БЕСКЛЕТОЧНЫЙ ТРАНСПЛАНТАТ Российский патент 2010 года по МПК A61L27/36 A61F2/08 A61F2/28 A61F2/30 

Настоящее изобретение относится к бесклеточному трансплантату для регенерации ткани, и в частности для регенерации хряща, к способу его изготовления и к применению трансплантата для регенерации ткани.

Уровень техники

Хрящ - это вид мезодермальной ткани, производной от соединительной ткани, происходящей от мультипотенциальных, недифференцированных мезенхимальных первичных клеток. Различают три типа хрящей: гиалиновый, эластичный и волокнистый. Гиалиновый хрящ является наиболее распространенным видом хряща, и его находят, например, в суставных поверхностях. Дефекты хряща в результате износа или повреждения являются широко распространеннной проблемой медицины. Из-за отстраненности хряща от классической системы воспалительных и восстановительных процессов в организме его способность к самоизлечению является минимальной. Соответственно в прошлые годы, а также в последнее время разрабатывались методы и технологии с целью замены хрящевых или даже костно-хрящевых участков суставного хряща. Так, например, в качестве заменителя суставного хряща использовались надкостница, надхрящница, аллогенные и аутогенные костно-хрящевые трансплантаты, аллогенные мениски и даже протезы из искусственных материалов.

При аналогичной трансплантации хондроциты, изъятые у пациента, размножаются в культуре клеток и возвращаются пациенту. Возвращение происходит в виде самых различных трансплантатов. Примерами этого являются растворы для инъекций, осуществляемых в сустав, матрицы с привитыми хрящевыми клетками и т.п.

В WO 97/15655 описаны, например, искусственные ткани, состоящие из трехмерных экстраклеточных матриц и матриц, полученных с помощью генной инженерии, причем матрицы могут приводить в действие иммуносупрессивные факторы или факторы клеточной дифференции. Предпочтительно речь идет о матрицах в виде полимерных волокон, по которым распределяется клеточная суспензия, которая может приготавливаться в виде фибринородного раствора. Кроме того, к матрице могут присоединяться факторы и компоненты соответствующей экстраклеточной матрицы, стимулирующие процесс роста и/или дифференцировки. Для удержания клеток в матрице и для получения готового трансплантата клеточная субстанция может закрепляться за счет добавления тромбина.

В патенте DE 44 31 598 описан способ изготовления имплантата из культур клеток, при котором трехмерные структуры-носители, присоединенные к клеткам, сначала обволакиваются, а затем перфундируют в питательный раствор. В структуры-носители вводятся усвоенные микрочастицы, которые в процессе ресорбции дают свободу действия факторам, способствующим образованию ткани.

В патенте DE 43 06 661 описана трехмерная структура-носитель, предпочтительно из полимерных волокон, в которую включаются клетки. Затем для стимулирования роста клеток и для образования их них экстраклеточной матрицы структура-носитель перфундирует в питательный раствор. Для предотвращения выхода или вымывания клеток структура-носитель обволакивается агарозой.

Кроме того, из патента DE 101 39 783 известно приготовление мезенхимальных клеток из синовиальной жидкости. Этот состав при желании может быть нанесен на носитель в виде волокон или пластмассы и таким образом использоваться в качестве трансплантата. В других случаях в качестве трансплантата в соответствующий сустав впрыскивается суспензия клеток из синовиальной жидкости.

В порядке альтернативы синтезируются матричные структуры, которые сами не содержат никаких клеток. Так, например, в патенте США US 2003/0003153 описаны армированные матричные мембраны, содержащие один или несколько скелетных протеинов, пригодных для роста клеток. Соответствующими протеинами являются, например, коллагены. Полученным матрицам в виде мембран могут прививаться клетки, и они как таковые могут трансплантироваться. В последнем случае исходят из того, что клетки из гомологической ткани мигрируют в матричную структуру. Для этого применяется, например, сверление отверстий или микропереломы. При этих технологиях проделываются небольшие отверстия или делаются переломы в костях суставов вплоть до костного мозга. Через отверстия происходит кровенаполнение дефекта, благодаря чему в дефекте образуется тромб. В этом тромбе оказываются мезенхимальные первичные клетки, которые с помощью соответствующих раздражителей могут оказывать стимулирующее воздействие на образование хрящевидной замещающей ткани, так называемого волокнистого хряща. Если над отверстием появляется материал матрицы, клетки крови могут мигрировать в этот материал и заселять его.

В патенте DE 199 57 388 и в издании WO 2005/014027 используют этот эффект и усиливают его за счет действия в матричной структуре в качестве рекрутирующего средства факторов роста и дифференцировки (патент DE 199 57 388) или хемокинов (WO 2005/014027). Все эти факторы должны способствовать активизации рекрутирования хрящеобразующих мезенхимальных первичных клеток, благодаря чему в конечном счете должно достигаться ускорение регенерации хряща.

Наконец, из WO 02/00272 известна возможность изготовления соответствующих трансплантатов из крови и полимерного компонента. В основе этой публикации лежит проблема, связанная с тем, что тромб, обычно возникающий при появлении отверстия, при свертывании крови уменьшается в объеме и тем самым изменяет форму. Добавленный полимер препятствует этому изменению формы и тем самым способствует заживлению при сохранении надлежащей формы. Для изготовления трансплантата полимер смешивается с кровью или с ее компонентами, такими как: эритроциты, лейкоциты, моноциты, тромбоциды, фибриногены, тромбин и плазма, обогащенная тромбоцидами, и вводится в дефект. Однако при использовании компонента крови для достижения желательного эффекта существенно присутствие вещества, способствующего свертыванию крови.

В качестве альтернативы могут быть использованы трансплантаты из хитозана и хондроцитов. Поскольку в этом случае клетки, как описано выше, вводятся в дефект заранее, от растворов Локка и/или факторов роста и дифференцировки можно отказаться.

Вышеописанные технологии имеют тот недостаток, что в том случае, если трансплантат сам содержит клетки, последние зачастую могут быть повреждены в результате манипуляций при обращении с ними, а трансплантат при использовании клеток, в частности аутологичных клеток, нуждается в длительном процессе культивирования и требует строгого контроля на предмет контаминации, и, наконец, он не может храниться долго. Параллельно с этим пополнение мезенхимальных клеток у бесклеточных трансплантатов через просверленные отверстия с раствором Локка или без него оказалось недостаточным. Колонизация протекает медленно, участвует в ней небольшое количество клеток, и к тому же она является неспецифической. Это значит, что с кровью, вытекающей из просверленных отверстий, в трансплантат заносятся различные типы клеток, которые остаются там. Однако желательной является колонизация только за счет мезенхимальных первичных клеток, дифференцирующихся в хондроциты, но при обычных трансплантатах это не гарантировано.

Поэтому задачей данного изобретения, помимо всего прочего, является получение трансплантата, простого в изготовлении, долго хранящегося и удобного в применении. Кроме того, хотелось бы увеличить скорость пополнения трансплантата, добиться лучшей избирательности в отношении вида пополняемых или содержащихся в трансплантате клеток, а также отказаться от применения чужеродных клеток, и особенно от факторов-рекомбинантов роста, представляющих собой потенциальные аллергены.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение решает эти и другие проблемы, известные из уровня техники. Для этого предложен бесклеточный трансплантат, содержащий (i) взаимосвязанную, образующую каркас матрицу с открытой пористостью из биологически и фармацевтически пригодного материала и (ii) сыворотку крови человека. В соответствии с особенно предпочтительным вариантом выполнения изобретения матрица содержит также гель.

Вторым аспектом является предложение способа изготовления такого бесклеточного трансплантата, в котором матрица и гель, если он содержится, контактируют с сывороткой крови человека. При необходимости трансплантат с сывороткой могут высушиваться. В качестве альтернативы матрица и гель, если он есть, могут быть представлены в сухом виде перед контактированием.

Наконец, третьим аспектом настоящего изобретения является использование бесклеточного трансплантата для регенерации ткани, и в частности для регенерации хряща и/или костей.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 изображает хемотактическое действие CDMP1, CDMP2, SDF-1-α и IL8 на мезенхимальные стволовые клетки человека in vitro;

фиг. 2 - хемотактическое действие сыворотки крови человека, на его мезенхимальные стволовые клетки in vitro.

Подробное описание изобретения

Данное изобретение относится, как описано выше, к бесклеточному трансплантату, содержащему (i) взаимосвязанную, образующую каркас матрицу с открытой пористостью из биологически и фармацевтически пригодного материала и (ii) сыворотку крови человека. Применение сыворотки в бесклеточном трансплантате согласно изобретению неожиданно обеспечивает повышение эффективности пополнения мезенхимальных первичных клеток из костного мозга, снабжаемого кровью, на несколько порядков. Это неожиданное увеличение эффективности пополнения опять же позволяет отказаться от отдельного введения дифференцированных или первичных клеток в сам трансплантат, что облегчает работу, упрощает изготовление трансплантата и сокращает сроки его изготовления, а также делает возможным его хранение.

Сыворотку крови обычным путем получают просто. Ее можно взять предпочтительно непосредственно при трансплантации у самого пациента. В результате пациенту можно реимплантировать аутологичный материал, и тогда необходимость в добавлении других потенциально аллергенных факторов и/или факторов активной иммунизации отпадает.

Матрица бесклеточного трансплантата представляет собой взаимосвязанную, образующую каркас матрицу с открытой пористостью. Под понятием «взаимосвязанную» подразумевается, что матрица позволяет обращаться с трансплантатом, не распадаясь при этом на отдельные или составные части. Нет необходимости в том, чтобы составные части матрицы были связаны друг с другом химическими связями или были связаны за счет действующих веществ. Достаточно механической связи, например, за счет ткани, валяния или скручивания.

Под понятием «образующая каркас» следует понимать свойство матрицы выступать в качестве структуры для образования тканевой матрицы мигрирующими клетками. Кроме того, матрица образует каркас или решетку, которые могут заселяться клетками и в которых они могут удерживаться для того, чтобы не оказаться вымытыми из матрицы, за счет, например, синовиальной жидкости или крови.

Наконец, под «открытой пористостью» в изобретении понимается, что промежутки между структурами каркаса матрицы являются доступными для обмена веществом между матрицей и окружением, в частности жидкостью. Предпочтительно размер пор рассчитывается с учетом возможности введения или намыва клеток. Однако под открытостью пор в изобретении подразумевается также структура типа геля. В этом случае за счет скелета образователей геля формируется каркасная структура матрицы. Между ними находятся гидратные оболочки и жидкость, в которые могут проникать клетки и с которыми возможен жидкостной обмен. Поэтому соответствующие структуры геля рассматриваются как матрицы с открытостью пор в смысле данного изобретения.

Каркасные структуры с открытой пористостью предпочтительно выбираются среди тканых и нетканых тканей (в частности, из волокнистых и войлочных структур), мембран, губок, ваты, пленки с открытыми ячейками, шерсти, плетения, упорядоченных и неупорядоченных пучков волокон, пористых керамических материалов, губчатой ткани и геля, а также из их комбинаций. Предпочтительно матрица имеет волокнистую или войлочную структуру. Комбинации различных структур, например в виде слоев, возможны и не выходят за рамки данного изобретения.

Материалом для матрицы в принципе может быть любой подходящий биологически и фармацевтически пригодный материал. Материал матрицы, применяемый в матрице согласно изобретению, может быть рассасывающимся или нерассасывающимся. Предпочтение отдается рассасывающимся материалам. Предпочтительно матрица содержит материал, выбранный из группы, состоящей из природных и искусственных полимеров, таких как: коллаген, гиалуроновая кислота, хитозан, хитин, полисахариды, целлюлозы и их производные, протеины, полипептиды, полигликолевая кислота, полимолочная кислота, полигликолид, полилактат, капролактон; керамических материалов, таких как: оксиды, карбиды, нитриды и карбонитриды металлов, в частности окиси кремния, титана и кальция; минералов, таких как: галогениды, в частности фториды, гидроокиси, фосфаты, сульфаты металлов, предпочтительно физиологически не вызывающие сомнений металлов, таких как: фосфат кальция, апатит, гидроксилапатит; металлов, таких как: титан, алюминий, золото, серебро, высококачественная сталь, и их смеси. Особо предпочтительными являются полигликолевая кислота (PGA), полимолочная кислота, коллаген или гиалуроновая кислота.

В качестве полигликолевых кислот предпочтительно используются чистые полигликолевые кислоты с молекулярным весом > 20000, предпочтительно 30000-70000 (г/моль), наиболее предпочтительно около 50000 (г/моль). В качестве материала матрицы может, например, использоваться волокно из полигликолевой кислоты, реализуемое «Alpha Research Switzerland GmbH» с торговой маркой «PGA-Soft Felt®». У этого продукта время рассасывания in vitro составляет около 40-50 дней. Через 7 дней in vitro механическая прочность в результате гидролиза составляет еще 50% исходной величины.

В одной из особенно предпочтительных форм бесклеточный трансплантат наряду с матрицей дополнительно содержит гель. Этот гель нанесен, по меньшей мере, на одну сторону матрицы и/или пронизывает ее, по меньшей мере, частично. Предпочтительно, когда гель пронизывает матрицу полностью. Если матрица включает такой гель, то сама матрица предпочтительно имеет другую структуру, нежели гель. Особенно предпочтительными являются жесткие структуры, которые перечислены выше, за исключением гелей. В соответствии с этим гель предпочтительно имеет большую жесткость, чем матрица. Наиболее предпочтительными являются структуры из нетканого материала (волокнистые структуры) и войлока, в которые введен гель.

Гель может быть природным или искусственным гидрогелем. Предпочтительно он имеет меньшую жесткость, чем матрица. Гель может быть выбран, например, из полисахаридов, полипептидов, гиалуроновой кислоты, фибрина, коллагена, альгината, агарозы и хитозана, а также из их солей, производных и их смесей. Соответствующими солями являются, например, щелочные и щелочноземельные соли указанных гелей. Как о наиболее предпочтительных речь может идти о гиалуроновой кислоте или о соли гиалуроновой кислоты, как например о гиалуронате натрия.

В качестве гиалуроновой кислоты могут быть использованы ферментативно изготовленные гиалуроновые кислоты. В порядке альтернативы возможно также использование гиалуроновой кислоты животного происхождения. Средний молекулярный вес используемых кислот составляет обычно 250-6000 (кДа), предпочтительно 1000 - 2000 (кДа), наиболее предпочтительным является молекулярный вес 1200 (кДа). Соответствующие продукты из гиалуроновой кислоты имеются в продаже. Подходящим продуктом является, например, класс гиалуроновых кислот, реализуемый акционерным обществом «TRB Chemedika AG» с торговой маркой «Ostenil®». Этот материал сертифицирован и поэтому пригоден в качестве лекарственного средства.

Гели могут быть получены вымачиванием, преципитацией или полимеризацией соответствующего формирователя геля в соответствующем растворе. Примером таких соответствующих растворов являются вода, а также водные растворы солей (например, щелочных и щелочноземельных галогенидов (Cl, Br, I и т.п.), карбонатов, фосфатов, цитратов, ацетатов и т.п.), органических кислот, буферных веществ и их смесей. В качестве альтернативы могут быть использованы более сложные растворы, такие как: культуральная среда или телесные жидкости, или производные от них растворы, такие как: синовиальная жидкость или сыворотка крови. Используемое количество формирователей геля рассчитано таким образом, чтобы получить соответствующую вязкость геля. Для гиалуроновой кислоты она обычно располагается в диапазоне 0,5-50 мг/мл, предпочтительно 0,5-20 мг/мл, наиболее предпочтительно составляет 10 мг/мл.

Наиболее предпочтительным является трансплантат из волокон или войлока PGA в качестве матрицы, в которую введен гель гиалуроновой кислоты.

Габариты бесклеточного трансплантата определяются в общем случае габаритами имеющегося дефекта или необходимыми размерами трансплантата. Размеры подгоняются по мере необходимости в соответствии с указанием лечащего врача. При повреждениях хрящевой ткани, в частности коленного сустава, эти размеры обычно располагаются в диапазоне 10-50 мм в длину, 10-50 мм в ширину и 0,5-3 мм в толщину, предпочтительно 10-30 мм в длину, 10-30 мм в ширину и 1-2 мм в толщину. Наиболее предпочтительными являются размеры 20х20 мм в ширину и в длину и 1,1-2 мм в толщину. Под соответствующие размеры подгоняются неквадратные формы, например прямоугольные, круглые, овальные, полиэдрические и т.д.

Комбинация матрицы и геля в бесклеточном трансплантате настоящего изобретения имеет то преимущество, что гель образует механический барьер против всех других клеток, кроме мезенхимальных первичных клеток крови, проникающей через отверстие или аналогичные переломы. Тем самым обеспечивается возможность селективной миграции мезенхимальных первичных клеток в трансплантат. Поэтому матрицу заселяют только они, дифференцируя в нужные клетки ткани. Благодаря этому чрезмерного разрастания других клеток в ущерб необходимым тканеобразующим клеткам не происходит, или оно существенно сокращается.

Вместе с тем гель стимулирует удерживание нужных клеток под механической нагрузкой до образования вокруг них естественной биоматрицы хряща. Это дает возможность пациенту раньше начать пользоваться трансплантатом после его установки.

Другой необходимой составной частью бесклеточного трансплантата согласно данному изобретению является сыворотка крови, обычно человеческой крови. Она может быть аутологичной, аллогенной или гетерогенной. Под сывороткой крови согласно изобретению понимают жидкую часть крови, остающуюся после свертывания последней. Сыворотка крови не содержит никаких кровяных клеток и в отличие от плазмы крови никакого фибриногена. Остальные составные части плазмы крови можно также найти в сыворотке крови. Это - жиры, жирные кислоты, глицерин, сахар, соли, металлы и протеины плазмы. Протеины плазмы включают, например, транспортные протеины, энзимы, проэнзимы, ингибиторы энзимов, дополнительную систему, иммунные протеины, медиаторы воспаления и т.п.

Сыворотка крови, применяемая согласно изобретению, может быть модифицирована путем добавления к ней по меньшей мере одной составной части и/или путем удаления из нее по меньшей мере одного из ее компонентов. В одной из предпочтительных форм выполнения изобретения речь идет о немодифицированной системе. Особенно предпочтительной является аутологичная сыворотка крови. Она может быть получена путем взятия крови у пациента с помощью обычных методов. Затем сыворотка, полученная таким образом, может быть введена в контакт с матрицей с помощью геля, если он есть, и тем самым введена в трансплантат лечащим врачом в случае необходимости непосредственно на месте трансплантации.

В качестве альтернативы речь идет о модифицированной сыворотке крови. Если модификация осуществляется путем добавления по меньшей мере одной составной части, последняя может быть предпочтительным образом выбрана из группы, включающей факторы роста, факторы дифференцировки (см. патент DE 199 57 388, используемый здесь в качестве ссылки), гормоны, цитокины, клеточные адгезионные молекулы, хемотактические факторы, включая хемокины, какими они описаны в WO 2005/014027, используемом в качестве ссылки, энзимы, ингибиторы энзимов, коэнзимы, минералы, жиры, липиды, сахариды, биологически активные лекарства, такие как: антибиотики, анальгетики, противовоспалительные средства и иммуносупрессоры, буферные вещества, стабилизаторы, в частности криостабилизаторы, и витамины, предпочтительно гормоны, хемокины, факторы роста и факторы дифференцировки, выбранные из инсулина PDGF, IGF, GMCSF, GDF5, GDF6, FGF, BMP2, BMP4, BMP7, IL8, SDF1-α и EGF. Наиболее предпочтительным является инсулин. Вместе с тем матрица и/или гель могут быть модифицированы путем введения вышеупомянутых составных частей или их смесей.

В качестве альтернативы определенные составные части, такие как: энзимы, иммунные протеины, проэнзимы, сахар и т.д., перед контактированием с матрицей могут быть удалены из сыворотки крови. Протеины или сахар могут быть удалены выборочно, например, с помощью аффинной хроматографии. Сыворотка крови может быть также разбавлена. Для этого сыворотку перемешивают с желательным количеством физиологически пригодной жидкости, такой как: цитратный буфер, РВS или похожей.

Вышеописанный бесклеточный трансплантат может быть изготовлен способом, при котором матрица и гель, если он есть, вводятся в контакт с сывороткой крови. Это контактирование может осуществляться путем накапывания, замачивания, пропитки. При наличии геля предпочтительно сначала ввести его в матрицу или нанести гель на нее, после чего осуществляется его контактирование с сывороткой крови. Если бесклеточный трансплантат содержит другие вышеуказанные составные части, то они могут быть введены только в матрицу, в гель или в сыворотку, или в некоторые из них одновременно.

Способ согласно изобретению должен включать этап сушки. Наличие этапа сушки имеет то преимущество, что трансплантат в сухом виде может дольше храниться. Если матрица и гель, при наличии последнего, перед контактированием с сывороткой крови высушиваются, то в результате контакта путем пропитки или замачивания эта структура может быть восстановлена и переведена в состояние готовности к употреблению. Если в качестве альтернативы высушивается структура из матрицы, геля, при наличии последнего, и сыворотки, то с помощью пропитки сывороткой или замачивания в ней или в каком-либо другом подходящем фармацевтически или биологически пригодном растворе, как описано выше при образовании геля, например в физиологическом растворе поваренной соли, эта структура также может быть восстановлена и переведена в состояние готовности к употреблению. Если же трансплантат содержит еще какие-либо составляющие, то они вместе с восстановленным раствором могут быть введены в готовый бесклеточный трансплантат. Это, в частности, может оказаться желательным, если в случае дополнительных составляющих речь идет о протеинах или неустойчивых кофакторах.

Для вышеупомянутых предпочтительных форм выполнения из волокон полигликолевой кислоты с гелем гиалуроновой кислоты при размерах волокон 20 мм×20 мм×1,1 мм в материал вводят 400 мкл раствора гиалуроновой кислоты (10 мг/мл) в физиологически подходящем растворе или уже с сывороткой крови. При размерах волокон 20×20×2 мм используется 730 мкл раствора гиалуроновой кислоты. Если трансплантаты таких размеров сушатся, например, путем лиофилизации, они могут восстанавливаться путем пропитки 1-2 мл раствора. В высушенных без сыворотки матрицах восстановление предпочтительно осуществляется с помощью чистой или разбавленной сыворотки, а при высушенных с сывороткой матрицах - предпочтительно с физиологическим раствором поваренной соли.

Подходящие концентрации сыворотки составляют 1-100 об.% от объема, который занимают гель и жидкость в матрице. В матрицах без геля предпочтительными являются концентрации сыворотки от 10 до 100%, более предпочтительными - 50-100% и наиболее предпочтительными - 100% объема жидкости, удерживаемого при помощи капиллярных сил. Для уменьшения концентрации сыворотки крови ниже 100% можно воспользоваться сывороткой, разбавленной физиологическим раствором поваренной соли.

При использовании матриц с гелем предпочтительным является содержание геля порядка 0,01-50 об.%, более предпочтительным - 0,5-20 об.% и наиболее предпочтительным - 1-10 об.% от общего объема геля, сыворотки и при необходимости фармацевтически пригодной жидкости.

Бесклеточный трансплантат может быть использован для регенерации ткани, и в частности для регенерации хрящей или костей. Предпочтительно он применяется для регенерации мезенхимальных тканей. Наиболее предпочтительным является его применение для регенерации хрящей и/или костей, в частности, после просверливания отверстий или после микропереломов. Трансплантат используется как целесообразное покрытие, которое после просверливания отверстия или после микропереломов с ювелирной точностью вводится в хрящ для восстановления поверхности сустава. Материал матрицы, предпочтительно войлочный, служит для механического упрочнения и выступает в качестве основной структуры, стимулирующей гомогенное, трехмерное распределение клеток пациента, мигрирующих из костного мозга или спонгиозной кости. Гель, как и гиалуроновая кислота, действует как барьер на пути миграции красных клеток крови и лейкоцитов. Сыворотка крови, предпочтительно аутологичная сыворотка, способствует миграции клеток, особенно мезенхимальных первичных клеток, в трансплантат, а тем самым и в дефект. Созревание или дифференцировка первичных клеток, мигрировавших в трансплантат, в хондроциты, а значит, и образование регенерируемой хрящевой ткани индуцируются с помощью гиалуроновой кислоты, сыворотки крови и присутствующей в суставе синовиальной жидкости. Неожиданно оказалось, что применение сыворотки крови дает заметно лучшие показатели пополнения.

Нижеприведенные примеры лишь иллюстрируют данное изобретение, не ограничивая его объема.

Пример 1

Пополнение мезенхимальных стволовых клеток человека с помощью факторов роста и дифференцировки, хемокинов и плазмы крови человека in vitro

Изоляция и культивирование мезенхимальных стволовых клеток человека

А. Изоляция мезенхимальных стволовых клеток (MSC) человека из костного мозга описана в DE 103 33 901. Максимум 3 мл пунктата смешиваются с 10 мл РВS и центрифугируются в течение 10 мин при 310 об/мин (g) и при комнатной температуре. Клеточный центрифугат ресуспендируется и повторно промывается в PBS. Клетки помещаются в 20 мл среды DME (с 10-20% FBS, 2% HEPES, 4 мл глютамина L, 100 единиц/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептоцина). Каждые 5 мл этой клеточной суспензии приходятся на 20 мл Percoll с градиентом концентрации плотностью 1,073 г/мл. Клетки центрифугируются при 900 об/мин (g) в течение 32 мин. Верхняя фаза переносится в новую центрифугальную трубку. После добавления 2,5-кратного объема PBS центрифугирование повторяется при 310 об/мин (g) в течение 6 мин. Клеточный центрифугат помещается в среду DME. 1,5·10⁵-3,5·10⁵ клеток/см² помещаются для культивирования в склянку для культуры клеток и инкубируются при 37°С, 5% СО₂. Первая замена среды осуществляется через 72 часа, затем - каждые 3-4 дня. Изолированные таким образом клетки через 2-3 недели роста сливаются и после трипсинизирования при плотности клеток порядка 6000/см² поверхности культуры переносятся в новую склянку для культуры клеток (этап 1). Примерно через неделю клетки снова трипсинизируются (этап 2). Гомогенность полученной культуры стволовых клеток человека верифицируется с помощью анализа FACS, причем поверхностный эндоглин и ALKAM обнаруживаются, а поверхностные антигены CD34, CD45 и CD14 нет.

В. Контроль хемотактической активности факторов роста и дифференцировки (CDMP1, CDMP2), а также хемокинов (SDF1-α, IL8) на предмет наличия мезенхимальных стволовых клеток человека in vitro

Хемотактическое действие факторов роста и дифференцировки, как например cartilage derived morphogenetik protein-1 (CDMP1 или growth and differentiation factor-5, GDF5) и cartilage derived morphogenetik protein-2 (CDMP2 или growth and differentiation factor-6, GDF6), на мезенхимальные стволовые и первичные клетки описано в DE 199 57 388. Хемотактическое действие или применение хемокинов, как например stromal derived faktor-1α (SDF1-α) или интерлейкин-8 (IL8), для пополнения мезенхимальных стволовых и первичных клеток также описано в DE 103 33 901.

Контроль хемотактической активности происходит с помощью так называемых 96-дырочных хемотактических пластин (ChemoTx system, Neuroprobe, USA). Принцип теста предусматривает, чтобы контролируемое вещество в растворе определенного количества и определенной концентрации подавалось в отстойник (Well). После этого отстойник закрывается мембраной, снабженной порами (в данном случае размером 8 мкм), так чтобы нижняя сторона мембраны смачивалась раствором, содержащим хемотактическое вещество.

На верхнюю сторону мембраны напротив отстойника наносится определенное количество клеточной суспензии, не содержащей контролируемого вещества. Через несколько часов, начиная с отстойника, сквозь мембрану в направлении клеточной суспензии создается градиент концентрации контрольного вещества. Если контрольное вещество является хемотактически активным, клетки клеточной суспензии мигрируют через поры мембраны в направлении нижней стороны мембраны, т.е. в нижний отстойник. Мигрирующие клетки подкрашиваются, и их число определяется с помощью микроскопа.

Для контроля нижние отстойники снабжаются растворителем контрольного вещества, закрываемого мембраной и покрытого слоем клеточной суспензии. Благодаря пересчету клеток на нижней стороне мембраны под микроскопом (площадь поверхности: 25 мм²), т.е. в нижнем отстойнике, определяются клетки, мигрировавшие сквозь хемотактическое вещество спонтанно, без всякого стимула. Для определения числа клеток, рекрутируемых хемотактическим веществом, число спонтанно мигрировавших клеток вычитается.

Перед началом теста вышеупомянутых факторов роста и дифференцировки, а также хемокинов мезенхимальные стволовые клетки костного мозга человека в течение 24 часов перемешивались с диетической средой (среда DME + 1% пенициллин/стрептомицин + 0,5% тяжелого альбумина сыворотки крови, BSA). Факторы роста и дифференцировки, а также хемокины входили в диетическую среду в различных количествах, так что получились определенные растворы по 250, 500, 750 и 1000 нМ факторов. 36 мкл соответствующих растворов были триадой заправлены в нижние отстойники 96-дырочной хемотактической пластины и закрыты мембраной, так что нижняя сторона мембраны оказалась смачиваемой растворами. Для контроля использовалась диетическая среда.

На верхнюю сторону мембраны наносились 40 мкл диетической среды с 30000 мезенхимальных стволовых клеток. Через 20 часов культивирования в инкубаторе при 37°С, 5% СО₂ мембрану удаляли и для фиксации клеток на 3 мин помещали в ледяной этанол/ацетон при объемном соотношении (1:1). Верхняя сторона мембраны очищалась с помощью ватного тампона, пропитанного сывороткой. Клетки на нижней стороне мембраны окрашивались с помощью раствора хемаколора (фирма «Мерк», Дармштадт). В нижнем отстойнике никаких клеток обнаружить не удалось.

Подсчет клеток, находящихся на нижней стороне мембраны, осуществлялся путем их пересчета под микроскопом. Число стволовых клеток, пополненных за счет CDMP1, CDMP2, SDF1-α и IL8 в различных концентрациях, определялось после вычета мигрировавших клеток в контрольной заправке (без хемотактического фактора). Средние величины количества клеток со стандартным отклонением представлены для соответствующих факторов на фиг. 1. С помощью CDMP1 удалось побудить к миграции максимум 156 MSC (750 нМ CDMP1)/25 мм². С помощью CDMP2 рекрутировано максимум 38 MSC (500 нМ CDMP2)/25 мм², с помощью SDF1-α - максимум 79 MSC (750 нМ SDF1-α)/25 мм² и с помощью IL8 - максимум 814 MSC (500 нМ IL8)/25 мм².

С. Контроль хемотактической активности сыворотки крови человека на предмет наличия человеческих мезенхимальных стволовых клеток in vitro

Тестирование сыворотки крови человека с помощью метода, описанного в пункте B, неожиданно показало, что сыворотка крови человека по сравнению с факторами роста и дифференцировки, а также хемокинами оказывает явно большее хемотактическое действие на мезенхимальные стволовые и первичные клетки человека in vitro. Количества человеческих мезенхимальных стволовых и первичных клеток, рекрутированных сывороткой крови человека, в различных составах (в диетической среде или гиалуроновой кислоте) в среднем с соответствующими стандартными отклонениями представлены на фиг. 2. В зависимости от состава с помощью сыворотки крови человека удалось рекрутировать минимум 2135 (PGA-НА lyo.+HS) (lyo.= в жидком виде) и максимум 10332 (5%-среда HS-HA) мезенхимальных стволовых и первичных клеток человека. Контроль гиалуроновой кислоты без сыворотки крови человека в диетической среде в качестве хемотактического фактора показал в среднем 24 (среда НА) или в среднем 48 (PGA-НА lyo.+NaCl) рекрутированных мезенхимальных стволовых и первичных клеток человека.

В описанном способе рекрутирования мезенхимальных стволовых и первичных клеток человека использовались следующие различные составы сыворотки человеческой крови. Сыворотка крови человека из 5 проб цельной крови без антикоагулянтов после ее естественного свертывания перемешивалась в равных долях и использовалась для получения различных составов сыворотки. Для изготовления заправок «5%-среда HS» и «10%-среда HS» диетическая среда перемешивалась с сывороткой крови человека, так чтобы в результате получились 5%-ные и 10%-ные растворы. Заправка «среда НА» состоит из равных частей диетической среды и ферментативно полученной гиалуроновой кислоты (Ostenil®, TRB Chemedica AG) (AG=AO) со средним молекулярным весом 1200 (кДа). Заправки «1%-среда HS-НА», «5%-среда HS-НА» и «10%-среда HS-НА» состоят из «среды НА», в которую добавляется сыворотка крови человека, так чтобы в результате получились 5%-ные и 10%-ные растворы.

Для изготовления заправки «PGA-10% HS-НА, lyo.» 270 мкл ферментативно полученной гиалуроновой кислоты (Ostenil®, TRB Chemedica AG), смешанной с 30 мкл сыворотки крови человека, наносились на волокно (PGA-Soft Felt®, Alpha Research Switzerland GmbH) размером 20×15×1,1 мм из полигликолевой кислоты (PGA). Волокно, пропитанное смесью сыворотки крови человека с гиалуроновой кислотой, в течение часа замораживалось при -20°С, после чего в замороженном виде в течение 16 часов высушивалось в лиофилизаторе. Для восстановления волокно, высушенное в замороженном виде в лиофилизаторе, на 10 мин помещалось в 1 мл физиологического раствора поваренной соли, чтобы затем с помощью десятиминутного центрифугирования при 2000 об/мин получить около 80-100 мкл раствора сыворотки крови с гиалуроновой кислотой. После разбавления раствора диетической средой в равных частях был получен и прямо направлен на контроль хемотактической активности состав «PGA-10% HS-НА, lyo.»

Для изготовления заправки «PGA-НА lyo.+HS» 300 мкл ферментативно полученной гиалуроновой кислоты (Ostenil®, TRB Chemedica AG) наносились на волокно (PGA-Soft Felt®, Alpha Research Switzerland GmbH) размером 20×15×1,1 мм из полигликолевой кислоты (PGA). Волокно, пропитанное гиалуроновой кислотой, в течение часа замораживалось при -20°С, после чего в замороженном виде в течение 16 часов высушивалось в лиофилизаторе. Для восстановления волокно, высушенное в замороженном виде в лиофилизаторе, на 10 мин помещалось в 1 мл сыворотки крови, чтобы затем с помощью десятиминутного центрифугирования при 2000 об/мин получить около 80-100 мкл раствора сыворотки крови с гиалуроновой кислотой. После разбавления раствора диетической средой в равных частях был получен и направлен на контроль хемотактической активности состав «PGA-НА lyo.+HS».

Для изготовления заправки «PGA-НА lyo.+NaCl)» 300 мкл ферментативно полученной гиалуроновой кислоты (Ostenil®, TRB Chemedica AG) наносилось на волокно (PGA-Soft Felt®, Alpha Research Switzerland GmbH) размером 20×15×1,1 мм из полигликолевой кислоты (PGA). Волокно, пропитанное гиалуроновой кислотой, в течение часа замораживалось при -20°С, после чего в замороженном виде в течение 16 часов высушивалось в лиофилизаторе. Для восстановления волокно, высушенное в замороженном виде в лиофилизаторе, на 10 мин помещалось в 1 мл физиологического раствора поваренной соли, чтобы затем с помощью десятиминутного центрифугирования при 2000 об/мин получить около 80-100 мкл раствора сыворотки крови с гиалуроновой кислотой. После разбавления раствора диетической средой в равных частях был получен и прямо направлен на контроль хемотактической активности состав «PGA-НА lyo.+NaCl)».

Пример выполнения 2

Волкно из полигликолевой кислоты, реализуемое в продаже «Alpha Research Switzerland GmbH» под маркой «PGA-Soft Felt®», было разрезано на образцы размером 20×15×1,1 мм. Материал, из примера 1, был пропитан смесью гиалуроновой кислоты с сывороткой человеческой крови, содержащей 10% сыворотки, а затем высушен. Сушка вначале производилась при -20°С, а затем в течение 16 часов в лиофилизаторе. Волокно восстанавливалось с помощью десятиминутной пропитки 1-2 мл физиологическим раствором поваренной соли.

В альтернативной варианте волокно пропитывалось чистой гиалуроновой кислотой плотностью 10 мг/мл, растворенной в физиологическом растворе поваренной соли. Полученный материал сушился, как показано выше. Восстановление производилось путем пропитки 1-2 мл сывороткой крови в течение 10 мин. Оба волокна можно использовать непосредственно для трансплантации.

Изобретение относится к медицине. Описан бесклеточный трансплантат, содержащий (i) связную, скелетную матрицу с открытостью пор из биологически и фармацевтически пригодного материала и (ii) сыворотку крови человека. В соответствии с особенно предпочтительным вариантом выполнения изобретения матрица содержит также гель. Описан также способ изготовления такого бесклеточного трансплантата, в котором матрица и гель контактируют с сывороткой крови человека. При необходимости трансплантат с сывороткой могут высушиваться. В качестве альтернативы матрица и гель могут быть представлены в сухом виде перед контактированием. Описано также использование бесклеточного трансплантата для регенерации ткани, и в частности для регенерации хряща и/или костей. Трансплантат прост в изготовлении, долго хранится и удобен в применении. 3 н. и 13 з.п. ф-лы, 2 ил.

1. Бесклеточный трансплантат, содержащий (i) взаимосвязанную, образующую каркас матрицу с открытой пористостью из биологически и фармацевтически пригодного материала и (ii) сыворотку крови, причем бесклеточный трансплантат дополнительно включает гель, нанесенный по крайней мере на одну сторону матрицы и/или пронизывающий ее по меньшей мере частично, и матрица выполнена из материала, выбранного из группы, состоящей из природных и искусственных полимеров, таких как: коллаген, гиалуроновая кислота, хитозан, хитин, полисахариды, целлюлозы и их производные, протеины, полипептиды, полигликолевая кислота, полимолочная кислота, поли(гликолид, лактат), капролактон; керамических материалов, таких как: оксиды, карбиды, нитриды и карбонитриды металлов, в частности оксиды кремния, титана и кальция; минералов, таких как: галогениды, в частности, фториды, гидрооксиды, фосфаты, сульфатов металлов, таких как: фосфат кальция, апатит, гидроксилапатит; металлов, таких как: титан, алюминий, золото, серебро, высококачественая сталь, и их смесей.

2. Бесклеточный трансплантат по п.1, в котором материал матрицы является рассасывающимся или нерассасывающимся.

3. Бесклеточный трансплантат по п.1 или 2, в котором матрица имеет структуру, выбранную из тканых или нетканых структур (в частности из волокнистых и войлочных структур), мембран, губок, ваты, пленки с открытыми ячейками, шерсти, плетения, упорядоченных и неупорядоченных пучков волокон, пористых керамических материалов, губчатой ткани и геля, а также из их комбинаций.

4. Бесклеточный трансплантат по п.1, в котором гель является природным или искусственным гидрогелем.

5. Бесклеточный трансплантат по п.1, в котором гель имеет меньшую жесткость, чем матрица.

6. Бесклеточный трансплантат по п.1, в котором гель выбран из таких материалов, как полисахариды, полипептиды, гиалуроновая кислота, фибрин, коллаген, альгинат, агароза и хитозан, а также из их смесей и предпочтительно гиалуроновая кислота.

7. Бесклеточный трансплантат по п.1, в котором сыворотка крови является аутологичной, аллогенной или гетерологичной, а при необходимости модифицированной за счет добавления к ней по меньшей мере одной составной части или удаления из нее по меньшей мере одного компонента сыворотки крови.

8. Бесклеточный трансплантат по п.1, дополнительно содержащий одну или несколько составных частей, выбранных из группы, состоящей из факторов роста, факторов дифференцировки, гормонов, хемокинов, цитокинов, клеточных адгезионных молекул, хемотактических факторов, энзимов, ингибиторов энзимов, коэнзимов, минералов, жиров, липидов, сахаридов, биологически активных лекарственных средств, таких как: антибиотики, анальгетики, противовоспалительные средства и иммунодепрессанты, буферные вещества, стабилизаторы, в частности криостабилизаторы, и витамины, препочтительно гормоны, факторы роста и факторы дифференцировки.

9. Бесклеточный трансплантат по п.8, в котором гормоны, факторы роста и дифференцировки выбраны из инсулина, PDGF, IGF, GMCSF, GDF5 GDF6, FGF, BMP2, ВМР4, ВМР7, IL8, SDF1-α и EGF и их комбинаций.

10. Способ изготовления бесклеточного трансплантата по одному из предшествующих пунктов, при котором матрицу и гель вводят в контакт с сывороткой крови.

11. Способ по п.10, при котором контактирование осуществляется путем накапывания, замачивания, насыщения или пропитки.

12. Способ по п.10 или 11, при котором сначала гель вводят в матрицу и/или наносят на нее, а затем устанавливают контакт между ними и сывороткой крови.

13. Способ по п.10, при котором комбинация из геля и матрицы, а также при необходимости и из других составных частей высушивается до или после контактирования.

14. Способ по п.13, при котором трансплантат восстанавливается из высушенного состояния.

15. Применение бесклеточного трансплантата по любому из пп.1-9 для регенерации ткани.

16. Применение по п.15 для регенерации мезенхимальных тканей, в частности хряща и/или костей.