ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО, ЭФФЕКТИВНОЕ ДЛЯ ЛИМФОГЕННОГО СПОСОБА ВВЕДЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА Российский патент 2021 года по МПК A61K31/337 A61K31/4745 A61K31/513 A61K45/00 A61P35/00 

Область техники

[0001]

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, пригодной для доставки лекарственных средств в лимфатические системы.

Уровень техники

[0002]

Рак представляет собой заболевание, которое поражает одного из двух человек в Японии, и 90% больных раком умирают от метастаз. При многих видах рака, включая рак молочной железы и рак головы и шеи, раковые клетки распространяются в регионарный лимфатический узел через лимфатические сосуды. Лимфатический узел, в котором появляются первые метастазы, называется сигнальным лимфатическим узлом.

[0003]

Метастатический лимфатический узел обычно лечат с помощью лимфаденэктомии, радиотерапии или системной химиотерапии. Системная химиотерапия включает инъекцию противоракового лекарственного средства в вену. Поскольку противораковое лекарственное средство представляет собой небольшую молекулу, оно легко рассасывается капиллярными кровеносными сосудами, присутствующими в интерстициальной ткани вокруг рака. В результате, удовлетворительные терапевтические результаты не всегда достигаются системной химиотерапией.

[0004]

Недавно авторы настоящего изобретения успешно создали специфическую мышь, которая имеет лимфатические узлы, равные по размеру лимфоузлам человека. Затем раковые клетки переносили в лимфатический узел (подвздошный лимфатический узел (SiLN)) мыши и давали распространиться в надлежащий подмышечный лимфатический узел (PALN) для создания модели метастазирования лимфатического узла. В мышиной модели было обнаружено, что введение доксорубицина через подвздошный лимфатический узел (SiLN) приводило к противораковому эффекту в надлежащем подмышечном лимфатическом узле (PALN), имеющем рак (непатентная литература 1).

Перечень цитируемых ссылочных документов

Непатентная литература

[0005]

Непатентная литература 1: Shigeki Kato, Shiro Mori, Tetsuya Kodama, Journal of Cancer 2015, 6 (12): 1282-1294.

Сущность изобретения

Техническая задача

[0006]

Одной задачей настоящего изобретения является создание фармацевтической композиции, более подходящей для введения противоопухолевого препарата в лимфатический узел.

Решение задачи

[0007]

Авторы настоящего изобретения провели исследования с учетом вышеупомянутых обстоятельств. В результате они обнаружили, что антиметаболит или противораковый растительный алкалоид проявляет превосходную противораковую активность даже при малых дозах при введении в лимфатический узел и что антиметаболит или противораковый растительный алкалоид служит полезным медицинским препаратом для введения в лимфатический узел. На основании полученных результатов было осуществлено настоящее изобретение.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к следующим пунктам (1)-(10).

(1) Фармацевтическая композиция для терапевтического или профилактического лечения рака, предназначенная для введения в лимфатический узел, содержащая в качестве активного ингредиента по меньшей мере одно противораковое лекарственное средство, выбранное из группы, состоящей из антиметаболитов и противораковых растительных алкалоидов.

(2) Фармацевтическая композиция по п. (1), где антиметаболит представляет собой 5-фторурацил или его соль.

(3) Фармацевтическая композиция по п. (1) или (2), где противораковый растительный алкалоид представляет собой по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из иринотекана, SN-38, доцетаксела и их солей.

(4) Фармацевтическая композиция по любому из пп. (1)-(3), где лимфатический узел в качестве мишени для введения представляет собой лимфатический узел, подлежащий терапевтическому или профилактическому лечению, или лимфатический узел, расположенный выше по потоку в лимфатической сети, к которой принадлежит лимфатический узел.

(5) Фармацевтическая композиция по любому из п.п. (1)-(4), где количество разовой дозы составляет от 1 нг до 100 мг в качестве антиметаболита и/или от 1 нг до 20 мг в качестве противоракового растительного алкалоида.

(6) Фармацевтическая композиция по любому из п.п. (1)-(5), где фармацевтическая композиция имеет вязкость 40 мПа⋅с или менее.

(7) Фармацевтическая композиция по любому из п.п. (1)-(5), где фармацевтическая композиция имеет вязкость 1-10 мПа⋅с.

(8) Применение по меньшей мере одного противоракового лекарственного средства, выбранного из группы, состоящей из антиметаболитов и противораковых растительных алкалоидов, при изготовлении фармацевтической композиции для терапевтического или профилактического лечения рака, предназначенной для введения в лимфатический узел.

(9) Фармацевтическая композиция, содержащая, по меньшей мере, одно противораковое лекарственное средство, выбранное из группы, состоящей из антиметаболитов и противораковых растительных алкалоидов, для применения в терапевтическом или профилактическом лечении рака путем введения в лимфатический узел.

(10) Способ терапевтического или профилактического лечения рака, включающий введение в лимфатический узел пациента фармацевтической композиции, которая содержит по меньшей мере одно противораковое лекарственное средство, выбранное из группы, состоящей из антиметаболитов и противораковых растительных алкалоидов.

Эффекты изобретения

[0008]

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению для введения в лимфатический узел оказывает превосходный противораковый эффект при низких дозах. Когда композицию вводят в лимфатический узел, расположенный выше по потоку в лимфатической сети, лимфатический узел, расположенный ниже по потоку в лимфатической сети, также может быть целью лечения. Благодаря такому расположению лимфатический узел в начальной стадии метастазирования и лимфатический узел с высоким риском метастазирования могут быть мишенями для терапевтического или профилактического лечения.

Краткое описание чертежей

[0009]

[Фигура 1] Фигура иллюстрирует надлежащий подмышечный лимфатический узел в мышиной модели метастазирования и введения лекарственного средства мыши. Сначала, раковые клетки трансплантируют в подвздошный лимфатический узел (SiLN) и дают распространиться в надлежащий подмышечный лимфатический узел (PALN) через лимфатические сосуды. Затем лекарственное средство вводят во вспомогательный подмышечный лимфатический узел (AALN) и дают распространиться в надлежащий подмышечный лимфатический узел через лимфатический сосуд для лечения клеток метастатического рака.

[Фигура 2] На фигуре показаны фотографии (a: 2×, b: 10×) картины патологического изменения надлежащего подмышечного лимфатического узла на день 9^T после введения раствора B. Фигура b представляет собой увеличенный вид квадратной части на фигуре а; «cor» обозначает корковый слоя лимфатического узла; и «Т» указывает рак. Остаточные раковые клетки наблюдаются в поверхности коркового слоя лимфатического узла; однако раковые клетки не наблюдаются в области, соответствующей краевому синусу лимфатического узла.

[Фигура 3] На фигуре показаны фотографии (a: 2×, b: 10×) картины патологического изменения надлежащего подмышечного лимфатического узла на день 9^T после введения раствора С. Фигура b представляет собой увеличенный вид квадратной части на фигуре а; и «Т» указывает рак. Инфильтрация/рост рака наблюдается в паренхиме лимфатического узла и краевом синусе.

[Фигура 4] На фигуре показаны фотографии (a: 2×, b: 10×) картины патологического изменения вспомогательного подмышечного лимфатического узла на 9 день после введения раствора С. На фигуре b представлен увеличенный вид квадратной части на фигуре а; и «F» обозначает фиброз. Некроз и фиброз наблюдали в широкой области вокруг медуллы лимфатического узла. Патологические изменения выражены от коры лимфатического узла до области вне капсулы лимфатического узла, включая базальную часть эфферентного лимфатического сосуда. Предполагается стаз эфферентного лимфатического сосуда.

Описание вариантов осуществления

[0010]

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одно противораковое лекарственное средство, выбранное из группы, состоящей из антиметаболитов и противораковых растительных алкалоидов, и должно вводиться локально в лимфатический узел.

[0011]

Примеры антиметаболита включают противораковое лекарственное средство фторированный пиримидин, такой как 5-фторурацил (5-FU), пролекарство 5-FU (например, тегафур или его соль), капецитабин или его соль, TS-1 (также упоминаемый как как S-1; комбинированное лекарственное средство, содержащее тегафур и модулятор в комбинации), кармофур и доксифлуридин. Кроме них, упомянуты гемцитабин, цитарабин, эноцитабин, меркаптопурин, флударабин, кладрибин, метотрексат, пеметрексед, гидроксикарбамид, неларабин, пентостатин и их пролекарства. Противораковое лекарственное средство фторированный пиримидин, который представлен в виде 5-фторурацила in vivo, является более предпочтительным, и 5-фторурацил или его соль является особенно предпочтительным.

Примеры его соли в настоящем документе включают его соль с фармацевтически приемлемой неорганической кислотой (например, хлористоводородной кислотой, серной кислотой, бромистоводородной кислотой, йодистоводородной кислотой, азотной кислотой и фосфорной кислотой) и фармацевтически приемлемой органической кислотой (например, муравьиной кислотой, уксусной кислотой, пропионовой кислотой, малоновой кислотой, янтарной кислотой, глутаровой кислотой, фумаровой кислотой, малеиновой кислотой, молочной кислотой, яблочной кислотой, лимонной кислотой, винной кислотой, бензолсульфоновой кислотой, п-толуолсульфоновой кислотой и метансульфоновой кислотой).

[0012]

Примеры противоракового растительного алкалоида включают винкристин, винбластин, виндезин, винорелбин, этопозид, иринотекан или их активный метаболит или их соль, ногитекан, собузоксан, доцетаксел, паклитаксел, паклитаксел для инъекций и эрибулин; и иринотекан или его метаболит или их соль являются предпочтительными. Примером активного метаболита иринотекана является 7-этил-10-гидроксикамптотецин (SN-38).

Примеры соли иринотекана включают ее соль с вышеупомянутой фармацевтически приемлемой неорганической кислотой или органической кислотой; и его гидрохлорид является предпочтительным.

[0013]

Содержание противоракового лекарственного средства в фармацевтической композиции по настоящему изобретению в стандартной дозированной форме, которое варьируется в зависимости от его типа, составляет от 1 нг до 1000 мг, предпочтительно от 10 нг до 100 мг, более предпочтительно от 100 нг до 10 мг и даже более предпочтительно от 1 мкг до 1 мг.

[0014]

Поскольку фармацевтическую композицию по настоящему изобретению вводят в лимфатический узел, композиция предпочтительно имеет дозированную форму, которую можно инъецировать в лимфатический узел. Примеры инъекционной дозированной формы включают инъекционный раствор, инъекционную суспензию, инъекционную эмульсию, инъекционный гель и твердое вещество для инъекций.

Примеры твердого вещества для инъекций включают лиофилизированный препарат и препарат, заполненный порошком, который необходимо смешать с растворителем, таким как вода для инъекций, физиологический раствор для инъекций и раствор глюкозы для инъекций, чтобы использовать его в качестве инъекции в лимфатический узел во время использования.

[0015]

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент, в дополнение к вышеуказанному противораковому лекарственному средству. В этом случае фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент может быть соответствующим образом выбран из группы, состоящей из водорастворимого растворителя, липидорастворимого растворителя, диспергатора, средства, регулирующего тоничность, консерванта, солюбилизатора, стабилизатора и тому подобного.

Примеры водорастворимого растворителя в настоящем документе включают дистиллированную воду, физиологический раствор, раствор Рингера и Фосфатно-солевой буферный раствор (PBS). Примеры липидорастворимого растворителя включают растительные масла, такие как оливковое масло, касторовое масло, кунжутное масло, хлопковое масло и кукурузное масло. Примеры диспергатора включают tween 20 или tween 80, полиэтиленгликоль, карбоксиметилцеллюлозу и альгинат натрия. Примеры средства, регулирующего тоничность, включают хлорид натрия, глицерин, сорбиловый спирт и глюкозу. Примеры солюбилизатора включают салицилат натрия, полоксамер и ацетат натрия. Примеры консерванта включают метилпарабен, пропилпарабен, бензиловый спирт, хлорбутанол, бензоат натрия и фенол. Примеры стабилизатора включают альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин и бычий сывороточный альбумин.

[0016]

Фармацевтическая композиция может быть приготовлена с использованием противоракового лекарственного средства по настоящему изобретению в соответствии с известной методикой получения; например, путем растворения, суспендирования или эмульгирования противоракового лекарственного средства по настоящему изобретению в водорастворимом растворителе или липидорастворимом растворителе вместе, например, с диспергатором, средством, регулирующим тоничность, консервантом, солюбилизатором и стабилизатором, как упомянуто выше.

[0017]

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, принимая во внимание эффект регрессии опухоли, предпочтительно имеет вязкость 40 мПа⋅с или менее, более предпочтительно 30 мПа⋅с или менее, более предпочтительно 20 мПа⋅с или менее и еще более предпочтительно 10 мПа или меньше; и предпочтительно 0,5 мПа⋅с или более и более предпочтительно 1 мПа⋅с или более.

Более конкретно, вязкость составляет предпочтительно от 0,5 до 40 мПа⋅с, более предпочтительно 0,5-30 мПа⋅с, более предпочтительно 0,5-20 мПа⋅с, более предпочтительно 0,5-10 мПа⋅с и еще более предпочтительно 1-10 мПа⋅с.

[0018]

Вязкость можно измерить с помощью вибрационного вискозиметра (например, вибрационного вискозиметра с камертоном <SV-1A, производства A&D Company Ltd.>) при 20°C, как описано далее в разделе ʺПримерыʺ.

[0019]

Вязкость можно контролировать путем использования различных гидрофильных полимеров, обычно используемых в качестве сгустителя в препарате для инъекций. Его примеры включают линейный полисахарид, такой как целлюлоза, амилоза, пектин, желатин, декстрин и альгинат; производное целлюлозы (например, метилцеллюлоза (МС), гидроксиалкилцеллюлоза, такая как гидроксипропилцеллюлоза (HPC) и гидроксипропилметилцеллюлоза (HPMC), карбоксиалкилцеллюлоза и карбоксиметилцеллюлоза (CMC), и их соли); гликозаминогликан (например, несульфатированный гликозаминогликан, такой как гиалуроновая кислота и ее соль, десульфированный гепарин, десульфированный хондроитинсульфат и десульфированный дерматансульфат); галактоманнан (например, гуаровая камедь, камедь пажитника, камедь тары, камедь бобов рожкового дерева и камедь рожкового дерева); карбомер; полиакриловую кислоту; поликарбофил; поливинилпирролидон; полиакриламид; поливиниловый спирт; производное поливинилацетата; и смесь из них. Кроме них, полиоксиэтиленовый эфир сорбитана и жирной кислоты также может быть использован в качестве стабилизатора, поверхностно-активного вещества, суспендирующего агента, эмульгатора, диспергатора, растворителя, солюбилизатора и солюбилизирующего агента. Принимая во внимание эффект регрессии опухоли, предпочтительно использовать полиоксиэтиленовый эфир сорбитана и жирной кислоты. В качестве полиоксиэтиленового эфира сорбитана и жирной кислоты, полиоксиэтилен сорбитан монолаурат (полисорбат 20, Tween 20), полиоксиэтилен сорбитан моностеарат (полисорбат 60, Tween 60), полиоксиэтилен сорбитан тристеарат (полисорбат 65, Tween 65) и полиоксиэтиленсорбитанолеат 80 (полисорбат 80, Tween 80) являются предпочтительными, и полиоксиэтиленсорбитанолеат является более предпочтительным.

[0020]

Полученную таким образом фармацевтическую композицию по настоящему изобретению вводят локально в лимфатический узел пациента. Мишень для введения, то есть лимфатический узел, в настоящем документе может представлять собой паренхиму лимфатического узла, подлежащего терапевтическому или профилактическому лечению (целевой лимфатический узел), или лимфатический узел, расположенный выше по потоку в лимфатической системе, к которой принадлежит лимфатический узел. Примеры лимфатического узла включают сигнальный лимфатический узел, в который раковые клетки мигрируют из первичного поражения и сначала формируют метастаз, лимфатический узел (вторичный лимфатический узел), расположенный ниже от сигнального лимфатического узла, лимфатический узел, расположенный выше от регионарного лимфатического узла, окружающего первичное поражение, и лимфатический узел, расположенный выше по течению в лимфатической системе, к которой принадлежит регионарный лимфатический узел.

Целевой лимфатический узел в настоящем описании может иметь или не иметь рак. Например, перед иссечением лимфатического узла, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению вводят в лимфатический узел (расположенный выше лимфатический узел) в области диссекции, для доставки таким образом противоракового лекарственного средства в лимфатический узел (расположенный нижний лимфатический узел) вне области диссекции через лимфатическую систему, и после этого проводится диссекция. Таким образом, может быть осуществлено профилактическое лечение расположенного ниже лимфатического узла.

[0021]

Способ введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению в лимфатический узел не ограничен при условии, что фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно инъецировать в лимфатический узел. Композицию можно вводить путем инъекции в лимфатический узел, обнаженный посредством разреза кожи пациента, или вводить путем инъекции через участок кожи пациента, под которым предположительно находится целевой лимфатический узел.

[0022]

Как показано далее в примерах, 5-фторурацил, иринотекан и доцетаксел, каждый, проявляют превосходный противораковый эффект при введении в лимфатический узел в малых дозах по сравнению с системно вводимым доксорубицином. Поскольку известно, что ингибирующая рост клеток активность (величина GI₅₀) доксорубицина в штамме раковых клеток является очень сильной по сравнению с 5-фторурацилом и иринотеканом и эквивалентна доцетакселу (см. Сравнительный пример), противораковый эффект, полученный при введении 5-фторурацила, иринотекана или доцетаксела в лимфатический узел не может быть предсказан на основе общих технических знаний.

Противораковый эффект проявляется введением в лимфатический узел, расположенный выше лимфатического узла-мишени для профилактического или терапевтического лечения. Таким образом, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить в лимфатический узел на начальной стадии метастазирования и в лимфатический узел с высоким риском стать метастазирующим в качестве мишени для терапевтического или профилактического лечения и особенно полезна для профилактики рецидива и т.п.

Следует отметить, что в описании термин «лечение» относится к лечению субъекта, имеющего рак, (немедленное лечение) и означает улучшение, облегчение или устранение его болезненного состояния или одного или нескольких симптомов, вызванных болезненным состоянием. «Профилактическое лечение» относится к лечению субъекта с риском развития рака и в настоящее время не имеющего болезненного состояния и симптомов.

[0023]

Тип рака, который можно лечить путем введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению, конкретно не ограничен при условии, что он проявляет чувствительность к противораковому лекарственному средству по настоящему изобретению. Его примеры включают рак головы и шеи, рак желудка, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак печени, рак желчного пузыря/желчных протоков, рак поджелудочной железы, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак простаты, рак матки, фарингеальный рак, рак пищевода, рак почки и рак яичников. В частности, ожидается, что композиция будет оказывать сильный эффект на рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак молочной железы, рак пищевода, рак желудка, рак головы и шеи, рак легкого, рак поджелудочной железы и рак желчного пузыря/желчных протоков.

[0024]

Частоту введения и величину дозы фармацевтической композиции по настоящему изобретению для субъекта-человека можно соответствующим образом контролировать или изменять. Интервал введения составляет, например, один раз в 1-42 дня, предпочтительно один раз в 1-28 дней и более предпочтительно один раз в 1-21 день.

Величина единичной дозы композиции в качестве антиметаболита составляет от 1 нг до 100 мг, предпочтительно от 10 нг до 10 мг и более предпочтительно от 100 нг до 1 мг, что составляет примерно от 1/10⁹ до 1/3 от величины дозы, обычно используемой для системного введения. Величина единичной дозы композиции в качестве противоракового растительного алкалоида составляет от 1 нг до 20 мг, предпочтительно от 10 нг до 10 мг и более предпочтительно от 100 нг до 1 мг, что составляет примерно от 1/10⁷ до 2/3 от величины дозы, обычно используемой для системного введения.

[0025]

Далее, настоящее изобретение будет более конкретно описано с помощью примеров; однако настоящее изобретение не ограничивается этими примерами.

Примеры

[0026]

Пример 1. Противораковая активность 5-FU, вводимого в лимфатический узел

1. Материалы

(a) Используемые животные

В качестве мышиной модели лимфаденопатии, мышей MXH10/Mo/lpr/lpr (MXH10/Mo/lpr) получали в соответствии с ранее описанным способом (J Immunol Methods 2013; 389 (1-2): 69-78 doi 10.1016/j.jim.2013.01.004). В следующих примерах в общей сложности использовали в качестве мышиной модели 5 самцов и самок мышей в возрасте от 15 до 18 недель.

[0027]

(b) Раковые клетки

Клетки KM-Luc/GFP, полученные из фибробластов мыши, получали в соответствии с ранее описанным способом (PLoS One 2013; 8 (2): e55797 doi 10.1371/journal.pone.0055797). Клетки KM-Luc/GFP получали путем трансфекции раковых клеток, полученных из фибробластов мыши MRL/MpTn-gld/gld, клеток MRL/N1, плазмидой pEGFPLuc. KM-Luc/GFP клетки постоянно экспрессируют ген люциферазы и ген зеленого флуоресцентного белка. В следующих примерах клетки культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (производства Sigma-Aldrich), содержащей 10% FBS (фетальная бычья сыворотка), 1% L-глутамин-P.S. раствор (производство Thermo Fisher Scientific) и 0,5% G418 и использовали.

[0028]

(c) Исследуемое лекарственное средство

В качестве 5-FU, 5-FU для инъекций, использовали 250 мг (производства Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.). Его концентрацию регулировали физиологическим раствором, чтобы она составляла 0 мкг/г, 0,1 мкг/г, 1 мкг/г и 10 мкг/г массы тела мыши.

[0029]

2. Способ

(a) Получение мышиной модели метастазирования надлежащего подмышечного лимфатического узла

Клетки KM-Luc/GFP (раковые), которые получали путем оттаивания клеток, хранившихся при -80°С, а затем субкультивирования их в общей сложности дважды, суспендировали в PBS (забуференном фосфатом солевом растворе) и их концентрацию контролировали так, чтобы составляла 1,0×10⁶ клеток/мл. После этого клеточную суспензию смешивали с Matrigel (матрица базальной мембраны, производимой Becton, Dickinson and Co.) и разбавляли до концентрации 3,3×10⁵ клеток/мл, а затем полученный результат (60 мкл) инокулировали мышам в подвздошный лимфатический узел (фиг. 1). День, когда были инокулированы раковые клетки, был указан как день 0.

[0030]

(b) Оценка роста раковых клеток in vivo

Используя систему биологической флуоресцентной визуализации (IVIS, производства Caliper Life Science), скорости роста раковых клеток в подвздошном лимфатическом узле и надлежащем подмышечном лимфатическом узле определяли в день 0, день 6 и день 9 после инокуляции раковых клеток. 200 мкл люциферина (производства Promega), концентрацию которого контролировали на уровне 15 мг/мл, вводили в брюшную полость мыши. Через десять минут активность люциферазы определяли с использованием IVIS.

[0031]

(c) Введение лекарственного средства через вспомогательный подмышечный лимфатический узел

Из мышей на 6-й день после инокуляции раковых клеток отбирали мышей с активностью люциферазы 1,0×10⁶ фотонов/сек или более в надлежащем подмышечном лимфатическом узле и 120 мкл 5-FU вводили во вспомогательный подмышечный лимфатический узел при скорости 10 мкл/мин при использовании шприцевого насоса (KDS100, производства Muromachi) (фиг. 1).

[0032]

(d) Оценка противораковой активности

Активности люциферазы на 6-й и 9-й день нормализовали в соответствии со следующим [выражение 1]. После этого отношение нормализованной активности люциферазы на 9-й день к активности на 6-й день рассчитывали в соответствии со следующим [выражение 2]. Отношение нормализованной активности люциферазы в день 9 к активности в день 6 при каждой концентрации введения 5-FU, когда отношение нормализованной активности люциферазы в день 9 к активности в день 6 при введении 0 мкг/г было установлено равным 100, рассчитывали в соответствии со следующим [выражение 3].

[0033]

[Выражение 1]

Нормализованная активность люциферазы в день 6 или день 9=((активность люциферазы в день 6 или день 9)/(активность люциферазы в день 0))

[0034]

[Выражение 2]

Отношение нормализованной активности люциферазы на 9 день к активности на 6 день=((нормализованная активность люциферазы на 9 день)/(нормализованная активность люциферазы на 6 день))

[0035]

[Выражение 3]

Отношение нормализованной активности люциферазы в день 9 к таковой в день 6 при каждой концентрации введения 5-FU, когда отношение нормализованной активности люциферазы в день 9 к таковой в день 6 при введении 0 мкг/г было установлено равным 100,=((отношение нормализованной активности люциферазы на 9 день к активности на 6 день при каждой концентрации введения 5-FU)/(отношение нормализованной активности люциферазы на 9 день к активности на 6 день при введении 0 мкг/г)×100)

[0036]

3. Результаты

Результаты приведены в таблице 1.

[0037]

[0038]

Было подтверждено, что отношение активности люциферазы резко уменьшилось и рак уменьшился в размере при введении 5-FU, и что эффект регрессии опухоли 90% или более был получен даже при чрезвычайно малой дозе (0,1 мкг/г). 5-FU вводили во вспомогательный подмышечный лимфатический узел, находящийся выше лимфатических узлов, и противоопухолевая активность была подтверждена в надлежащем подмышечном лимфатическом узле, находящемся ниже его. Исходя из вышеизложенного, было высказано предположение, что введение небольшого количества 5-FU в лимфатический узел, в частности, лимфатический узел, находящийся выше по течению, является полезным, например, для лечения рака, профилактики рецидивов и профилактики метастазирования, и, в частности, является высокоэффективным, например, для лечения и профилактики рецидивов в лимфатическом узле, расположенном ниже. Кроме того, поскольку противораковая активность проявлялась даже в очень малых дозах, было высказано предположение, что этот способ является высокобезопасным с уменьшенными побочными эффектами.

[0039]

Пример 2. Противораковая активность иринотекана гидрохлорида (СРТ-11), вводимого в лимфатический узел

1. Материал

Использовали таких же животных и клетки, что и в примере 1.

В качестве исследуемого лекарственного средства использовали СРТ-11, то есть иринотекан гидрохлорид (производства Yakult Honsha Co., Ltd.). Иринотекан гидрохлорид растворяли в физиологическом растворе, и его концентрацию контролировали на уровне 0 мкг/г, 0,5 мкг/г и 5 мкг/г массы тела мыши.

[0040]

2. Способ

Использовали такой же способ, что и в примере 1, за исключением того, что исследуемое лекарственное средство, предназначенное для введения во вспомогательный подмышечный лимфатический узел, было заменено на CPT-11.

[0041]

3. Результаты

Результаты приведены в таблице 2.

[0042]

[0043]

Было подтверждено, что отношение активности люциферазы резко уменьшилось и рак уменьшился в размере при введении СРТ-11, и что эффект регрессии опухоли 90% или более был достигнут даже при чрезвычайно малой дозе (0,5 мкг/г). СРТ-11 вводили через вспомогательный подмышечный лимфатический узел, находящийся выше лимфатического узла, и противоопухолевая активность была подтверждена в надлежащем подмышечном лимфатическом узле, находящемся ниже его. Исходя из вышеизложенного, было высказано предположение, что введение небольшого количества CPT-11 в лимфатический узел, в частности, лимфатический узел, находящийся выше по течению, является полезным, например, для лечения рака, профилактики рецидивов, и, в частности, является высокоэффективным, например, для лечения и профилактики рецидивов в лимфатическом узле, расположенном ниже. Кроме того, поскольку противораковая активность проявлялась даже в очень малых дозах, было высказано предположение, что этот способ является высокобезопасным с уменьшенными побочными эффектами.

[0044]

Пример 3. Противораковая активность доцетаксела, вводимого в лимфатический узел

1. Материалы

(a) Используемые животные

Использовали таких же животных, что и в примере 1.

[0045]

(b) Раковые клетки

Клетки FM3A-Luc, полученные из клеток рака молочной железы мыши, получали в соответствии с ранее описанным способом (J Immunol Methods 2013 Mar 29; 389 (1-2): 69-78. doi: 10.1016/j.jim.2013.01.004.). Клетки FM3A-Luc получали путем введения гена pGL4.51 в клетки FM3A посредством электропорации и постоянно экспрессировали ген люциферазы. В следующих примерах клетки культивировали в RPMI-1640 (производства Sigma-Aldrich), содержащей 10% FBS (фетальная бычья сыворотка), 1% L-глутамин-P.S.(пенициллин-стрептомицин) раствор (производства Thermo Fisher Scientific) и 0,5% G418 и использовали.

[0046]

(c) Исследуемое лекарственное средство

В качестве доцетаксела использовали таксотер для внутривенной инфузии, 80 мг (производства Sanofi K.K.). Таксотер для внутривенной инфузии 80 мг (2 мл) растворяли в 13% этаноле (6 мл) для получения исходного раствора 10 мг/мл. После этого исходный раствор растворяли в стерильной воде таким образом, чтобы концентрация на массу тела мыши составляла 0 мкг/г, 1 мкг/г и 10 мкг/г.

[0047]

2. Способ

(a) Получение мышиной модели метастазирования надлежащего подмышечного лимфатического узла

Клетки FM3A-Luc (раковые), которые получали путем оттаивания клеток, хранившихся при -80°С, а затем субкультивирования их в общей сложности дважды, суспендировали в PBS (забуференном фосфатом солевом растворе) и их концентрацию контролировали так, чтобы составляла 1,0×10⁶ клеток/мл. После этого клеточную суспензию смешивали с Matrigel (матрица базальной мембраны, производимой Becton, Dickinson and Co.) и разбавляли до концентрации 3,3×10⁵ клеток/мл, а затем полученный результат (60 мкл) инокулировали мышам в подвздошный лимфатический узел (фиг. 1). День, когда были инокулированы раковые клетки, был указан как день 0.

[0048]

(b) Оценка роста раковых клеток in vivo

Используя систему биологической флуоресцентной визуализации (IVIS, производства Caliper Life Science), скорости роста раковых клеток в подвздошном лимфатическом узле и надлежащем подмышечном лимфатическом узле определяли в день 0, день 7, день 14, день 17, день 20, день 23, день 26 и день 29 после инокуляции раковых клеток. 200 мкл люциферина (производства Promega), концентрацию которого контролировали на уровне 15 мг/мл, вводили в брюшную полость мыши. Через десять минут активность люциферазы определяли с использованием IVIS.

[0049]

(c) Введение лекарственного средства через вспомогательный подмышечный лимфатический узел

Мыши, у которой подтверждено, что она имеет люциферазную активность 1,0×10⁶ фотонов/сек или более в надлежащем подмышечном лимфатическом узле, вводили доцетаксел (120 мкл) во вспомогательный подмышечный лимфатический узел на следующий день после подтверждения со скоростью 10 мкл/мин при использовании шприцевого насоса (KDS100, производства Muromachi) (фиг. 1).

[0050]

(d) Оценка противораковой активности

День, когда вводили доцетаксел, определяли как день 0^T. Активность люциферазы на день 3^T (через 3 дня после введения доцетаксела) и активность люциферазы на день 6^T (через 6 дней после введения доцетаксела) нормализовали в соответствии со следующим [выражением 4]. После этого отношение нормализованной активности люциферазы в день 3^T или день 6^T к нормализованной активности люциферазы в день -1^T (день, когда было подтверждено, что активность люциферазы в надлежащем подмышечном лимфатическом узле составляет 1,0×10⁶ фотонов/сек или более, и день до введения доцетаксела) рассчитывали в соответствии со следующим [выражением 5]. Отношение нормализованной активности люциферазы в день 3^T или день 6^T к таковой в день -1^T при каждой концентрации введения доцетаксела, когда отношение нормализованной активности люциферазы в день 3^T или день 6^T к таковой в день -1^T при введении 0 мкг/г был установлен на 100, рассчитывали в соответствии со следующим [Выражение 6].

[0051]

[Выражение 4]

Нормализованная активность люциферазы в день 3^T, день 6^T или день -1^T=((активность люциферазы в день 3^T, день 6^T или день -1^T)/(активность люциферазы в день 0^T))

[0052]

[Выражение 5]

Отношение нормализованной активности люциферазы в день 3^T или день 6^T к нормализованной активности люциферазы в день -1^T=((нормализованная активность люциферазы на день 3^T или день 6^T)/(нормализованная активность люциферазы на день -1^T))

[0053]

[Выражение 6]

Отношение нормализованной активности люциферазы в день 3^T или день 6^T к нормализованной активности люциферазы в день -1^T при каждой концентрации введения доцетаксела, когда отношение нормализованной активности люциферазы в день 3^T или день 6^T к нормализованной активности люциферазы в день -1^T при введении 0 мкг/г был установлен равным 100,=((отношение нормализованной активности люциферазы в день 3^T или день 6^T к таковой в день -1^T при каждой концентрации введения доцетаксела)/(отношение нормализованной активности люциферазы в день 3^T или день 6^T к таковой в день -1^Т при введении 0 мкг/г)×100)

[0054]

3. Результаты

Результаты приведены в таблице 3.

[0055]

[0056]

Было подтверждено, что отношение активности люциферазы резко уменьшилось и рак уменьшился в размере при введении доцетаксела, и что эффект регрессии опухоли 90% или более был достигнут даже при небольшой дозе (1 мкг/г) в день 6 после начала лечения. Доцетаксел вводили через вспомогательный подмышечный лимфатический узел, находящийся выше лимфатического узла, и противоопухолевая активность была подтверждена в надлежащем подмышечном лимфатическом узле, находящемся ниже его. Исходя из вышеизложенного, было высказано предположение, что введение небольшого количества доцетаксела в лимфатический узел, в частности, лимфатический узел, находящийся выше по течению, является полезным, например, для лечения рака, профилактики рецидивов и профилактики метастазирования, и, в частности, является высокоэффективным, например, для лечения и профилактики рецидивов в лимфатических узлах, расположенных ниже. Кроме того, поскольку противораковая активность проявлялась даже в очень малых дозах, было высказано предположение, что этот способ является высокобезопасным с уменьшенными побочными эффектами.

[0057]

Пример 4. Противораковая активность доцетаксела с различной вязкостью, вводимого в лимфатический узел

1. Материал

Использовали таких же животных, что и в примере 1.

Использовали такие же клетки, что и в примере 4.

В качестве доцетаксела использовали таксотер для внутривенной инфузии, 80 мг (производства Sanofi K.K.). Таксотер для внутривенной инфузии 80 мг (2 мл) растворяли в 13% этаноле (6 мл) для получения исходного раствора 10 мг/мл. После этого раствор A, раствор B и раствор C получали в соответствии с соотношениями смешивания, показанными в таблице 4, таким образом, чтобы концентрация доцетаксела на массу тела мыши составляла 1 мкг/г.

[0058]

[0059]

2. Способ

(a) Получение мышиной модели метастазирования надлежащего подмышечного лимфатического узла, (b) оценка роста раковых клеток in vivo и (c) введение лекарственного средства через вспомогательный подмышечный лимфатический узел осуществляли таким же образом, как в примере 4.

(d) Оценка противораковой активности

День, когда вводили раствор А, В или С, определяли как день 0^Т. Активность люциферазы в день 9^T относительно активности в день -1^T (день, когда было подтверждено, что активность люциферазы в надлежащем подмышечном лимфатическом узле составляет 1,0×10⁶ фотонов/сек или более, и за день до введения доцетаксела) рассчитывали в соответствии со следующим [выражением 7].

[0060]

[Выражение 7]

Активность люциферазы в день 9^T относительно активности люциферазы в день -1^T=(активность люциферазы в день 9^T)/(активность люциферазы в день -1^T)

[0061]

(e) Измерение вязкости

Значения вязкости раствора A, раствора B и раствора C измеряли с использованием вибрационного вискозиметра с камертоном (SV-1A: диапазон измерения вязкости: от 0,3 до 10000 мПа⋅с; SV-1H: диапазон измерения вязкости: от 0,3 до 1000 мПа⋅с, производства A&D Company Ltd.) в соответствии со способом измерения вязкости, определенным Японской фармакопеей.

(f) Фотосъемка картин патологических изменений

На день 9^T после введения раствора B или раствора C картину патологических изменений надлежащего подмышечного лимфатического узла и вспомогательного подмышечного лимфатического узла наблюдали с использованием инвертированного микроскопа BX51 (производства Olympus Corporation) в соответствии с методом наблюдения в светлом поле и фотографировали. Увеличение было 2× и 10×.

[0062]

3. Результаты

(a) Связь между вязкостью и активностью люциферазы

Результаты приведены в таблице 5.

[0063]

[0064]

Активность люциферазы, рассчитанная по выражению 7, представляла собой активность люциферазы в день 9^Т относительно активности люциферазы в день -1^Т. Следовательно, меньшее значение указывает на лучшую регрессию опухоли на день 9^T. Поскольку в случае раствора A и раствора B значения активности люциферазы были низкими, было обнаружено, что эффекты регрессии опухоли в случае раствора A и раствора B были высокими. Напротив, наблюдали слабый или нулевой эффект регрессии опухоли в случае раствора С. Из вышеизложенного следует, что для получения эффекта регрессии опухоли доцетаксела, вводимого в лимфатический узел, его вязкость предпочтительно составляет 40 МПа⋅с или менее и особенно предпочтительно 1-10 мПа⋅с.

[0065]

(b) Фотографии картины патологических изменений на день 9^T в случае введения раствора B и раствора C

Картины патологических изменений надлежащего подмышечного лимфатического узла на день 9^T после введения раствора B или раствора C показаны на фиг. 2 и фиг. 3, соответственно.

В случае раствора В остаточные раковые клетки наблюдали в поверхности коркового слоя лимфатического узла, но раковые клетки не наблюдали в области, соответствующей краевому синусу лимфатического узла. Напротив, в случае раствора C инфильтрация/рост рака наблюдали в паренхиме лимфатического узла и краевом синусе. Исходя из этого, эффект регрессии опухоли в зависимости от вязкости был подтвержден также по фотографиям картин патологических изменений надлежащего подмышечного лимфатического узла.

Следует отметить, что, когда картина патологических изменений вспомогательного подмышечного лимфатического узла, который является местом введения раствора C, была получена аналогичным образом, некроз и фиброз наблюдали в широкой области вокруг медуллы лимфатического узла. Изменения наблюдали от коры лимфатического узла до области вне капсулы лимфатического узла, включая базальную часть эфферентного лимфатического сосуда. Предполагается стаз эфферентного лимфатического сосуда (фиг. 4). Причиной этого считается то, что раствор C при введении в верхний лимфатический узел, то есть во вспомогательный подмышечный лимфатический узел, оставался во вспомогательном подмышечном лимфатическом узле, не поступая в нижний лимфатический узел из-за его высокой вязкости. В связи с этим, считается, что не только в случае доцетаксела, но также и в случае, когда вводят СРТ-11 или SN-38, оба из которых являются противораковыми растительными алкалоидами, такими как доцетаксел, или 5-FU, который является антиметаболитом, в лимфатический узел, вязкость лекарственного средства должна быть 40 мПа⋅с или менее.

[0066]

Сравнительный пример. Противораковая активность доксорубицина, вводимого в лимфатический узел

1. Материал

Использовали таких же животных и клетки, что и в примере 1.

В качестве исследуемого лекарственного средства, т.е. доксорубицина, использовали доксорубицина гидрохлорид (производства Wako). Его концентрацию регулировали физиологическим раствором, чтобы она составляла 0 мкг/г, 0,1 мкг/г, 1 мкг/г и 10 мкг/г массы тела мыши.

[0067]

2. Способ

Использовали такой же способ, что и в примере 1, за исключением того, что исследуемое лекарственное средство, предназначенное для введения во вспомогательный подмышечный лимфатический узел, было заменено на доксорубицин.

[0068]

3. Результаты

Результаты приведены в таблице 6. Для сравнения противораковой активности доксорубицина с таковой 5-FU, СРТ-11 и доцетаксела, результаты примеров 1-3 показаны вместе в таблице 6.

[0069]

[0070]

Отношение активности люциферазы снижалось при введении доксорубицина, но отношение уменьшения опухоли был низким по сравнению с теми, которые были получены с помощью 5-FU, CPT-11 и доцетаксела. В частности, отношение уменьшения размеров опухоли, полученное доксорубицином в дозе 10 мкг/г, составляло около 25%, и лучшее отношение уменьшения размеров опухоли составляло менее 60% при дозе 1 мкг/г, но отношения уменьшения размеров опухоли, полученные с помощью 5-FU и СРТ-11, составляли 90% или более даже при дозе менее 1 мкг/г, и отношение уменьшения размеров опухоли, полученное доцетакселом, составляло 80% или более при дозе 10 мкг/г. Исходя из этих данных, было высказано предположение, что эффекты 5-FU, CPT-11 и доцетаксела высоки по сравнению с эффектом доксорубицина.

[0071]

Известно, что ингибирующая рост клеток активность (величина GI₅₀) доксорубицина в отношении штамма раковых клеток примерно в 10-1000 раз выше, чем активность 5-FU и CPT-11, как показано в таблице 7 (среднее значение, рассчитанное по значениям GI₅₀ в отношении клеточных штаммов, описанных в базе данных NIH DTP (https://dtp.cancer.gov/dtpstandard/cancerscreeningdata/index.jsp)). Известно, что активность доцетаксела практически равна активности доксорубицина.

[0072]

[0073]

Как показано в таблице 7, обычно считалось, что эффект доксорубицина был высоким по сравнению с эффектами 5-FU и СРТ-11 и почти равным эффекту доцетаксела. Однако в случае введения в лимфатический узел противораковая активность 5-FU, CPT-11 и доцетаксела оказалась выше, чем у доксорубицина, как показано в таблице 6. Из этих данных было продемонстрировано, что эти лекарственные средства особенно подходят для введения в лимфатический узел.

Промышленная применимость

[0074]

В соответствии с фармацевтической композицией по настоящему изобретению, когда противораковое лекарственное средство вводят в лимфатический узел перед удалением, противораковое лекарственное средство может доставляться в лимфатический узел, находящийся ниже от лимфатического узла, в который вводили лекарственное средство. В результате возможно не только то, что противораковый эффект проявляется в целевом лимфатическом узле, но также и то, что противораковое лекарственное средство может доставляться в другие лимфатические узлы, которые потенциально могут иметь небольшое распространение рака в них. Таким образом, уничтожают рак небольшого размера для предотвращения рецидива.

Если рак присутствует в лимфатическом узле в области, где нельзя применить хирургическое удаление, лечение хирургическим путем не может быть осуществлено, но лимфатический узел в области, где нельзя применить хирургическое удаление, можно лечить путем введения противоракового лекарственного средства через лимфатический узел, присутствующий выше по течению, используя фармацевтическую композицию по настоящему изобретению. Кроме того, поскольку фармацевтическая композиция по настоящему изобретению включает противораковое лекарственное средство в количестве, меньшем, чем количество, используемое при обычном системном введении, композиция обладает уменьшенными побочными эффектами и является высокобезопасной.

Группа изобретений относится к фармацевтической промышленности, а именно к средству для лечения рака, предназначенная для введения в лимфатический узел. Фармацевтическая композиция для лечения рака, предназначенная для введения в лимфатический узел, содержащая по меньшей мере одно противораковое лекарственное средство, выбранное из группы, состоящей из 5-фторурацила, иринотекана, доцетаксела и их солей с фармацевтически приемлемыми неорганическими кислотами или органическими кислотами, в качестве активного ингредиента, где количество 5-фторурацила или его соли в композиции составляет от 1 нг до 100 мг, количество иринотекана или его соли и/или доцетаксела или его соли в композиции составляет от 1 нг до 20 мг, и фармацевтическая композиция имеет вязкость 1-10 мПа⋅с. Применение по меньшей мере одного противоракового лекарственного средства, выбранного из группы, состоящей из 5-фторурацила, иринотекана, доцетаксела и их солей с фармацевтически приемлемыми неорганическими кислотами или органическими кислотами, при изготовлении фармацевтической композиции для лечения рака, предназначенной для введения в лимфатический узел, где количество 5-фторурацила или его соли в композиции составляет от 1 нг до 100 мг, количество иринотекана или его соли и/или доцетаксела или его соли в композиции составляет от 1 нг до 20 мг, и фармацевтическая композиция имеет вязкость 1-10 мПа⋅с. Применение фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере, одно противораковое лекарственное средство, выбранное из группы, состоящей из 5-фторурацила, иринотекана, доцетаксела и их солей с фармацевтически приемлемыми неорганическими кислотами или органическими кислотами, для лечения рака путем введения в лимфатический узел, где количество 5-фторурацила или его соли в композиции составляет от 1 нг до 100 мг, количество иринотекана или его соли и/или доцетаксела или его соли в композиции составляет от 1 нг до 20 мг, и фармацевтическая композиция имеет вязкость 1-10 мПа⋅с. Способ лечения рака, включающий введение в лимфатический узел пациента фармацевтической композиции, которая содержит по меньшей мере одно противораковое лекарственное средство, выбранное из группы, состоящей из 5-фторурацила, иринотекана, доцетаксела и их солей с фармацевтически приемлемыми неорганическими кислотами или органическими кислотами, где количество 5-фторурацила или его соли в композиции составляет от 1 нг до 100 мг, количество иринотекана или его соли и/или доцетаксела или его соли в композиции составляет от 1 нг до 20 мг, и фармацевтическая композиция имеет вязкость 1-10 мПа⋅с. Вышеописанные средства эффективны для лечения рака при введении в лимфатический узел пациента фармацевтической композиции, обеспечивают регрессию опухоли на 90% и более, при применении малой дозы средства. 4 н. и 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 7 табл., 4 пр.

1. Фармацевтическая композиция для лечения рака, предназначенная для введения в лимфатический узел, содержащая по меньшей мере одно противораковое лекарственное средство, выбранное из группы, состоящей из 5-фторурацила, иринотекана, доцетаксела и их солей с фармацевтически приемлемыми неорганическими кислотами или органическими кислотами, в качестве активного ингредиента, где количество 5-фторурацила или его соли в композиции составляет от 1 нг до 100 мг, количество иринотекана или его соли и/или доцетаксела или его соли в композиции составляет от 1 нг до 20 мг, и фармацевтическая композиция имеет вязкость 1-10 мПа⋅с.

2. Фармацевтическая композиция по п. 1, где лимфатический узел в качестве мишени для введения представляет собой лимфатический узел, подлежащий терапевтическому или профилактическому лечению, или лимфатический узел, расположенный выше в лимфатической сети, к которой принадлежит лимфатический узел.

3. Применение по меньшей мере одного противоракового лекарственного средства, выбранного из группы, состоящей из 5-фторурацила, иринотекана, доцетаксела и их солей с фармацевтически приемлемыми неорганическими кислотами или органическими кислотами, при изготовлении фармацевтической композиции для лечения рака, предназначенной для введения в лимфатический узел, где количество 5-фторурацила или его соли в композиции составляет от 1 нг до 100 мг, количество иринотекана или его соли и/или доцетаксела или его соли в композиции составляет от 1 нг до 20 мг, и фармацевтическая композиция имеет вязкость 1-10 мПа⋅с.

4. Применение фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере, одно противораковое лекарственное средство, выбранное из группы, состоящей из 5-фторурацила, иринотекана, доцетаксела и их солей с фармацевтически приемлемыми неорганическими кислотами или органическими кислотами, для лечения рака путем введения в лимфатический узел, где количество 5-фторурацила или его соли в композиции составляет от 1 нг до 100 мг, количество иринотекана или его соли и/или доцетаксела или его соли в композиции составляет от 1 нг до 20 мг, и фармацевтическая композиция имеет вязкость 1-10 мПа⋅с.

5. Способ лечения рака, включающий введение в лимфатический узел пациента фармацевтической композиции, которая содержит по меньшей мере одно противораковое лекарственное средство, выбранное из группы, состоящей из 5-фторурацила, иринотекана, доцетаксела и их солей с фармацевтически приемлемыми неорганическими кислотами или органическими кислотами, где количество 5-фторурацила или его соли в композиции составляет от 1 нг до 100 мг, количество иринотекана или его соли и/или доцетаксела или его соли в композиции составляет от 1 нг до 20 мг, и фармацевтическая композиция имеет вязкость 1-10 мПа⋅с.