Наборы олигонуклеотидов для количественного определения провируса лейкоза крупного рогатого скота Российский патент 2021 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, к ветеринарной медицине, к способу определения провируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) в образцах крови и спермы КРС, а именно, к разработке олигонуклеотидов для количественного молекулярно-генетического анализа провируса лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, и может быть использовано для выявления животных - вирусоносителей, в том числе среди новорожденных телят сразу после отела, с целью формирования безвирусного ремонтного поголовья крупного рогатого скота и выращивания ремонтного молодняка, свободного от ВЖРС.

Известны способы определения провируса лейкоза КРС, основанные на иммунологических и молекулярно-генетических методах.

В настоящее время чаще всего для выявления вирусоносителей используют иммунологические методы РИД (радиальной иммунодиффузии) и ИФА (иммуноферментный анализ), для которых выпускаются соответствующие коммерческие диагностические наборы. У зараженных животных в крови циркулируют антитела против gp51 (белки оболочки) и р24 (к белкам gag). Антитела к др51 появляются раньше и в более высоком титре, чем антитела к р24 и, серологические реакции, направленные на выявление антител против др51, по своей чувствительности превосходят реакции, в которых используется в качестве антигена белок р24. В целом, чувствительность метода достаточно низкая.

Метод ПЦР (полимеразной цепной реакции) разработан для диагностики провируса лейкоза КРС и применяется в нескольких регионах России для массового скрининга животных, но этот метод требует проведения анализа амплифицированного фрагмента с помощью электрофореза в агарозном геле, при этом возможна контаминации проб, что приводит в ложноположительным реакциям и к последующей ошибочной выбраковке животных.

ПЦР-РВ (ПЦР в реальном времени) основана на количественной детекции флуоресцентного сигнала, который увеличивается пропорционально количеству ПЦР-продукта. Следовательно, результат ПЦР в реальном времени можно регистрировать в процессе реакции, в каждый момент времени. Современная тест-система ПЦР в реальном времени содержит пару праймеров и дополнительный TagMan зонд, комплементарный внутреннему участку фрагмента. К зонду ковалентно пришиты две молекулы: на 5-конце флуоресцентная метка («reporter»), она испускает флуоресценцию, на 3'- конце гаситель флуоресценции («quencher»), который гасит флуоресценцию флуоресцирующей молекулы. В ходе реакции Tag-полимераза, продвигаясь по матрице, достигает зонда и расщепляет его. При этом расстояние между флуоресцентной меткой и гасителем флуоресценции увеличивается, флуоресценция больше не гасится (рисунок 1).

Недостатком иммунологических способов выявления вирусоносительства является то, что их использование возможно при достижении телятами возраста 6 месяцев, когда из крови исчезают колостральные антитела.

Недостатком ПЦР является возможность получения ложноположительных результатов, поэтому для устранения этого недостатка в лабораториях необходимо организовать 2 рабочие зоны, надежно изолированные друг от друга, что требует дополнительных затрат средств и наличия 2-3 отдельных лабораторных комнат, что далеко не всегда возможно. В настоящее время для выявления вирусоносителей по ВЛКРС предложен способ ПЦР-РВ, лишенный этих недостатков.

Прототипом в настоящей работе является патент №2521330 (автор Косовский Г.Ю. и соавт.), которые предложили «Способ выявления вируса лейкоза КРС по нуклеотидным последовательностям консервативных областей вирусного генома». Их изобретение обеспечивает детектирование провируса ВЛКРС за счет генов группоспецифического антигена (gag) для ядра и структурных белков вируса и полимеразы для обратной транскриптазы pol. Недостатками метода являются

- невысокая чувствительность - при низком уровне матрицы после 30-35 циклов реакции появляются неспецифические продукты реакции, в том числе в отрицательном контроле, что недопустимо в принципе;

- недостатком прототипа является нереализованная возможность количественного обнаружения провируса.

Задачей изобретения является разработка наборов олигонуклеотидов и подхода, являющегося основой для способа выявления провируса лейкоза крупного рогатого скота методом ПЦР-РВ, имеющего следующие преимущества по сравнению с прототипом:

1) повышенная специфичность детекции ВЛКРС, что стало возможным благодаря двум флуоресцентным меткам TagMan;

2) возможность увеличения количества циклов ПЦР для повышения чувствительности метода;

3) возможность проводить генотипирование местных изолятов вируса лейкоза, используя аллель-специфичные праймеры для гена env в реакции ПЦР в реальном времени.

Задача решается тем, что выявление провируса ВЛКРС с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени проводится на основе последовательности гена белка оболочки вируса env. Консенсусная последовательность использованного в работе фрагмента получена путем сравнения (выравнивания) 18 последовательностей разных изолятов, имеющихся в настоящий момент в банках генов (рисунок 2).

Представленная область генома ВЛКРС содержит консервативные участки, чередующиеся с вариабельными. Консервативные участки позволили подобрать олигонуклеотиды для анализа провируса лейкоза, независимо от распространенного изолята вируса. Вариабельные участки определяют антигенные свойства вируса, что является основанием для генотипирования вируса. В таблице 1 показаны наборы праймеров, включающие три прямых, два обратных праймера и две флуоресцентных пробы типа TagMan.

Для генотипирования в указанной области выбираются сайт-специфические праймеры (по 3'-концу), соответствующие участку gp51 внутри env-гена. Температура плавления линейной разрушаемой пробы TagMan должна быть на 3-5°С выше чем у пары используемых праймеров. Несколько повышенная температура плавления пробы необходима для более прочной гибридизации данного олигонуклеотида с участком провирусной ДНК, так как только в этом случае проба удержится на матрице до начала ее 5'-экзонуклеазного разрушения Taq-полимеразой.

Условия проведения реакции ПЦР-РВ приведены в таблице 2. При необходимости количество циклов увеличивается.

Результат применения подобранных праймеров при определении провируса ВЛКРС в образцах крови телят показан на рисунке 3.

Особенностью предлагаемого способа выявления провируса ВЛКРС с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени является наличие в наборе трех прямых, двух обратных праймеров и 2 флуоресцентных разрушаемых проб внутри одной последовательности внутри гена env, что позволяет существенно повысить специфичность и точность реакции, а также чувствительность при определении малых доз провируса в образце. Минимально выявляемое количество молекул вирусной ДНК равно 50-100 молекул на пробу при 40 циклах реакции.

Для подтверждения возможности использования методики ПЦР-РВ для массового скрининга были проанализированы образцы геномной ДНК животных четырех групп разного возраста и различным статусом по заболеваемости лейкозом, результаты представлены в таблице 4.

Полученные данные свидетельствуют о широком распространении ВЛКРС. Причем среди молодняка доля инфицированных животных значительно ниже, чем у взрослых коров. Среди РИД + скота только у половины обнаружен провирус лейкоза, что говорит либо об устойчивости животных к персистенции вируса в периферической крови, либо о бессимптомном вирусоносительстве, либо о сниженной специфичности реакции иммунопреципитации. Животные с гематологическими проявлениями лейкоза имеют 100%, как и должно быть, поскольку это больные животные.

Список использованной литературы

Косовский Г.Ю., Климов Е.А., Горюнов Д.В., Сиволапова А.Б. Пат.2521330 РФ, МПК С2 G01N. Способ выявления вируса лейкоза КРС по нуклеотидным последовательностям консервативных областей вирусного генома [Текст] /; заявл. 15.06.2012; опубл. 20.12.2013.

Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю., Семенов П.А., Савилова A.M., Кофиади И.А., Абрамов Д.Д. ПЦР в реальном времени. - М., Издательство: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009, - 223 с. ил.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой набор олигонуклеотидов для анализа провируса лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, включает три прямых праймера: env_5400_F ttc-cct-ctg-tca-gat-cat-gg; env_5442_F cac-ggg-cct-tcc-cag-a; env F aag-ggc-ggc-gcc-ggt-tt, один обратный праймер env_5620_R gga-agg-gtg-gtg-cca-tc и две флуоресцентных разрушаемые пробы типа TagMan: env_5441 (ROX) ct-acg-ggc-ctt-ccc-ag (RTQ2); env_5549 (FAM)ct-ccc-gga-cgc-cca-aa (RTQ1), позволяющий количественно определять провирус ВЛКРС с повышенной чувствительностью и высокой специфичностью. Предложенный набор олигонуклеотидов повышает чувствительность, специфичность и точность количественного определения провируса ВЛКРС методом ПЦР-РВ. 3 ил., 3 табл.

Набор олигонуклеотидов для анализа провируса лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в реальном времени включает три прямых праймера: env_5400_F ttc-cct-ctg-tca-gat-cat-gg; env_5442_F cac-ggg-cct-tcc-cag-a; env F aag-ggc-ggc-gcc-ggt-tt, один обратный праймер env_5620_R gga-agg-gtg-gtg-cca-tc и две флуоресцентных разрушаемые пробы типа TagMan: env_5441 (ROX) ct-acg-ggc-ctt-ccc-ag (RTQ2); env_5549 (FAM)ct-ccc-gga-cgc-cca-aa (RTQ1), позволяющий количественно определять провирус ВЛКРС с повышенной чувствительностью и высокой специфичностью.