КОМПОЗИЦИИ ПОЛИСАХАРИДОВ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ТКАНЕЙ Российский патент 2021 года по МПК A61K31/722 A61K31/728 A61P17/02 A61P19/00 A61P19/02 A61P19/04 

Область техники

В настоящем изобретении предложены композиции полисахаридов, содержащие водорастворимую смесь полисахаридов, подходящие в качестве модуляторов процессов клеточной пролиферации, а также их применение при восстановлении тканей за счет подавления фибротического процесса. Указанные свойства модулирования можно специально использовать при восстановлении тканей и для предотвращения фиброза и/или образования спаек тканей.

Уровень техники

Внеклеточный матрикс представляет собой динамичную совокупность молекул, взаимодействующих друг с другом, и играет ключевую роль в регуляции и модулировании клеточных функций при процессах восстановления ткани. В таких процессах восстановления после травм различной этиологии происходит последовательность событий, затрагивающая клетки разных типов, от макрофагов до клеток сосудистого эндотелия и до фибробластов, которые окружены внеклеточным матриксом, состоящим из множества компонентов, таких как фибронектин, коллаген, протеогликаны и гликозаминогликаны (например, гиалуроновая кислота), которые осуществляют многие функции клеточной регуляции. Коллаген известен как самый распространенный компонент внеклеточного матрикса. Клетки соединительной ткани, такие как фибробласты и синовиоциты, представляют собой клетки, участвующие, в частности, в ремоделировании ткани, необходимом для ее восстановления, и, следовательно, преимущественно в синтезе и расщеплении белков внеклеточного матрикса, среди которых преобладает коллаген I типа и II типа. Их функциональная регуляция на данной стадии, по-видимому, является принципиально важной, поскольку если указанный синтез является избыточным и не сбалансирован обратными процессами расщепления коллагена, то выработка коллагена указанными клетками приводит к образованию фиброзных тканей. Фиброз, главным образом, представляет собой избыточное отложение компонентов клеточного матрикса с патологическими последствиями для структуры ткани и ее функций (Mutsaers SE et al., Int J Biochem Cell Biol, 1997, 29, 5-17). При восстановлении ткани, например, после хирургического вмешательства, необходимо воздействовать и на фазу репарации путем ускорения клеточной пролиферации и миграции, и на ремоделирование ткани посредством предотвращения избыточного отложения внеклеточного матрикса, особенно коллагена, для предотвращения фибротических процессов, лежащих в основе образования спаек тканей и гипертрофированных рубцов. К молекулам, формирующим внеклеточный матрикс, относятся гликозаминогликаны, которые, как известно, участвуют во многих нормальных и патологических биологических процессах в клетках, участвующих в восстановлении ткани. Такие биологические процессы включают: миграцию, адгезию, дифференцировку и пролиферацию.

Гликозаминогликаны представляют собой неразветвленные биополимеры, состоящие из повторяющихся дисахаридных звеньев с высокой гидрофильностью, и в физиологических условиях они ведут себя как полианионы вследствие наличия карбоксильных групп или сульфатов на сахаридных остатках. Это позволяет им принимать конформации, подходящие для образования устойчивых к сжатию матриц с высоковязкими и/или вязкоупругими реологическими свойствами. Простейшим из таких биополимеров является гиалуроновая кислота (также известная как гиалуронат натрия или НА), состоящая из повторяющихся звеньев N-ацетилглюкозамина и глюкуроновой кислоты. Ее молекулярная масса может составлять от 400 дальтон (дисахарид) до более 10 миллионов дальтон, и она присутствует во многих тканях и физиологических жидкостях млекопитающих, таких как дермальный слой кожи, хрящи суставов, эндобульбарные жидкости глаза, где она является важнейшим элементом для организации других молекул и, следовательно, также для формирования внеклеточного матрикса. Кроме того, в соединительной ткани гидратация, связанная с гиалуроновой кислотой, обеспечивает образование подходящей среды для клеточной подвижности и пролиферации.

Также известно, что гиалуроновая кислота, как эндогенный биополимер, вовлечена в процесс в клеточной подвижности и адгезии, опосредованной поверхностным рецептором RHAMM (рецептором для подвижности, опосредованной гиалуронаном), а также трансмембранным рецептором CD44. Таким образом, на основании представленного выше краткого описания, понятно, что гиалуроновая кислота играет ключевую роль в биологических процессах, связанных с восстановлением ткани (Jiang D, Liang J, Noble PW, Annu Rev. Cell Dev Biol, 2007, 23, 435-61).

Исключительные физические и биологические функции, наряду с высокой биосовместимостью и биоразлагаемостью под действием эндогенной гиалуронидазы, обусловили широкое применение указанного биополимера в косметических препаратах, офтальмологии, ревматологии, для транспорта активных ингредиентов, при восстановлении тканей и в технологии тканевой инженерии.

Важнейшим аспектом применения гиалуроновой кислоты является ее средняя молекулярная масса; фактически, гиалуроновая кислота представляет собой полимер, состоящий из фракций, имеющих различные молекулярные массы, и эта техническая особенность отвечает за ее физические свойства, которые, в свою очередь, критичны для биологических функций (ЕР 0138572; WO 2010/003797).

Вязкие и/или вязкоупругие свойства, в частности, легли в основу ее применения в препаратах для повышения вязкости синовиальной жидкости при костно-суставных заболеваниях, применения, в котором используют, прежде всего, фракции высокомолекулярной гиалуроновой кислоты (более 2000 кДа), те высокомолекулярные фракции, которые, помимо высокой вязкости, имеют высокий модуль вязкоупругости.

Помимо гиалуроновой кислоты, для практического использования представляют интерес также другие полисахариды благодаря их биосовместимости и относительно широкой доступности, такие как хитозан, который является биополимером, представляющим особый интерес. По факту, хитозан представляет собой полисахарид, широко распространенный в природе, который можно получить химическим деацетилированием хитина, и он состоит, главным образом, из глюкозаминных звеньев и N-ацетилглюкозаминных звеньев, оставшихся в результате деацетилирования хитина. В отличие от гиалуроновой кислоты, он ведет себя как поликатион вследствие присутствия аминогрупп глюкозамина, полученного в результате деацетилирования хитина.

В настоящее время известно, что хитозан может участвовать в клеточной регуляции в соответствии с механизмами, которые все еще находятся в стадии изучения. Например, на коленном хряще крыс было показано, что хитозан может вызывать образование фиброзной ткани, пролиферацию хондроцитов и снижать уменьшение толщины эпифизарного хряща (Jian Xi Lu et al., 1999, 20, Biomaterials, 1937-1944).

Кроме того, гидрогели, образованные из полимера per se, не имеют биологической активности. Например, было показано, что поливинилпирролидон в комбинации с хитозаном имеет перспективную модулирующую активность в отношении различных типов клеток. В частности, было показано, что такие гидрогели могут подавлять рост и пролиферацию фибробластов, а также вызывать прикрепление и рост эпителиальных клеток. Однако следует отметить, что чистый хитозан может вызывать снижение роста эпителиальных клеток (Risbud М et al., J Biosci, 2000, 25, 25-31). Такой эффект подавления клеточного роста под действием хитозана также подтвержден в модели повреждения ахиллова сухожилия, где было показано, что хитозан может вызывать замедление роста фибробластов, действуя на процессы клеточной адгезии, что является существенным при послеоперационных последствиях указанных заболеваний (Qiang Chen et al, Int J Clin Exp Pathol, 2014, 7, 8462-8470).

Однако наибольшей проблемой применения хитозана является его низкая растворимость в воде, для чего необходим рН, равный или менее 5. Уменьшение рН приводит к протонированию аминогрупп глюкозаминных остатков, обеспечивая растворимость системы. Кроме того, в связи с его высоким положительным зарядом в водных растворах, он слабо совместим с полианионными полимерами, что приводит к образованию коацерватов с разделением фаз.

В связи с его широким применением, хитозан стал одним из наиболее изученных полисахаридов с химической точки зрения, с целью улучшения его полезных свойств для практических целей, в частности, его вязкости и растворимости в воде. В последние годы посредством химических модификаций полимерной цепи получены несколько производных хитозана. В целом, для осуществления таких модификаций используют реакции аминных остатков глюкозаминных звеньев. В частности, внедрение сахаридных звеньев (моно- и олигосахаридов) в боковую цепь обеспечивает возможность получения водорастворимых производных хитозана без необходимости снижения рН до кислотных значений, что, следовательно, позволяет избежать дальнейших проблем деградации полимера. Дериватизация хитозана боковыми сахаридными группами, например, посредством вставки лактозных звеньев, полученных по реакции восстановительного аминирования, описанная в патенте США 4,424,346 (Hall, L.D. и Yalpani, М.), обеспечивает более высокую растворимость производных указанного полисахарида в воде, и именно в таких дериватизованных формах хитозан имеет наиболее благоприятные свойства для применения в качестве биоматериала с высокой биосовместимостью. Кроме того, такая дериватизация улучшает совместимость хитозана в водных растворах с полианионными биополимерами, такими как альгиновая кислота и гиалуроновая кислота (ЕР 2021408). Было показано, что смеси указанных полимеров обеспечивают получение однородно диспергированных водных растворов без образования коацерватов, при этом указанные растворы характеризуются более высокой вязкостью и вязкоэластичностью, чем исходные полисахариды. Олигосахаридное производное хитозана, полученное функционализацией аминогруппы глюкозамина лактозой, также продемонстрировало перспективные свойства с биологической точки зрения. В частности, два производных с различной степенью функционализации, в отличие от немодифицированного хитозана, могут вызывать клеточную агрегацию хондроцитов и стимулировать выработку гликозаминогликанов и коллагена посредством взаимодействия с галектином-1 (Donati et al., Biomaterials, 2005, 26, 987-998; Marcon P. et al., 2005, 26, 4975-4984). Указанная активность также сохраняется при комбинировании олигосахаридного производного хитозана и лактозы в гидрогелях с анионными полисахаридами, такими как альгиновая кислота (Macleod Е. et al., J Biomed Mat Res Part A, 2007, DOI:10.1002/jbm.a31307).

В области восстановления тканей остро ощущается потребность в средствах, способных индуцировать сбалансированное восстановление поврежденных тканей без возникновения фибротических и/или спаечных процессов, и для удовлетворения указанной потребности долгое время изучают использование гиалуроновой кислоты благодаря ее вязкоупругим свойствам, отдельно или в комбинации с другими соединениями.

Например, в ЕР 059015 описаны композиции, содержащие клей на основе фибрина и фибриногена в комбинации с биоразлагаемыми и биосовместимыми полимерами, способными повышать вязкость композиций. Предпочтительно, указанные полимеры выбраны из протеогликанов и полисахаридов, включая гиалуроновую кислоту, и для целей указанного изобретения такие полимеры должны иметь высокую молекулярную массу. Таким образом, использовано только одно физическое свойство указанных полимеров, и такие полимеры фактически определены как «полимеры, увеличивающие вязкость». Этой концепции долго придерживались при получении композиций, подходящих для предотвращения спаек тканей. В этом отношении указанное исследование, направленное на разработку средств для восстановления тканей при подавлении фибротических процессов и спаек тканей, относится, главным образом, к разработке фракций высокомолекулярной гиалуроновой кислоты или ее производных, устойчивых к разложению, под действием эндогенной гиалуронидазы для усиления «барьерного эффекта», обусловленного высокой вязкостью композиций. В WO 97/07833 описаны биоматериалы, состоящие из эстерифицированных бензиловым спиртом или поперечно-сшитых производных гиалуроновой кислоты, в качестве альтернативы высокомолекулярным фракциям гиалуроновой кислоты и, следовательно, очень вязкие для применения при предотвращении послеоперационных спаек. Дериватизация гиалуроновой кислоты предназначена для повышения ее устойчивости к разложению и для оптимизации биоматериалов в форме гелей, мембран и тканей. Таким же образом, в ЕР 1207828 описаны гели, которые можно использовать в качестве противоспаечных барьеров, которые получают смешиванием пены поперечно-сшитых производных гиалуроновой кислоты и водных растворов гиалуроновой кислоты. Для получения такого геля описано применение гиалуроновой кислоты с молекулярной массой в диапазоне от 1000 кДа до 2000 кДа.

Однако для такого применения подходящим является и использование фракций высокомолекулярной гиалуроновой кислоты (например, от 3500 до 10000 кДа), описанное в недавней заявке на патент ЕР 2977460; и применение химически модифицированных гиалуроновых кислот и, в частности, гидрогелей, состоящих из структурно сложных производных гиалуроновой кислоты, в которых указанные гиалуроновые кислоты, имеющие молекулярную массу от 50 до 3500 кДа, связаны с биосовместимыми и биоразлагаемыми сложными полиэфирами с молекулярной массой от 3 до 900 кДа, как описано в WO 2012/014180.

Однако следует отметить, что вследствие сложности клеточных взаимодействий в процессах восстановления тканей, для их ускорения без инициации фибротических и/или спаечных процессов в тканях необходимо определить стратегию, которая бы не была основана лишь на «барьерном эффекте» высокомолекулярной гиалуроновой кислоты или ее производных, устойчивых к эндогенному разложению. Для удовлетворения указанной терапевтической потребности, продемонстрированной продолжительными исследованиями в данной области техники, возможно, более важно исследовать уникальные биологические свойства гиалуроновой кислоты и других биосовместимых полисахаридов для терапевтических целей, а также вмешаться в модулирование процессов пролиферации различных типов клеток, участвующих в восстановлении тканей.

Сущность изобретения

Задача настоящего изобретения заключается в обеспечении композиций для модулирования процессов клеточной пролиферации для применения при восстановлении тканей с подавлением фибротических процессов, используя биологические свойства полисахаридных биополимеров. Таким образом, объект настоящего изобретения представляют собой композиции полисахаридов, содержащие гиалуроновую кислоту и олигосахаридное производное хитозана и лактозы, полученное по реакции восстановительного аминирования D-глюкозамина, имеющее степень замещения его аминной функциональной группы лактозой по меньшей мере 40%, для применения при восстановлении тканей и при подавлении фиброза и/или спаек ткани посредством модулирования клеточной пролиферации. Как правило, гиалуроновая кислота в композиции полисахаридов, предложенной в настоящем изобретении, представляет собой матрицу, в которой однородно распределено олигосахаридное производное хитозана. В соответствии с некоторыми аспектами, композиции согласно настоящему изобретению предназначены для применения при восстановлении тканей и/или для предотвращения фиброза и/или спаек при травматических, послеоперационных и хронических воспалительных повреждениях ткани. Преимущества, достигаемые благодаря настоящему изобретению, станут лучше понятны специалистам в данной области техники на основании следующего подробного описания со ссылкой на следующие фигуры.

Краткое описание графических материалов

Фигура 1. На диаграмме представлены результаты, полученные для пролиферации фибробластов человека после инкубации в течение 24 часов, 3 и 6 дней с гиалуроновой кислотой (НА), Chitlac и гиалуроновой кислотой и Chitlac в различных концентрациях: (А) НА в концентрации от 0,1 до 1,25 мг/мл; (В) Chitlac в концентрации от 0,1 до 1,0 мг/мл; (С) НА в концентрации 1,25 и Chitlac в концентрации от 0,1 до 1,0 мг/мл.

Фигура 2. На диаграмме представлены результаты, полученные для пролиферации хондроцитов человека после инкубации в течение 24 часов, 3 и 6 дней с гиалуроновой кислотой (НА), Chitlac и гиалуроновой кислотой и Chitlac в различных концентрациях: (А) НА в концентрации от 0,25 до 1,25 мг/мл; (В) Chitlac в концентрации от 0,1 до 1,5 мг/мл; (С) НА в концентрации 0,5 мг/мл и Chitlac в концентрации от 0,1 до 1,5 мг/мл; (D) НА в концентрации 1,0 мг/мл и Chitlac в концентрации от 0,1 до 1,0 мг/мл; (Е) НА в концентрации 1,25 мг/мл и Chitlac в концентрации от 0,1 до 1,0 мг/мл.

Фигура 3. На диаграмме представлены результаты, полученные для пролиферации синовиоцитов человека после инкубации в течение 24 часов, 3 и 6 дней с гиалуроновой кислотой (НА), Chitlac и гиалуроновой кислотой и Chitlac в различных концентрациях: (А) НА в концентрации от 0,25 до 1,25 мг/мл; (В) Chitlac в концентрации от 0,1 до 1,5 мг/мл; (С) НА в концентрации 0,5 мг/мл и Chitlac в концентрации от 0,1 до 1,5 мг/мл; (D) НА в концентрации 1,0 мг/мл и Chitlac в концентрации от 0,1 до 1,0 мг/мл; (Е) НА в концентрации 1,25 мг/мл и Chitlac в концентрации от 0,1 до 1,0 мг/мл.

Фигура 4. На диаграмме представлены результаты, полученные в испытании царапания на дермальных фибробластах, обработанных гиалуроновой кислотой в концентрации 1 мг/мл, Chitlac в концентрации 0,75 мг/мл и их смесью (НА 1 мг/мл, Chitlac 0,75 мг/мл), через 0, 48 и 72 часа, для определения клеточной миграции в % (А) и смыкания разреза в мкм (В).

Подробное описание изобретения

Олигосахаридное производное хитозана, полученное восстановительным аминированием аминофункциональной группы D-глюкозамина лактозой, в композиции полисахаридов согласно настоящему изобретению, здесь и далее также упоминаемой как Chitlac, оценивали также in vitro на различных типах клеток из соединительной ткани, поскольку такие клетки больше всего участвуют в восстановлении и ремоделировании ткани после ее повреждения. Такие повреждения могут быть разного происхождения, и могут варьироваться от хирургических или травматических повреждений до повреждений вследствие хронических воспалительных процессов.

В in vitro экспериментах, результаты которых подробно описаны далее, указанное производное хитозана, замещенного лактозой (Chitlac), продемонстрировало перспективные биологические свойства в отношении пролиферации клеток разного происхождения.

В частности, на дермальных фибробластах и синовиоцитах, а также на хондроцитах человека показан дозозависимый эффект ингибирования клеточной пролиферации, который однако не влияет на жизнеспособность клеток.

Фактически, в указанных клетках Chitlac вызывает явное и существенное дозозависимое ингибирование клеточной пролиферации после инкубации в течение шести дней уже в концентрации 0,25 мг/мл. Этот эффект весьма заметен при более высоких концентрациях (0,75 и 1,0 мг/мл для фибробластов и 1,0 и 1,5 мг/мл для синовиоцитов и хондроцитов). Однако после инкубации в течение трех дней существенное влияние на фибробласты отсутствует, а действие более высоких концентраций на хондроциты и синовиоциты является существенным. Кроме того, нет существенного различия эффектов в концентрациях между 1,0 и 1,5 мг/мл. Таким образом, на основании анализа данных можно видеть, что Chitlac ингибирует клеточную пролиферацию хондроцитов и синовиоцитов после трех дней инкубации в концентрациях 1,0 и 1,25 мг/мл и после 6 дней инкубации уже в концентрации 0,25 мг/мл - на всех трех рассмотренных типах клеток. Таким образом, указанный эффект является не только дозозависимым, но и зависимым от времени. На основании полученных результатов очевидно, что Chitlac ингибирует клеточную пролиферацию клеток любого типа, то есть и клеток, участвующих в ремоделировании ткани с отложением коллагена, таких как фибробласты и синовиоциты, гиперактивность которых предшествует фибротическим процессам, и клеток, которые выполняют функцию при восстановлении поврежденной ткани, таких как хондроциты, которые, как известно, являются клетками, участвующими в образовании хряща сустава. В отличие от Chitlac, гиалуроновая кислота (здесь и далее также упоминаемая как НА) напротив продемонстрировала отсутствие существенного влияния на процессы клеточной пролиферации фибробластов и хондроцитов ни в одной использованной концентрации ни в одном рассмотренном периоде инкубации, за исключением ингибирующего эффекта уже в концентрации 0,75 мг/мл и существенного эффекта в максимальной концентрации (1,25 мг/мл) через шесть дней инкубации синовиоцитов. По-видимому, этот эффект не связан с барьерным эффектом гиалуроновой кислоты, поскольку использованная фракция НА имеет не слишком высокую молекулярную массу.

Однако для практического применения такой эффект на клеточную пролиферацию особенно важен при комбинировании указанных двух полисахаридов.

По факту, следует отметить, что: i) комбинация НА в концентрации 0,5 мг/мл существенно не влияет на ингибирующий эффект, оказываемый Chitlac, ни в одной испытанной концентрации ни через три дня, ни через шесть дней инкубации хондроцитов и синовиоцитов; и) комбинация НА в концентрации 1,0 мг/мл полностью препятствует ингибирующему эффекту Chitlac во всех концентрациях в испытании на хондроцитах и частично снижает ингибирующий эффект Chitlac в более высоких концентрациях в испытании на синовиоцитах; iii) комбинация НА в концентрации 1,25 мг/мл препятствует ингибирующему эффекту Chitlac в концентрациях от 0,1 до 0,75 мг/мл в испытании на хондроцитах, но не в максимальной концентрации Chitlac, и снижает эффект Chitlac, но не исключает его в испытании на синовиоцитах, тогда как в испытании на фибробластах она не ингибирует эффект Chitlac. Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что ингибирующий эффект Chitlac на пролиферацию клеток, участвующих в синтезе коллагена, таких как фибробласты и синовиоциты, не аннулируется действием гиалуроновой кислоты, хотя она может препятствовать ему в клетках, пролиферация которых предшествует восстановлению ткани. Также установлено, что эффект ингибирования клеточной пролиферации не изменяет физиологическую миграцию дермальных фибробластов, даже при использовании Chitlac в более высокой концентрации, когда эффект ингибирования пролиферации является более существенным. Таким образом, указанный процесс не оказывает негативного влияния на процесс восстановления ткани.

Не ограничиваясь какой-либо теорией, можно предположить, что указанные два полисахарида вмешиваются в процессы клеточного восстановления и ремоделирования по дифференцированным механизмам и, следовательно, их комбинирование приводит к такому модулированию процессов клеточной пролиферации, которое подходит для инициации восстановления ткани, предотвращая фибротические процессы вследствие сверхсинтеза коллагена. Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции полисахаридов, содержащей гиалуроновую кислоту и олигосахаридное производное хитозана и лактозы, полученное по реакции восстановительного аминирования D-глюкозамина, имеющее степень замещения его аминной функциональной группы лактозой по меньшей мере 40%, для применения при восстановлении тканей и при подавлении фибротических процессов посредством модулирования клеточной пролиферации.

Как известно, указанные два полисахарида имеют свойства хорошей растворимости в воде и совместимы друг с другом, поскольку их водные растворы при смешивании не образуют осадки в форме коацерватов, с разделением фаз вследствие взаимодействий между анионными группами гиалуроновой кислоты и катионными группами аминных остатков, все еще присутствующими в олигосахаридном производном, полученном из хитозана и лактозы (Chitlac). Напротив, они образуют композиции, в частности, растворы, характеризующиеся вязкостью и вязкоэластичностью, в которых гиалуроновая кислота является матрицей, в которой однородно распределено олигосахаридное производное Chitlac.

В некоторых вариантах реализации хитозан, используемый для получения олигосахаридного производного с лактозой (Chitlac), получают из различных природных источников (например, деацетилированием хитина) или ремкомбинантными технологическими способами, и он имеет среднюю молекулярную массу (здесь и далее упоминаемую как MW) до 1000 кДа. Средняя молекулярная масса исходного хитозана предпочтительно составляет от 500 кДа до 700 кДа, и более предпочтительно от 200 до 400 кДа. Такой хитозан предпочтительно имеет степень деацетилирования до 90%, и предпочтительно имеет степень остаточного ацетилирования от 10 до 20%.

Кроме того, для целей настоящего изобретения степень замещения аминогрупп D-глюкозамина в хитозане лактозой составляет по меньшей мере 40%. Предпочтительно, степень замещения аминогрупп хитозана таким олигосахаридом составляет от 50% до 70% и более предпочтительно 60%. Что касается гиалуроновой кислоты, указанный полисахарид также можно получать из различных природных источников или рекомбинантными технологическими способами посредством ферментации. Однако средняя молекулярная масса указанного полисахарида является существенной, и для целей настоящего изобретения она составляет не более 2000 кДа, и составляет от 1000 кДа до 1600 кДа, так что после стерилизации влажным теплом, способом, который, как известно, вызывает некоторое разложение биополимера, гиалуроновая кислота имеет молекулярную массу от 800 кДа до 1000 кДа.

Более важный аспект композиций полисахаридов, предложенных в настоящем изобретении, представляет собой содержание указанных двух полисахаридов, поскольку, согласно экспериментальным наблюдениям, их содержание оказывает существенное влияние на достижение задач настоящего изобретения.

В частности, гиалуроновая кислота в полисхаридных композициях, используемых для репаративных целей и для предотвращения фибротических процессов, содержится в концентрации от 10 до 20 мг/мл (1-2% мас./об.), а олигосахаридное производное Chitlac содержится в концентрации от 2,5 до 7,5 мг/мл (0,25-0,75% мас./об.). Предпочтительно, концентрация гиалуроновой кислоты составляет 10 мг/мл или 12,5 мг/мл, а концентрация Chitlac составляет от 2,5 до 7,5 мг/мл. В предпочтительном варианте реализации концентрация гиалуроновой кислоты составляет 10 мг/мл, а концентрация Chitlac может составлять от 2,5 до 5 мг/мл в зависимости от требуемого эффекта.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации, композиции согласно настоящему изобретению используют для ускорения восстановления ткани и/или для предотвращения фибротических процессов в областях травматических и послеоперационных повреждений ткани, а также хронических фибротических процессов, связанных с аутоиммунными заболеваниями. Такое применение предпочтительно направлено на восстановление ткани и предотвращение фибротических процессов, затрагивающих, главным образом, ткани, выбранные из дермы, абдоминальных эндотелиальных тканей, сухожилий и хрящей. В частности, одним из применений является применение при травматических и послеоперационных последствиях, затрагивающих дерму и абдоминальные ткани. Другие варианты применения представляют собой применение при послеоперационных последствиях в сухожилиях и хрящевых тканях, а также при фибротических процессах, связанных с аутоиммунными заболеваниями, поражающими дерму и хрящевые ткани, наиболее предпочтительно выбранными из псориаза и псориатического остеоартрита. В некоторых вариантах реализации композиции согласно настоящему изобретению используют в комбинации с другими ингредиентами и/или растворителями, подходящими для фармацевтического применения, для получения биоматериалов, подходящих для введения местным, интрадермальным или внутрисуставным способом в виде растворов, нетканых материалов, мембран, гидрогелей или препаратов, получаемых лиофилизацией.

ПРИМЕРЫ

Экспериментальные испытания, описанные в приведенных ниже примерах, проводили с использованием следующих полисахаридов: Гиалуроновая кислота (НА): 1-1,6 МДа (1000-1600 кДа) соответствующей фармацевтической марки для внутрисуставного и внутриглазного введения, полученная биоферментацией;

Chitlac гидрохлорид (CTL): Chitlac гидрохлорид получали добавлением водного раствора хлористоводородной кислоты к раствору Chitlac в воде до достижения рН 2,5. Затем соль полимера осаждали метанолом, фильтровали на спеченном стеклянном фильтре (Gooch) и промывали собранное твердое вещество метанолом (3х), и сушили. Chitlac, использованный для получения соли, характеризуется степенью замещения лактозой от 50 до 70%, и его получали из хитозана размером 200-400 кДа со степенью остаточного ацетилирования примерно 15%.

Получали исходные растворы полисахарида с известным титром, используя воду для инъекционных растворов, как описано ниже.

Гиалуроновая кислота 1% в PBS 1Х: 800 мг гиалуроновой кислоты растворяли в 72 мл воды для инъекционных препаратов. В полученный таким образом раствор добавляли 8 мл 10Х фосфатно-солевого буфера (PBS 10Х: NaCl 1370 мМ, KCI 27 мМ, Na₂HPO₄ 81 мМ, NaH₂PO₄ 17,6 мМ), а затем стерилизовали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут (ЕР 5.1.1).

Chitlac 1% в PBS 1Х: 800 мг Chitlac гидрохлорида растворяли в 69,04 мл воды для инъекционных растворов, и в полученный раствор по каплям добавляли 2,96 мл 0,5 М МаОН. Затем в полученный раствор добавляли 8 мл 10Х фосфатно-солевого буфера (PBS 10Х: NaCl 1370 мМ, KCI 27 мМ, Na₂HPO₄ 81 мМ, NaH₂PO₄ 17,6 мМ), а затем стерилизовали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут (ЕР 5.1.1).

Пример 1: анализ пролиферации дермальных фибробластов человека Фибробласты человека выделяли из образцов кожи здорового донора (57-62 года), перенесшего пластическую хирургию.

Вкратце, кожу помещали на 1 час в стерильный PBS с 3% пенициллина и стрептомицина для разрушения бактериальной массы. Затем образцы разрезали на небольшие кусочки и помещали в раствор диспазы II (2,5 мг/мл HBSS, сбалансированный солевой раствор Хэнкса) на 4 часа при 37°С, в результате чего эпителий отслаивался от подлежащей дермы. Фрагменты дермы расщепляли с помощью коллагеназы I (80 ед./мл в HBSS) в течение 12 часов в инкубаторе при 37°С с процентным содержанием CO2 5%. Расщепление блокировали средой Игла в модификации Дульбекко (DMEM), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FCS), 4 мМ глутамина, 100 МЕ/мл пенициллина/стрептавидина, и фильтровали суспензию, и центрифугировали при 1200 об./мин. Фибробласты, присутствующие в осадке после центрифугирования, повторно суспендировали в полной среде DMEM и высевали на стерильные культуральные планшеты в инкубаторе при 37°С, с процентным содержанием СО₂ 5% и относительной влажностью 90%. Фенотип клеток подтверждали, наблюдая форму клеток в инвертированном оптическом микроскопе, а также иммуноцитохимическим анализом пролил-4-гидроксилазы. Среду меняли каждые два дня и отделяли конфлюэнтные культуры от дна планшета с помощью 0,05% раствора трипсина и 0,02% ЭДТК, а затем разделяли 1:3. Для экспериментов использовали клетки из третьего-пятого пересева.

Фибробласты высевали в концентрации 2500 клеток на лунку в 48-луночный планшет. На следующей день после посева клетки обрабатывали исследуемыми веществами в следующих концентрациях: гиалуроновая кислота (НА) от 0,1 до 1,25 мг/мл; Chitlac (CTL) от 0,1 до 1,0 мг/мл; смесь НА и CTL, состоящая из фиксированной концентрации 1,25 мг/мл НА и увеличивающихся количеств CTL (от 0,1 до 1,0 мг/мл). Каждые два дня обновляли среду с исследуемыми веществами.

Эффект такой обработки на жизнеспособность клеток анализировали через 1 день, 3 дня, 6 дней анализом с МТТ, (4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромидом, в соответствии со способом, описанным Denizot и Lang (Denizot et al., J Immunol Meth, 1986, 89, 271-277). В данном анализе измеряют активность сукцинатдегидрогеназы, присутствующей в митохондриях клетки, и анализ основан на восстановлении (4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида до нерастворимых солей формазона. Количество образовавшихся солей формазона определяют спектрофотометрически, и оно пропорционально количеству фермента и, следовательно, косвенно пропорционально количеству живых клеток. Вкратце, после удаления культуральной среды, монослои клеток промывали PBS и добавляли раствор МТТ на 3 часа при 37°С. По окончании инкубации МТТ удаляли и заменяли экстракционным раствором (90% изопропанола, 10% ДМСО) на 15 минут при 37°С. Измерение поглощения проводили на спектрофотометре при 570 нм.

Статистический анализ проводили двухсторонним критерием Стьюдента, и расхождения значений критерия Стьюдента <0,05 считали значимыми.

Начинали трехкратные эксперименты и проводили их три раза.

На Фиг. 1А и в Таблице 1А представлены результаты, полученные для клеточной пролиферации с гиалуроновой кислотой в указанных концентрациях.

На Фиг. 1В и в Таблице 1В представлены результаты, полученные для клеточной пролиферации с Chitlac в указанных концентрациях.

На Фиг. 1С и в Таблице 1С представлены результаты, полученные для клеточной пролиферации с гиалуроновой кислотой в концентрации 1,25 мг/мл и Chitlac в концентрациях, увеличивающихся с 0,1 до 1,0 мг/мл, в указанных концентрациях.

Пример 2: Анализ пролиферации хондроцитов суставного хряща Хондроциты человека выделяли посредством биопсии хряща у пациентов, перенесших операцию по замене коленного хряща.

Биопсийный образец разрезали на мелкие кусочки, затем переносили в 0,25% раствор трипсина на 15 минут при 37°С. По окончании указанного периода хрящ переносили в 300 ед./мл раствор коллагеназы I на 12 часов в инкубаторе при 37°С с процентной концентрацией CO2 5%. После фильтрации раствор центрифугировали при 1200 об./мин. и повторно суспендировали клеточный осадок в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FCS), 4 мМ глутамина, 100 МЕ/мл пенициллина/стрептавидина в присутствии 500 мг/мл аскорбиновой кислоты. Клетки выдерживали в культуре, заменяя среду каждые два дня. При слиянии клетки отделяли от дна культурального планшета с помощью 0,05% раствора трипсина и 0,02% ЭДТК, разделяли 1:3 и использовали для экспериментов клетки со второй и третьей стадии.

Хондроциты высевали в концентрации 3000 клеток на лунку в 48-луночный планшет. На следующей день после посева клетки обрабатывали исследуемыми веществами в следующих концентрациях: CTL от 0,1 до 1,5 мг/мл; НА от 0,1 до 1,25 мг/мл; смесь НА и CTL, состоящая из фиксированной концентрации НА (0,5 мг/мл, 1 мг/мл или 1,25 мг/мл) и переменных количеств CTL. Каждые два дня обновляли среду с исследуемыми веществами. Эффект такой обработки на жизнеспособность клеток анализировали через 1 день, 3 дня, 6 дней анализом с МТТ, (4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромидом, в соответствии со способом, описанным Denizot и Lang, как в предыдущем примере.

Вкратце, после удаления культуральной среды, монослои клеток промывали PBS и добавляли раствор МТТ на 3 часа при 37°С. По окончании инкубации МТТ удаляли и заменяли экстракционным раствором (90% изопропанола, 10% ДМСО) на 15 минут при 37°С. Измерение поглощения проводили на спектрофотометре при 570 нм.

Статистический анализ проводили двухсторонним критерием Стьюдента, и расхождения значений критерия Стьюдента <0,05 считали значимыми. Начинали трехкратные эксперименты и проводили их три раза. На Фиг. 2А и в Таблице 2А представлены результаты, полученные для клеточной пролиферации после инкубации и через 1, 3 и 6 дней с применением гиалуроновой кислоты в указанных концентрациях.

На Фиг. 2В и в Таблице 2В представлены результаты, полученные для клеточной пролиферации с Chitlac в указанных концентрациях.

На Фиг. 2С и в Таблице 2С представлены результаты, полученные для клеточной пролиферации с гиалуроновой кислотой в концентрации 0,5 мг/мл и Chitlac в концентрациях, увеличивающихся с 0,1 до 1,5 мг/мл, в указанных концентрациях.

На Фиг. 2D и в Таблице 2D представлены результаты, полученные для клеточной пролиферации с гиалуроновой кислотой в концентрации 1,0 мг/мл и Chitlac в концентрациях, увеличивающихся с 0,1 до 1,0 мг/мл, в указанных концентрациях.

На Фиг. 2Е и в Таблице 2Е представлены результаты, полученные для клеточной пролиферации с гиалуроновой кислотой в концентрации 1,25 мг/мл и Chitlac в концентрациях, увеличивающихся с 0,1 до 1,0 мг/мл, в указанных концентрациях.

Пример 3: анализ пролиферации синовиоцитов из синовиальной жидкости человека

Синовиоциты человека получали из синовиальной жидкости пациентов, перенесших операцию по восстановлению связок.

Клетки экстрагировали, обрабатывая первым раствором коллагеназы I с концентрацией 40 ед./мл в течение 12 часов в инкубаторе при 37°С с процентным содержанием СО₂ 5% и влажностью 90%. Действие фермента блокировали добавлением полной среды DMEM, фильтровали и центрифугировали раствор при 1200 об./мин. Клеточный осадок повторно суспендировали в DMEM с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 4 мМ глутамина, 100 МЕ/мл пенициллина/стрептавидина и высевали на стерильные культуральные планшеты в инкубаторе при 37°С с 5% СО₂ и относительной влажностью 90%. Фенотип клеток подтверждали морфологическим анализом с оптической микроскопией, а также иммуноцитохимическим анализом пролил-4-гидроксилазы. Среду меняли каждые два дня, и конфлюэнтные культуры отделяли с помощью 0,05% раствора трипсина и 0,02% ЭДТК, и пересевали в новые планшеты, деля их 1:3. Для экспериментов использовали клетки из четвертого-шестого пересева. Синовиоциты высевали в концентрации 3000 клеток на лунку в 48-луночный планшет. На следующей день после посева клетки обрабатывали исследуемыми веществами в следующих концентрациях: CTL от 0,1 до 1 мг/мл; НА от 0,1 до 1,25 мг/мл; смесь НА и CTL, состоящая из фиксированной концентрации НА (0,5 мг/мл, 1 мг/мл или 1,25 мг/мл) и переменных количеств CTL. Каждые два дня обновляли среду с исследуемыми веществами.

Эффект такой обработки на жизнеспособность клеток анализировали через 1 день, 3 дня, 6 дней анализом с МТТ, (4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромидом, в соответствии со способом, описанным Denizot и Lang, как описано в примере 1.

Вкратце, после удаления культуральной среды, монослои клеток промывали PBS и добавляли раствор МТТ на 3 часа при 37°С. По окончании инкубации МТТ удаляли и заменяли экстракционным раствором (90% изопропанола, 10% ДМСО) на 15 минут при 37°С. Измерение поглощения проводили на спектрофотометре при 570 нм.

Статистический анализ проводили двухсторонним критерием Стьюдента, и расхождения значений критерия Стьюдента <0,05 считали значимыми.

Начинали трехкратные эксперименты и проводили их три раза.

На Фиг. 3А и в Таблице 3А представлены результаты, полученные для клеточной пролиферации с гиалуроновой кислотой в указанных концентрациях.

На Фиг. 3В и в Таблице 3В представлены результаты, полученные для клеточной пролиферации с Chitlac в указанных концентрациях.

На Фиг. 3С и в Таблице 3С представлены результаты, полученные для клеточной пролиферации с гиалуроновой кислотой в концентрации 0,5 мг/мл и Chitlac в концентрациях, увеличивающихся с 0,1 до 1,5 мг/мл, в указанных концентрациях.

На Фиг. 3D и в Таблице 3D представлены результаты, полученные для клеточной пролиферации с гиалуроновой кислотой в концентрации 1,0 мг/мл и Chitlac в увеличивающихся концентрациях, в соответствии с указанными концентрациями.

На Фиг. 3Е и в Таблице 3Е представлены результаты, полученные для клеточной пролиферации с гиалуроновой кислотой в концентрации 1,25 мг/мл и Chitlac в увеличивающихся концентрациях, в соответствии с указанными концентрациями.

Пример 4: анализ миграции дермальных фибробластов in vitro - испытание царапания

Влияние обработки НА и CTL на скорость миграции и пролиферации выращенных фибробластов оценивали на клетках, полученных так, как описано в Примере 1, и доводили их до полуслияния в 6-луночных культуральных планшетах. Клеточный монослой разрезали для его разделения на две части, а затем обрабатывали только исследуемыми веществами (НА в концентрации 1 мг/мл; CTL в концентрации 0,75 мг/мл) или смесью 1 мг/мл НА и CTL в концентрации 0,75 мг/мл. Смыкание разреза, созданного в клеточном монослое, наблюдали в оптический микроскоп через 48 и 72 часа после обработки. Начинали трехкратные эксперименты и проводили их три раза.

Полученные результаты представлены на Фиг. 4А в % скорости клеточной миграции в зависимости от времени, а на Фиг. 4В результаты представлены в мкм смыкания разреза в зависимости от времени через 48 и 72 часа.

Изобретение относится к области фармакологии и медицины, а именно к модуляции процессов клеточной пролиферации. Описано применение композиции полисахаридов, содержащей гиалуроновую кислоту и олигосахаридное производное хитозана, полученное в реакции восстановительного аминирования D-глюкозамина лактозой, которое имеет степень замещения аминной функциональной группы D-глюкозамина лактозой по меньшей мере 40%, для модулирования пролиферации клеток, которая приводит к восстановлению тканей и/или предотвращению фиброза и/или спаек ткани, при этом указанная гиалуроновая кислота присутствует в количестве 1,0 мг/мл или 1,25 мг/мл, и указанное олигосахаридное производное хитозана и лактозы присутствует в количестве от 0,1 до 1,5 мг/мл. Технический результат: обеспечение модуляции процессов клеточной пролиферации, что эффективно используется при восстановлении тканей для предотвращения фибротических процессов и/или образования спаек тканей при травматических, послеоперационных и хронических фибротических процессах, связанных с аутоиммунными заболеваниями. 12 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 табл., 4 пр.

1. Применение композиции полисахаридов, содержащей гиалуроновую кислоту и олигосахаридное производное хитозана, полученное в реакции восстановительного аминирования D-глюкозамина лактозой, которое имеет степень замещения аминной функциональной группы D-глюкозамина лактозой по меньшей мере 40%, для модулирования пролиферации клеток, которая приводит к восстановлению тканей и/или предотвращению фиброза и/или спаек ткани, при этом указанная гиалуроновая кислота присутствует в количестве 1,0 мг/мл или 1,25 мг/мл, и указанное олигосахаридное производное хитозана и лактозы присутствует в количестве от 0,1 до 1,5 мг/мл.

2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что гиалуроновая кислота представляет собой матрицу, в которой однородно распределено указанное олигосахаридное производное хитозана и лактозы.

3. Применение по п. 1, отличающееся тем, что указанное олигосахаридное производное хитозана и лактозы составляет не более 0,75% по массе.

4. Применение по п. 1, отличающееся тем, что указанное олигосахаридное производное хитозана и лактозы составляет 0,25% по массе, или 0,5% по массе, или 0,75% по массе.

5. Применение по п. 1, отличающееся тем, что указанная гиалуроновая кислота имеет среднюю молекулярную массу от 1000 до 1600 кДа, или от 800 до 1000 кДа.

6. Применение по п. 1, отличающееся тем, что хитозан в указанном олигосахаридном производном с лактозой имеет среднюю молекулярную массу от 500 до 600 кДа, или от 200 до 400 кДа.

7. Применение по п. 1, отличающееся тем, что указанное олигосахаридное производное хитозана и лактозы имеет степень замещения в диапазоне от 50 до 70%.

8. Применение по любому из пп. 1-7, отличающееся тем, что указанное олигосахаридное производное хитозана и лактозы представляет собой соль гидрохлорида.

9. Применение по п. 1, отличающееся тем, что указанное применение представляет собой применение при травматических и/или послеоперационных процессах в ткани и/или при хронических фибротических процессах, связанных с аутоиммунными заболеваниями.

10. Применение по п. 9, отличающееся тем, что указанное применение представляет собой применение при травматических и послеоперационных последствиях, затрагивающих дерму и абдоминальные ткани.

11. Применение по п. 9, отличающееся тем, что указанное применение представляет собой применение при послеоперационных последствиях в тканях сухожилия и/или хряща.

12. Применение по п. 9, отличающееся тем, что указанное применение представляет собой применение при фибротических процессах, связанных с аутоиммунными заболеваниями, поражающими дерму и/или ткани хряща.

13. Применение по п. 12, отличающееся тем, что указанные аутоиммунные заболевания выбраны из псориаза и псориатического остеоартрита.