Олигонуклеотидные праймеры для выявления РНК вируса энзоотического лейкоза крупного рогатого скота полимеразно-цепной реакцией Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и молекулярной генетики, а также к диагностическому способу обнаружения РНК вируса лейкоза крупного рогатого скота. Разработанные праймеры на лейкоз КРС можно применять в научно-исследовательских и диагностических целях в области ветеринарии.

Лейкоз крупного рогатого скота (ВЛКРС) – это хроническая инфекционная болезнь, вызываемая РНК-содержащим вирусом семейства Retroviridae и относится к подсемейству Oncornaviridae. Данный вирус имеет генетическое сходство с вирусом Т-клеточного лейкоза человека (Самуйленко А.Я. и др., 2006).

Вирус лейкоза КРС преимущественно поражает В-лимфоциты и вызывает персистентный лимфоцитоз у 30-70% инфицированного скота. В настоящее время лечение против вируса лейкоза крупного рогатого скота не разработано. Размножение возбудителя происходит в лифоидных клетках животных (Мищенко В.А. и др., 2018). Естественным хозяином вируса лейкоза в природе является крупный рогатый скот. Пораженный вирусом КРС остается до конца жизни инфицированным (Гулюкин М.И., 2019).

Мероприятиями по профилактике и контролю заболевания на сегодняшний день являются: охрана благополучных по болезни хозяйств от заноса ВЛКРС, оздоровление неблагополучных по лейкозу хозяйств (изолирование больных и подозрительных по заболеванию животных), проведение диагностических исследований инфицированных коров и повышение требований при осуществлении ветеринарно-гигиенических мероприятий в хозяйствах (Зубова Т.В. и др., 2018).

Отсутствие вакцинации и эффективного лечения наносит колоссальный экономический ущерб хозяйствам. Для диагностики ВЛКРС существует целый спектр методов, основанных на серологических (РИД и ИФА), а также молекулярно-генетических (ПЦР) исследованиях (Горошникова Г.А. и др., 2023).

Вирус лейкоза КРС обладает способностью к персистенции в организме животных в виде провируса в связи с чем происходит постоянная продукция специфических антител. В связи с чем используются непрямые серологические методы – реакция иммунной диффузии и иммуноферментный анализ, основанными на выявлении антитела к антигену ВЛКРС (Степанова Т. В. и др., 2016).

Ущерб, обусловленный лейкозом КРС, наносится селекции и выращиванию ценных чистых пород высокопродуктивных животных. Племенные хозяйства из-за лейкоза не могут реализовывать ценных в генетическом плане бычков и телочек, и они становятся товарными производителями мяса и молока. Также помимо ущерба и огромных затрат на ветеринарно-гигиенические мероприятия, лейкоз КРС негативно влияет на общеэкономические показатели производства животноводческой продукции (Степанова Т.В. и др., 2016).

На сегодняшний день известно большое количество синтетических олигонуклеотидных праймеров для обнаружения РНК вируса лейкоза КРС с помощью ПЦР-РВ.

Известны олигонуклеотидные праймеры для выявления РНК лейкоза КРС. Данные праймеры амплифицируют участки двух целевых генов, фланкирующие фрагменты высококонсервативного гена pol и гена tax, выявляемого на самых ранних стадиях инфекции, которые комплементарны выбранным областям генома вируса лейкоза КРС.

Однако следует отметить, что недостатком предложенного способа диагностики является длительность проведения ПЦР в режиме реального времени и высокая стоимость (Козырева Н. Г., Иванова Л. А., Степанова Т. В., Гулюкин М. И. 2018. Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции. RU 2 694 617).

Прототипом данного изобретения являются праймеры и способ выделения РНК вируса лейкоза КРС, основанный на ПЦР в режиме реального времени, состоящий из выделения РНК, включающий использование прямого и обратного олигонуклеотидного праймера, с добавлением в реакционную смесь олигонуклеотидного зонда с флуоресцентной меткой для выявления фрагмента гена провируса лейкоза крупного рогатого скота, выявляющий фрагмент гена р24 провируса лейкоза крупного рогатого скота.

Наше изобретение отличается от прототипа тем, что была создана другая нуклеотидная последовательность праймеров генома ВЛКРС, а также была выбрана другая область гена env и она является более вариабельной (Никитин A.И. Усольцев K.В., Фаизов T. Х., Чернов А. Н. 2016. Способ экспресс-диагностики лейкоза крупного рогатого скота. RU 2016 109 396).

Техническая задача изобретения – это создание олигонуклеотидных праймеров для выявления РНК вируса энзоотического лейкоза крупного рогатого скота полимеразно-цепной реакцией.

Техническим результатом изобретения является сокращение времени для проведения массовых исследований проб на наличие генома вируса энзоотического лейкоза КРС и удешевление стоимости проведения исследования.

Сущность изобретения состоит в том, что при помощи указанных олигонуклеотидных праймеров env (F) и env (R), проводят ПЦР-РВ для выявления генома ВЛКРС. В качестве мишени был выбран фрагмент гена гликопротеина (env) вируса лейкоза КРС, участвующий в кодировании двух белков gp85 и gp37. Данные белки синтезируются как единый полипептид, который проходит процессинг и транспортируется к клеточной мембране, где они остаются связанными дисульфидными связями. Белок gp85 содержит детерминанты подгрупповой специфичности, нейтрализации и связывания с рецептором.

Полученные нами праймеры позволят осуществлять идентификацию изолятов и штаммов РНК вируса лейкоза КРС.

Изобретение выявляет возбудитель лейкоза КРС у изолятов и штаммов по гену env, и их можно использовать в диагностических целях. Температурно-временной режим проведения ПЦР в режиме реального времени представлен в таблице 1.

В таблице 2 представлены праймеры для специфической амплификации.

На фигуре в графической части представлены кривые флуоресценции, которые были получены с применением праймеров при амплификации исследуемых образцов, где 1-12 – номера исследуемых образцов, ПКВ – положительный контроль выделения РНК вируса лейкоза, К⁺ – положительный контроль ПЦР.

Способ осуществляют следующим образом:

Выделение РНК из крови и суспензии органов животного проводили с применением набора «ЛЕЙКОЗ» («ИнтерЛабСервис», Россия) в соответствии с инструкцией производителя.

Для постановки ПЦР в режиме реального времени использовали следующую реакционную смесь (на одну пробу): дистиллированная воды
10 мкл; 5×буфер для ПЦР-5 мкл; смеси специфических олигонуклеотидных праймеров (10 пкМ каждого) – 2 мкл; зонд флуоресцирующий – 0,5 мкл, раствор МgCl₂ (25 mM) – 1 мкл; смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов dNTP (10 мМ) – 1 мкл; Taq-полимераза (5 ед/мкл) – 0,5 мкл, 5 мкл РНК исследуемого образца ВЛКРС.

Общий объем реакционной смеси составил 25 мкл для фрагмента гена env прямой праймер (F) 5’-GGGCACTGGCTTAGTGGAAT-3’; обратный праймер (R) 5’-TGCAACAGGGCGTAAAAAGC-3’. Учет результатов реакции осуществлялся на экране монитора компьютера в виде графика интенсивности сигнала флюоресценции (фиг.). Кривые флуоресценции, представленные на фигуре, получены в результате проведения амплификации исследуемых образцов и визуально отражают циклы, в которых наблюдается большая концентрация вируса, кривые 10-12.

Амплификацию осуществляют при следующих условиях: денатурация 95ºС 3 мин 1 цикл, 95ºС 20 сек; 2) отжиг праймеров 55ºС 20 с.; 3) элонгация 72ºС 25 с.

Цикл: денатурация – отжиг – элонгация повторяют 35 раз по каналам HEX (yellow) и по каналу FAM (green).

Детекция исследуемых образцов, с использованием разработанных олигонуклеотидов, осуществлялась на амплификаторе «CFX 96 Bio-Rad (США)» и представлена на фигуре в виде кривых. Во всех исследуемых образцах, кривая флуоресценции пересекала линию threshold и возвышалась над ней. Полученный результат свидетельствовал о наличии в образце генома вируса лейкоза КРС. Чем больше кривая флуоресценции возвышается над линией threshold, тем выше концентрация генетического материала возбудителя, а, следовательно, выше чувствительность разработанных праймеров.

Накопление флуоресцентного сигнала измеряли по каналу HEX/yellow и по каналу FAM/green. После окончания реакции были получены изображения с кривыми накоплениями флуоресцентного сигнала по каждому из образцов каналов.

Пример использования праймеров.

Пример 1. Применение реакции амплификации для обнаружения РНК вируса лейкоза КРС с использованием разработанных специфических олигонуклеотидных праймеров

Для проведения анализа методом ПЦР-РВ были взяты 12 проб сыворотки крови от крупного рогатого скота в ГБУ “Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория” в Краснодарском крае, г. Кропоткин. В качестве положительного контроля использовали изолят, выделенный на территории Саратовской области в 2022 году.

Выделение РНК из крови животных проводили с применением набора «ЛЕЙКОЗ» («ИнтерЛабСервис», Россия) в соответствии с инструкцией производителя.

Выполняли амплификацию, используя реакционную смесь следующего состава (на одну пробу): дистиллированная вода 10 мкл; 5×буфер для
ПЦР-5 мкл; смеси специфических олигонуклеотидных праймеров (10 пкМ каждого) – 2 мкл; зонд флуоресцирующий – 0,5 мкл, раствор МgCl₂ (25 mM) – 1 мкл; смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов dNTP (10 мМ) – 1 мкл;

Taq-полимераза (5 ед/мкл) – 0,5 мкл, 5 мкл РНК исследуемого образца ВЛКРС. Постановку ПЦР проводили в общем объеме 25 мкл (20 мкл реакционной смеси и 5 мкл РНК пробы).

Программа амплификации для фрагмента гена env была следующей: денатурация 95°С 3 мин 1 цикл, 95°С 20 сек.; 2) отжиг праймеров 55°С 20 с.; 3) элонгация 72°С 25 с.

Цикл: денатурация – отжиг – элонгация повторяют 35 раз по каналам HEX (green).

В процессе конструирования дизайна олигонуклеотидных праймеров основными параметрами должны быть следующие: степень гомологии, отсутствие самокоплементарных участков внутри праймеров, процентное содержание гуанина и цитозина (GC-состав) (допустимо 50-55%), длина олигонуклеотида (18-24 нуклеотидов) и комплементарность друг другу, близость значений температур плавления (допустимо различие в 3- 6°С).

В результате проведенного анализа ПЦР-РВ были обнаружены 14 кривых флуоресценции, вместе с двумя положительными контролями, пересекающие линию Threshold. Значения показателя «Ct» составило от 10 до 35 (фигура). Представленные результаты проведенных реакций говорят об их хорошей воспроизводимости и достоверности.

В результате практических испытаний с использованием наших синтезированных олигонуклеотидных праймеров с помощью ПЦР в режиме реального времени удалось обнаружить РНК вируса эндемичного лейкоза КРС.

В ходе проведенной реакции наблюдалась высокая специфичность, чувствительность идентификации вируса. Также простота, дешевизна и быстрота постановки реакции позволяет получить результат в кратчайшие сроки. Наибольшая флуоресценция, а следовательно, и концентрация РНК вируса эндемичного лейкоза КРС, пересекла пороговую линию Thrashold на 10 цикле (фиг. образец 1). Олигонуклеотидные праймеры для выявления РНК вируса энзоотического лейкоза крупного рогатого скота полимеразно-цепной реакцией являются новыми, промышленно применимыми и обладают изобретательским уровнем.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и молекулярной генетики. Предложен набор олигонуклеотидных праймеров для анализа вируса энзоотического лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. Набор включает следующие праймеры: env F 5’-GGGCACTGGCTTAGTGGAAT-3’ и env R 5’-TGCAACAGGGCGTAAAAAGC-3’. Праймеры набора обладают высокой специфичностью, чувствительностью идентификации вируса энзоотического лейкоза КРС. Использование набора позволяет сократить время при проведении массовых исследований проб на наличие генома вируса энзоотического лейкоза КРС. 1 ил., 2 табл., 1 пр.

Набор олигонуклеотидов для анализа вируса энзоотического лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, включающая следующий нуклеотидный состав:

env F 5’-GGGCACTGGCTTAGTGGAAT-3’;

env R 5’-TGCAACAGGGCGTAAAAAGC-3’.