ВЕКТОРИЗОВАННЫЕ ВОДОСОВМЕСТИМЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ МИЦЕЛЛЯРНЫЕ ЧАСТИЦЫ ДЛЯ ДОСТАВКИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ЧЕРЕЗ ГЕМАТОЭНЦЕФАЛИЧЕСКИЙ БАРЬЕР Российский патент 2021 года по МПК A61K9/08 A61K47/30 A61K47/64 C08F10/00 C08F12/00 C08F16/00 C08F20/00 C08F26/10 C08F28/04 B82Y5/00 

Изобретение относится к фармакологии и медицине, а именно к векторизированным водосовместимым частицам на основе биосовместимых амфифильных полимеров в виде наноразмерных мицеллярных структур, способных проникать через гематоэнцефалический барьер и направленно доставлять в структуры мозга нерастворимые и плохорастворимые лекарственные вещества.

Уровень техники

Адресная доставка лекарственных препаратов и биологически активных веществ к органам и тканям в организме человека является одной из основных проблем повышения эффективности лечения заболеваний самой различной этиологии. Особенно эта проблема актуальна в случае доставки лекарственных препаратов к тканям мозга. Стоящая перед медициной необходимость лечения заболеваний центральной нервной системы (ЦНС) (патологические изменения, психические отклонения, раковые опухоли с локализацией в ЦНС и др.) формирует задачи целенаправленного влияния на клетки ЦНС и доставки к ним необходимых лекарственных средств. А это подразумевает необходимость преодоления помимо ретикуло-эндотелиальной системы организма преодоление и гематоэнцефалического барьера (ГЭБ).

Известны способы получения липосомальных форм различных фармацевтических препаратов (амфотерицин В, доксорубицин, цисплатин, кверцетин и др.) и попытки их использования для транспорта лекарственных веществ в организме. Хотя липосомальные системы доставки на основе природных жиров (липидов) и обеспечивают некоторую защиту инкапсулированных препаратов, неустойчивость структуры, проникновение активного вещества сквозь липосомальную мембрану во внешнюю среду и достаточно большие размеры липосом ограничивают область их применения.

Еще одним направлением получения наноразмерных систем доставки лекарственных веществ является разработка наноразмерных частиц, состоящих, в частности, из внутреннего ядра, образованного структурированными полисахаридами, с привитыми на их наружной части жирными кислотами и покрытыми слоем из фосфолипидов. Недостатком таких систем доставки является то, что они не способствуют повышению водосовместимости плохо- или нерастворимых в воде лекарственных веществ, а, следовательно, не могут быть использованы для транспорта таких лекарственных субстанций в организме человека.

В настоящее время одним из наиболее перспективных направлений в создании наноразмерных систем доставки лекарственных веществ является использование для этих целей природных или синтетических амфифильных (дифильных) полимеров. Известно, что амфифильные полимеры способны формировать самоорганизующиеся наноструктуры за счет наличия в их цепи гидрофобных и гидрофильных фрагментов. Варьируя химическое строение синтезируемых полимеров, природу и распределение функциональных групп, удается эффективно управлять процессом молекулярной сборки, добиваясь получения сложных регулярных структур различного строения, обладающих уникальными свойствами.

J. Kreuter (J.Anat. 1996 Dec; 189 (Pt 3): 503-505) предложен способ получения системы доставки лекарств через ГЭБ на основе полимерных носителей (полиметилметакрилата, полиалкилцианакрилата и др.) с добавлением полисорбата-80. В публикации Julie A. Straub et al. (Pharm. Res. 2005 Mar; 22 (3); 347-355) также предложен способ доставки гидрофобных лекарственных средств на основе паклитаксела (AI-850) с добавлением полисорбата-80. Общим недостатком предложенных способов является получение достаточно крупных частиц, более 1 мкм, что резко увеличивает скорость их поглощения ретикуло-эндотелиальной системой (тем самым, уменьшая время их циркуляции в организме), а также затрудняет их проникновение через ГЭБ.

В патенте US6117454 описан способ переноса лекарственных веществ через гематоэнцефалический барьер млекопитающих, в котором для направленной доставки лекарств или диагностических средств к ЦНС путем преодоления гематоэнцефалического барьера используют наночастицы. Согласно патенту US 6117454, во время или после полимеризации соответствующих мономеров, таких как цианоакрилат, добавляют лекарство, которое включают в получаемые полибутилцианакрилатные наночастицы или адсорбируют на их поверхность. Как полагают, эти комплексы наночастиц и лекарства способны преодолевать гематоэнцефалический барьер и направленно доставлять лекарства к ЦНС, если они покрыты соответствующим поверхностно-активным веществом. Полиоксиэтилен-20-сорбитанмонолаурат (Tween® 20), полиоксиэтилен-20-сорбитанмонопальмитат (Tween® 40), полиоксиэтилен-20-сорбитанмоностеарат (Tween® 60), полиоксиэтилен-20-сорбитанмоноолеат (Tween® 80) и их смеси заявлены в качестве соответствующих поверхностно-активных веществ, позволяющих наполненным лекарством полибутилцианакрилатным наночастицам пересекать гематоэнцефалический барьер. Существенными недостатками такого способа является использование токсичных цианоакрилатов для получения наночастиц, модификация поверхности частиц различными полиоксиэтиленами, а также невозможность модификации поверхности таких частиц пептидными векторами.

Ближайшим аналогом настоящего изобретения является техническое решение, известное из RU2423104 (C2). В патенте раскрывается способ получения системы направленной доставки лекарств для введения фармакологически активных веществ в центральную нервную систему млекопитающих через гематоэнцефалический барьер. Данная система представляет собой наночастицы на основе поли(DL-лактида) и/или поли(DL-лактид-согликолида), в которых содержится фармакологически активное вещество, абсорбируемое, адсорбируемое и/или включаемое в наночастицы, и содержит TPGS (D-α-токоферолполиэтиленгликоль 1000 сукцинат) или имеет покрытие из поверхностно-активного вещества плюроник 188. Известными недостатками описанного способа являются сложность модификации таких частиц пептидными векторами (ввиду отсутствия на поверхности частиц реакционно активных групп), использование для стабилизации поверхности частиц плюроников, а также их чувствительность к замораживанию и, как следствие, необходимости добавления маннитола как криозащитного агента.

Несмотря на то, что в последние годы технологии направленного транспорта лекарственных веществ активно разрабатываются, существует множество нерешенных проблем, требующих поиска новых технологических решений.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является разработка системы направленной доставки нерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ (БАВ) к выбранным мишеням центральной нервной системы (ЦНС) млекопитающих, обеспечивающей эффективность, специфичность, высокую стабильность в кровотоке, пролонгирование активности лекарственных веществ, пониженную токсичность, возможность контроля распределения и высвобождения лекарственных веществ при введении пациенту, простоту получения.

В результате осуществления изобретения достигаются следующие технические результаты:

- разработаны биосовместимые наноразмерные носители для направленной доставки БАВ на основе полимерных наночастиц, модифицированных пептидными векторами, способные проникать через гематоэнцефалический барьер и доставлять БАВ к выбранным мишеням в ЦНС;

- разработанные векторизированные биосовместимые полимерные мицеллярные носители водосовместимы, при этом их структура позволяет включать в них молекулы нерастворимых и плохорастворимых в воде биологически активных веществ, решая задачу их направленной доставки в клетки и ткани ЦНС;

- разработанные векторизированные водосовместимые полимерные мицеллярные носители способствуют повышению стабильности биологически активных веществ в кровотоке, а также их стабилизации при хранении,

- использование разработанных векторизированных водосовместимых полимерных мицеллярных носителей также позволяет обеспечить продолжительное высвобождение биологически активных веществ в организме с возможностью контроля распределения и высвобождения биологически активных веществ, а наличие пептидного вектора позволяет увеличить терапевтическую эффективность БАВ путем “нацеливания” наночастиц на определенные клетки или группы клеток, увеличения биодоступности биологически активных и лекарственных веществ или проявления синергии пептидного вектора и лекарственного вещества;

- основу разработанных векторизированных водосовместимых полимерных мицеллярных носителей составляют мицеллярные частицы, состоящие из биосовместимых амфифильных полимеров, что обеспечивает их пониженную токсичность на организм пациента; кроме того, включение молекул биологически активных веществ в состав таких наноразмерных носителей позволяет существенно снизить проявление их аллергенности;

- получение векторизированных водосовместимых полимерных мицеллярных носителей по изобретению не требует использования высокотоксичных соединений, а значит многократной очистки и инактивации промежуточных соединений на каждой стадии, что делает процесс их получения относительно простым и недорогим, пригодным к масштабированию, а получаемые частицы - безопасными для применения.

Решение поставленной задачи и достижение указанного технического результата обеспечивается путем создания векторизованных водосовместимых полимерных мицеллярных носителей (частиц) для доставки биологически активных веществ (БАВ), представляющих собой мицеллы, состоящие из амфифильных полимеров со среднечисловой молекулярной массой от 1 до 12 кДа, имеющих в гидрофильной части реакционноспособные группы, способные ковалентно связывать пептидный вектор,

при этом амфифильные полимеры имеют общую формулу

в которой

[---M---]_n - гидрофильная часть, состоящая из одинаковых или нескольких различных нерегулярно упорядоченных мономеров М, выбранных из группы:

N-винилпирролидон, этиленамин, 2-аллилоксибензальдегид, акриламид, акриловая кислота, метакриловая кислота,

N-диалкилакриламид, малеиновая кислота фумаровая кислота, малеиновый ангидрид коричная кислота,

где R₁ независимо представляет собой H, С_1-4алкил,

R – гидрофобная часть общего строения

,

где X выбирается независимо и представляет собой H, OH, NH₂ или NH₃Cl,

а реакционноспособная группа представляет собой аминную, карбоксильную, амидную или альдегидную группу, причем в амфифильном полимере по меньшей мере 1 мольн.% мономеров составляют мономеры, содержащие реакционноспособную группу,

при этом количество пептидных векторов, ковалентно связанных с мицеллой, составляет не менее одной молекулы пептида на мицеллу.

В некоторых предпочтительных вариантах изобретения пептидный вектор представляет собой пептид TAT, Annexin V, TRAIL или FALGEA.

Изобретение также относится к наноразмерным формам для направленной доставки биологически активных веществ (БАВ), содержащих, по меньшей мере, одно биологически активное вещество и векторизованный водосовместимый полимерный мицеллярный носитель, описанный выше.

Такие векторизованные водосовместимые полимерные мицеллярные носители могут доставлять биологически активные вещества через гемато-энцефалический барьер.

Изобретение также относится к применению вышеописанных векторизованных водосовместимых полимерных мицеллярных носителей для направленной доставки нерастворимых или плохорастворимых биологически активных веществ в центральную нервную систему.

В некоторых вариантах воплощения изобретения биологически активные вещества доставляют к внутренним структурам клетки-мишени.

В некоторых вариантах воплощения изобретения биологически активные вещества доставляют к нейронам головного мозга, расположенным в определенных структурах мозга.

В некоторых вариантах воплощения изобретения биологически активные вещества доставляют к опухолевым клеткам.

В некоторых вариантах воплощения изобретения биологически активное вещество представляет собой лекарственное вещество или диагностическое (в том числе контрастное) вещество.

Настоящее изобретение также относится к способу получения вышеописанных векторизованных водосовместимых полимерных мицеллярных носителей посредством присоединения к амфифильным полимерам пептидов, путем ковалентного связывания пептидов и реакционноспособных групп амфифильного полимера.

Краткое описание рисунков

Фиг. 1 - пространственная модель векторизованной водосовместимой полимерной мицеллярной частицы (носителя) для доставки биологически активных веществ через гемато-энцефалический барьер по изобретению.

Фиг. 2 - МРТ визуализация глиобластомы, показывающая накопление контрастного вещества (ионов гадолиния) после введения в хвостовую вену мыши в составе векторизованных водосовместимых полимерных мицеллярных частиц (носителей) на основе амфифильного сополимера акриловой кислоты и N-винилпирролидона с ковалентно связанным пептидом FALGEA.

Фиг. 3 - изображение сетчатки глаза мыши методом ICON после введения в хвостовую вену векторизованных водосовместимых полимерных мицеллярных частиц (носителей) на основе амфифильного сополимера метакриловой кислоты и N-винилпирролидона с ковалентно связанным пептидом Annexin V.

Термины и определения

Определения некоторых терминов, используемых в данном описании, приведены ниже. Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе. Кроме того, если не указано иное, все вхождения функциональных групп выбираются независимо.

В описании и в формуле изобретения термины «включает», «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

Термин «алкил», сам по себе или как часть другого заместителя, относится к насыщенным углеводородным группам с прямой или разветвленной цепью, включая углеводородные группы, имеющие указанное число атомов углерода (то есть, С_1-6 подразумевает от одного до шести атомов углерода). Примеры алкилов включают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, втор-пентил и н-гексил, но не ограничиваются ими.

Под «биологически активным веществом» (БАВ) подразумевают вещество, обладающее физиологической активностью, т.е. способностью влиять на процессы жизнедеятельности организма человека или животных, вырабатываемое организмом или сходное с ним. Физиологическая активность веществ может рассматриваться как с точки зрения возможности их медицинского применения, так и с точки зрения поддержания нормальной жизнедеятельности организма человека или животных, а также с точки зрения профилактики (предотвращения) возникновения каких-либо нарушений.

Под «лекарственным веществом» подразумевают биологически активное вещество, обладающее лечебными или профилактическими свойствами и предназначенное для изготовления лекарственных средств.

Под «диагностическим веществом» подразумевают вещество, используемое в диагностических исследованиях, чаще всего такие диагностические средства используют для контрастирования исследуемых структур или отдельных клеток.

В данном изобретении термин «векторизованный амфифильный полимер» означает, что полимер состоит из водорастворимого полимерного и гидрофобного неполимерного фрагментов, причем звенья водорастворимого полимерного фрагмента ковалентно связаны с пептидными векторами.

Под «вектором» понимают соединение, обеспечивающее адресность доставки лекарственного средства к фармакологической мишени. Выбор вектора осуществляется в зависимости от выбранной фармакологической мишени так, чтобы обеспечить к ней доставку лекарственного средства. При этом мишенью могут быть как поверхностные/ мембранные структуры клетки определенного типа (например, но не ограничиваясь, нейрона или опухолевой клетки), клеточные рецепторы, так и внутриклеточные структуры (для проникающих в клетку векторов). При этом структура «векторизованная водосовместимая полимерная мицеллярная частица - биологически активное вещество» должна быть, как минимум, стабильной и нетоксичной.

«Пептидный вектор» - вектор, имеющий пептидную природу. Такие пептидные векторы хорошо известны из уровня техники. В некоторых вариантах изобретения пептидный вектор представляет собой пептид TAT, Annexin V, TRAIL, FALGEA, пенетратин, VP22 или полиаргинин (polyR), но не ограничивается ими.

Подробное описание изобретения

В отличие от обычного введения лекарственного вещества и его распространения по всему организму, направленная доставка позволяет снизить дозу вводимого биологически активного вещества и минимизировать его воздействие на органы, ткани и клетки, не являющиеся мишенями терапии. При агрессивной терапии опухолей аспект направленной доставки высокотоксичных онкологических препаратов приобретает особое значение. Особенно актуальна направленная доставка биологически активных веществ в центральную нервную систему, структуры которой, выполняющие совершенно разные функции, расположены очень плотно.

Настоящее изобретение относится к векторизированным водосовместимым частицам на основе биосовместимых амфифильных полимеров в виде наноразмерных мицеллярных структур, способных проникать через гематоэнцефалический барьер и направленно доставлять в структуры мозга, к выбранным клеткам-мишеням ЦНС, нерастворимые и плохорастворимые БАВ. В зависимости от целей, с помощью предлагаемых векторизированных частиц БАВ может быть доставлено, например, к поверхности клетки, внутрь клетки, к синапсу. Такая направленная доставка позволяет увеличить терапевтическую эффективность и специфичность БАВ путем «нацеливания» наночастиц на определенные клетки или группы клеток, а также проявления синергии пептидного вектора и БАВ.

Векторизованные водосовместимые полимерные мицеллярные носители (частицы) для доставки БАВ по изобретению представляют собой мицеллы, образованные амфифильными полимерами, ковалентно связывающими пептидные векторы, причем мицеллы имеют очень малый размер – всего 10-200 нм (см. Фиг.1). Образование ковалентной связи происходит между реакционноспособными группами в гидрофильной части полимера и пептидного вектора. При этом каждый амфифильный полимер, входящий в состав мицеллы, может быть связан более чем с одним пептидным вектором. Количество векторных пептидов, связываемых одной мицеллой, может различаться и зависит от множества параметров, таких как молекулярная масса, стерический размер, активность пептидного вектора, размер мицеллы и др. Каждая мицелла связывает по меньшей мере один пептидный вектор. Выбор конкретного пептидного вектора зависит от мишени, к которой необходимо доставить БАВ, поэтому пептидные векторы, связанные с одной мицеллой, одинаковы. Пептидные векторы хорошо известны из уровня техники, в зависимости от выбранной мишени для доставки БАВ это может быть, например, TAT, Annexin V, TRAIL, FALGEA, пенетратин, VP22 или полиаргинин (polyR), но не ограничиваясь ими.

Амфифильные полимеры, входящие в состав мицеллярных частиц (носителей) согласно изобретению, представляют собой линейные карбоцепные полимеры, содержащие один концевой гидрофобный фрагмент R, связанный с основной цепью (представляющей собой гидрофильный фрагмент) сульфидной группой, имеющих среднечисловую молекулярную массу от 1 до 12 кДа.

Общая формула амфифильных полимеров, входящих в состав мицелл согласно изобретению, представляет собой

где

[---M---]_n - гидрофильная часть - линейный водорастворимый карбоцепной полимер, как это более подробно раскрыто далее в описании и в формуле изобретения;

R - гидрофобная часть, представляющая собой линейный или разветвленный алкильный радикал с числом атомов углерода в углеродной цепи 9-20.

Гидрофильная и гидрофобная части амфифильных полимеров связаны между собой сульфидной группой S.

Амфифильные полимеры, входящие в состав мицеллярных частиц согласно изобретению, являются биосовместимыми и биоразлагаемыми; структура амфифильных полимеров по изобретению позволяет синтезировать их одностадийным способом, без дополнительной модификации, что позволяет, во-первых, регулировать среднечисловую молекулярную массу непосредственно в процессе синтеза, в результате чего готовый продукт получают с высоким выходом и высокой степенью чистоты (низким количеством примесей), что сводит к минимуму (практически исключает) возможность их токсического воздействия на живой организм; кроме того, возможность использования одностадийного способа синтеза позволяет значительно интенсифицировать процесс получения конечного продукта: снизить временные и энергетические затраты, упростить аппаратное оформление всего процесса, что значительно снижает его стоимость.

Во-вторых, наличие реакционноспособных групп в составе амфифильных полимеров обеспечивает возможность присоединения к ним пептидных векторов, как это более подробно описано далее.

В качестве линейного водорастворимого карбоцепного полимера, входящего в состав амфифильных полимеров, мицеллярные частицы могут содержать как гомополимеры, например, поли-N-винилпирролидон, поли-N-изопропилакриламид, полиэтиленамин, поли-2-аллилоксибензальдегид, полиакриламид, полиакриловую кислоту, полиметакриловую кислоту, поли-N-диалкилакриламид, так и сополимеры, как регулярные, так и нерегулярные, в которых распределение мономеров по длине носит случайный характер. Ключевым параметром является наличие реакционноспособных групп в составе гидрофильной части амфифильного карбоцепного полимера. Реакционноспособная группа представляет собой аминную, карбоксильную, амидную или альдегидную группу, причем в амфифильном полимере по меньшей мере 1 мольн.% мономеров составляют мономеры, содержащие реакционноспособную группу. При этом амфифильные полимеры, входящие в одну мицеллу, необязательно должны быть одинаковыми.

Общие формулы некоторых неограничивающих вариантов предлагаемых амфифильных полимеров, содержащих реакционноспособные группы, могут быть представлены следующим образом:

1) Амфифильный гомополимер акриловой кислоты:

2) Амфифильный гомополимер метакриловой кислоты:

3) Амфифильный сополимер акриловой кислоты и N-винилпирролидона:

4) Амфифильный сополимер акриловой кислоты и акриламида:

5) Амфифильный сополимер акриловой кислоты и 2-аллилоксибензальдегида:

В приведенных структурах R – гидрофобная часть амфифильного полимера, представляющая собой линейный или разветвленный алкильный радикал общего строения

,

где X представляет собой H, OH, NH₂ или NH₃Cl.

Получение амфифильных полимеров, входящих в состав векторизованных водосовместимых полимерных мицеллярных частиц согласно изобретению, подробно описано в уровне технике (см., например, патент RU2580649).

Изобретение также относится к наноразмерным формам для направленной доставки нерастворимых и плохорастворимых БАВ, представляющих собой БАВ, включенные в векторизованные водосовместимые полимерные мицеллярные частицы, описанные выше. В качестве таких БАВ могут быть использованы любые водонерастворимые или плохорастворимые вещества, которые необходимо направленно доставить к мишеням в головном мозге человека или млекопитающих (например, лекарственные или диагностические, контрастные вещества).

Наноразмерные формы (фармацевтические композиции, системы доставки) для доставки БАВ согласно изобретению получают путем солюбилизации БАВ водорастворимыми амфифильными полимерами по изобретению методом самоассоциации дифильных веществ в водных средах при критической концентрации их мицелообразования (ККМ) или критической концентрации агрегации (ККА) в водных средах с образованием структур в виде сферических частиц - мицелл. При этом векторы гидрофобных фрагментов амфифильных молекул полимера обращены внутрь частиц, образуя внутреннее ядро, которое содержит нерастворимое или плохорастворимое БАВ.

В качестве БАВ в рамках настоящего изобретения могут быть использованы, нерастворимые и плохорастворимые биологически активные молекулы, относящиеся к следующим группам: снотворные, успокаивающие, анальгезирующие, противосудорожные лекарственные вещества, транквилизаторы, антидепрессанты, противомикробные вещества, в том числе антибиотики, противовирусные и противопаразитарные лекарственные вещества и др. БАВ также могут представлять собой нерастворимые и плохорастворимые биологически активные молекулы, используемые для проведения диагностики, например контрастировании тканей при проведении исследований. Необходимо понимать, что приведенный перечень не является ограничивающим и приведен здесь лишь с целью иллюстрации возможных вариантов воплощения изобретения.

Как известно, многие БАВ обладают высокой чувствительностью (подвергаются деструкции, теряют фармакологические свойства) к повышенной температуре, воздействию излучения (солнечный свет, УФ излучение), а также к воздействию кислорода воздуха. Заключение БАВ в векторизованные водосовместимые полимерные мицеллярные частицы по изобретению повышает стабильность таких БАВ при хранении, что позволяет продлить срок годности лекарственных препаратов, упростить режим их хранения. Кроме того, мицеллы позволяют защитить БАВ и в биологических средах, а небольшой размер мицеллярных частиц по изобретению (10-200 нм) позволяет им циркулировать в кровотоке долгое время, избегая захвата портальной системой печени и ретикуло-эндотелиальной системой, обеспечивая высокую стабильность в кровотоке и пролонгирование активности лекарственных веществ.

Возможность контроля распределения и высвобождения БАВ при введении мицеллярных частиц пациенту обеспечивается путем изменения их размера, заряда и пептидного вектора.

Возможность объективного проявления технического результата при использовании изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными в примерах, содержащих сведения экспериментального характера, полученные в процессе проведения исследований по методикам, принятым в данной области. Сущность изобретения поясняется рисунками.

Следует понимать, что эти и все приведенные в материалах заявки примеры не являются ограничивающими и приведены только для иллюстрации настоящего изобретения.

Структура некоторых вариантов амфифильных полимеров, содержащих ковалентно-связанные пептидные векторы, и входящих в состав векторизованных водосовместимых полимерных мицеллярных частиц по изобретению, может быть представлена следующим образом:

1. Амфифильный гомополимер акриловой кислоты, содержащий вектор для распознавания клеток глиобластомы головного мозга человека (FALGEA):

2. Амфифильный сополимер N-винил-2-пирролидона и метакриловой кислоты, содержащий вектор для распознавания апоптирующих глиальных клеток (Annexin V):

Следует отметить, что согласно изобретению, пептидные векторы могут связываться как с концевыми, так и не с концевыми мономерами гидрофильной части амфифильных полимеров. При этом каждый амфифильный полимер, входящий в состав векторизованных водосовместимых полимерных мицеллярных частиц по изобретению, может быть связан более чем с одним пептидным вектором. С точки зрения химии, пептидные векторы могут присоединяться по всем доступными (химически и стерически) группам амфифильных полимеров, которых в полимере должно быть не менее 1 мольн.%.

Получение наноразмерных форм для направленной доставки нерастворимых и плохорастворимых БАВ на основе векторизованных водосовместимых полимерных мицеллярных частиц

Наноразмерные формы для направленной доставки нерастворимых и плохорастворимых БАВ могут быть получены из амфифильных полимеров эмульсионным методом (нанопреципитация). Количество амфифильных полимеров при этом должно быть таким, чтобы в конечном растворе его концентрация была больше критической концентрации агрегации.

Наноразмерные формы для направленной доставки нерастворимых и плохорастворимых БАВ образуются при добавлении в процессе получения наночастиц необходимого количества БАВ. Количество включаемого БАВ варьируется от 0.1 до 50 масс. %.

Расчетное количество амфифильного полимера растворяют в бидистиллированной обеспыленной воде, а БАВ растворяют в органическом растворителе (например, хлороформе, метиленхлориде или этиацетате) при перемешивании без нагревания. Затем полученный раствор БАВ в органическом растворителе добавляют при интенсивном перемешивании по каплям к раствору амфифильного полимера в бидистиллированной воде. Полученную эмульсию интенсивно перемешивают 10-20 минут, а затем подвергают воздействию ультразвукового излучения 12-24 минуты при мощности 60 Вт и импульсном режиме (1 сек. через 1 сек.) (на приборе “VibraCell”, США). Органический растворитель отгоняют на роторном испарителе, а полученную массу лиофильно сушат.

Получение мицеллярных частиц, содержащих ковалентно связанные пептидные векторы

Мицеллярные частицы, содержащие ковалентно связанные пептидные векторы, согласно изобретению получают посредством присоединения к полученным мицеллярным частицам пептидов по N-концу. Присоединение осуществляют в два этапа:

1) На первом этапе проводят активацию реакционноспособных групп амфифильных полимеров, входящих в состав мицеллярных частиц, посредством последовательного химического взаимодействия с карбодиимидом в растворителе и сукцинимидом или этил-(2Z)-2-циано-2-гидроксииминоацетатом (Oxyma).

2) На втором этапе к мицеллярным частицам с активированными реакционноспособными группами, добавляют водный раствор пептида.

3) Смесь инкубируют при комнатной температуре. После окончания реакции мицеллярные частицы с ковалентно связанным пептидом отделяют от примесей с помощью диализа.

Благодаря наличию реакционноспособных групп в составе амфифильных полимеров, а, следовательно, и в составе мицеллярных частиц, удается эффективно присоединять к мицеллярным частицам различные пептиды. В свете настоящего изобретения в качестве пептидов выбирают пептиды, обладающие свойствами векторов.

В некоторых неограничивающих вариантах изобретения в качестве пептидного вектора могут быть использованы, например TAT (клеточно-проникающий пептидный вектор), Annexin V (пептидный вектор, обладающий собственной биологической активностью), TRAIL (векторный пептид большой молекулярной массы, порядка 30 кДа), FALGEA (векторный пептид низкой молекулярной массы (606 Да)).

Предпочтительно, карбодиимид выбирают из группы, включающей дициклогексилкарбодиимид, диизопропилкарбодиимид, 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид, но не ограничиваются ими.

Также, предпочтительно, растворитель для проведения реакции выбирают из группы, включающей: воду, диметилсульфоксид, хлороформ, хлористый метилен, циклогексан, диметилформамид.

В частных случаях воплощения изобретения в качестве растворителя для присоединения пептидов TAT, Annexin V и FALGEA, используют диметилсульфоксид, хлороформ, хлористый метилен, циклогексан, диметилформамид, но не ограничиваются ими. В других частных вариантах воплощения изобретения в качестве растворителя для присоединения пептида TRAIL выбирают воду.

Ниже представлены примеры получения некоторых мицеллярных частиц с ковалентно связанными пептидными векторами по изобретению.

Пример 1.

Мицеллярные частицы с ковалентно связанным пептидом Annexin V на основе сополимера N-винилпирролидона и акриловой кислоты получают следующим образом. Расчётное количество сополимера растворяют в диметилсульфоксиде в хорошо промытой плоскодонной колбе с притертой пробкой. К полученному раствору добавляют дициклогексилкарбодиимид и сукцинимид. Полученный раствор инкубируют при комнатной температуре в течение двух часов. Навеску пептида Annexin V растворяют в минимальном количестве диметилсульфоксида. Затем эти два раствора совмещают и инкубируют полученную смесь при комнатной температуре в течение часа. По истечении времени содержимое колбы диализуют против воды в течение 3-5 суток. Выход мицеллярных частиц с ковалентно связанным пептидом Annexin V составляет 86%.

Пример 2.

Мицеллярные частицы с ковалентно связанным пептидом TRAIL на основе сополимера N-винилпирролидона и метакриловой кислоты получают следующим образом. Расчётное количество сополимера растворяют в дистиллированной воде в хорошо промытой плоскодонной колбе с притертой пробкой. К полученному раствору добавляют 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид и этил-(2Z)-2-циано-2-гидроксииминоацетат. Полученный раствор инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин. Навеску пептида TRAIL растворяют в минимальном количестве дистиллированной воды. Затем эти два раствора совмещают и инкубируют полученную смесь при комнатной температуре в течение 30 мин. По истечении времени содержимое колбы диализуют против воды в течение 3-5 суток. Выход мицеллярных частиц с ковалентно связанным пептидом TRAIL составляет 81%.

Пример 3.

Мицеллярные частицы с ковалентно связанным пептидом TAT на основе гомополимера акриловой кислоты получают следующим образом. Расчётное количество гомополимера растворяют в хлороформе. К полученному раствору добавляют диизопропилкарбодиимид и сукцинимид. Полученный раствор инкубируют при комнатной температуре в течение трех часов. Навеску пептида TAT растворяют в минимальном количестве диметилсульфоксида. Затем эти два раствора совмещают и инкубируют полученную смесь при комнатной температуре в течение часа. По истечении времени содержимое колбы диализуют против воды в течение 3-5 суток. Выход мицеллярных частиц с ковалентно связанным пептидом TAT составляет 83%.

Подтверждение возможности включения лекарственных веществ в мицеллы, образованные амфифильными полимерами с ковалентно связанными пептидными векторами по изобретению

Благодаря своей амфифильной природе, мицеллярные частицы, включающие ковалентно связанные пептидные векторы, обладают возможностью солюбилизовать плохорастворимые и нерастворимые в воде лекарственные вещества. Данные по солюбилизации ряда лекарственных веществ приведены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты измерения степени включения лекарственных веществ в мицеллы, образованные амфифильными полимерами с ковалентно связанными пептидными векторами.

Гидрофильный фрагмент - сополимер метакриловой кислоты и N-винилпирролидона гидрофобный фрагмент - октадецил (H(CH₂)₁₈-), пептидный вектор - Annexin V или FALGEA.

Лекарственное вещество Степень включения в мицеллы, образованные амфифильными полимерами на основе метакриловой кислоты и N-винилпирролидона с ковалентно связанным пептидом Annexin V, % Степень включения в мицеллы, образованные амфифильными полимерами на основе метакриловой кислоты и N-винилпирролидона с ковалентно связанным пептидом FALGEA, % Даларгин 34 17 Паклитаксел 16 39 DADLE 42 13 Темозоломид 20 41 Бортезомиб 18 40

Подтверждение возможности нацеливания полимерных мицеллярных частиц

на основе амфифильных полимеров

с ковалентно связанными пептидными векторами по изобретению

на выбранные мишени

In vivo исследования проводились на мышах с имплантированной глиобластомой с использованием полимерных мицеллярных частиц на основе амфифильного сополимера акриловой кислоты и N-винилпирролидона с ковалентно связанным пептидом FALGEA. Из литературных данных известно, что короткоцепочечный пептидный вектор FALGEA способен селективно связываться с мутировавшим глиобластома-специфическим рецептором EGFRvIII, тем самым проявляя эффект “нацеливания”. Исследование проводилось с помощью магнито-резонансной томографии, в качестве контрастного вещества использовалась соль гадолиния, которая в целях эксперимента комплексно связывалась с поверхностью мицеллярных частиц. В качестве БАВ использовался куркумин, включенный в полимерные мицеллы. Результаты, демонстрирующие усиление накопления сигнала контрастного вещества в глиобластоме, показаны на Фиг. 2.

По окончании in vivo исследований готовились препараты ткани глиобластомы и методом атомно-абсорбционной спектроскопии определялась концентрация ионов гадолиния. Сравнительные результаты определения концентрации ионов гадолиния в тканях глиобластомы представлены в таблице 2.

Таблица 2. Результаты определения концентрации ионов гадолиния в тканях глиобластомы после введения полимерных мицеллярных частиц на основе амфифильного сополимера акриловой кислоты и N-винилпирролидона с ковалентно связанным пептидом FALGEA и без ковалентно связанного пептида.

Тип введенных в кровоток мыши полимерных частиц Концентрация ионов гадолиния в тканях глиобластомы, мкг/мл Частицы на основе амфифильного сополимера акриловой кислоты и N-винилпирролидона с ковалентно связанным пептидом FALGEA 3,44 Частицы на основе амфифильного сополимера акриловой кислоты и N-винилпирролидона без ковалентно связанного пептида 1,25

Проведенный эксперимент демонстрирует достоверное существенное увеличение накопление в тканях глиобластомы полимерных мицеллярных частиц с ковалентно связанным пептидом FALGEA по сравнению с мицеллярными частицами, не имеющими нацеливающего вектора.

Подтверждение преодоления ГЭБ полимерными мицеллярными частицами на основе амфифильных полимеров с ковалентно связанными пептидными векторами по изобретению

In vivo исследования проводились с помощью метода конфокальной нейровизуализации сетчатки (ICON метод). В хвостовую вену мыши вводили раствор полимерных мицеллярных частиц на основе амфифильного сополимера метакриловой кислоты и N-винилпирролидона с ковалентно связанным пептидным вектором Annexin V. В качестве контрастных веществ использовались включенные в полимерные мицеллы флуоресцентные красители DiI и FITC, плохорастворимые в воде. Снимок сетчатки проводился непосредственно в момент введения (0 мин), через 1 минуту после введения и через 5 минут после введения. Результаты показаны на Фиг. 3.

Как показано на Фиг. 3, через 5 минут после введения полимерных мицеллярных частиц наблюдается флуоресценция клеток за пределами капилляров, что свидетельствует о преодолении гемато-ретинального барьера – одного из участков гемато-энцефалического барьера (ГЭБ).

Таким образом, векторизованные водосовместимые полимерные мицеллярные носители по изобретению могут быть эффективно использованы для доставки нерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ к выбранным мишеням центральной нервной системы.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к векторизованному водосовместимому полимерному мицеллярному носителю для доставки биологически активных веществ, представляющему собой мицеллу, состоящую из амфифильных полимеров со среднечисловой молекулярной массой от 1 до 12 кДа, имеющих в гидрофильной части реакционноспособные группы, способные ковалентно связывать пептидный вектор, при этом амфифильные полимеры имеют общую формулу

в которой [---M---]_n - гидрофильная часть, состоящая из одинаковых или нескольких различных нерегулярно упорядоченных мономеров М, выбранных из группы:

,

где R₁ независимо представляет собой H, С_1-4алкил; R – гидрофобная часть общего строения , в которой X выбирается независимо и представляет собой H, OH, NH₂ или NH₃Cl, а реакционноспособная группа представляет собой аминную, карбоксильную, амидную или альдегидную группу, причем в амфифильном полимере по меньшей мере 1 мол.% мономеров составляют мономеры, содержащие реакционноспособную группу; при этом количество пептидных векторов, ковалентно связанных с мицеллой, составляет не менее одной молекулы пептида на мицеллу и пептидные векторы, связанные с одной мицеллой, одинаковы, а также к наноразмерной форме для направленной доставки биологически активных веществ, содержащей векторизованный водосовместимый полимерный мицеллярный носитель, и к применению векторизованного водосовместимого полимерного мицеллярного носителя для направленной доставки нерастворимых или плохорастворимых в воде биологически активных веществ в центральную нервную систему. Группа изобретений обеспечивает разработку биосовместимых наноразмерных носителей для направленной доставки БАВ на основе полимерных наночастиц, модифицированных пептидными векторами, способных проникать через гематоэнцефалический барьер и доставлять БАВ к выбранным мишеням в ЦНС, обеспечивает направленную доставку векторизированных водосовместимых полимерных мицеллярных носителей в клетки и ткани ЦНС; обеспечивает повышение стабильности биологически активных веществ в кровотоке, а также их стабилизации при хранении; обеспечивает продолжительное высвобождение БАВ в организме с возможностью контроля распределения и высвобождения БАВ и обеспечивает увеличение терапевтической эффективности и биодоступности БАВ и лекарственных веществ или обеспечивает проявление синергии пептидного вектора и лекарственного вещества; обеспечивает процесс получения векторизированных водосовместимых полимерных мицеллярных носителей относительно простым и недорогим, пригодным к масштабированию, а получаемые частицы - безопасными для применения. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл.

1. Векторизованный водосовместимый полимерный мицеллярный носитель для доставки биологически активных веществ, представляющий собой мицеллу, состоящую из амфифильных полимеров со среднечисловой молекулярной массой от 1 до 12 кДа, имеющих в гидрофильной части реакционноспособные группы, способные ковалентно связывать пептидный вектор,

при этом амфифильные полимеры имеют общую формулу

в которой

[---M---]_n - гидрофильная часть, состоящая из одинаковых или нескольких различных нерегулярно упорядоченных мономеров М, выбранных из группы:

где R₁ независимо представляет собой H, С_1-4алкил;

R – гидрофобная часть общего строения , в которой X выбирается независимо и представляет собой H, OH, NH₂ или NH₃Cl,

а реакционноспособная группа представляет собой аминную, карбоксильную, амидную или альдегидную группу, причем в амфифильном полимере по меньшей мере 1 мол.% мономеров составляют мономеры, содержащие реакционноспособную группу;

при этом количество пептидных векторов, ковалентно связанных с мицеллой, составляет не менее одной молекулы пептида на мицеллу и пептидные векторы, связанные с одной мицеллой, одинаковы.

2. Векторизованный водосовместимый полимерный мицеллярный носитель по п.1, в котором пептидный вектор представляет собой пептид TAT, Annexin V, TRAIL или FALGEA.

3. Наноразмерная форма для направленной доставки биологически активных веществ, содержащая векторизованный водосовместимый полимерный мицеллярный носитель по любому из пп.1, 2 и по меньшей мере одно нерастворимое или плохорастворимое в воде биологически активное вещество, включенное в гидрофобное ядро мицеллы.

4. Наноразмерная форма для направленной доставки биологически активных веществ по п.3, в которой биологически активное вещество представляет собой лекарственное вещество или диагностическое вещество.

5. Наноразмерная форма для направленной доставки биологически активных веществ по п.4, в которой биологически активное вещество выбрано из группы, состоящей из снотворных, успокаивающих, анальгезирующих, противосудорожных, антибактериальных, противовирусных, противопаразитарных лекарственных веществ, транквилизаторов, антидепрессантов.

6. Применение векторизованного водосовместимого полимерного мицеллярного носителя по любому из пп.1, 2 для направленной доставки нерастворимых или плохорастворимых в воде биологически активных веществ в центральную нервную систему.