС восстанавливало конечную среднюю массу тела и общий средний прирост массы зараженных птиц до уровней, которые значимо не отличались от уровней, наблюдаемых у не подвергнутых экспериментальному заражению контролей (G1) (таблица 8).

Надстрочные ^{a, b, c} обозначают статистически значимое различие. *, Р<0,05; **, Р<0,001, однофакторный дисперсионный анализ (SPSS 12,0).

Прирост массы в %=[(конечная масса-начальная масса)/начальная масса]×100.

3.3 Поражение кишечника в баллах

Макроскопические (обширные) поражения в тонкой кишке оценивали в 3 временных точках в течение настоящего исследования:

• В день исследования-10, перед экспериментальным заражением (в дни 14-16), пять птиц из каждого изолятора подвергали эвтаназии и оценивали в отношении предшествующей экспериментальному заражению гиперемии и кровотечений.

• В день исследования-21, через пять дней после финального экспериментального заражения CP, трех птиц из каждого изолятора подвергали эвтаназии и оценивали в отношении поражений кишечника.

• В день исследования-28, последний день исследования, оставшихся 12 птиц в каждом инкубаторе оценивали в отношении поражений кишечника.

Оценка предшествующих экспериментальному заражению образцов, взятых в день-10, выявила, что наблюдалась небольшая многоочаговая гиперемия и/или кровотечения, присутствующие на слизистой оболочке кишечника в любой из групп лечения, или их отсутствие. Эти данные подтвердили, что птицы во всех группах характеризовались хорошим состоянием здоровья до периода экспериментального заражения, который начинался в день-14.

Экспериментальное заражение С. perfringens индуцировало поражения в тонкой кишке. Подвергнутая экспериментальному заражению, не получавшее лечение группа (G2) характеризовалась самым высоким средним баллом поражения (1,54±0,58), который являлся значимо более высоким, чем баллы для любой другой группы в исследовании (таблица 9). Не подвергнутая экспериментальному заражению группа (G1) характеризовалась самым низким средним баллом поражения, составляющим 0,30±0,39.

В течение периода после экспериментального заражения (дни 14-28) лечение с помощью ОхВС значимо уменьшало поражения кишечника по сравнению с подвергнутой экспериментальному заражению, не получавшей лечение группой. Примечательно, что средний балл поражения птиц, которым вводили с кормом 2 ppm ОхВС, являлся наименьшим (0,40±0,51) из всех групп, за исключением не подвергнутой экспериментальному заражению контрольной группы (таблица 9).

Средние баллы поражения также являлись значимо сниженными в обеих получивших лечение антибиотиком группах относительно зараженных, не получивших лечение контролей (таблица 9).

Надстрочные ^{a, b, c} обозначают статистически значимое различие. *, Р<0,05; **, Р<0,001, однофакторный дисперсионный анализ (SPSS 12,0).

Стандартное отклонение рассчитывали со средним значением каждой группы

3.4 Определение количества Clostridium perfringens

Содержание С. perfringens в образцах кала, собранных из тонкой кишки, оценивали, путем определения колониеобразующих единиц (CFU), в трех временных точках в течение исследования.

• В день исследования-10, перед экспериментальным заражением (в дни 14-16), пять птиц из каждого изолятора подвергали эвтаназии и оценивали в отношении содержания С. perfringens в кале.

• В день исследования-21, через пять дней после последнего экспериментального заражения С. perfringens ("CP"), трех птиц из каждого изолятора подвергали эвтаназии и оценивали в отношении содержания С. perfringens в кале.

• В день исследования-28, последний день исследования, оставшихся 12 птиц в каждом инкубаторе оценивали в отношении содержания С. perfringens в кале.

Предшествующее экспериментальному заражению содержание С. perfringens, определяемое в день-10, находилось в диапазоне от 4,4×10² до 1,3×10³ КОЕ во всех семи группах лечения (таблица 10). Такое низкое содержание С. perfringens являлось ожидаемым, так как этот вид, как обычно обнаруживают, находится в кишечнике бройлеров в низких, непатогенных содержаниях.

Для не подвергнутой экспериментальному заражению контрольной группы содержания С. perfringens увеличивались в течение всего испытания. Как указано выше, С. perfringens представляет собой постоянного обитателя микрофлоры кишечника бройлеров, и при низких содержаниях бактерии не поражают птицу. Кроме того, с возрастом у птиц нередко увеличивается содержание С. perfringens в содержимом кишечника. Содержания С. perfringens, наблюдаемые у не подвергнутого экспериментальному заражению контроля в течение настоящего исследования согласовывались с непатологическими содержаниями, наблюдаемыми в норме у здоровых птиц.

В период после экспериментального заражения, в дни 21 и 28, птицы в группе, подвергнутой заражению + не получившей лечение, характеризовались содержаниями С. perfringens, которые являлись значимо более высокими, чем во всех других группах (таблица 10). Лечение с помощью ОхВС значимо и зависимым от дозы образом снижало содержания С. perfringens на 2-3 порядка величин относительно подвергнутой заражению, не получившей лечение группы в каждой оцениваемой временной точке после заражения (дни 21 и 28). Более того, содержания С. perfringens в группах ОхВС не отличались статистически от таковых у незараженных птиц (таблица 10).

Применение антибиотиков также приводило к значимым снижениям содержаний С. perfringens в течение периода после экспериментального заражения. К концу исследования, в день 28, из образцов, взятых от птиц из любой получавшей антибиотик группы, не выделяли С. perfringens. Полное уничтожение С. perfringens антибиотиками отличается от эффектов ОхВС, которые поддерживали содержания С. perfringens на нормальных, не подвергнутых заражению уровнях (таблица 10).

Надстрочные символы ^{[a, b]} обозначают статистически значимое различие. *, Р<0,05; **, Р<0,001, однофакторный дисперсионный анализ (SPSS 12,0). Средние значения получивших лечение с помощью антибиотика групп (группы 6 и 7) исключали из статистического анализа, поскольку количество бактерий Clostridial не являлось очень низким или обнаруживаемым. Стандартное отклонение рассчитывали со средним значением каждой группы.

4. Обобщение результатов исследования

• Настоящее исследование оценивало профилактический эффект ОхВС в субклинической модели некротического энтерита у цыпленка-бройлера. Оценивали некоторые параметры, включая в себя уровень выживаемости (смертности), клинические признаки, массу тела, прирост массы, поражение кишечника и определение количества бактерий. ОхВС оценивали относительно подвергнутой экспериментальному заражению, не получившей лечение контрольной группы, не подвергнутой экспериментальному заражению контрольной группы, двух получивших антибиотики групп (бацитрацин и виргиниамицин).

• Отсутствие смертности наблюдали в течение испытания для любой из групп. Это обусловлено тем, что в исследовании использовали модель субклинического некротического энтерита, которая не предусматривает присутствие клинических признаков или патологических показателей, в отличие от высокого уровня смертности, характерного для острой или клинической моделей заболевания.

• В период после экспериментального заражения, в дни 21 и 28, птицы во всех получивших ОхВС группах характеризовались значимо более высокой средней массой тела (Р<0,05) по сравнению с подвергнутой экспериментальному заражению, не получившей лечение контрольной группой.

• Тяжесть обширных поражений, наблюдаемых в течение испытания, согласовывались с субклиническим уровнем модели заражения. Оценка поражений в дни 21 и 28 выявила присутствие различных патологических данных, таких как диссеминированная тяжелая гиперемия и кровотечения, фокальный некроз или изъязвление слизистой оболочки кишечника птиц в подвергнутой экспериментальному заражению, не получившей лечение контрольной группе. В отличие от этого, птицы в получившей ОхВС и антибиотик группах показали баллы поражения, которые являлись сниженными приблизительно в 3 раза по сравнению с подвергнутой экспериментальному заражению, не получившей лечение группой. Более того, тяжесть поражений в получившей ОхВС и антибиотик группах не отличилась значимо от этого показателя у не подвергнутых экспериментальному заражению контрольных птиц. Улучшение баллов поражения кишечника происходило одновременно со снижением содержаний С. perfringens в кале птиц, получивших с кормом ОхВС или антибиотики.

5. Заключение

Настоящее исследование продемонстрировало способность низких, составляющих ppm, содержаний ОхВС в корме для защиты от вредных эффектов некротического энтерита на здоровье бройлеров и их продуктивность. Полезные эффекты ОхВС наблюдали в отношении уровня показателей роста (масса тела и прирост массы), состояния здоровья кишечника (сниженная тяжесть поражений NE) и колонизации патогенов (сниженные содержания С. perfringens в тонкой кишке). Факт того, что птицы, получившие ОхВС, вели себя так же, как и здоровые, незараженные контроли, является еще одним свидетельством защитных эффектов продукта.

Согласно одному варианту осуществления применение дополнения к корму в виде 2-6 ppm ОхВС в качестве кормовой добавки на коммерческих фермах по разведению кур может вносить вклад в профилактику и улучшение NE кур и, как предполагают, характеризуется положительным эффектом в улучшении продуктивности в течение периода разведения.

ПРИМЕР 4. Доказательство того, что улучшенные показатели продуктивности животных, которых содержат для получения продуктов питания, с помощью полностью окисленного β-каротина ассоциированы с иммунологической активностью и что это является характерным признаком полностью окисленных каротиноидов.

Исходная точка - каротиноиды

Каротиноиды представляют собой желтые, оранжевые и красные пигменты, синтезируемые растениями. Существует свыше 600 известных каротиноидов, которые состоят из двух классов, называемых каротины, которые представляют собой исключительно углеводороды, и ксантофиллы, которые представляют собой каротины, замещенные одним или несколькими атомами кислорода. β-Каротин и ликопин представляют собой примеры распространенных каротинов, тогда как лютеин, зеаксантин и кантаксантин представляют собой распространенные примеры ксантофиллов. Наиболее распространенные каротиноиды в рационах жителей Северной Америки представляют собой α-каротин, β-каротин, β-криптоксантин, лютеин, зеаксантин и ликопин.

Все каротиноиды образованы из 8 изопреновых звеньев, и каждая молекула каротиноида содержит 40 атомов углерода. Структурно каротиноиды принимают форму полиеновой углеводородной цепи, которая иногда заканчивается на одном или обоих концах кольцом. Каротиноиды, которые содержат незамещенные β-иононовые кольца (включая в себя β-каротин, α-каротин, β-криптоксантин и γ-каротин), обладают активностью витамина А (что означает, что они могут превращаться в ретиналь). Напротив, лютеин, зеаксантин и ликопин не характеризуются активностью витамина А.

Цвет каротиноидов в диапазоне от бледно-желтого с ярко-оранжевым до глубокого красного напрямую связан с их структурой. Углерод-углеродные двойные связи взаимодействуют друг с другом в процессе, который носит название сопряжение, что позволяет электронам в молекуле свободно перемещаться по этим областям молекулы и легко проходить электронные переходы, поглощая энергию в области видимого света.

Конечная точка - кислород самопроизвольно образует сополимеры с каротиноидами в качестве основного продукта реакции

Та же система сопряженных двойных связей, которая приводит к интенсивному цвету каротиноидов, также делает их очень восприимчивыми к спонтанной реакции с молекулярным кислородом. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что реакция окисления происходит преимущественно путем добавления многочисленных молекул кислорода к молекуле каротиноида с образованием продуктов на основании сополимера каротиноида и кислорода [1, 2 и 11]. Например, β-каротин, растворенный в подходящем органическом растворителе (например, бензоле, этилацетате), реагирует с почти 8 эквивалентами молекулярного кислорода, приводя в результате к увеличению чистой массы приблизительно на 30%. Продукт, ОхВС главным образом состоит из полимеров (85% по массе) с норизопреноидными продуктами разложения (15%), обеспечивающими равновесие.

Самопроизвольная реакция β-каротина с кислородом происходит преимущественно путем добавления с образованием полимеров с высоким содержанием кислорода. ОхВС представляет собой общий продукт реакции и состоит как из полимера (85%), так и продуктов расщепления (15%). Другие каротиноиды реагируют аналогично с преобладанием образования полимерного продукта.

Преобладание полимерного продукта также находит отражение в эмпирической формуле ОхВС (таблица), которая лишь слегка отличается от эмпирической формулы своего выделенного полимерного продукта и согласуется с добавлением многочисленных молекул О₂ на молекулу β-каротина. На хроматограмме ОхВС с проникновением в гель-фазу (GPC) (т.е. полученной с помощью гель-фильтрации хроматограмме) доминирует широкий пик, продолжающийся вплоть до приблизительно 8000 Да с медианной MW, составляющей 900 Да. (фиг. 2А)

Протяженные системы неразветвленных сопряженных двойных связей, представленные в β-каротине, являются общими для всех каротиноидов, поэтому ожидается, что другие каротиноиды будут вести себя аналогично в своих самопроизвольных реакциях с молекулярным кислородом. В таблице ниже показано, что это ожидание подтверждается, что проиллюстрировано путем сравнения результатов полных окислений β-каротина, ликопина, кантаксантина и лютеина.

Сравнение результатов самопроизвольного, полного окисления кислородом β-каротина, ликопина, кантаксантина и лютеина проиллюстрировано в следующей таблице:

n.d. - не определено.

Как и в случае с окислением 6-каротина, все указанные каротиноиды демонстрируют высокое поглощение кислорода, что отражено в общем существенном увеличении (≥25%) массы продукта и сходных эмпирических формулах, с преобладанием полимерных продуктов, как показано с помощью их GPC (фиг. 2B-3D). Более того, все из полностью окисленных каротиноидов характеризуются поразительно сходными инфракрасными спектрами (FTIR) (фиг. 3A-3D).

Усиление иммунной функции - пример полностью окисленного β-каротина (ОхВС)

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что ОхВС способен проявлять необычную двойную функцию при выполнении иммунологической функции [3-5]. Два эффекта представляют собой (1) способность примировать и усиливать врожденную иммунную функцию [2, 3] и (2) способность ограничивать избыточное воспаление [12]. Указанные эффекты не зависят от какой-либо связанной с витамином А активности, поскольку ОхВС не содержит как В-каротин, так и витамин А [3], и, более того, было показано, что у него отсутствует способность активировать рецепторы ретиноевой кислоты [3].

Открытие этой активности связано с признанием того, что полимерные продукты β-каротина преимущественно образуются самопроизвольно в реакции с молекулярным кислородом [2] и что указанные продукты главным образом отвечают за наблюдаемые иммунологические активности [3] (см. ниже).

Поскольку этот тип характера окисления не ограничивается только β-каротином, но характерен для каротиноидов в целом (см. выше), указанные наблюдения предоставляют осязаемую, заслуживающую доверия и проверяемую основу для объяснения эффектов, не относящихся к витамину А, как у являющихся провитамином А каротиноидов (α-, β- и γ-каротинов и β-криптоксантина), так и у более многочисленных каротиноидов, которые не могут превращаться в витамин А.

Предварительный скрининг ОхВС с использованием биочипа для определения экспрессии генов на основе ПЦР показал паттерн активности, указывающий на потенциал в отношении двух ключевых иммуномодулирующих способностей (таблица 3 в ссылке [2]). В этой первой способности, относящейся к модуляции врожденной иммунной функции, ОхВС положительно регулирует экспрессию генов, кодирующих продукты, которые функционируют в чувствительности к патогену и обнаружении патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (РАМР), включая в себя toll-подобные рецепторы (TLR) и другие белки, которые действуют как кофакторы для обнаружения РАМР, такие как CD-14 (кластер дифференцировки 14).

Способность примировать врожденную иммунную функция подтвердили как in vitro, так и in vivo, на что указывает увеличенная экспрессия рецепторов TLR и CD14 плазматической мембраны (фиг. 1 и 2 в ссылке [3]). Более того, как будет описано ниже, анализ на основе экспрессии рецептора CD14 показывает, что полимерный продукт главным образом, если не полностью, отвечает за активность OxC-beta.

Распространение на другие полностью окисленные каротиноиды - демонстрация увеличенных содержаний рецепторов иммунного надзора с помощью полностью окисленного ликопина

Центральной для усиливающих иммунитет действий ОхВС является его способность увеличивать содержание чувствительных к патогену иммунных рецепторов, включая в себя toll-подобные рецепторы подтипов 2 и 4 (TLR-2 и TLR-4) и CD14. Указанные рецепторы играют важную роль в обнаружении патогена и активации системы врожденного иммунитета. Путем увеличения присутствующего у хозяина набора иммунных рецепторов ОхВС эффективно повышает уровень иммунного надзора в отношении патогенов.

Для оценки способности других каротиноидов усиливать врожденный иммунитет разработали анализ на основе положительной регуляции рецепторов иммунного надзора CD14 [3]. Полностью окисленный ликопин (OxLyc) сравнивали с полностью окисленным β-каротином (ОхВС). Хотя ликопин содержит такое же число линейно сопряженных двойных связей, как и β-каротин, у него отсутствуют циклогексильные группы на каждом конце.

На фиг. 4А показана линейная зависимость ответа от дозы экспрессии CD14 от концентрации ОхВС и OxLyc, соответственно, а также то, что их активности по существу неразличимы. Сравнение продукта-ликопина с продуктом-β-каротином указывает на отсутствие влияния циклогексильных групп на ответ иммунного рецептора CD14.

Сополимеры каротиноида и кислорода отвечают за усиленный врожденный иммунитет

На фиг. 4В показано, что существует полимерная фракция ОхВС, которая главным образом отвечает за положительно регулируемую экспрессию CD14. Эти данные и по существу эквивалентные активности ОхВС и OxLyc в анализе CD14 согласуются с преобладанием полимерного продукта в каждом из окисленных каротиноидов и сильным сходством между их спектрами FTIR, указывая на существование общих структурных элементов в полимерах окисленных каротиноидов.

Экспрессию CD14 количественно определяли с использованием анализа FACS. Эффект каждого соединения показан относительно необработанных клеток. Точки представляют среднее и среднеквадратическую ошибку от трех отдельных экспериментов. (A) OxLyc характеризовался значимым эффектом от дозы на содержание CD14 на поверхности (р=0,020), что значимо не отличалось от эффекта ОхВС. (В) Корреляционный анализ указывает на значимый эффект от дозы для каждого соединения на экспрессию CD14 с р-значениями, составляющими 0,0036 для ОхВС, 0,0034 для полимера и 0,0113 для мономера. Сравнение относительной активности каждого соединения (В) показывает, что мономер являлся значимо менее активным, чем полимер (р<0,001) и ОхВС (р<0,01), при этом отсутствует значимое отличие между активностями полимера и ОхВС. Кажущаяся активность мономера может быть обусловлена присутствием низкомолекулярных полимеров, которые не могут быть полностью удалены из мономерной фракции (из ссылки [3]).

Важность усиления врожденного иммунитета для производства животноводческой продукции

Современные линии сельскохозяйственных животных были выбраны для оптимального роста, эффективностей использования кормов и уровней продукции. Сопутствующим генетическому отбору для более высоких производственных потенциалов явилось снижение иммунологического потенциала, который является метаболически затратным для животного. Как следствие современные виды сельскохозяйственных животных предрасположены к инфекции. Указанная предрасположенность в сочетании с окружающими условиями интенсивного производства делает животных, которых содержат для получения продуктов питания, уязвимыми к инфекции, обусловленной многочисленными патогенами. Снижение темпов роста, эффективностей использования кормов и увеличенных уровней смертности от инфекций представляют значительную экономическую угрозу для промышленного животноводства во всем мире. Чтобы попытаться смягчить угрозу, которую представляют собой инфекции, промышленность обратилась к разработке ингредиентов кормов со способностью усиливать врожденную иммунную защиту хозяина. ОхВС представляет один такой ингредиент корма со способностью благоприятно воздействовать на систему врожденного иммунитета хозяина.

В такой ситуации можно увидеть важность усиливающих иммунитет действий ОхВС. Посредством своей способности увеличивать содержание чувствительных к патогенам иммунных рецепторов, включая в себя TLR-2, TLR-4 и CD14, ОхВС может усилить жизненно важную роль обнаружения патогенов и активации врожденной иммунной системы. Путем увеличения присутствующего у хозяина набора иммунных рецепторов ОхВС эффективно повышает уровень иммунного надзора в отношении патогенов.

Этот повышенный надзор приводит к более ранней стадии обнаружения, реакции и клиренсу патогенов. Иммунологические ответы являются метаболически затратными и могут отвлекать ресурсы от роста и связанных с получением продукции путей. Посредством своих эффектов на экспрессию иммунных рецепторов ОхВС обеспечивает механизм для профилактики инфекций на ранней стадии, тем самым ограничивая объем и продолжительность иммунологического ответа и экономному расходу метаболических ресурсов. В результате животное поддерживается в здоровом состоянии, и метаболические ресурсы могут быть сохранены и направлены на достижение полного потенциала роста животного.

Хотя вышеизложенное изобретение описано более подробно для целей ясности и понимания, специалисту в настоящей области техники, из прочтения настоящего раскрытия, будет понятно, что можно произвести различные изменения в форме и деталях, не отклоняясь от действительного объема настоящего изобретение в прилагаемой формуле изобретения.

Все публикации, патенты и заявки на выдачу патента полностью включены в настоящий документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на выдачу патента была специально и индивидуально полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.

ССЫЛКИ

Burton, GW, Daroszewski, J, Phipps, J. 1995. Extensively oxidized derivatives of carotenoids, retinoids and related conjugated polyenes useful as non-toxic cell-differentiation inducers, anti-proliferative agents, and anti-tumor agents. US Patent 5,475,006.

Burton, GW, Daroszewski, J, Nickerson, JG, Johnston, JB, Mogg, TJ, Nikiforov, GB. 2014. β-Carotene autoxidation: oxygen copolymerization, non-vitamin A products and immunological activity. Can. J. Chem. 92: 305-316.

Johnston JB, Nickerson JG, Daroszewski J, Mogg TJ, Burton GW. 2014. Biologically active polymers from spontaneous carotenoid oxidation: a new frontier in carotenoid activity. PLoS ONE 9 e 111346.

Cui B, Liu S, Wang Q, Lin X. 2012. Effect of β-carotene on immunity function and tumour growth in hepatocellular carcinoma rats. Molecules 17: 8595-8603.

Shojadoost B, Vince AR, Prescott JF. 2012. The successful experimental induction of necrotic enteritis in chickens by Clostridium perfringens: a critical review. Veterinary research 43: 74.

Prescott JF, Sivendra R, Barnum DA. 1978. The use of bacitracin in the prevention and treatment of experimentally-induced necrotic enteritis in the chicken. The Canadian veterinary journal 19: 181-183.

Gholamiandehkordi AR, Timbermont L, Lanckriet A, Van Den Broeck W, Pedersen K, Dewulf J, Pasmans F, Haesebrouck F, Ducatelle R, Van Immerseel F. 2007. Quantification of gut lesions in a subclinical necrotic enteritis model. Avian pathology 36, 375-382.

Chen CY, Nace GW, Irwin PL. 2003. A 6×6 drop plate method for simultaneous colony counting and MPN enumeration of Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, and Escherichia coli. Journal of microbiological methods 55, 475-479.

Yan F, Zhao Y, Hu Y, Qiu J, Lei W, Ji W, Li X, Wu Q, Shi X, Li Z. 2013. Protection of chickens against infectious bronchitis virus with a multivalent DNA vaccine and boosting with an inactivated vaccine. J Vet Sci. 14:53-60.

Antao EM, Glodde S, Li G, Sharifi R, Homeier T, Laturnus C, Diehl I, Bethe A, Philipp HC, Preisinger R, Wieler LH, Ewers C. 2008. The chicken as a natural model for extraintestinal infections caused by avian pathogenic Escherichia coli (APEC). Microb Pathog. 45:361-369.

Burton, G.W., et al., Oxidized carotenoids, retinoids and related conjugated polyenes, and derived fractions and compounds useful as cell-differentiation inducers, cytostatic agents, and anti-tumor agents, in WO 96/05160, W.I.P. Organization, 1996.

Duquette, S.C., et al., Anti-inflammatory benefits of retinoids and carotenoid derivatives: retinoic acid and fully oxidized β-carotene induce caspase-3-dependent apoptosis and promote efferocytosis of bovine neutrophils. Am J Vet Res, 2014. 75.

Некротический энтерит (NE) широко встречается у коммерческих кур-бройлеров, если их производят без применения противомикробных стимуляторов роста. Настоящее изобретение относится к способу и применению окисленных каротиноидов, их компонентов и содержащих их композиций и продуктов, таких как ОхВС (продукт 'ОхС-beta™' от Avivagen Inc., Canada) для профилактики некротического энтерита у таких животных, как сельскохозяйственная птица. 3 з.п. ф-лы, 11 табл., 3 пр., 4 ил.

1. Применение полностью окисленного бета-каротина (ОхВС) для снижения тяжести поражений кишечника ассоциированных с некротическим энтеритом (NE) у сельскохозяйственных птиц, где применение включает введение эффективного количества полностью окисленного бета-каротина указанным сельскохозяйственным птицам, при выращивании сельскохозяйственных птиц без антибиотиков.

2. Применение по п. 1, при котором сельскохозяйственная птица представляет собой цыпленка-бройлера.

3. Применение по п. 1 или 2, при котором эффективное количество составляет 2-30 ppm от рациона.

4. Применение по п. 1, где полностью окисленный бета-каротин вводят в качестве корма для сельскохозяйственной птицы, содержащего 2-30 ppm полностью окисленного бета-каротина.