Оптимизированная питательная среда для укоренения побегов винограда в культуре in vitro, сорт "Августин" Российский патент 2021 года по МПК A01G31/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к биотехнологии, и может быть использовано в питомниководстве при получении оздоровленного посадочного материала при помощи методов клонального микроразмножения.

Известны питательные среды различного минерального состава, предназначенные для укоренения ягодных и плодовых растений in vitro (Алексеенко Л.В. Подбор питательных сред для клонального микроразмножения нейтральнодневных и ремонтантных сортов земляники / Алексеенко Л.В., Высоцкий В.А / Плодоводство и ягодоводство России: Сб. науч. работ / ВСТИСП. - М., 1997. - Т. IV. - С.77-82, Шипунова А.А. Подбор минеральной основы питательных сред для клонального микроразмножения жимолости в производственных условиях. / Шипунова А.А., Высоцкий В.А./ Плодоводство и ягодоводство России: Сб. науч. работ / ВСТИСП. - М, 2001. Т. VII. С.158-163).

Наиболее часто для укоренения побегов, полученных в культуре in vitro, исследователи используют половину макро- и микросолей по прописи, разработанной Мурасиге и Скуга (MS ¹/₂), (Murashige Т., Skoog F.A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - vol. 5, 95 - P. 473-497).

Для наиболее эффективного ее применения исследователи практически всегда оптимизируют ее состав, изменяя гормональный фон или вводя различные добавки в виде аминокислот, витаминов, препаратов нового поколения (Белошапкина О.О. Использование биопрепаратов при клональном микроразмножении земляники / Белошапкина О.О., Жаркова И. В.// Докл. ТСХА. - 2001. - №273, ч. 2. - С.284-289). Значительно реже исследователи изменяют минеральный состав и, как правило, незначительно.

При этом следует отметить, что минеральный состав среды Мурасиге и Скуга (МС) плохо подходит для укоренения побегов, полученных in vitro, так как среда разрабатывалась для культивирования каллусов и каллусных клеток и учитывает, прежде всего, условия для их развития. Соотношение и концентрации макроэлементов в среде неоптимальные относительно потребности в них микрорастений винограда, что в процессе культивирования приводит к дисбалансу минеральных солей, сдвигу рН питательной среды и как следствие ухудшает параметры развития микрорастений винограда.

Наиболее часто применяемая среда для укоренения (MS ¹/₂) содержит следующие компоненты мг/л: NH₄NO₃ - 825; KNO₃ - 950; KН₂РO₄ - 85; MgSO₄*7H₂O - 185 мг/л, СаСl₂ - 220; FeSO₄*7H₂O - 13,4-13,8; Na₂ ЭДТА 2Н₂O - 18,5-18,9; Н₃ВO₃ - 3,0-3,2; MnSO₄*4H₂O - 11,0-11,4; ZnSO₄*7H₂O - 4,1-4,5; KJ - 0,40-0,44; Na₂MoO₄ - 0,11-0,15; CuSO₄*5H₂O - 0,011-0,015; CoCI₂⋅6H₂O - 0,011-0,015; миоинозит - 40-60; тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота по 0,2-0,3; аскорбиновая кислота 0,4-0,6; ИМК - 0,5-1,5; сахароза - 14000-16000; агар - 6000-8000; остальное бидистиллированная вода до 1 л; рН - 5,5-5,9.

Наиболее близким к предлагаемому решению является питательная среда - Н2, разработанная для укоренения побегов винограда, полученных на этапе пролиферации (Голодрига П.Я. Методические рекомендации по клональному микроразмножению винограда / ВНИИВиПП «Магарач» (П.Я. Голодрига, В.А. Зленко, Л.А. Чекмарев), ИФР АН СССР (Р.Г. Бутенко), ИФР АН УССР (Б.А. Левенко), и др. - Ялта: Издательская группа ВНИИ ВиПП «Магарач», 1986 - 56 с).

Недостатками данной среды для укоренения являются высокое содержание хлора, несбалансированность элементов по магнию и фосфору, а также низкое содержание хелата железа и микроэлементов (1/4 прописи МС), что при укоренении побегов негативно сказывается на регенерации корней и последующем развитии побегов и листьев. Кроме того, несбалансированное содержание макроэлементов часто провоцирует рост каллусной ткани и преждевременное старение эксплантов.

Задача, на решение которой направлено изобретение, является повышение количества и качества укорененных побегов и преодоление сортовой специфики виноградного растения на этапе укоренения.

Задача, на решение которой направлено изобретение, решается оптимизацией концентрации и соотношением макросолей, входящих в состав питательной среды: NH₄NO₃ уменьшается до 825 мг/л; KNO₃ - 950 мг/л; уровень содержания фосфора в среде уменьшается в два раза, MgSO₄⋅7H₂O - 220 мг/л, СаСl₂×2Н₂О - хлористый кальций также в два раза 220 мг/л.

Таким образом предлагаемая оптимизированная питательная среда предоставляет из себя следующий состав: Таблица 1.

Пример осуществления способа:

В питательную среду вносят следующие компоненты (концентрации в мг): при следующем соотношении компонентов, мг/л:

Агар-агар 7000 Сахароза 15000 KNО₃ - азотнокислый калий 950 NH₄NО₃ - азотнокислый аммоний 825 MgSО₄×7H₂О - сернокислый магний 185 CaCl₂×2Н₂О - хлористый кальций 220 КН₂РО₄ - фосфорнокислый калий 85 Мезоинозит 100 KI - йодистый калий 0,42 Н₃ВО₃ - борная кислота 3,1 ZnSО₄×2H₂О - сернокислый цинк 4,3 MnSО₄×4H₂О - сернокислый марганец 1,1 CuSО₄×5H₂О - сернокислая медь 0,025 NiCl₂ - хлористый никель 0,025 Никотиновая кислота 1 Пиридоксин В₆ 1 Тиамин В₁ 1 FeSО₄×7H₂О - сернокислое железо 27,8 Трилон БNa₂ЭДТА×2Н₂O 37,2 Уголь активированный 5000 рН среды 6,6

В начале объем раствора доводят до 0,5 л, устанавливают рН 6,4-6,6 и добавляют 0,5 л воды с агаром, предварительно нагретой до кипения, для полного расплавления и растворения агара. Питательную среду разливают по сосудам и автоклавируют при давлении 0,7-1,0 атм. (температура 119-121°С) в течение 20-25 мин. После остывания среды осуществляют высадку срезанных с этапа пролиферации побегов.

Испытание оптимизированной прописи питательной среды показало эффективность ее применения в сорте «Августин» учувствовавшего в испытании. Влияние разработанной питательной среды, для укоренения срезанных с пролиферации побегов, на их рост и развитие через 70 дней, представлено в табл. 2.

Как видно, из представленных данных в варианте, где для укоренения побегов примененяли разработанную пропись питательной среды, укореняемость микропобегов была лучше, стабильно улучшалось их развитие, а также снижалось число отбракованных эксплантов из-за некроза или отсутствия развития.

Таким образом, установлено, что соотношение макросолей, входящих в состав питательной среды: NH₄NO₃ уменьшенное до 825 мг/л KNO₃ - 950 мг/л; уровень содержания фосфора в среде уменьшенное в два раза, MgSO₄⋅7H₂O - 220 мг/л, СаСI₂×2Н₂O - хлористый кальций также в два раза 220 мг/л. заметно повышает процессы регенерации и развития микрорастений на этапе укоренения побегов.

Использование предложенной оптимизированной питательной среды для укоренения микропобегов винограда в условиях in vitro обеспечивает по сравнению с существующей следующие преимущества:

1. Повышает количество укоренных побегов винограда in vitro, срезанных с этапа пролиферации, и соответственно выход укорененных микрорастений в среднем на 20,0-30,0%. Соответственно снижает количество отбракованных эксплантов из-за некроза и отсутствия развития.

2. Заметно улучшает развитие микрорастений винограда, ростовые процессы при этом ускоряются минимум в два раза.

3. В разработанной питательной среде для достижения значительного положительного эффекта предусмотрено использование стандартных и общепринятых (в клональном микроразмножении растений) компонентов и не требуется дополнительно применение редких или малоизученных физиологически активных веществ.

Изобретение позволяет повысить количество и качество укорененных побегов.

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную среду для укоренения побегов винограда in vitro, содержащую агар-агар, сахарозу, азотнокислый калий, азотнокислый аммоний, сернокислый магний, хлористый кальций, фосфорнокислый калий, мезоинозит, йодистый калий, борную кислоту, сернокислый цинк, сернокислый марганец, сернокислую медь, хлористый никель, никотиновую кислоту, пиридоксин, тиамин, сернокислое железо, трилон, уголь активированный, воду. Изобретение позволяет повысить количество и качество укорененных побегов и преодолеть сортовую специфику виноградного растения на этапе укоренения. 2 табл.

Питательная среда для укоренения побегов винограда in vitro, содержащая агар-агар, сахарозу, азотнокислый калий, азотнокислый аммоний, сернокислый магний, хлористый кальций, фосфорнокислый калий, мезоинозит, йодистый калий, борную кислоту, сернокислый цинк, сернокислый марганец, сернокислую медь, хлористый никель, никотиновую кислоту, пиридоксин, тиамин, сернокислое железо, трилон, уголь активированный, воду, при следующем содержании исходных компонентов, мг/л:

Агар-агар 7000 Сахароза 15000 KNО₃ - азотнокислый калий 950 NH₄NО₃ - азотнокислый аммоний 825 MgSО₄×7H₂О - сернокислый магний 185 CaCl₂×2Н₂О - хлористый кальций 220 КН₂РО₄ - фосфорнокислый калий 85 Мезоинозит 100 KI - йодистый калий 0,42 Н₃ВО₃ - борная кислота 3,1 ZnSО₄×2H₂О - сернокислый цинк 4,3 MnSО₄×4H₂О - сернокислый марганец 1,1 CuSО₄×5H₂О - сернокислая медь 0,025 NiCl₂ - хлористый никель 0,025 Никотиновая кислота 1 Пиридоксин В₆ 1 Тиамин В₁ 1 FeSО₄×7H₂О - сернокислое железо 27,8 Трилон БNa₂ЭДТА×2Н₂O 37,2 Уголь активированный 5000 рН среды 6,6,

при этом объем раствора доводят до 0,5 л, устанавливают рН 6,4-6,6 и добавляют 0,5 л воды с агаром, предварительно нагретой до кипения.