Материал для кератопластики и способ его получения Российский патент 2021 года по МПК A61F9/07 

Изобретение относится к области медицины или ветеринарии и более конкретно к офтальмологии и может быть использовано в хирургическом лечении заболеваний роговицы, путем замещения мутных или воспаленных слоев роговицы или всей роговицы.

Настоящее изобретение относится к способу приготовления безопасного материала для замещения роговицы, который обладает повышенной прозрачностью, биосовместимостью, низкой антигенностью, и стойкостью к биодеградации.

Предшествующий уровень техники.

Материал для кератопластики используется для замещения поврежденных слоев роговицы при дистрофических, дегенеративных, воспалительных заболеваниях, а также после травм или ожогов. При этом материал для кератопластики должен быть прозрачен, должен обеспечивать другие оптические параметры (сферичность, оптическая сила, зеркальность), необходимые для восстановления функции зрения. Также материал для кератопластики не должен обладать антигенностью, должен быть стерилен. Прочность его должна позволять осуществлять надежную, герметичную фиксацию к тканям реципиента с помощью микрохирургических швов. Известно, что лучшим материалом для кератопластики является свежая донорская роговица. Однако не всегда возможно своевременное получение донорского материала, существует проблема отторжения донорского материала, которую не всегда удается решить даже применением препаратов, подавляющих иммунитет. Существуют определенные риски инфицировать реципиента в случае заражения донора латентными инфекциями или инфекциями, не выявленными в так называемый «светлый промежуток» или серонегативный период. Кроме того, существуют поражения роговицы, которые дают крайне низкий процент приживления свежей донорской роговицы, например, при термически химических ожоговых бельмах.

Проблемы частично решаются путем использования в качестве материала для кератопластики децеллюлизированной роговицы домашних животных (Protectively Decellularized Porcine Cornea versus Human Donor Cornea for Lamellar Transplantation Weiyun Shi, et al.Adv. Funct. Mater., 2019, 1902491). Однако децеллюлизированную роговицу животных можно использовать только для послойной кератопластики, что сужает круг заболеваний, при которых можно осуществлять кератопластику. Кроме того, децеллюлизированную роговицу сложно интегрировать в слои реципиента, т. к. она непредсказуемо изменяет свою толщину, вследствие отека, которым не удается управлять в нужной степени. Для сквозного восстановления прозрачности переднего отрезка глаза применяются кератопротезы, наиболее эффективные из них известны как бостонские кератопротезы, которые имеют в своей конструкции деталь из донорской роговицы (последняя модификация описана в United States Patent Application Publication Pub. No.: US 2019 / 0151077 A1 Chodosh et l. Pub. Date :May 23 , 2019). Однако при их изготовлении применяются синтетические материалы, которые склонны к отторжению тканями больного. Известны случаи расплавления роговицы реципиента после применения этого кератопротеза. Известен также способ изготовления кератопротеза с роговичным компонентом, в котором для повышения стойкости роговичной части к биодеградации применяли раствор дубящих веществ в виде смеси формалина и глютаральдегида (Борзенок С.А. и соавт. Патент РФ №2204247 от 11.27.2001 г.) Однако, известна токсичность применяемых веществ и их относительно недолговечное дубящее действие на ткани, имплантированные в организм человека. Способ не нашел практического применения. Известно также решение, в котором свиную роговицу использовали при послойной пересадке роговицы в эксперименте, как каркасный материал для восстановления поврежденной роговицы после ее децеллюлизации. Для этого свежую свиную роговицу обрабатывали 0,5% натрия додецил сульфатом (НДС) в течение 24 часов при температуре 4 градуса Цельсия (Kunpeng Pang, Liqun Du, Xinyi Wu, A rabbit anterior cornea replacement derived from a cellular porcine cornea matrix, epithelial cells and keratocytes. J. Biomaterials, n.31 (2010) P. 7257 – 7265). Это решение также подразумевает использование полученной роговицы только в качестве материала для послойной кератопластики. Кроме того, при применении такого материала при ожоговых или неоваскулярных бельмах нельзя гарантировать успех, так как предлагаемый материал не может противостоять неоваскуляризации и инфильтрации мигрирующими воспалительными клетками, что приводит к образованию вторичного бельма.

Другими авторами в целях устранения неоваскуляризации и деградации материала для кератопластики предложено заселять ацеллюлярную свиную роговицу слоями амниотического эпителия (Hailang Luo, Yongbo Lu, Tiantian Wu, Mi Zhang, Yongjie Zhang, Yan Jin. Construction of tissue-engineered cornea composed of amniotic epithelial cells and acellular porcine cornea for treating corneal alkali burn. J. Biomaterials n34 (2013) 6748-759). Еще одним способом приготовления роговицы для кератопластики является децеллюляризация роговицы с использованием активного агента является способ с применением фосфолипазы А2 200 Ед/мл и 0,5% натрия диоксихлората (Zheng Wu, Yang Zhou, Naiyang Li, Minghai Huang, Haoyun Duan, Jian Ge, Peng Xiang, Zhichong Wang. The use of phospholipase A2 to prepare acellular porcine corneal stroma as a tissue engineering scaffold. J. Biomaterials n 30 (2009) 3513–3522). Применение химических или биологически активных агентов снижает биосовместимость материала для кератопластики т. к. они не могут быть полностью удалены из роговичной ткани.

Существует способ приготовления роговицы для кератопластики, основанный на децеллюлизации путем создания высокого гидростатического давления, вплоть до 980 мПа в течение 10 минут при температуре от 10 до 30 градусов Цельсия, которое разрушает кератоциты, однако такая процедура за счет высокого гидростатического давления вызывает помутнение роговицы из-за пропотевания дополнительной жидкости в строму роговицы. Что требует в последующем ее дополнительной дегидратации 3,5% декстраном (Yoshihide Hashimoto, Seiichi Funamoto, Shuji Sasaki, Takako Honda, Shinya Hattori, Kwangwoo Nam, Tsuyoshi Kimura, Manabu Mochizuki Toshiya Fujisato, Hisatoshi Kobayashi, Akio Kishida. Preparation and characterization of decellularized cornea using high-hydrostatic pressurization for corneal tissue engineering. J. Biomaterials, n31 (2010) 3941–3948). Указанный способ наиболее близок по техническому исполнению к предлагаемому нами техническому решению, поэтому он выбран за прототип. В части материала наиболее близким решением является материал, который получают в результате осуществления способа, в котором для увеличения устойчивости к биодеградации роговичного материала для кератопластики применяли УФ кросслинкинг в диапазоне 370 нм в сочетании с пропитыванием роговицы фотомедиатором – рибофлавином (Мороз З.И. и соавт. Патент РФ 2381649 от 02.12.2008). Этот способ позволяет получить материал для кератопластики с повышенной прочностью и повышенной устойчивостью к биодеградации, однако улучшение указанных характеристик незначительно, т. к. модификация материала происходит слишком поверхностно. Этот материал более подробно описан в диссертации М.В.Гороховой (М.В.Горохова. Кератопластика с использованием кросслинкинг модифицированного донорского материала у пациентов с язвами роговицы. Диссертация на соискание степени канд. мед. наук, М., 2017, 132 С). Этот модифицированный материал принят нами за прототип изобретения в части материала.

Задачей изобретения является увеличение прозрачности, прочности, стойкости к биодеградации и снижение антигенности материала для кератопластики.

Техническим результатом при использовании данного изобретения является получение материала для кератопластики, который прозрачен, не мутнеет при контакте с тканями и внутриглазной жидкостью реципиента, отлично фиксируется швами без их прорезания, сохраняет другие оптические свойства в виде стабильной и точной оптической силы, сферичности, гладкости и регулярности поверхности, не подвергается иммунному отторжению, хорошо интегрируется в структуры глаза реципиента и не деградирует со временем.

Указанный технический результат достигается тем, что в части способа в асептических условиях из донорского глазного яблока человека или животного (свинья, корова, лошадь и т. п.) выкраивают корнео-склеро-лимбальный блок, включающий роговую оболочку, лимб с кольцом склеры шириной до 10 мм. Полученный корнео-склеро-лимбальный блок очищают от эпителия и десцеметовой мембраны и увеальной ткани. Для увеличения прозрачности кератопластического материала и получения его по толщине сопоставимым с роговицей реципиента корнео-склеро-лимбальный блок прессуют с усилием до 1 т/см², обезвоживают корнео-склеро-лимбальный блок. После обезвоживания корнео-склеро-лимбальный блок помещают в вакуумную печь и выдерживают при температуре от 60 до 180 градусов Цельсия и вакууме до -100 кПа от 1 часа до 5 суток. Процесс, происходящий в вакуумной печи, является термическим кросслинкингом материала.

Далее, корнео-склеро-лимбальный блок облучают с обеих сторон ультрафиолетом диапазона С (254 нм) и или А (365 нм) при мощности от 3 до 30 мВт/см² в течение от 3 минут до 24часов. Процесс, происходящий при облучении ультрафиолетом, является фотокросслинкингом материала.

При этом допустимо осуществление фотокросслинкинга до этапа термического кросслинкинга: осуществляют фотокросслинкинг путем облучения корнео-склеро-лимбального блока ультрафиолетом диапазона С (254 нм) и или А (365 нм) при мощности от 3 до 30 мВт/см² в течение от 1 минуты до 24 часов с каждой стороны, а затем термический кросслинкинг корнео-склеро-лимбального блока в вакуумной печи путем выдерживания при температуре от 60 до 180 градусов Цельсия и вакууме до –100 кПа от 1 часа до 5 суток.

Полученный корнео-склеро-лимбальный блок помещают в раствор слабого окислителя (например, в раствор 3 - 30% раствор перекиси водорода) не менее, чем на 1 сутки при комнатной температуре.

Для выкраивания корнео-склеро-лимбального блока могут быть использованы ножницы, лезвие, трепан или фемтосекундный лазер.

Очистку корнео-склеро-лимбального блока осуществляют путем выскребания роговичными скребцами или другими пригодными для этого микрохирургическими инструментами.

Возможна также очистка путем абляции указанных структур хирургическим эксимерным лазером или их отслаиванием в пределах прилежащей стромы фемтосекундным офтальмологическим лазером.

Возможен вариант, когда для прессования корнео-склеро-лимбального блока используют вальцы, через которые пропускают материал для кератопластики, а зазор между которыми составляет от 50 до 500 мкм, что позволяет регулировать толщину получаемого материала для кератопластики

Для прессования корнео-склеро-лимбальный блок помещают на полированную матрицу и прессуют полированным пуансоном.

Пуансон и матрица в зависимости от требуемой геометрии кератопластического материала могут быть плоскими или обладать радиусом кривизны, по крайней мере, от 25 до 50 диоптрий, соответствующим кривизне роговицы реципиента, необходимой для получения оптимальной клинической рефракции пациента.

Обезвоживание осуществляют высушиванием при температуре не выше 50 градусов Цельсия от одного часа до 5 суток. Вместо высушивания возможна дегидратация корнео-склеро-лимбального блока на силикагеле или с применением другого гигроскопичного материала или раствора (например, в абсолютном спирте или ацетоне), адсорбенте, или путем лиофилизации.

Обезвоживание после прессования осуществляют на воздухе, в вакуумной камере, в сушильном шкафу, лиофильной камере, или с использованием гигроскопических веществ или в гигроскопических растворах. При этом осуществляют обезвоживание зажатого между пуансоном и матрицей корнео-склеро-лимбального блока.

Возможен вариант, когда пуансон и матрица оказывают давление на корнео-склеро-лимбальный блок в процессе прессования, которое создается за счет магнитов, помещенных в пуансон и матрицу. Кроме того, возможен вариант, когда корнео-склеро-лимбальный блок для высушивания свободно помещают на выпуклую матрицу или вогнутый пуансон.

Для получения кератопластического материала более подходящего по толщине для послойной пересадки в глаз реципиента до этапа высушивания корнео-склеро-лимбальный блок гидратируют в дистиллированной воде или гипотоническом растворе от 1 минуты до 5 суток, после чего расслаивают с получением слоев меньшей толщины. Отдельные слои корнео-склеро-лимбального блока также помещают между пуансоном и матрицей и прессуют усилием до 1 тс/см², обезвоживают одним из известных способов, например высушивают в течение времени от 1 часа до 5 суток при температуре не выше 50 градусов Цельсия. Затем осуществляют все последующие действия.

При осуществлении предлагаемого способа получения кератопластического материала после выделения корнео-склеро-лимбального блока возможно его замораживание при температуре не менее -1градуса Цельсия в течение не менее 1 часа. Наиболее предпочтительный режим постепенное замораживание до – 20 градусов Цельсия. После замораживания допустимо длительное хранение корнео-склеро-лимбального блока до проведения следующих этапов способа.

После выдерживания корнео-склеро-лимбального блока в растворе слабого окислителя его промывают в деионизированной воде и высушивают на воздухе или в сушильном шкафу, после чего упаковывают в двойные стерильные пакеты и стерилизуют радиационным методом дозой от 14,8 до 50 кГр. Материал для кератопластики готов к использованию.

Материал для кератопластики, полученный описанным выше способом, представляет собой корнео-склеро-лимбальный блок, с шириной склерального ободка до 10,0 мм, центральная часть которого образована децеллюлизированным прессованным роговичным коллагеном, фиксированным термическим кросслинкингом и двухсторонним многодиапазонным фотокросслинкингом. Он состоит из слоистого роговичного коллагена, расстояние между ламелями роговичной части блока, образуемыми волокнистыми структурами коллагена составляют 10- 90% от расстояния между таковыми нативной роговичной ткани. При этом плотность упаковки коллагена в материале для кератопластики превышает плотность нативного роговичного коллагена на 10- 300%. Содержание воды не превышает 71 весового %. Коэффициент светопропускания относительно воздуха не менее 50%. Сопротивление растяжению в 10-ти процентном диапазоне у предлагаемого материала по сравнению с нативной роговицей выше на 300%. Усилие на разрыв материала для кератопластики также в три раза выше, чем у нативной роговицы. Толщина материала для кератопластики составляет от 10 до 500 мкм. Радиус кривизны от 25 до 50 дптр.

Изобретение поясняется фигурами графического отображения и фотографиями.

Фиг.1. Порядок обработки материала для кератопластики.

Фиг.2. Корнео-склеро-лимбальный блок вид сверху.

Фиг.3. Корнео-склеро-лимбальный блок вид сбоку.

Фиг.4. Плоский корнео-склеро-лимбальный блок.

Фиг.5. Прессование корнео-склеро-лимбального блока с помощью матрицы и пуансона Фиг.6. Прессование корнео-склеро-лимбальный блока с помощью матрицы и пуансона с магнитами

Фиг.7. Высушивание корнео-склеро-лимбального блока при свободном размещении на выпуклой матрице

Фиг.8. Графики светопропускания (в процентах, среднее ± стандартное отклонение) свиной роговицы после проведения обработки по различным вариантам предлагаемого способа и гидратации в дистиллированной воде в течение суток.

Фиг.9. Фотография гистологического среза материала

Фиг.10. Фотография гистологического среза роговицы. Крио срез..

Фиг.11. Материал, полученный указанным способом, обеспечивает прозрачность и не отекает в жидкости.

Порядок обработки материала для кератопластики отображен в блок схеме на фиг.1 и включает в себя выкраивание материала для кератопластики в виде корнео-склеро-лимбального блока из донорского глаза или из глаза домашних животных 1, прессование материала 2, предварительное обезвоживание материала 3, термический кросслинкинг материала в вакууме 4, фотокросслинкинг за счет двустороннее облучение материала ультрафиолетом диапазона С (254 нм) и или А (365нм) 5, обработку материала раствором слабого окислителя, например, перекисью водорода, и промывание деионизированной водой 6. При этом допустимо осуществление фотокросслинкинга до этапа термического кросслинкинга.

Ниже рассматривается техническая сущность способа согласно настоящему изобретению и признаки полученного этим способом материала для кератопластики.

В асептических условиях из донорского глазного яблока человека или животного (свинья, корова, лошадь и т.п.) ножницами или трепаном выкраивают корнео-склеро-лимбальный блок 7 (фиг. 2 – вид сверху, фиг. 3 – вид сбоку, фиг. 4 плоский корнео-склеро-лимбальный блок), включающий роговую оболочку 8, лимб 9 с кольцом склеры 10 шириной до 10,0 мм. Асептические условия позволяют избежать контаминации материала, что в дальнейшем улучшает его свойства биосовместимости после стерилизации, за счет отсутствия эндотоксинов на поверхности материала. Предварительное сохранение в материале для кератопластики лимба с кольцом склеры служит барьером для избыточного смещения слоев роговицы при прессовании, что позволяет получить более прозрачный и прочный материал для кератопластики. Ширина кольца более 10 мм из-за сферичности исходного глазного яблока создает трудности для прессования материла. Полученный корнео-склеро-лимбальный блок очищают от эпителия и десцеметовой мембраны с эндотелиальными клетками и увеальной ткани, которые выскребают роговичными скребцами или другими пригодными для этого микрохирургическими инструментами. Этим достигается снижение антигенности. Возможна также абляция указанных структур хирургическим эксимерным лазером или их отслаивание в пределах прилежащей стромы фемтосекундным офтальмологическим лазером. При осуществлении предлагаемого способа получения кератопластического материала после выделения корнео-склеро-лимбального блока возможно его замораживание при температуре не менее -1градуса Цельсия в течение не менее 1 часа. Наиболее предпочтительный режим постепенное замораживание до – 20 градусов Цельсия. После замораживания допустимо длительное хранение корнео-склеро-лимбального блока до проведения следующих этапов способа. После этого корнео-склеро-лимбальный блок 7 прессуют, например, помещая на полированную матрицу 11 полированным пуансоном 12, в направляющей втулке 13, снабженной отверстиями 14 для выхода отжимаемой жидкости наружу (фиг.5) с усилием до 1 т/см². Это позволяет децеллюлизировать корнео-склеро-лимбальный блок за счет высокого механического давления, что снижает антигенность. Кроме того, эта процедура отжимает свободную воду, водорастворимые не коллагеновые белки, другие водорастворимые соединения и водосодержащие гликозаминогликаны из коллагена материала межклеточного матрикса роговицы, содержание воды в готовом материале для кератопластики становится не более 71 весовых процента. Коллагеновые слои корнео-склеро-лимбального блока уплотняются за счет уменьшения расстояния между ними, что улучшает качество термического и фото-кросслинкинга, проводимых на следующих этапах, повышает прозрачность и прочность материала. В дальнейшем это обеспечивает то, что при контакте с водой материал для кератопластики не мутнеет. Прессование с усилием более 1 т/см² не проводят, потому что это приводит к деструктивным изменениям коллагена, что снижает прозрачность материала. Полированная поверхность пуансона и матрицы обеспечивает оптическое качество поверхности материала для кератопластики. После прессования зажатый между пуансоном и матрицей корнео-склеро-лимбальный блок обезвоживают одним из известных способов. Например, высушивают на воздухе, в вакуумной или лиофильной камере или сушильном шкафу при температуре не выше 50 градусов Цельсия от одного часа до 5 суток). Температура высушивания материала не выше 50 градусов Цельсия позволяет гарантированно избежать денатурации. Такое предварительное обезвоживание позволяет проводить следующим этапом термический кросслинкинг без риска денатурации коллагена в присутствии воды и позволяет еще больше сблизить слои коллагена для повышения качества дальнейшего ультрафиолетового кросслинкинга, что повышает прозрачность и прочность материала. После этого корнео-склеро-лимбальный блок помещают в вакуумную печь и выдерживают при температуре от 60 до 180 градусов Цельсия и в вакууме до – 100 кПа от 1 часа до 5 суток. Этот этап обеспечивает термический кросслинкинг коллагена, что еще больше увеличивает прозрачность материала, его прочность и стойкость к биодеструкции. Кроме того, эта операция позволяет получить материал для кератопластики соизмеримый по толщине с роговицей реципиента, потому что после термического кросслинкинга материал не набухает в послеоперационном периоде, что улучшает его способность к приживлению и исключает прорезывание хирургических швов. Температура менее 60 градусов Цельсия не обеспечивает достаточную степень термического кросслинкинга, материал получается недостаточно прозрачный. Температура более 180 градусов приводит к термодеструкции материала со значительным изменением цветности и снижением прозрачности материала. Время термического кросслинкинга менее суток не обеспечивает стойкость материала к набуханию в воде, а период термообработки более 5 суток более не приводит к повышению прозрачности, то есть не влияет на достижение технического результата. Отсутствие вакуума не обеспечивает улучшения прозрачности и прочности материала, т. к. не позволяет удалить остаточную воду из материала и приводит к гидролизу коллагена под воздействием высокой температуры, что разрушает материал. Для улучшения барьерной функции материала для кератопластики после прессования корнео-склеро-лимбального блока его облучают с двух сторон ультрафиолетом, по крайней мере в двух диапазонах: в диапазоне С (254 нм) и или А (365 нм) при мощности от 3 до 30 мВт/см² в течение от 3 минут до 5 часов. В результате материал приобретает дополнительно две зоны повышенной плотности на обеих поверхностях, что еще больше увеличивает прозрачность материала и его биосовместимость. Совокупность термического и многодиапазонного двухстороннего фотокросслинкинга позволяет фиксировать материал для кератопластики без применения токсичных химических агентов и приводит к получению достаточно прозрачного, прочного, биосовместимого и стойкого к биодеструкции материала. Помещение в раствор перекиси водорода с концентрацией менее 3% не устраняет побочный запах материала, который свидетельствует о наличии активных летучих веществ, снижающих биосовместимость материала. Концентрация перекиси водорода более 30% избыточна. Помещение материала в раствор перекиси водорода на срок более 1 суток, приводит к нежелательной деструкции коллагеновой основы материала. Промывание в деионизированной воде позволяет провести финальную очистку материала.

Возможен вариант, когда пуансон 12 и матрица 11оказывают давление на корнео-склеро-лимбальный диск за счет магнитов 15, помещенных в пуансон 12 и матрицу11 (фиг.6). Кроме того, возможен вариант, когда корнео-склеро-лимбальный блок 1 для высушивания свободно помещают на выпуклую матрицу 11 сразу после прессования (фиг.7) или на пуансон. Пуансон и матрица в зависимости от требуемой геометрии кератопластического материала могут быть плоскими или обладать радиусом кривизны, по крайней мере, от 25 до 50 диоптрий, соответствующим кривизне роговицы реципиента, необходимой для получения оптимальной клинической рефракции пациента. Для получения кератопластического материала более подходящего по толщине для послойной пересадки в глаз реципиента до этапа высушивания корнео-склеро-лимбальный блок гидратируют в дистиллированной воде или гипотоническом растворе от 1 минуты до 5 суток, после чего расслаивают с получением слоев меньшей толщины. Это позволяет получить толщину материала, требуемую для лучшего совмещения с роговицей реципиента при послойной кератопластике. При этом минимальная толщина материала составляет не менее 5% от исходной, что позволяет имплантировать материал для кератопластики в слои роговицы при лечении эндотелиально-эпителиальной дистрофии. После этого проводят высушивание на воздухе или в сушильном шкафу при температуре не более 50 градусов Цельсия. Возможно также дегидратирование корнео-склеро-лимбального блока на силикагеле или путем лиофилизации. Отдельные слои корнео-склеро-лимбального блока также помещают между пуансоном и матрицей и прессуют усилием до 1 тс/см². Затем отслоенные слои корнео-склеро-лимбального блока обезвоживают одним из известных способов (например, в течение времени от 1 часа до 5 суток, в вакуумной камере или сушильном шкафу на воздухе при температуре не выше 50 градусов Цельсия), что дает эффект, описанный выше в отношении не расслоенного материала. После обезвоживания корнео-склеро-лимбальный блок помещают в вакуумную печь и выдерживают при температуре от 60 до 180 градусов Цельсия и вакууме до – 100 кПа от 1 часа до 5 суток. Это также повторяет эффект, который относится к не расслоенному материалу. Полученный корнео-склеро-лимбальный блок помещают в раствор слабого окислителя, например, в 3 - 30% раствор перекиси водорода, не менее, чем на 1 сутки при комнатной температуре. Это позволяет удалить остатки биологически активных продуктов, образующихся в материале в процессе термического и ультрафиолетового кросслинкинга. Это повышает прозрачность и биосовместимость материала для кератопластики. После выдерживания корнео-склеро-лимбального блока в окислителе, его промывают в деионизированной воде, для финальной очистки и высушивают на воздухе или в сушильном шкафу при температуре не выше 80 градусов Цельсия, после чего упаковывают в двойные стерильные пакеты и стерилизуют радиационным методом дозой от 14,8 до 50 кГр. Материал для кератопластики готов к использованию.

Материал для кератопластики, полученный описанным выше способом, представляет собой корнео-склеро-лимбальный блок, с шириной склерального ободка до 10,0 мм. Такая ширина склерального ободка позволяет при осуществлении способа изготовления материала защитить его при прессовании от избыточного сдвига структурных слоев коллагена, что приводит к помутнению материала. Кроме того, такие параметры склерального ободка делают материал для кератопластики удобным для хирургических манипуляций. Ширина ободка более 10,0 мм затрудняет прессование материала из-за сферичности склеры. Материал для кератопластики состоит из слоистого роговичного коллагена, расстояние между ламелями роговичной части блока, образуемыми волокнистыми структурами коллагена типа 1 составляют 10- 90% от расстояния между таковыми нативной роговичной ткани. Такие параметры слоистости коллагена позволяют в процессе интеграции материала в ткани глаза миграцию клеточных элементов реципиента. Расстояние менее 10% препятствует миграции соединительнотканных элементов в толщу материала при его приживлении, а при расстоянии более 90% от исходного при контакте с тканевыми жидкостями происходит отек и снижение прозрачности материала. При этом плотность упаковки коллагена в материале для кератопластики превышает плотность нативного роговичного коллагена на 10- 300%. Содержание воды не превышает 71 весового %. Коэффициент светопропускания относительно воздуха не менее 50%. Сопротивление растяжению в 10-ти процентном диапазоне у предлагаемого материала по сравнению с нативной роговицей выше на 300%. При этом поверхность материала в отличие от нативной роговицы приобретает более гидрофобные свойства, чем у нативной роговицы. Угол смачивания водой составляет от 30 до 90°. Толщина материала для кератопластики составляет от 10 до 500 мкм. Радиус кривизны от 25 до 50 диоптрий.

Для пояснения сущности изобретения приводим примеры конкретного выполнения.

Пример № 1: Пациент С-а, 50 лет. Поступил в клинику с диагнозом: Гнойная язва роговицы ОД. Первая попытка замещения пораженных гнойной язвой слоев роговицы свежим донорским материалом была безуспешна – материал полностью расплавился. Принято решение для повторной операции применить заявляемый материал для кератопластики. Произведено выкраивание корнео-склеро-лимбального блока из глазного яблока свиньи. С помощью фемтолазера удален эпителиальный слой и десцеметова оболочка с эндотелиальными клетками. Корнео-склеро-лимбальный блок помещают на матрицу и пуансоном сдавливают с усилием 1 тс/см², затем помещают в сушильный шкаф и при температуре 50 градусов Цельсия высушивают в течение суток. Затем перемещают корнео-склеро лимбальный блок, зажатый между пуансоном и матрицей в вакуумный сушильный шкаф, и при вакууме -100 кПа при температуре 180 градусов Цельсия выдерживают в течение 1 часа, затем корнео-склеро-лимбальный блок извлекают из вакуумной печи и облучают с двух сторон ультрафиолетом с длинной волны 365 и 254 нм, мощностью 5 мВт/см² в течении 30 минут, затем помещают в 30% перекись водорода на 1 сутки. Материал простерилизовали на радиационной установке дозой 50 кГр. Далее материал использовали при замещении расплавленных слоев роговицы при ее гнойной язве. Трепаном выкроили из материала для кератопластики трансплантат диаметром 7 мм, зачистили дно язвы, наложили 4 направляющих шва 9-0 и герметизировали трансплантат 12-ю узловыми швами 10-0. Через 2 недели после кератопластики заявляемым материалом наблюдается полная эпителизация поверхности материала для кератопластики, его интеграция и частичная васкуляризация. Приживление полупрозрачное.

Пример № 2. В ветеринарную клинику обратились с собакой с посттравматическим гнойным кератитом. При осмотре: роговица мутная в центре дефект, десцеметоцеле. Осуществлено покрытие дефекта мороженной, неконсервированной донорской роговицей, через неделю покрытие расплавилось. Принято решение провести повторную пластику с материалом для кератопластики. Произведено выкраивание трепаном корнео-склеро-лимбального блока из глазного яблока быка. Микрохирургическим скребцом удален эпителиальный слой и десцеметова оболочка с эндотелиальными клетками. Корнео-склеро-лимбальный блок помещают на матрицу и пуансоном сдавливают с усилием 500 кгс/см², затем помещают в сушильный шкаф и при температуре 30 градусов Цельсия высушивают в течение 5 суток. Затем перемещают корнео-склеро лимбальный блок зажатый между пуансоном и матрицей в вакуумный сушильный шкаф и при вакууме -100 кПа при температуре 60 градусов Цельсия выдерживают в течение 5суток, затем корнео-склеро-лимбальный блок извлекают из вакуумной печи и облучают с двух сторон ультрафиолетом с длинной волны 365 и 254 нм в течении 24 часов при мощности 3 мВт/см². Затем помещают в 3% перекись водорода на 1 сутки. Материал простерилизовали на радиационной установке дозой 50 кГр. Далее материал использовали при замещении расплавленных слоев роговицы при ее гнойной язве. Трепаном выкроили из материала для кератопластики трансплантат диаметром 8 мм, зачистили дно язвы, наложили 4 направляющих шва 9-0 и герметизировали трансплантат 12-ю узловыми швами 10-0. Веки животного зашили. Через 2 недели сняли швы с век, после кератопластики заявляемым материалом наблюдается полная эпителизация поверхности материала для кератопластики, его интеграция и частичная васкуляризация. Приживление полупрозрачное.

Пример № 3. Пациент Г-в, возраст 25 лет, обратился в клинику с диагнозом кератоконус левого глаза IV стадии. Острота зрения 0,05 с максимальной коррекцией. При осмотре наружные слои роговицы в центре мутные, сохраняется прозрачность глубоких слоев роговицы. Принято решение провести замену наружных слоев роговицы материалом для кератопластики. Произведено выкраивание ножницами корнео-склеро-лимбального блока из донорского глазного яблока. Эксимерным лазером удален (аблирован) эпителиальный слой и десцеметова оболочка с эндотелиальными клетками. Корнео-склеро-лимбальный блок помещают на матрицу, имеющую радиус кривизны, соответствующий 44,0 диоптриям и пуансоном, имеющим радиус кривизны, соответствующий 44,0 диоптриям, и сдавливают с усилием 100 кгс/см², затем помещают в сушильный шкаф и при температуре 40 градусов Цельсия высушивают в течение 3 суток. Затем перемещают корнео-склеро лимбальный блок, зажатый между пуансоном и матрицей, в вакуумный сушильный шкаф и при вакууме -50 кПа при температуре 90 градусов Цельсия выдерживают в течение 3 суток, затем корнео-склеро-лимбальный блок извлекают из вакуумной печи и облучают с двух сторон ультрафиолетом с длинной волны 365 и 254 нм, мощностью 3 мВт/см² в течении 1 часа, затем помещают в 30% перекись водорода на 1 сутки. помещают в 6 % перекись водорода на 1 сутки. Материал простерилизовали на радиационной установке дозой 50 кГр. Далее материал использовали для глубокой послойной кератопластики. Трепаном выкроили из материала для кератопластики трансплантат диаметром 8 мм, наложили 4 направляющих шва и непрерывный шов 10-0. Швы держалки удалили. Через 1 неделю наблюдается полная эпителизация поверхности материала для кератопластики, его интеграция. Приживление прозрачное, острота зрения без коррекции 0,9-1,0.

Пример № 4. Пациент Г-в, возраст 25 лет, обратился в клинику с диагнозом: ожоговые бельма обоих глаз. При осмотре: все слои роговицы в центре мутные, отмечается васкуляризация бельма. Острота зрения: движение руки у лица. Принято решение провести сквозную кератопластику материалом для кератопластики. Произведено выкраивание корнео-склеро-лимбального блока из донорского глазного яблока. Микрохирургическим скребцом удален эпителиальный слой и десцеметова оболочка с эндотелиальными клетками. Корнео-склеро-лимбальный блок помещают на матрицу и пуансоном сдавливают с усилием 50 кгс/см², затем помещают для обезвоживания в лиофильную камеру. Затем перемещают корнео-склеро- лимбальный блок зажатый между пуансоном и матрицей в вакуумный сушильный шкаф и при вакууме -10 кПа при температуре 60 градусов Цельсия выдерживают в течение 5 суток, затем корнео-склеро-лимбальный блок извлекают из вакуумной печи и облучают с двух сторон ультрафиолетом с длинной волны 365 и 254 нм в течении 30 минут при мощности 3 мВт/см ². Затем помещают материал в 15% перекись водорода на 1 сутки. Материал простерилизовали на радиационной установке дозой 50 кГр. Далее материал использовали для сквозной кератопластики. Трепаном выкроили из материала для кератопластики трансплантат диаметром 8 мм, наложили 4 направляющих шва и непрерывный шов полипропиленом 10-0. Швы держалки удалили. Через 2 недели наблюдается полная эпителизация поверхности материала для кератопластики, его интеграция. Приживление прозрачное, острота зрения с коррекцией 0,4.

Пример 5. Произведено выкраивание корнео-склеро-лимбального блока из донорского глазного яблока. Микрохирургическим скребцом удален эпителиальный слой и десцеметова оболочка с эндотелиальными клетками. Корнео-склеро-лимбальный блок помещают на матрицу и пуансоном сдавливают с усилием 500 кгс/см², затем обезвоживают его на силикагеле Затем корнео-склеро- лимбальный блок оставляют свободно на поверхности выпуклой матрицы, после чего помещают в вакуумный сушильный шкаф и при вакууме -10 кПа при температуре 60 градусов Цельсия выдерживают в течение 5 суток, затем корнео-склеро-лимбальный блок извлекают из вакуумной печи и облучают с двух сторон ультрафиолетом с длинной волны 365 и 254 нм в течении 30 минут при мощности 3 мВт/см². Затем помещают материал в 15% перекись водорода на 1 сутки. Материал применили для сквозной кератопластики по поводу ожогового бельма. Получено прозрачное приживление.

Пример 6. Произведено выкраивание корнео-склеро-лимбального блока из донорского глазного яблока. Микрохирургическим скребцом удален эпителиальный слой и десцеметова оболочка с эндотелиальными клетками. Корнео-склеро-лимбальный блок помещают на матрицу и пуансоном сдавливают с усилием 500 кгс/см², затем помещают в сушильный шкаф и при температуре 50 градусов Цельсия высушивают в течение 5 суток. Затем перемещают корнео-склеро- лимбальный блок извлекают из пуансона, после чего облучают с двух сторон ультрафиолетом с длинной волны 365 и 254 нм в течении 30 минут при мощности 3 мВт/см², затем помещают в вакуумный сушильный шкаф и при вакууме -5 кПа при температуре 60 градусов Цельсия выдерживают в течение 5 суток, затем корнео-склеро-лимбальный блок извлекают из вакуумной печи, Затем помещают материал в 3% перекись водорода на 1 сутки. Материал использовали для глубокой послойной кератопластики при эндотелиально-эпителиальной дистрофии. Получено прозрачное приживление. Острота зрения увеличилась с 0,05 до 0,8.

Пример №7. При обработке материала после выделения корнео-склеро-лимбального блока из свиного глаза вместо сдавливания материала пуансоном и матрицей, корнео-склеро-лимбальный блок пропускают через вальцы с зазором 250 мкм. Далее обезвоживают на силикагеле. Далее проводят термический и фото-кросслинкинг, помещают материал в 3% перекись водорода. В результате получают плоский материал для кератопластики, который использовали для покрытия дефекта роговицы, с целью восстановления герметичности глазного яблока. Герметичность глазного яблока восстановлена полностью.

Пример № 8. Пациент Т-н. 51 год. Посттравматический неправильный астигматизм левого глаза. Осуществлен способ изготовления кератопластического материала с тем отличием, что до этапа обезвоживания в абсолютном спирте корнео-склеро-лимбальный блок гидратировали в дистиллированной воде в течение суток, после чего расслоили его с получением слоя, составляющего 50% исходной толщины. Произвели термический кросслинкинг на матрице с радиусом кривизны 45 диоптрий, что составляло радиус кривизны пациента. Далее помещают в 0,1% раствор окислителя KMnO4 на 1 сутки. Полученным материалом заменили 50% толщины передних, неровных слоев роговицы пациента. В послеоперационном периоде острота зрения 0,7 без дополнительной коррекции.

Для более полного раскрытия сущности изобретения фиг.8 приведена зависимость влияния на прозрачность материала для кератопластики каждого этапа осуществления способа и его режимов.

Отмечается увеличение коэффициентов светопропускания корнео-склеро-лимбального блока свиной роговицы при переходе от одного этапа к другому и при усилении термического и фотокросслинкинга за счет увеличения времени воздействия

Повышение светопропускания (в процентах, среднее ± стандартное отклонение) свиной роговицы после проведения обработки по различным вариантам предлагаемой техники и гидратации в дистиллированной воде в течение суток. Условные обозначения этапов обработки: EPI-: удален эпителий; DM-: удалена десцеметова мембрана; SPH: роговица выложена на матрицу в виде стеклянной сферы радиусом 8 мм; PRES: роговица спрессована между плоскими пластинами в прессе с усилием до 1,0 т/см²; DRY: роговица обезвожена высушиванием при комнатной температуре в течение суток; WET: роговица влажная; DHT+: термическая обработка в вакууме; 2 и 5сут.: время проведения соответствующего этапа в сутках; UV+: облучение ультрафиолетом.

На фиг.9 дан поперечный срез материала для кератопластики.

Стрелка направлена на изображение структуры материала для кератопластики на поперечном срезе при увеличении Х160. Без фиксации и окраски. Отмечается отсутствие обводненных полостей между слоями стромы, что обеспечивает прозрачность материала и сохранение высокого коэффициента светопропускания при помещении его в воду. Это обеспечивает сохранение прозрачности материала при контакте его с тканями и биологическими жидкостями реципиента. После фото-кросслинкинга на обеих поверхностях материала формируются зоны повышенной плотности, увеличивающие прозрачность материала (фиг.10). Это происходит за счет того, что эти уплотненные зоны (слои) являются дополнительными барьерами для проникновения воды из переднекамерной жидкости реципиента. На фиг.10 стрелкой указана строма материала для кератопластики после этапа термического кросслинкинга. Ув. Х160. Видно отсутствие обводненных прослоек между ламелями коллагена. Материал прозрачен компактен, однороден (режим: EPY-, DM-, PRES+, DRY+, DHT+)

На фиг. 10 -фотография среза роговицы. Крио срез. Ув. Х160. На обеих поверхностях наблюдаются уплотненные гомогенные слои (обозначены стрелками).

Материал, полученный указанным способом, обеспечивает прозрачность и не отекает в жидкости, что иллюстрируется фиг.11.

В правом ряду роговичная часть материала для кератопластики, материал прозрачен и не набухает при помещении в физиологический раствор. В левом и центральном ряду нативные свиные роговицы отекли в физиологическом растворе, утолщены, непрозрачны.

Группа изобретений относится к области медицины или ветеринарии, а именно к офтальмологии. Предложены способ получения материала для кератопластики и материал для кератопластики, полученный заявленным способом и представляющий собой корнео-склеро-лимбальный блок с шириной склерального ободка до 10,0 мм, центральная часть которого образована децеллюлизированным прессованным роговичным коллагеном, фиксированным термическим кросслинкингом и двухсторонним многодиапазонным фотокросслинкингом. Способ включает выкраивание корнео-склеро-лимбального блока из донорского глазного яблока, затем его очищают, прессуют, обезвоживают при температуре не выше 50°С, осуществляют термический кросслинкинг в вакуумной печи, а затем осуществляют фотокросслинкинг путем его облучения ультрафиолетом или осуществляют фотокросслинкинг, а затем термический кросслинкинг. Полученный корнео-склеро-лимбальный блок помещают в раствор слабого окислителя. Изобретения обеспечивают получение прозрачного материала для кератопластики, который интегрируется в структуры глаза реципиента и сохраняет оптические свойства. 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 11 ил., 8 пр.

1. Способ получения материала для кератопластики, заключающийся в том, что в асептических условиях из донорского глазного яблока человека или животного выкраивают корнео-склеро-лимбальный блок, включающий роговую оболочку и лимб с кольцом склеры шириной до 10 мм, полученный корнео-склеро-лимбальный блок очищают от эпителия, десцеметовой мембраны и увеальной ткани, прессуют с усилием до 1 т/см², обезвоживают, осуществляют термический кросслинкинг корнео-склеро-лимбального блока в вакуумной печи путем выдерживания при температуре от 60 до 180 градусов Цельсия и вакууме до –100 кПа от 1 ч до 5 сут, а затем осуществляют фотокросслинкинг путем облучения корнео-склеро-лимбального блока ультрафиолетом диапазона 254 нм и/или 365 нм при мощности от 3 до 30 мВт/см² в течение от 3 мин до 24 ч с каждой стороны или осуществляют фотокросслинкинг путем облучения корнео-склеро-лимбального блока ультрафиолетом диапазона 254 нм и/или 365 нм при мощности от 3 до 30 мВт/см² в течение от 3 мин до 24 ч с каждой стороны, а затем термический кросслинкинг корнео-склеро-лимбального блока в вакуумной печи путем выдерживания при температуре от 60 до 180 градусов Цельсия и вакууме до –100 кПа от 1 ч до 5 сут, полученный корнео-склеро-лимбальный блок помещают в растворе слабого окислителя не менее чем на 1 сут при комнатной температуре.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что корнео-склеро-лимбальный блок выкраивают ножницами, лезвием, трепаном или фемтосекундным лазером

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что очистку корнео-склеро-лимбального блока осуществляют путем выскребания роговичными скребцами или другими пригодными для этого микрохирургическими инструментами.

4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что очистку корнео-склеро-лимбального блока осуществляют путем абляции корнео-склеро-лимбального блока хирургическим эксимерным лазером или отслаиванием в пределах прилежащей стромы фемтосекундным офтальмологическим лазером.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве слабого окислителя используют 3-30% раствор перекиси водорода.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что прессование осуществляют с помощью вальцов, через которые пропускают корнео-склеро-лимбальный блок, зазор между которыми составляет от 50 до 500 мкм.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для прессования корнео-склеро-лимбального блока используют полированную матрицу и полированный пуансон.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что пуансон и матрица выполнены плоскими или обладающими радиусом кривизны по крайней мере от 25 до 50 диоптрий.

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что обезвоживание осуществляют при температуре не выше 50 градусов Цельсия в течение времени от 1 ч до 5 сут высушиванием на воздухе, в вакуумной камере или в сушильном шкафу.

10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что обезвоживание осуществляют в лиофильной камере.

11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что обезвоживание осуществляют на гигроскопичных материалах или в гигроскопичных растворах.

12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что в качестве гигроскопичного материала используют силикагель.

13. Способ по п. 11, отличающийся тем, что в качестве гигроскопичного раствора применяют абсолютный спирт или ацетон.

14. Способ по п.7 или 8, отличающийся тем, что осуществляют обезвоживание зажатого между пуансоном и матрицей корнео-склеро-лимбального блока или свободно размещенного на матрице или пуансоне.

15. Способ по п.7 или 8, отличающийся тем, что давление создается за счет магнитов, помещенных в пуансон и матрицу.

16. Способ по п. 1, отличающийся тем, что до этапа обезвоживания корнео-склеро-лимбальный блок гидратируют в дистиллированной воде или гипотоническом растворе от 1 мин до 5 сут, после чего расслаивают с получением слоев меньшей толщины.

17. Способ по любому из пп. 1-16, отличающийся тем, что после выдерживания корнео-склеро-лимбального блока в растворе слабого окислителя его промывают в деионизированной воде.

18. Материал для кератопластики, полученный способом по любому из пп. 1-17 представляет собой корнео-склеро-лимбальный блок с шириной склерального ободка до 10,0 мм, центральная часть которого образована децеллюлизированным прессованным роговичным коллагеном, фиксированным термическим кросслинкингом и двухсторонним многодиапазонным фотокросслинкингом.