УСТРОЙСТВО ДЛЯ ТЕСТИРОВАНИЯ И НАСТРОЙКИ СИСТЕМЫ ВИЗУАЛИЗАЦИИ МИКРООБЪЕКТОВ И СПОСОБ ЕГО ИЗГОТОВЛЕНИЯ Российский патент 2021 года по МПК G01N21/64 B81B1/00 

Уровень техники

Областью возможного применения предлагаемого настоящего изобретения является детектирование сигналов флуоресценции от микрообъектов различной природы, например, в цифровой микроскопии, в системах сканирования изображений, в системах регистрации флуоресцентных сигналов от меченых нуклеотидов, таких как секвенаторы.

Для юстировки и валидации приборов, предназначенных для регистрации оптических, в частности флуоресцентных, сигналов светящихся микрообъектов и для последующей корректной обработки полученной информации, представляется необходимым создание устройства тестирования, которое содержало бы набор микрочастиц с заранее известными характеристиками. Характеристики указанных микрочастиц должны по возможности точно моделировать параметры реально исследуемых объектов.

При рассмотрении известных устройств, схожих по назначению с предлагаемым изобретением, было выявлено несколько близких аналогов. Их исследование дает основание считать, что существующие устройства тестирования не позволяют осуществлять юстировку параметров оптических систем, предназначенных для работы с очень большими ансамблями флуоресцирующих микрообъектов, произвольно расположенных по всей длине поверхности канала микрофлюидного чипа.

Известен оптический эталонный стандарт (патент США № 7,480,042 B1), который включает в себя механизм для контроля и калибровки системы обнаружения света и может использоваться совместно с тестируемым образцом. Указанный стандарт может включать светопроизводящую (например, люминесцентную) часть и/или светонепроницаемую часть (например, маску) и может быть размещен в плоскости объекта. В указанном стандарте используются комбинации светоизлучающих и светоблокирующих слоев. Например, для излучения света используется широкополосный фотолюминесцентный компонент в комбинации со спектральными фильтрующими компонентами, включающими фильтрующие материалы с холодным покрытием, сконфигурированные для передачи света со спектрами, например, FAM и ROX.

Известны варианты осуществления указанного эталонного стандарта с растворимыми или суспендируемыми люминофорами, такими как фотолюминесцентные нанокристаллы, которые могут быть дозированы в лунки микропластины (96, 384, 1356 лунок). Лунки покрывают или герметизируют подходящими материалами. Примерами суспензионных сред указаны полимерные гели, агарозные гели, акриламидные гели, эпоксидные смолы оптического класса и др. Плюсом данного подхода является то, что влажные стандарты могут располагать люминофоры в эталонном стандарте в той же или аналогичной среде, что и люминофоры в образце. Кроме того, влажные стандарты могут располагать люминофоры в стандарте в расчетной точке фокуса оптической системы обнаружения, используемой в анализе.

Недостатком указанного стандарта, кроме отсутствия дискретных флуоресцирующих частиц микронного размера, можно считать его специфичность для использования в комплексах предназначенных для детектирования сигналов от пластин с микролунками, что существенно ограничивает область его использования в системах, работающих иначе.

Известна мультифункциональная калибровочная система (патент США № 7,544,926 B2) для характеристики люминесцентных систем измерения, в частности спектрально разрешающих, широкопольных и/или конфокальных систем визуализации. Известная система содержит один или несколько калибровочных модулей, расположенных на опорной плите и соответственное количество калибровочных и/или характеристических функций, а также одну или более поверхностей для настройки фокусировки, обладающих высокой планарностью, причем эти фокусирующие поверхности расположены в общей плоскости с, по меньшей мере, одним калибровочным модулем и имеют шероховатость поверхности, меньшую, чем оптическое разрешение системы измерения люминесценции. Указанные фокусирующие поверхности могут иметь отражающие и/или люминесцирующие свойства для установки определенного фокуса измерительного луча калибруемой люминесцентной системы. Размеры указанной опорной плиты составляют 76,0 мм × 26,0 мм, что соответствует стандартным размерам предметных стекол для микроскопов. Калибровочные модули расположены между фокусирующими поверхностями и предназначены для различных настроечных и тестовых операций.

Указанная калибровочная система позволяет осуществлять юстировку лучей от источников излучения, как в узких полосах спектрального диапазона, так и для широкополосного излучения. Недостатком указанной системы, кроме отсутствия дискретных флуоресцирующих частиц микронного размера, можно считать её специфичность для устройств люминесцентной визуализации только в микроскопии и невозможность сопряжения с комплексами, использующими микрофлюидные устройства с каналами заданной глубины, на поверхностях которых расположены целевые флуоресцирующие объекты.

Известны устройство и способ (патент РФ № 2701875 C1), в соответствии с которыми устройство тестирования представляет собой оптическую миру из твердого материала-основы, в который введен флуоресцирующий материал и который имеет заданную фононную энергию HOST_PE.

Использование твердотельных флуоресцирующих оптических мир обосновано в описании указанного устройства сложностью работы с жидкими флуоресцирующими материалами. При этом авторами отмечается, что жидкий флуоресцентный носитель внутри каналов микрофлюидного чипа обладает определенными несовершенствами, такими как неравномерность свечения, которая обусловлена быстрым фотовыцветанием носителя под действием возбуждающего излучения, которое усугубляется перемешиванием облученного и необлученного слоев носителя в ходе тестирования и калибровки системы, а также существующей вероятностью образованием пузырей при введении красителя в микрофлюидный канал.

Флуоресцирующий материал в указанном устройстве характеризуется определенным основным энергетическим уровнем и целевым излучательным (ЦИ) энергетическим уровнем, отделенным от основного энергетического уровня первым энергетическим зазором, соответствующим интересующему спектральному интервалу флуоресценции, и имеет энергетический уровень, который является ближайшим нижележащим уровнем относительно ЦИ энергетического уровня, отделенным от него вторым энергетическим зазором FM_EG2, причем отношение FM_EG2/HOST_PE составляет три или более. Недостатком указанного решения можно считать трудоемкость и относительную сложность при изготовлении твердого материала-основы, позволяющего получить флуоресценцию в полосах излучения, которые соответствуют интересующим оптическим каналам.

В указанном устройстве на самой мире или на поверхности прозрачного слоя, расположенного над мирой, могут быть сформированы микроструктуры с образованием слоя решетки, которые могут быть использованы для различных настроечных тестов. На поверхность слоя решетки может наноситься, различными методами, слой хрома с образованием различными участками хрома различных паттернов (именуемых также "участками хрома" или "паттернами хрома") для использования в сочетании с различными операциями юстировки и/или калибровки.

Как вариант, указанное устройство может содержать корпус, в котором выполнено гнездо для приема оптической миры, а в его верхней поверхности сформирована приемная область, окружающая гнездо, и прозрачный слой, установленный в приемную область и расположенный над оптической миррой; при этом в корпусе имеется канал, по меньшей мере частично окружающий гнездо и предназначенный для приема адгезива, прикрепляющегося к указанному прозрачному слою, при этом канал снабжен серией углублений для ослабления давления, распределенных по его длине и предназначенных для уменьшения напряжения, создаваемого в прозрачном слое адгезивом в процессе его отверждения. Недостатком такого подхода можно считать сложность равномерного заполнения канала адгезивом, что может повлечь за собой изгибание прозрачного слоя, расположенного над оптической миррой, и нарушение его планарности, что, в свою очередь, может повлечь за собой ошибки в процедуре тестирования и калибровки.

Как вариант, оптическая мира в указанном устройстве может содержать твёрдое тело, внутри которого имеется множество квантовых точек. Твёрдое тело может быть изготовлено из эпоксидной смолы, полимеров и других материалов, в которые может быть включено множество дискретных частиц (например, квантовых точек), удерживающихся в фиксированном положении. Квантовые точки распределены, по существу, равномерно по всей оптической мире. При этом квантовые точки распределены не в одном слое, а по всему объему миры, что можно считать недостатком данного устройства, так как свечение случайно расположенных микрообъектов на разных глубинах миры будет вносить существенный вклад в неравномерность фона изображения и помехи в сигналы флуоресценции от точек, свечение которых регистрируется в какой-либо выбранной фокальной плоскости на определенной глубине миры. Кроме того, из-за случайного распределения квантовых точек по глубине миры неравномерность фона изображения, обусловленная их свечением, будет различной в различных кадрах изображения, другими словами, будет представлять собой невоспроизводимую случайную помеху.

Известна тестовая пластина, включающая в себя микросферы, предназначенная для тестирования флуоресцентных отображающих систем, которая выбрана прототипом настоящего изобретения (патентная заявка США № US20020098588 A1). В указанной тестовой пластине микросферы нанесены монослоем в лунки – круглые зоны на пластине, которых может быть 96, 384 или 1024. В указанной пластине суспензию с флуоресцирующими микросферами одинакового или разного размера наносят пипеткой в зону лунок, после чего высушивают. При этом микросферы в течение нескольких часов оседают под действием силы тяжести. Чем выше концентрация, тем выше количество агрегатов из сфер. Известен вариант пластины, когда запечатывают лунки с высушенными микросферами тонкой пленкой полимера, например, при необходимости длительного хранения, причем полимерный слой выбирают из группы, состоящей из полиуретана, полиакрилата, полисиликонов, полигликолей и поливинилового спирта.

Указанная пластина и заявленные для неё методы тестирования не позволяют простым и удобным способом настраивать и тестировать отображающие сканирующие системы, использующие микрочипы с микрофлюидным каналом внутри, где целевые объекты локализованы на разных поверхностях микрофлюидного канала. Кроме того, в указанной пластине концентрация микросфер сравнительно невелика: 1 × 10⁵ ÷ 4 × 10⁵ сфер/мл, что соответствует концентрации 10 × 10³ ÷ 40 × 10³ сфер в лунке. Это не позволяет моделировать очень высокую концентрацию флуоресцирующих целевых объектов, которая бывает в системах секвенирования ДНК.

ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Термины

Микрофлюидный чип в общем виде представляет собой конструкцию из нескольких герметично соединенных достаточно тонких пластин, в которых изготовлены микро- и наноразмерные структуры (каналы, реакционные камеры и/или отверстия).

Канал микрофлюидного чипа – канал внутри микрофлюидного чипа, имеющий планарные верхнюю и нижнюю поверхности, которые являются взаимно параллельными. Кроме того, канал имеет входной и выходной порты для ввода и вывода аналита и реагентов.

Флуоресцирующие микросферы – полимерные микросферы известного размера с известными спектральными характеристиками возбуждающего и эмиссионного излучения.

Поверхностная плотность микросфер – количество микросфер, приходящееся на 1 мм² поверхности канала микрофлюидного чипа.

Целью создания предлагаемого устройства тестирования является получение эффективного, точного и экономически выгодного способа юстировки и валидации оптической системы комплекса визуализации изображений микрообъектов.

Для решения задачи юстировки и валидации приборов, предназначенных для регистрации оптических, в частности флуоресцентных, сигналов светящихся микрообъектов и для последующей корректной обработки полученной информации, в настоящем изобретении предлагается устройство для тестирования и настройки системы визуализации микрообъектов, в котором набор флуоресцирующих микрочастиц размещён и зафиксирован на одной из поверхностей внутреннего канала микрофлюидного чипа, а не во всём объёме внутреннего канала микрофлюидного чипа.

Моделирование флуоресцирующих в разных спектральных диапазонах объектов может быть осуществлено, например, при помощи имеющихся на рынке наборов окрашенных микросфер компании ThermoFisher (FluoSpheres™ Carboxylate-Modified Microspheres, каталожные номера F8816, F8820, F8821; FocalCheck™ Thin-Ring Fluorescent Microspheres Kit, каталожный номер F14791), паспортные характеристики которых содержат информацию о размерах, концентрации, спектральных характеристиках и интенсивности флуоресценции входящих в них частиц.

В предлагаемом настоящем изобретении в качестве источника флуоресценции использованы твёрдые полистиреновые микросферы с очень высокой устойчивостью к фотовыцветанию, которая достигается за счёт окрашивания флуоресцентным красителем всего объема микросфер, а не только их поверхности. Такие микрочастицы выдерживают большое количество циклов засветки излучением с высокой плотностью мощности без потери интенсивности испускаемой ими флуоресценции. При этом, микросферы иммобилизованы полимером на верхней или нижней поверхностях канала микрофлюидного чипа, поэтому исключается их перемещение и бесконтрольное повторное засвечивание.

В качестве полимера для иммобилизации микросфер предпочтительно использовать полимерные гели, агарозные гели, акриламидные гели, эпоксидные смолы оптического класса и др.

Технология изготовления устройства согласно настоящему изобретению значительно проще по сравнению с устройством, известным из патента РФ 2701875 C1, за счёт отсутствия сравнительно сложных и трудоёмких технологических процессов, таких как введение флуоресцирующего материала в твёрдую основу миры или формирование микроструктур для образования решетки, используемой для настройки и калибровочных тестов. Имея в распоряжении микросферы известного размера и нужного спектрального диапазона, микрофлюидный чип и полимер для иммобилизации, можно изготовить устройство тестирования согласно настоящему изобретению непосредственно в исследовательской лаборатории со стандартным лабораторным оборудованием. Микросферы располагаются в монослое на верхней или нижней поверхности канала микрофлюидного чипа и могут выполнять функцию, аналогичную микроструктурам решетки в указанном аналоге, то есть могут быть использованы для определения оптического разрешения, глубины фокуса, оптического и механического дрейфа, дисторсии, аберрации, вносимой оптическими элементами, и т.д.

Предлагаемое настоящее изобретение является, по сути, монолитным устройством, не имеющим деталей, которые перед началом тестирования было бы необходимо соединять друг с другом для обеспечения работоспособности устройства. Также отсутствуют операции, которые могли бы исказить геометрию устройства тестирования и тем самым ухудшить его качество. Кроме того, для устройства тестирования используется такой же микрофлюидный чип, который используется непосредственно для исследования целевых объектов, например, меченых флуорохромом нуклеотидов в процедуре секвенирования. То есть, условия проведения тестовых и калибровочных операций полностью совпадают с условиями исследования реальных объектов.

В предлагаемом настоящем изобретении микросферы расположены и зафиксированы в тонком слое на одной из поверхностей канала микрофлюидного чипа. При этом толщина слоя из микросфер остается постоянной и не превышает глубину резкости оптической системы, что позволяет во время тестирования настроить фокусировку точно на выбранном слое вверху или внизу канала. Флуоресцирующие объекты в близлежащих слоях канала микрофлюидного чипа при этом отсутствуют, что позволяет избежать помех на изображении.

В настоящем изобретении может быть выбрана любая концентрация микросфер. Экспериментально установлено, что для многих задач тестирования удобна концентрация порядка 10⁸ ÷ 10⁹ микросфер/мл, что значительно превышает концентрацию микросфер в прототипе. Суспензию микросфер предварительно смешивают с полимером для иммобилизации микросфер. Центрифугирование позволяет создать тонкий монослой из микросфер в полимере на выбранной поверхности указанного канала. Большое количество неподвижных, произвольно расположенных флуоресцирующих микрообъектов позволяет провести более качественную и точную юстировку всех систем комплекса в условиях, моделирующих реальные измерения.

Предлагаемое устройство тестирования позволяет решить следующие задачи: 1) более точно оценить чувствительность и пороговые характеристики оптической системы; 2) протестировать оптическую систему на наличие аберраций; 3) осуществить настройку фокусировки регистрируемых изображений; 4) выявить необходимость спектральной компенсации сигналов флуоресценции, полученных в разных каналах детекции и подобрать параметры компенсации; 5) настроить сканирующую систему (двухкоординатный столик) и определить точность сканирования; 6) протестировать и отладить алгоритмы обнаружения микроскопических изображений сигналов флуоресценции в нескольких спектральных диапазонах.

Основным техническим результатом предложенного устройства тестирования является повышение качества юстировки и валидации оптической системы комплекса визуализации изображений микрообъектов.

Также настоящее изобретение раскрывает способ изготовления указанного устройства.

Способ включает следующие стадии:

- обработка канала микрофлюидного чипа раствором Пираньи с последующей промывкой и сушкой,

- обработка канала микрофлюидного чипа раствором для силиконизации с последующей промывкой и сушкой,

- заполнение канала микрофлюидного чипа раствором для полимеризации, содержащим флуоресцирующие микросферы, и герметизация входного и выходного портов указанного канала,

- закрепление указанного микрофлюидногочипа на роторе микроцентрифуги и центрифугирование с противовесом.

В качестве раствора для силиконизации используют раствор, предпочтительно, содержащий:

этанол (100%, ОСЧ) 207,5 частей, воду 37, 5 частей, уксусную кислоту (100%) 4 части, силан 1 часть.

В качестве раствора для полимеризации используют раствор, предпочтительно содержащий:

водный раствор акриламида-бисакриламида (19% w/w : 1% w/w) 17 частей, водный раствор полидиметилакриламида (6% w/w) 13 частей, 10% водный раствор N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина (TEMED) 1 часть, 1% водный раствор персульфата аммония 2 части.

Концентрация микросфер в растворе для полимеризации предпочтительно составляет: 10⁵ ÷ 10¹⁰ шт/мл.

Центрифугирование проводят в течение 15-20 минут до полной полимеризации раствора для полимеризации.

Описание чертежей

На Фиг. 1 приведено схематичное изображение фрагмента устройства тестирования (вид сверху), микросферы показаны в увеличенном масштабе.

На Фиг. 2А приведено схематичное изображение устройства тестирования в поперечном сечении (вид сбоку), микросферы показаны в увеличенном масштабе на нижней поверхности канала микрофлюидного чипа.

На Фиг. 2В приведено схематичное изображение устройства тестирования в поперечном сечении (вид сбоку), микросферы показаны в увеличенном масштабе на верхней поверхности канала микрофлюидного чипа.

На Фиг. 3А приведено схематичное изображение устройства тестирования в продольном сечении (вид сбоку), микросферы показаны в увеличенном масштабе на нижней поверхности канала микрофлюидного чипа.

На Фиг. 3В приведено схематичное изображение устройства тестирования в продольном сечении (вид сбоку), микросферы показаны в увеличенном масштабе на верхней поверхности канала микрофлюидного чипа.

Подробное описание настоящего изобретения

Заявленное устройство тестирования представлено на Фиг. 1 – Фиг. 3 и содержит выполненный из стекла микрофлюидный чип 1, имеющий внутренний, оптически прозрачный канал 2, в который посредством входного 3 и выходного 4 портов образца введены флуоресцентные микросферы 5 и раствор для полимеризации 6.

В канале микрофлюидного чипа 2 имеются верхняя 7 и нижняя 8 поверхности, которые являются планарными и взаимно параллельными. Микросферы 5 осаждены на верхней 7 или же нижней 8 поверхности канала 2 в тонкий монослой 9 посредством центрифугирования микрофлюидного чипа 1. Толщина монослоя 9 не превышает глубину резкости оптической системы тестируемого комплекса. Глубина 10 канала микрофлюидного чипа 2 составляет 120 ± 10 мкм. Раствор для полимеризации 6, содержащий микросферы 5, полностью заполняет весь объем канала 2, после центрифугирования устройства и осаждения микросфер 5 раствор для полимеризации 6 затвердевает в течение нескольких минут, иммобилизуя микросферы 5 на поверхности 7 или 8 указанного канала.

Таким образом, микрофлюидный чип 1 с микросферами 5, осажденными и иммобилизованными в монослое 9 полимером, образованным в результате полимеризации раствора для полимеризации 6, представляет собой устройство тестирования согласно настоящему изобретению.

Микросферы на современном рынке наборов и реагентов для генетических, иммунологических и других биологических аналитических исследований представлены в широком диапазоне размеров от долей до единиц и десятков микрометров и могут обладать различными свойствами, например, быть заранее окрашены разнообразными флуоресцентными красителями. Микросферы для предлагаемого в настоящем изобретении устройства тестирования могут быть оптимально подобраны по спектральным характеристикам и размерам в зависимости от задач тестирования, а также должны быть надежно зафиксированы на поверхности канала микрофлюидного чипа таким образом, чтобы не происходило их смещения в пространстве под воздействием теплового движения частиц реакционной смеси, что могло бы повлечь неправильную интерпретацию сигналов флуоресценции во время детектирования и последующей обработки. Для иммобилизации микросфер может быть использован полимер, обволакивающий частицы и после затвердевания препятствующий их колебаниям и перемещениям. Для качественной настройки фокусировки изображения микронных и субмикронных объектов, которая не зависела бы от того, в каком месте канала осуществляется детектирование изображения, очень важно обеспечить расположение указанных микрообъектов на поверхностях канала микрофлюидного чипа в монослое, не изменяющем свои геометрические характеристики и сохраняющем постоянную концентрацию объектов. Толщина монослоя не должна изменяться и превышать глубину резкости оптической системы комплекса.

Концентрация микросфер должна быть подобрана таким образом, чтобы после центрифугирования они распределялись на поверхности канала равномерно, не образовывая крупных агрегатов (более 3-4 микросфер), а расстояния между соседними микросферами, по крайней мере, превышали бы величину в 2-3 их диаметра. При этом следует понимать, что некоторые микросферы могут образовывать агрегаты по 2-3, реже больше, микросфер, но указанных агрегатов должно быть не более 10% от общего количества микросфер в кадре. Указанный способ заполнения канала микросферами может быть использован в различных настроечных и юстировочных тестах.

Микросферы в фабричных наборах имеют неодинаковую концентрацию. В предлагаемом настоящем изобретении поверхностная плотность микросфер, удобная для многих настроечных тестов, составила примерно 10⁵ шт/мм², концентрация микросфер составила при этом 10⁹ шт/мл.

Для некоторых тестов, таких как юстировка лазерного луча, может быть целесообразным увеличение концентрации. Для юстировки систем перемещения и сканирования комплекса визуализации концентрация микросфер может быть уменьшена.

Диапазон возможных концентраций микросфер в растворе для полимеризации предпочтительно составляет 10⁵ ÷ 10¹⁰ шт/мл. Диапазон возможных плотностей микросфер на поверхности канала чипа (поверхностная плотность) предпочтительно составляет 10¹ ÷ 10⁶ шт/мм².

Ниже описывается один из вариантов способа изготовления устройства согласно настоящему изобретению, приведённый исключительно в иллюстративных целях и никоим образом не ограничивающий объём настоящего изобретения, определяемый приведённой ниже формулой изобретения.

Способ изготовления устройства тестирования:

1. Микрофлюидный чип заполняют свежеприготовленным раствором Пираньи (2 объема конц. серной кислоты, 1 объем 30% водного раствора перекиси водорода) и выдерживают, погруженным в раствор Пираньи, в течение 24 часов при 100°С с периодическим прокачиванием каналов раствором Пираньи для удаления пузырьков воздуха.

2. Отмывают канал микрофлюидного чипа ddH₂O MilliQ 5х200 мкл.

3. Просушивают канал микрофлюидного чипа сжатым воздухом и медленно прокачивают по 200 мкл смеси для силиконизации поверхности канала (Таблица 1). Время реакции – 40 минут при комнатной температуре (18-22°С).

Таблица 1. Состав смеси для силиконизации поверхности.

№ пп Компонент, концентрация Фирма, чистота CAS Контроль качества Объем, мкл Примечание 1. Этиловый спирт, 100% ОСЧ Нет 830 Перегнанный 2. Вода Milli-Q Нет 150 3. Уксусная кислота, 100% Нет 16,5 4. Silane A 174 adhesion promoter Merck 1.07673.0050 2530-85-0 Нет 4

4. Промывают канал микрофлюидного чипа последовательно 5х200 мкл этанола и 5х200 мкл воды.

5. Просушивают канал микрофлюидного чипа сжатым воздухом.

6. Для получения реакционной смеси смешивают выбранные для тестирования микросферы с раствором для полимеризации.

7. В силиконизированный канал микрофлюидного чипа медленно прокачивают 30 мкл раствора для полимеризации, содержащего микросферы, (Таблица 2), протирают насухо и заклеивают входной и выходной порты указанного канала скотчем.

Таблица 2. Состав раствора для полимеризации.

№ пп Компонент, концентрация Фирма, чистота Объем, мкл 1. Водный раствор акриламида-бисакриламида (19%w/w:1%w/w), фильтрованный PanReac A1089,9025
2K Standard grade, pure min 98% 12,5 2. Суспензия микросфер – 2 3. Водный раствор 6% w/w полидиметилакриламида Синтол, 99% 10 4. TEMED, 10% водный раствор Sigma T22500-100ml, 99% plus 0,75 5. Персульфат аммония APS, 1% водный раствор PanReac A1142,0250 1,5

8. В зависимости от того на верхней или нижней поверхности канала микрофлюидного чипа требуется осадить микросферы, закрепляют указанный чип на роторе микроцентрифуги Циклотемп-903, прижав верхнюю или нижнюю сторону чипа к ротору, и центрифугируют с противовесом на максимальных оборотах (4500 об/мин) в течение 15 минут.

9. В результате полимеризации происходит характерное помутнение канала микрофлюидного чипа.

10. Хранят изготовленный микрофлюидный чип при температуре 2 - 8 °С.

Микросферы размещаются на выбранной для работы поверхности канала микрофлюидного чипа монослоем и надежно фиксируются в полимере, что исключает их смещение.

Использование устройства, полученного указанным способом позволило повысить качество юстировки и валидации оптической системы комплекса визуализации изображений микрообъектов.

Калиброванные микросферы с известными параметрами в составе устройства обеспечивают возможность точного измерения и контроля линейных размеров и сигналов флуоресценции от светящихся микрообъектов, что позволяет проводить юстировку и оптимизацию оптических компонентов детектора, добиваясь достижения требуемых показателей. Размещение микросфер внутри канала микрофлюидного чипа обеспечивает валидацию работы комплекса в контролируемых условиях, полностью имитирующих секвенирование светящихся кластеров ДНК.

Хотя настоящее изобретение было подробно описано со ссылкой на предпочтительные варианты его осуществления, для специалиста в данной области техники ясно, что могут быть сделаны различные замены и применены эквиваленты, которые не выходят за рамки настоящего изобретения. Все процитированные в настоящем описании документы являются частью настоящей заявки, целиком включённые в настоящее описание посредством ссылки.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Thermo Fisher Scientific, https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/F8820

2. Thermo Fisher Scientific, https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/F8821

3. Thermo Fisher Scientific, https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/F8816

4. Thermo Fisher Scientific https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/F14791

5. J. Michael Phillips, Aldrich N. K. Lau, Mark F. Oldham, Kevin S. Bodner, Steven J. Boege, Donald R. Sandell, David H. Tracy. Luminescence reference standards. Патент США № US7480042B1.

6. Ute Resch-Genger, Katrin Hoffmann, Roland Nitschke, Axel Engel. Multi-functional calibration system and kit, and their uses for characterizing luminescence measurement systems. Патент США № US7544926B2.

7. Джон Герхардт Эрни, Джозеф Френсис Пинто, М.Шейн Боуэн, Майкл С.Грейндж. Артур Питера, Бала Мурали К.Венкатесан, Дацзюнь А.Юань. Testing device and method of its use. Патент РФ № RU2701875C1.

8. Paul Sammak, Gustavo Rosania, Lawrence Zana, Kim Ippolito, Jason Bush, Alex Friedman, Sarah Tencza, Ravi Kapur. Microbead-based test plates and test methods for fluorescence imaging systems. Патент США № US20020098588A1.

Настоящее изобретение относится к устройству тестирования и настройки оптической системы комплекса визуализации изображений микрообъектов, а также к способу его изготовления. Устройство для тестирования и настройки оптической системы комплекса визуализации изображений микрообъектов состоит из микрофлюидного чипа с внутренним оптически прозрачным каналом, содержащим две плоские поверхности, и микросфер, флуоресцирующих в одном или нескольких спектральных диапазонах, которые иммобилизованы монослоем на одной из поверхностей указанного канала микрофлюидного чипа. Техническим результатом является повышение качества юстировки и валидации оптической системы комплекса визуализации микрообъектов. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл.

1. Устройство для тестирования и настройки оптической системы комплекса визуализации изображений микрообъектов, состоящее из микрофлюидного чипа с внутренним оптически прозрачным каналом, содержащим две плоские поверхности, и микросфер, флуоресцирующих в одном или нескольких спектральных диапазонах, которые иммобилизованы монослоем на одной из поверхностей указанного канала микрофлюидного чипа.

2. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что указанные микросферы иммобилизованы на одной из поверхностей канала микрофлюидного чипа при помощи полимера.

3. Устройство по п. 2, отличающееся тем, что указанным полимером является сополимер акриламида, бисакриламида, полидиметилакридамида и N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина (TEMED).

4. Устройство по пп. 1-3, отличающееся тем, что плотность указанных микросфер на поверхности канала микрофлюидного чипа (поверхностная плотность) находится в диапазоне от 10 шт/мм² до 10⁶ шт/мм².

5. Способ изготовления устройства по п. 1, включающий следующие стадии:

- обработка канала микрофлюидного чипа раствором Пираньи с последующей промывкой и сушкой,

- обработка канала микрофлюидного чипа раствором для силиконизации с последующей промывкой и сушкой,

- заполнение канала микрофлюидного раствором для полимеризации, содержащим флуоресцирующие микросферы, и герметизация входного и выходного портов указанного канала,

- закрепление указанного микрочипа на роторе микроцентрифуги и центрифугирование с противовесом.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что в качестве раствора для силиконизации используют раствор, содержащий:

этанол (100%, ОСЧ) - 207,5 частей,

воду - 37, 5 частей,

уксусную кислоту (100%) - 4 части,

силан - 1 часть.

7. Способ по п. 5, отличающийся тем, что в качестве раствора для полимеризации используют раствор, содержащий

водный раствор акриламида-бисакриламида (19% w/w : 1% w/w) - 17 частей,

водный раствор полидиметилакриламида (6% w/w) - 13 частей,

10% водный раствор N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина (TEMED) - 1 часть,

1% водный раствор персульфата аммония - 2 части.

8. Способ по п. 5, отличающийся тем, что концентрация микросфер в растворе для полимеризации составляет 10⁵÷10¹⁰ шт/мл.

9. Способ по п. 5, отличающийся тем, что центрифугирование проводят в течение 15-20 минут до полной полимеризации раствора для полимеризации.