Способ получения фармацевтических сульфатированных гликоаминогликанов из биологических тканей Российский патент 2021 года по МПК C08B37/08 C08B37/10 C12P19/04 

Изобретение относится к области фармацевтической промышленности и может быть использовано для получения сульфатированных гликоаминогликанов, таких как хондроитин-4-сульфат, хондроитин-6-сульфат, дерматансульфат, кератансульфат.

Гликозаминогликаны являются главными компонентами многих тканей, включая хрящи, кожу, сухожилия, связки. Гликозаминогликаны были обнаружены в пупочном канатике, артериях, роговице глаза, в клапанах сердца и аорте, селезенке, мозге, слюне. Известно несколько типов сульфатированных гликозаминогликанов (сГАГ). Наиболее изучены четыре представителя: хондроитин-4-сульфат, хондроитин-6-сульфат, дерматансульфат, кератансульфат.

Функции сГАГ: замещение в структуре протеогликанов, подавление биосинтеза медиаторов воспаления, повышение биосинтеза компонентов матрикса, подавление синергического действия ферментов и кислородных радикалов, подавление апоптоза, маскирование вторичных антигенных детерминант, маскирование вторичных антигенных детерминант и подавление хемотаксиса, построение коллагеновых волокон, стимулируют синтез гиалуроната.

СГАГ используют в фармакологии и косметологии как основные вещества, а также в сочетании с гиалуронатом натрия.

Для получения сГАГ используют субпродукты: хрящи, связки, трахеи, кожу, жилы крупного рогатого скота, роговицу глаз, ткани морских гидробионтов. Состав конечного продукта зависит от используемых субпродуктов. Содержание тех или иных сГАГ варьирует в различных тканях, что приведено в таблице 1.

Таблица 1

Наименование сГАГ Молекулярная масса, Да Где содержится или был обнаружен Кератан-сульфат от 4 × 10³ до 20 × 10³ Впервые выделен из роговицы глаза, позднее найден и в других тканях, включая кости скелета. Обнаружено, что протеогликановые комплексы КС в скелете и роговице различаются структурно и имеют разный метаболизм. КС присутствует в центральной нервной системе, обнаружена его функция как регулятора регенерации нейронов.
В роговице, по данным сравнительного исследования, содержится в 10 раз больше КС, чем в хряще, и в 2–4 раза больше, чем в какой-либо иной ткани. Хондроитин-
4-сульфат (Х4С) от 5 × 10³ до 100 × 10³ Содержится в хрящевых и костных тканях, в трахеях, сердечных перегородках, преобладает в тканях животных и человека (~70 %). Хондроитин-
6-сульфат (Х6С) от 5 × 10³ до 100 × 10³ Содержится в хрящевых и костных тканях. Х6С преобладает в тканях
Гидробионтов (до 80 %), ранее его получали из хрящей (плавников) акулы Дерматан-сульфат (ДС) от 15 × 10³ до 40 × 10³ Преобладает в тканях кожи, также встречается в сердечных клапанах, сухожилиях и стенках артерий, легких, лошадиной аорте, пуповине, коже свиньи, слизистой оболочке кишечника свиней, селезенке, межпозвоночном диске, мениске и др.

Показано, что клиническая эффективность и безопасность зависит от природы и качества используемого для производства сырья, способов технологической переработки, степени очистки (Хондроитина сульфат натрия – примеси и проблемы стандартизации (обзор литературы) Е. Л. Комарова, С. В. Чернова, К. В. Касумова, М. С. Табачная, Л. В. Овсянникова, К. И. Эллер, «Российский биотерапевтический журнал», том 18, №1 (2019), с. 25-36).

Известны способы получения хондроитинсульфата из морских иглокожих, например, голотурий (заявка Японии 63-10601, 1988 г.) или хрящей животных ("Scand. Arch. Physrol." 1989. V.I, p.210-215), однако при этом получают неочищенные препараты, содержащие значительное количество примесей других полисахаридов и белков.

Известен способ, описанный в заявке FR 2491475 (1982 г.), при получении хондроитинсульфата А измельченные бычьи трахеи гидролизуют 1,25%-ным водным раствором пепсина при рH 4,5 и температуре 50^oC в течение 12 ч, фермент инактивируют при 80-90^oC, осадок отделяют центрифугированием, промывают горячей водой, промывные воды и надосадочную жидкость объединяют и последовательно обрабатывают сначала при рH 9-10, а затем при рH 6,5, нагревают до кипения, охлаждают, осадок отделяют, надосачную жидкость обрабатывают 5%-ным раствором цетилпиридинийхлорида, осадок отделяют, промывают метанолом, растворяют в воде, центрифугируют и осадок высушивают.

Известен способ получения хондроитинсульфата А, включающем ферментативный гидролиз бычьих трахей пепсином, инактивацию фермента при 80-90% отделение гидролизата центрифугированием, осаждение цетилпиридинийхлоридом, растворение осадка в воде и его сушку, гидролиз проводят 2-3 объемами 0,5-1%-ного раствора пепсина при 38-40oС и рH 1,5-2,0 в течение 4-6 ч, цетилпиридинийхлорид используют в количестве 2-4 г/л раствора, при этом перед осаждением гидролизатхроматографируютна колонке с диэтиламиноэтилцеллюлозой при использовании 1-2%-ной HCl в качестве элюента, а после растворения осадка в воде продукт высаливают хлоридом натрия из расчета 20-30 г/л при 2-4oС и целевой продукт получают обессоливанием диализом против воды при течение 12-16 ч (RU 2089557 С1, опубл. 10.09.1997)

Известен способ получения хондроитинсульфата из носового хряща лосося, предусматривающий измельчение сырья, растворение хондроитинсульфата в щелочной среде, ферментативный гидролиз белков, отделение высокомолекулярной углеводной фракции осаждением от низкомолекулярных продуктов гидролиза белка, остающихся в растворе, промывку полученного осадка и сушку готового продукта (EP 1270599 A1, опубл. 02.01.2003).

Известен также способ выделения сульфатированных гликозаминогликанов (RU 2304441 С1, опуб. 20.08.2007), который заключается в механической очистке биологической ткани, отмывке, гидролизе отмытой ткани активированным папаином, осаждением этанолом, при этом после механической очистки измельченную ткань промывают два раза нагретым фосфатным буфером в соотношении на 1 часть ткани 1,5 – 2 объема буфера и затем выдерживают в новой порции нагретого буфера в течение 15 – 30 минут, затем переваривают в растворе активированного папаина при нагревании в течение 6 –24 часов, перевар охлаждают до 4 °С и выдерживают при этой температуре в течение 2–24 часов, удаляют фильтрованием жиры и непереваренные остатки ткани, затем в течение времени от 10 до 24 часов селективно выделяют сульфатированные гликозаимногликаны на твердом носителе, полученном из коллагена костной ткани, носитель отмывают 0,05-0,1 н раствором соляной кислоты, обезжиривают, элюируют с носителя раствором 0,6-1,5 н минеральной соли в 0,8 н уксусной кислоте или 0,01-0,025 н раствором щелочи, осаждают сульфатированные гликозаминогликаны в этаноле, центрифугируют 15 минут при 1500 об/мин при 4°С, осадок отмывают этанолом или ацетоном, высушивают и стерилизуют.

В данном способе используется метод селективной адсорбции сГАГ на твердом коллагеновом носителе с последующим элюированием. Данный метод является достаточно медленным, используются нерегенерируемые растворители (соляная кислота, уксусная кислота, щелочь). Также в данном способе используется без исключений этанол для получения конечного продукта. В данном способе невозможно получение конечного продукта с заданным процентным содержанием конкретных сульфатсодержащих гликозаминогликанов.

Наиболее близким к предложенному способу является способ получения хондроитина сульфата с применением ультрафильтрации (RU 2458134 С1, опубл. 10.08.2012), согласно которому хондроитина сульфат получают из тканей морских гидробионтов, предусматривающий подготовку сырья к ферментативному гидролизу, гидролиз протеолитическими ферментными препаратами с осаждением примеси белка и отделением осадка от раствора гидролизата, выделение целевого продукта посредством ультрафильтрации, при этом предварительно проводят щелочной гидролиз с нейтрализацией полученного раствора до рН 7 и отделением твердого осадка, в ферментативный гидролизат добавляют соль до значения не менее 0,1 моль/л, проводят ультрафильтрацию ферментативного гидролизата на мембране с пределом задержания 50 кДа и отделение высокомолекулярной примеси, полученный раствор при концентрации соли в нем не менее 0,1 моль/л подвергают ультрафильтрации на мембране с пределом задержания 5 кДа и отделяют низкомолекулярные вещества, удержанный на мембране хондроитина сульфат промывают на той же мембране дистиллированной водой до полного удаления солей, затем проводят промывку дистиллированной водой и концентрирование раствора хондроитина сульфата путем ультрафильтрации на мембране с пределом задержания 50 кДа.

Недостатками данного способа является невозможность получения различных сульфатированных гликозаминогликанов, таких как кератансульфата, дерматансульфата, т. к. используется мембрана при ультрафильтрации с достаточно большим размером пор, что приводит к потере кератансульфата и дерматансульфата. Также недостатками является сравнительно небольшой выход и невозможность использования широкого спектра субпродуктов, также невозможность контролировать состав конечного продукта.

Сульфатированные гликозаминогликаны (сГАГ) в тканях всегда присутствуют вместе, отличается лишь количественный состав. Промышленное разделение на отдельные сГАГ – сложный, длительный и затратный процесс, снижающий выход и возможность применения разнообразных малоценных субпродуктов. Целесообразно получение именно комплексов сГАГ, которые имеют большее сродство к тканям тела человека. Перспективно использование данных комплексов в косметологической практике для создания биологически совместимых гетерогенных матриксов, а также в офтальмологии.

Данное изобретение решает техническую проблему получения фармацевтических композиций фармацевтического качества определенного состава с заданным процентным содержанием конкретных сульфатированных гликозаминогликанов, использования более широкого ассортимента малоценных субпродуктов, из которых можно выделить хондроитинсульфаты (4 и 6), повышения выхода целевого продукта, более полного выделения сопутствующих сГАГ (дерматансульфата, кератансульфата), а также повышение чистоты конечного продукта.

Технический результат достигается способом получения сульфатированных гликозаминогликанов из биологических тканей, заключающимся в том, что сырье очищают, измельчают, проводят его щелочной гидролиз, полученную смесь нейтрализуют и проводят ферментативный гидролиз, проводят ультрафильтрацию ферментативного гидролизата, удержанный на мембране продукт промывают раствором хлорида натрия и концентрируют с получением раствора сульфатированных гликозаминогликанов, при этом, согласно изобретению, после очистки перед измельчением сырье обеззараживают гипохлоритом натрия, и промывают водой, щелочной гидролиз проводят до полного растворения осадка, нейтрализацию смеси проводят с последующим закислением до рН 5,5-6,5, ферментативный гидролиз проводят с использованием комплекса ферментов папаина, трипсина и химотрипсина при температуре 30-40°С, после чего дезактивируют ферменты нагреванием до температуры 65-70°С (указать интервал) и фильтруют горячий раствор последовательно на мембранах с размером пор на конечной мембране не более 0,2 мкм, ультрафильтрацию полученного ферментативного гидролизата проводят мембране с пределом задерживания 2,5 кДа, а полученный после промывания и концентрирования раствор сульфатированных гликозаминогликанов фильтруют через мембрану с размером пор 0, 2 мкм и используют как готовый продукт или направляют на получение сухого готового продукта.

Кроме того, предпочтительно использовать комплекс ферментов в виде раствора со следующими значениями концентрации: папаин 0,25-0,5 мас.%, трипсин 0,5-1 мас.%, химтрипсин 0,5-1 мас.%.

Также предпочтительно проводить концентрирование до достижения концентрации 0,5-1% сульфатированных гликозаминогликанов.

При получении сухого готового продукта осуществляют осаждение этанолом из полученного после фильтрации раствора сульфатированных гликозаминогликанов и сушку полученного осадка.

Техническим результатом предлагаемого способа по сравнению с прототипом является повышение выхода продукта вследствие использования комплекса ферментов и субпродукты гидролизуются практически полностью, что повышает эффективность отделения целевого продукта из смеси гидролизата, а также использование при ультрафильтрации мембраны с меньшим размером пор. Также техническим результатом предлагаемого способа по сравнению с прототипом является повышение чистоты конечного продукта в результате того, что раствор гидролизата последовательно фильтруют прежде чем залить его в систему тангенцальной фильтрации на мембранах с размером пор на конечной мембране не более 0,2 мкм, ультрафильтрацию полученного ферментативного гидролизата проводят на мембране с пределом задерживания 2,5 кДа, а также полученный после промывания и концентрирования раствор сульфатированных гликозаминогликанов фильтруют через мембрану с размером пор 0, 2 мкм.

Можно заранее установить, каким является % содержание компонентов при использовании различного сырья в определенных рамках и получать композицию с содержанием компонентов, которое получается из определенного вида сырья. Кроме того, при использовании одновременно различных видов сырья процентное содержание в конечном продукте конкретного сГАГ будет зависеть от процентного содержания конкретного субпродукта на входе, так как в разных субпродуктах содержится разное количество определенного сГАГ. Так, например в роговице содержится максимальное количество кератансульфата, и чем больше этого субпродукта в исходном сырье, тем больше кератансульфата в конечном продукте.

Предложенный способ осуществляется следующим образом.

Подготовка материала. Особенностью данного способа является то, что в качестве субпродуктов для получения различных по составу фармацевтических композиций используют сырье, которое может иметь различный процентный состав субпродуктов, как это показано в таблице 2.

Таблица 2

Субпродукт Содержание в сырье, % Трахеи крупного рогатого скота (КРС) 0 –100 Хрящи и синовиальные сумки 0 – 100 Хрящи носовой перегородки КРС 0 – 100 Клапаны сердца 0 – 100 Сухожилия и связки 0 – 100 Кожа свиная, прошедшая мездрение 0 – 100 Роговица глаз КРС 0 – 100

Вначале материал промывают в проточной воде для удаления крови, мусора. Материал тщательно обрезают от имеющихся на нем кусков жира и мяса. Особенностью данного способа является то, что материал обеззараживают веществами, содержащими активный хлор, предпочтительно раствором гипохлорита натрия с концентрацией 0,5 – 0,55 % , вымачивая его в течение 24 – 36 часов в соотношении по массе 1 часть материала на 3 – 4 части раствора. После этого материал вынимают из раствора гипохлорита натрия и промывают дистиллированной водой 2 – 3 раза из расчета 1:1 по массе.

Измельчение. Материал пропускают через мясорубку и гомогенизируют в дисковом истирателе до размеров частиц 0,005-0,01 мм. Тщательность гомогенизации в значительной мере сказывается на выходе конечного продукта.

Щелочной гидролиз. Особенностью данного способа является то, что щелочной гидролиз ведут при перемешивании при температуре 20 – 30 °С в растворе гидроксида натрия с концентрацией 6,0 – 6,5 % в течение 24 – 36 часов до полного растворения осадка. Для щелочного гидролиза берут 1 часть сырого материала на 1 – 2 части раствора гидроксида натрия по массе. Затем раствор нейтрализуют и закисляют до рН = 5,5 – 6,5 раствором соляной кислоты с концентрацией 0,5 – 1 моль/л.

Ферментативный гидролиз. Особенностью данного способа является то, что после щелочного гидролиза на смесь действуют ферментативным папаин-трипсин-химотрипсиновым комплексом при соотношении ферментов по массе: папаина от 0,25 % до 0,5 %; трипсина от 0,5 % до 1 %; химотрипсина от 0,5 % до 1 %. На 1 л смеси после нейтрализации и закисления берут 100 мл раствора ферментного комплекса с общей концентрацией ферментов 2 – 3 %. Ферментативный гидролиз ведут при температуре 30 – 40 °С при перемешивании в течение 12 – 24 часов при поддержании рН = 5,5 – 6,5. По истечении заданного отрезка времени смесь нагревают до 70°С для дезактивации ферментов.

Фильтрация. Особенностью данного способа является то, что смесь после ферментативного гидролиза нагрева не охлаждают, а сразу фильтруют на мембранах 1,2 мкм, затем 0,65 мкм, далее 0,45 ммк и далее 0,2 мкм. Стерильный фильтрат поступает в систему фильтрации по принципу обратного осмоса.

Ультрафильтрация. Особенностью данного способа, является то, что раствор подвергают ультрафильтрационному разделению на мембране с молекулярно-массовым пределом задерживания 2,5 кДа для наиболее полного выхода сГАГ различной молекулярной массы и более полного удаления аминокислотно-белковой фракции и других примесей. Раствор после предыдущей нормальной фильтрации разбавляют в 2-3 раза стерильным раствором 0,9 % хлорида натрия и вливают в тангенциальную установку. Раствор отмывают 2-3 кратным раствором 0,9 % хлорида натрия от объема разбавленного раствора.

Концентрирование. По окончании процесса отмывки начинают процесс концентрирования, для чего прекращают долив отмывочного раствора в систему ультрафильтрации, в результате чего происходит уменьшение объема не прошедшего через мембрану раствора, содержащего сГАГ, и концентрация его возрастает. Процесс ведут по достижении концентрации 0,5 – 2 % целевого продукта в растворе.

Нормальная фильтрация на мембране 0,2 мкм. После концентрирования раствор фильтруют через мембрану 0,2 мкм. Полученный стерильный раствор комплекса целевых продуктов в физиологическом растворе хлорида натрия используют непосредственно, либо осаждают 96 %-ным этанолом при объемном соотношении раствор:этанол = 1:3, затем осадок сушат, либо лиофильно сушат.

Целевой продукт. Выход сГАГ составляет от 1 до 10 % по массе сухого вещества к сырым субпродуктам. Содержание основных веществ 98,3 – 98,5 мас.%. Содержание белка 0,02 – 0,025 мас.%. Содержание гиалуроната натрия 0,5 – 1 мас.%. Процентное содержание хондроитин-4-сульфата, хондроитин-6-сульфата, дерматансульфата и кератансульфата колеблется от 10% до 98 % в зависимости от соотношения различных субпродуктов в начальной субстанции. Все проценты указаны по массе.

Содержание компонентов в целевом продукте определяли с помощью ВЭЖХ и ИК – спектрометрии. Содержание основных веществ может составлять 98,3 – 98,5 мас.%. Содержание белка – 0,02 – 0,025 мас.%. Содержание гиалуроната натрия – 0,5 – 1 мас.%. Было показано, что содержание хондроитинсульфатов (4 и 6) может колебаться от 30 % до 98,5 %; дерматансульфатов от 0,5 % до 20,5 %; кератансульфатов 0,15 % до 80,5 %, что зависит от соотношения субпродуктов в сырье. Молекулярная масса компонентов в целевом продукте составляет от 2,5⋅10³ Да до 100⋅10³ Да. Вязкость 1 % раствора составляет от 50 мПа⋅с до 230 мПа⋅с.

Пример 1

Получение сГАГ из трахей КРС (100 %)

Взяли 1 кг очищенных и промытых бычьих трахей. Залили раствором гипохлорита натрия в количестве 3,5 л, содержащего 0,5 % гипохлорита натрия и оставили для отбеливания и дезинфекции материала на 24 часа. Затем жидкость слили, трахеи промыли три раза по 1 л дистиллированной водой.

Промытый материал пропустили через мясорубку. Измельченный материал поместили в дисковый истиратель. Измельчали в течение 20 минут.

Кашеобразную массу залили 1 л раствора гидроксида натрия, содержащего 65 г основания (6,5 %), поставили на мешалку. Суспензию гидролизовали в течение 36 часов при температуре 23°С при перемешивании.

Смесь нейтрализовали и закислили 1 молярным раствором соляной кислоты в объеме 1630 мл.

В смесь влили раствор папаин-трипсин-химотрипсинового комплекса в объеме 363 мл, содержащего 1,452 г папаина (0,4%), 2,904 г трипсина (0,8 %) и 2,904 г химотрипсина (0,8%). Ферментолиз проводили в течение 24 часов при температуре 35°С при рН = 5,5. По истечении заданного отрезка времени смесь нагрели до 70°С для дезактивации ферментов.

Смесь после ферментативного гидролиза и нагрева не охлаждали, а сразу фильтровали на мембранах 1,2 мкм, затем 0,65 мкм, далее 0,45 мкм и далее 0,2 мкм.

Стерильный фильтрат разбавили 12 литрами 0,9 % раствора хлорида натрия и влили в систему тангенциальной фильтрации с мембраной 2,5 кДа.

В ходе процесса ультрафильтрации в систему влили еще 30 л 0,9 % раствора хлорида натрия для промывки.

Раствор сконцентрировали до объема 8,2 л.

Затем раствор профильтровали через мембрану 0,2 мкм. Получили прозрачный стерильный раствор с содержанием 1 % сГАГ в растворе в 0,9 %-ном растворе хлориде натрия. Выход целевого продукта составил 7,7 % по массе. Содержание основных веществ 98,7 мас.%. Содержание хондроитинсульфатов 4, 6 составило 97,71 мас.%; дерматансульфатов – 0,43 мас.%; кератансульфатов – 0,015 мас.%; гиалуроната натрия – 0,55 мас.%. Содержание белка в сухом веществе составил 0,023 мас.%. Вязкость 1 % раствора составила 230 мПа⋅с.

Пример 2.

Получение сГАГ из хрящей носовых перегородок КРС (50 %) и свиной кожи, прошедшей мездрение (50%).

Взяли 500 г очищенных и промытых хрящей носовых перегородок КРС и 500 г очищенной, промытой и прошедшей мездрение свиной кожи.

Проводили процесс как описано в примере 1.

Раствор сконцентрировали до объема 3 л.

Затем раствор профильтровали через мембрану 0,2 мкм. Получили прозрачный стерильный раствор.

Затем раствор осадили 9 литрами 96%-ного этанола, охлажденного до температуры 4°С.

Материал высушили и получили 14,3 г сухого целевого продукта.

Выход целевого продукта составил 1,43%. Содержание основных веществ – мас. 98,3 %. Содержание белка в сухом веществе составило 0,025 мас.%. Вязкость 1 % раствора составило 152 мПа⋅с. Содержание компонентов в целевом продукте определяли с помощью ВЭЖХ и ИК – спектрометрии. Содержание хондроитина сульфатов 4, 6 составило 89,4%; дерматансульфатов – 9,3 мас.%; кератансульфатов – 0,17 мас.%; гиалуроната натрия – 0,95 мас.%.

Пример 3.

Получение сГАГ из роговицы глаз (100 %).

Взяли 1000 г очищенных и промытых роговиц КРС.

Проводили процесс как описано в примере 1.

Раствор сконцентрировали до объема 2,6 л.

Затем раствор профильтровали через мембрану 0,2 мкм. Получили прозрачный стерильный раствор.

Затем раствор осадили 7,8 литрами 96 %-ного этанола, охлажденного до температуры 4°С.

Материал высушили и получили 10,9 г сухого целевого продукта.

Выход целевого продукта составил 1,09 %. Содержание основных веществ – 98,45 мас.%. Содержание белка в сухом веществе составило 0,02 мас.%. Вязкость 1 %-ного раствора составило 50 мПа⋅с. Содержание компонентов в целевом продукте определяли с помощью ВЭЖХ и ИК – спектрометрии. Содержание кератансульфата составило 77,8 мас.%; хондроитинсульфатов (4 и 6) – 18,2 мас.%; дерматансульфатов – 2,6 мас.%; гиалуроната натрия – 1,05 мас.%.

Пример 4.

Получение сГАГ из суставных хрящей (50%), синовиальных сумок (25 %) и роговицы глаз (25%).

Взяли 500 г суставных хрящей КРС, 250 г синовиальных сумок КРС и 250 г роговицы глаз КРС.

Проводили процесс как описано в примере 1.

Раствор сконцентрировали до объема 4,5 л.

Затем раствор профильтровали через мембрану 0,2 мкм. Получили прозрачный стерильный раствор.

Затем раствор осадили 13,5 литрами 96%-ного этанола, охлажденного до температуры 4°С.

Материал высушили и получили 55,7 г сухого целевого продукта.

Выход целевого продукта составил 5,57 %. Содержание основных веществ – 98,35 мас.%. Содержание белка в сухом веществе составило 0,022 мас.%. Вязкость 1 % раствора составило 97 мПа⋅с. Содержание компонентов в целевом продукте определяли с помощью ВЭЖХ и ИК – спектрометрии. Содержание кератансульфата составило 19,7 мас.%; хондроитинсульфатов (4 и 6) – 78,1 мас.%; дерматансульфата – 1,8 мас.%; гиалуроната натрия – 0,22 мас.%.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и может быть использовано для получения сульфатированных гликоаминогликанов из биологических тканей. Сырье очищают, обеззараживают гипохлоритом натрия, промывают водой, измельчают. Проводят щелочной гидролиз до полного растворения осадка. Полученную смесь нейтрализуют закислением до рН 5,5-6,5. Проводят ферментативный гидролиз с использованием комплекса ферментов папаина, трипсина и химотрипсина при температуре 30-40°С. Дезактивируют ферменты нагреванием до температуры 65-70°С и фильтруют горячий раствор последовательно на мембранах с размером пор на конечной мембране не более 0,2 мкм. Проводят ультрафильтрацию ферментативного гидролизата на мембране с пределом задерживания 2,5 кДа. Удержанный на мембране продукт промывают раствором хлорида натрия и концентрируют с получением раствора сульфатированных гликозаминогликанов. Раствор сульфатированных гликозаминогликанов фильтруют через мембрану с размером пор 0,2 мкм и используют как готовый продукт или направляют на получение сухого готового продукта. Изобретение позволяет получать фармацевтические композиции с заданным процентным содержанием конкретных сульфатированных гликозаминогликанов, использовать более широкого ассортимента малоценных субпродуктов, из которых можно выделить хондроитинсульфаты, повысить выход целевого продукта, более полно выделить сопутствующие сГАГ (дерматансульфат, кератансульфат), а также повысить чистоту конечного продукта. 3 з.п. ф-лы, 2 табл., 4 пр.

1. Способ получения сульфатированных гликозаминогликанов из биологических тканей, заключающийся в том, что сырье очищают, измельчают, проводят его щелочной гидролиз, полученную смесь нейтрализуют и проводят ферментативный гидролиз, проводят ультрафильтрацию ферментативного гидролизата, удержанный на мембране продукт промывают раствором хлорида натрия и концентрируют с получением раствора сульфатированных гликозаминогликанов, отличающийся тем, что после очистки перед измельчением сырье обеззараживают гипохлоритом натрия, и промывают водой, щелочной гидролиз проводят до полного растворения осадка, нейтрализацию смеси проводят с последующим закислением до рН 5,5-6,5, ферментативный гидролиз проводят с использованием комплекса ферментов папаина, трипсина и химотрипсина при температуре 30-40°С, после чего дезактивируют ферменты нагреванием до температуры 65-70°С и фильтруют горячий раствор последовательно на мембранах с размером пор на конечной мембране не более 0,2 мкм, ультрафильтрацию полученного ферментативного гидролизата проводят мембране с пределом задерживания 2,5 кДа, а полученный после промывания и концентрирования раствор сульфатированных гликозаминогликанов фильтруют через мембрану с размером пор 0,2 мкм и используют как готовый продукт или направляют на получение сухого готового продукта.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют комплекс ферментов в виде раствора со следующими значениями концентрации: папаин 0,25-0,5 мас.%, трипсин 0,5-1 мас.%, химтрипсин 0,5-1 мас.%.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что концентрирование проводят до достижения концентрации 0,5-1% сульфатированных гликозаминогликанов.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что получение сухого готового продукта осуществляют путем осаждения этанолом из полученного после фильтрации раствора сульфатированных гликозаминогликанов и сушки полученного осадка.