Способ моделирования экспериментального воспаления легких у крыс Российский патент 2021 года по МПК G09B23/28 

Область применения: экспериментальная медицина и ветеринария. Изобретение предназначено для изучения патогенеза воспаления легких, тестирования средств профилактики и лечения, разработки методов диагностики.

Проблема воспаления легких (пневмония) остается одной из актуальных в клинической и экспериментальной медицине. Согласно данным официальной статистики, в России заболеваемость пневмонией взрослых варьировала от 344,0 до 403,4 на 100 тыс. населения. Реальная заболеваемость пневмонией существенно выше регистрируемой, общее число больных пневмонией ежегодно составляет 1,5 млн., каждый год от пневмонии погибает более 40 тысяч человек, при этом наиболее высокая смертность регистрируется у мужчин трудоспособного возраста [16, 17].

По данным Чучалина А.Г. (2010) пневмония относится к наиболее частым заболеваниям у человека и является одной из ведущих причин смерти от инфекционных болезней [16].

Несмотря на современное развитие медицины, этиологическая диагностика, лечение, регистрация пневмоний до настоящего времени представляет определенные трудности. Необходимость разработки вопросов патогенетически обоснованной терапии пневмонии, патогенеза данной патологии, методов диагностики диктуется медицинской и социальной значимостью [3, 14].

В настоящее время под пневмонией понимают острое, инфекционное, неспецифическое воспаление легочной ткани, приводящее к заполнению просвета альвеол воспалительным эксудатом и образованию вследствие этого легочного инфильтрата. Пневмонии - группа различных по этиологии, патогенезу и морфологической характеристике острых инфекционных (преимущественно бактериальных) заболеваний, характеризующихся очаговым поражением респираторных отделов дыхательных путей с обязательным наличием внутриальвеолярной экссудации [6, 8].

Этиология внебольничной пневмонии непосредственно связана с нормальной микрофлорой, колонизующей верхние отделы дыхательных путей. Из многочисленных микроорганизмов лишь некоторые, обладающие повышенной вирулентностью, способны при попадании в нижние отделы дыхательных путей вызывать воспалительную реакцию. Такими типичными возбудителями внебольничной пневмонии являются: Streptococcuspneumoniae (30-50% случаев заболевания); Haemophilusinfluenzae (10-20%). Определенное значение в этиологии внебольничной пневмонии имеют атипичные микроорганизмы, на долю которых в сумме приходится от 8 до 25% случаев заболевания, хотя точно установить их этиологическую значимость в настоящее время сложно: Chlamydophila (Chlamydia) pneumonia, Mycoplasmapneumonia, Legionellapneumophila. К типичным, но редким (3-5%) возбудителям внебольничной пневмонии относятся: Staphylococcusaureus, Klebsiellapneumoniae, реже - другие энтеробактерии [3, 17].

Энтеробактерии (Е. coli, Proteusspp., Klebsiellaspp., псевдомонадами) характерны для абдоминальной хирургической патологии, такой как перитонит [13]. Перитонит относится к полимикробным заболеваниям с плохим прогнозом. Смертность от перитонита колеблется от 3,5% при проникающих ранениях брюшной полости до 60% при абдоминальном сепсисе с полиорганной недостаточностью. Главными этиологическими агентами при этих типах перитонита являются грамотрицательные бактерии (в основном семейства Enterobacteriaceae) и энтерококки, как правило, в сочетании с анаэробными микроорганизмами (Bacteroidesspp., Fusobacteriumspp., Clostridiumspp.). Наиболее часто при вторичном перитоните из брюшной полости выделяются несколько видов микроорганизмов [2], причем в 90% случаев идентифицируются аэробно-анаэробные ассоциации микроорганизмов [3]. В качестве наиболее частых патогенов при перитоните выделяют Escherichiacoli и Bacteroidesfragilis, менее часто - Bacteroidesspp., Fusobacteriumspp., Clostridiumspp., различные виды рода Enterobacteriaceae, Enterococcusspp., Peptostreptococcusspp., Eubacteriumspp [2].

Бактерии в легкие могут проникнуть несколькими путями: аспирация секрета ротоглотки; вдыхание аэрозоля, содержащего микроорганизмы; гематогенное распространение микроорганизмов из внелегочного очага инфекции; непосредственное распространение инфекции из соседних пораженных органов или в результате инфицирования при проникающих ранениях грудной клетки [10].

Исходя из способа проникновения микроорганизмов в легкие, существуют различные методики моделирования пневмонии.

В настоящий момент существует несколько методик моделирования пневмонии в эксперименте.

Экспериментальную пневмонию вызывали путем интраназального заражения мышей штаммами бактерий в дозе, соответствующей LD50. Штаммы P. aeruginosa, Е. coli, Enterobacterspp. были выделены из бронхоальвеолярной лаважной жидкости больных с установленным диагнозом нозокомиальная пневмонии [7]. Модель бронхопневмонии сочетанной этиологии воспроизводили путем первичного ингаляционного метода повреждения бронхолегочной системы с последующим инфицированием бактериальным агентом. Для этого белых крыс помещали на 5 мин в герметичную камеру объемом 7,5 дм³ с содержанием в воздухе 2 г дихлофоса в виде аэрозоля. Через 1 сут на слизистую оболочку ротоглотки животных наносили 0,2 мл свежей культуры Staphylococcusaureus (титр 1 млрд/мл) [11]. Данные модели подразумевают работу с изолированными бактериальными культурами, что технологически сложно, требует специального оборудования и небезопасно для исследователя.

Щербак В.В., и Кубышкин А.В. пневмонию моделировали путем введения стерильной капроновой нити диаметром 0,2 мм и длиной 3,5 см в трахею животных [18]. Такой метод приводит к асептическому воспалению легочной ткани, что не соответствует патогенезу пневмонии.

В связи с большим значением в этиологии пневмонии условно-патогенной флоры, нами была выдвинута гипотеза, о том, что моделировать воспаление легких можно также, путем использования аутокала.

Предложенное нами изобретение позволяет сделать дешевле и безопасней для экспериментатора методику моделирования пневмонии при абдоминальной патологии.

Для моделирования воспалительного процесса брюшины крыс используется раствор аутокаловых масс (Никонова В.М. Местная детоксикация в комплексном лечении разлитого аппендикулярного перитонита у детей. Автореф. канд. диссертации, М., 1988).

В связи с большим значением в этиологии пневмонии условно-патогенной флоры, нами была выдвинута гипотеза, о том, что моделировать пневмонию можно также, путем использования аутокала. Среди бактерий, культивированных из ЖКТ, более 99,9% являются облигатными анаэробами, из которых доминирующими представителями являются: Bacteroides, Bifidobacterium, Eubacterium, Lactobacillus, Clostridium, Fusobacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus, Escherichia и Veillonella [1].

Аутокаловая взвесь готовится непосредственно перед экспериментом. За сутки до начала эксперимента крысам не давали пищу при свободном доступе к воде. Кал половозрелых крыс собирается и смешивается с физиологическим раствором в пропорции 1:10 (Никонова В.М, 1988 г.), раствор дважды фильтруют сквозь марлевый стерильный материал.

Эксперименты выполнены на 30 половозрелых белых крысах линии Вистар массой 198±3,8 г., обоего пола. Животные содержались в обычных условиях вивария на стандартной диете. Все эксперименты проводились в утренние часы натощак под анастезией Рометаром (2-3 мг на 1 кг массы животного) с соблюдением стандартов. Учитывая, что дыхательный объем легких крысы невелик (всего около 0,6-1 мл), то введение больших объемов жидкости невозможно [9].

Для достижения необходимой степени воспаления в легких объем может варьировать в пределах 0,1-0,4 мл. Снижение объема может привести к отсутствию эффекта, увеличение - к смерти [12].

Характеристика подгрупп и описание гистологической картины легких на 7 сутки после моделирования пневмонии

Гистологический забор тканей (легкое)производился на 7 сутки после моделирования пневмонии путем торокотомии. Животного выводили из эксперимента, путем введения летальной дозы Рометара. Полученный препарат из ткани фиксировали в нейтральном забуференном формалине, заливали парафином по общепринятой методике. Гистологические методы включали окраску Гематоксилин-Эозином.

На 7 сутки в ходе морфологического исследования определяются типичные признаки воспаления легких: Морфологические изменения, количество клеток воспалительного инфильтрата оценивали в препаратах по визуально-аналоговой шкале Э.А. Казачкова (1985.) Конкретные примеры выполнения эксперимента:

Пример 1.

Половозрелой самке, массой 210 гр, находившуюся на стандартной диете, после обработки раствором антисептика боковой поверхности грудной клетки справа по аксиллярной линии, выполнена инъекция аутокаловой взвеси в объеме 0,1-0,2 мл. В течение 7 последующих суток крыса имела свободный доступ к воде и пище. За сутки до окончания эксперимента животное находилось в состоянии пищевой депривации при свободном доступе к воде. На 7 сутки животное наркотизировали Рометаром (3-4 мг/кг) и проводили торокотомию с последующим изъятием правого легкого для гистологического исследования.

Результат гистологического исследования:

Умеренно выраженное полнокровие сосудов стромы и межальвеолярных перегородок. В лимфоидной ткани отмечаются незначительные признаки гиперплазии в виде скоплений макрофагов. В отдельных бронхиолах обнаруживаются признаки бронхоспазма. В просветах бронхиол определяются единичные клетки десквамированного бронхиального эпителия. Межальвеолярные перегородки незначительно инфильтрированы лимфоцитами, гистиоцитами, плазматическими клетками, единичными нейтрофилами и эозинофилами. В паренхиме легких отмечается единичные ателектазы и участки острой эмфиземы.

Заключение: Острая пневмония.

Пример 2.

Половозрелому самцу, массой 222 гр, находившемуся на стандартной диете после обработки раствором антисептика боковой поверхности грудной клетки справа по аксиллярной линии выполнена инъекция аутокаловой взвеси в объеме 0,3-0,4 мл. В течение 7 последующих суток крыса имела свободный доступ к воде и пище. За сутки до окончания эксперимента животное находилось в состоянии пищевой депривации при свободном доступе к воде. На 7 сутки животное наркотизировали Рометаром (3-4 мг/кг) и выполняли торакотомию с последующим изъятием правого легкого для гистологического исследования.

Результат гистологического исследования

При гистологическом исследовании выявлено выраженное полнокровие капилляров межальвеолярных перегородок, умеренно выраженное и выраженное полнокровие сосудов стромы. В лимфоидной ткани отмечаются признаки гиперплазии в виде скоплений макрофагов. В просветах бронхиол определяются клетки десквамированного бронхиального эпителия в небольшом количестве, следы слизи, следы бесструктурных слабо эозинофильных масс. Межальвеолярные перегородки диффузно инфильтрированы лимфоцитами, гистиоцитами, плазматическими клетками, единичными нейтрофилами и эозинофилами. В паренхиме легких отмечается очаговые ателектазы и участки острой эмфиземы.

Заключение: Острая пневмония.

Пример 3.

Половозрелый самец, массой 220 гр, находящийся на стандартной диете после обработки растворами антисептиков боковой поверхности грудной клетки справа по аксиллярной линии выполнена инъекция аутокаловой взвеси в объеме 0,5-0,6 мл. В течение последующих суток крыса имела свободный доступ к воде и пище. На 3 сутки крыса умерла. Посмертно выполнялась торокотомия с последующим изъятием правого легкого для гистологического исследования.

Результат гистологического исследования

В просвете альвеол экссудат, представленный скоплением сегментоядерных нейтрофилов, их обломков, макрофагов. Местами инфильтрация распространяется на межальвеолярные перегородки, разрушая их, с формированием абсцессов. Перибронхиально инфильтрация лейкоцитами, в просвете части бронхиол определяются клетки десквамированного бронхиального эпителия в небольшом количестве, следы слизи и единичные лейкоциты. В субплевральных отделах отмечаются острые эмфиземы.

Заключение: Острая пневмония.

Приведенные данные показывают, что данная методика позволяет добиться поставленной цели. Удалось смоделировать острую пневмонию с применением доступной, безопасной и технически простой методики.

Литература:

1. Барановский А.Ю., Кондрашина Э.А. Дисбактериоз и дисбиоз кишечника. - Санкт-Петербург: Питер. - 2000. - С. 17.

2. Бухарин О.В. Влияние invitro препарата лейкоцитарного катионного белка «Интерцид» на Escherihiacoli / О.В. Бухарин, В.А. Гриценко // Антибиотики и химиотерапия. - 2000. - №1 -. - С. 16-20.

3. Вишнякова Л.А. Роль Streptococcuspneumoniae, Mycoplasmapneumoniae и Chlamydiapneumoniae при внебольничной пневмонии у детей / Л.А. Вишнякова, М.А. Никитина, С.И. Петрова и др. // Пульмонология. - 2005. - №3. - с. 43-47.

4. Волков А.Г. Клинико-микробиологическая характеристика абдоминальной хирургической инфекции и ее этиотропная терапия // Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Пермь. - 2016.

5. Горлов А.В. Отимизация лечебно-диагностической тактики у больных острым аппендицитом с применением видеоэндоскопических технологий. Автреф. канд. мед. нак., Воронеж. - 2008. – 2.

6. Е.С. Мазур, М.А., Бачурина, И.Ю. Колесникова. Болезни органов дыхания. Практикум. Тверь, 2014 г. - 25 с.

7. Костюшко А.В., Кондрашова Н.М., Маркелова Е.В. Изучение активности клеточного иммунного ответа в модели экспериментальной бактериальной пневмонии // Fundamentalreserch №11, 2011, С. - 516-518.

8. Окороков А.Н. Диагностика болезней внутренних органов: Т. 3. Диагностика болезней органов дыхания: - М.: Мед. лит., 2001.- 464 с.: ил.

9. Петренко В.М. Анатомия легких у белой крысы // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2013. - №10 - 3. - С. 414-417; URL: https://applied-research.ru/ru/article/view?id=4220 (дата обращения: 09.08.2019).

10. Пневмония: учебно-методическое пособие / В.Н. Марченко [и др.]; под. ред. В.И. Трофимова. - СПб.: Издательство СПбГМУ, 2012. - 80 с.

11. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У. Хабриева. - М.: Медицина, 2005. - 398 с.

12. Рыбакова А.В. Методические указания по экспериментальному моделированию ЛПС индуцированной пневмонии у крыс. Сообщение №1 / А.В. Рыбакова, М.Н. Макарова, В.Д. Соколов, К.Л Крышень, С.В. Ходько, В.Г. Макаров // Международный вестник ветеринарии, №4, 2013 г. С - 106-116.

13. Савельева В.С. Перитонит: Практическое руководство / Под ред. В.С. Савельева, Б.Р. Гельфанда, М.И. Филимонова - М.: Литтерра, 2006. - 208 с. - (Серия «Практические руководства»). ISBN 5 98216 046 6.

14. Синопальников А.И. «Трудная» пневмония. / А.И. Синопальников, А.А. Зайцев // - М. - 2010. - 56 с.

15. Фирсова В.Г. Микробиологическая диагностика и выбор антимикробной терапии инфекции желчевыводящих путей / В.Г. Фирсова, В.В. Паршников, И.В. Чеботарь и др. // Анналы хирургической гепатологии. - 2013. - Т. 20, №1. - С. 124 - 131.

16. Чучалин А.Г. Внебольничная пневмония у взрослых. Практические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике / А.Г. Чучалин, А.И. Синопальников, Р.С. Козлов, И.Е. Тюрин, С.А. Рачина. - М. 2010. - 60 с.

17. Чучалин А.Г., Синопальников А.И., Козлов Р.С.и соавт. Внебольничная пневмония у взрослых: практические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике. Пособие для врачей. - Смоленск: МАКМАХ, 2010. - 80 с. - ISBN 978-5-918-12-010-1.

18. Щербак В.В. Изменения неспецифических протеиназ и их ингибиторов при коррекции течения экспериментального воспаления легких антибиотиками, ингибиторами протеаз и антиоксидантами / В.В. Щербак, И.И. Фомочкина, А.В. Кубышкин, // Таврический медико-биологический вестник. - 2012, том 15, №3, ч. 1 (59).

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к терапии и пульмонологии, и касается моделирования экспериментального воспаления легких у крыс. Для этого в паренхиму легких экспериментальных животных чрескожно вводят от 0,3 до 0,4 мл взвеси аутокала в физиологическом растворе в пропорции 1:10. Такое эмпирически подобранное количество патологического материала обеспечивает развитие типичной картины острой пневмонии на 7 сутки эксперимента. 3 пр., 1 табл.

Способ моделирования воспаления легких, отличающийся тем, что с целью упрощения существующих методик в паренхиму легких чрезкожно вводится от 0,3 до 0,4 мл взвеси аутокала в физиологическом растворе в пропорции 1:10 с последующим формированием картины, типичной для воспаления легких, на 7-е сутки после моделирования.