СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РАСТЕНИЙ ВИНОГРАДА В КОЛЛЕКЦИИ IN VITRO Российский патент 2021 года по МПК A01H4/00 

Описание патента на изобретение RU2760944C1

Изобретение относится к области биотехнологии растений и сельского хозяйства, в частности к сохранению генофонда вегетативно размножаемых растений.

В настоящее время актуальна проблема сохранения генофонда растений как дикорастущих видов, так и культурных растений, представляющих ценный материал для селекционной работы. Для этого широко используются методы биотехнологии, такие как микроклональное размножение in vitro, эмбриокультура, сохранение коллекций в условиях in vitro, криосохранение.

В последние десятилетия во многих странах возрос интерес к биотехнологическим коллекциям растительных объектов, прежде всего редких и исчезающих видов растений, а также видов, для которых традиционные методы сохранения неэффективны.

В практике создания, поддержания и использования биотехнологических коллекций существуют следующие основные направления: сохранение генетических ресурсов в пересадочных коллекциях (растения in vitro, культуры органов и клеток); депонирование растительных объектов при пониженных температурах и хранение растительных объектов в криобанках. Недостатком пересадочных коллекций in vitro является необходимость частых пересадок образцов, что повышает риск повторного инфицирования, нарушения генетической стабильности, приводит к дополнительным расходам материалов, реактивов и людских ресурсов. Создание условий надежного сохранения коллекций, способствующих замедлению ростовых процессов растений, может существенно повысить эффективность поддержания подобных коллекций.

Целью изобретения является повышение эффективности длительного сохранения in vitro микрорастений винограда при пониженной положительной температуре 2-4°С, без пересадок в течение одного года и более.

Изобретение может быть использовано в виноградарстве, для поддержания и сохранения ценного генетического материала в вегетирующей коллекции, может быть источником первичного оздоровленного посадочного материала для массового производства саженцев категории оригинальный в целях закладки элитных (базисных) маточников. Поддержание в условиях in vitro коллекции ценных сортов и перспективных клонов винограда позволяет постоянно иметь первичный оздоровленный материал и в нужный момент приступить к процедуре ускоренного размножения. При предлагаемом способе культивирования коллекция будет занимать небольшое пространство, обходиться минимальными концентрациями минеральных веществ и нуждаться в редких пересадках растительного материала.

Аналог 1. Известен «Способ длительного хранения in vitro микрорастений березы» (патент на изобретение № 2634409, РФ), включающий культивирование микропобегов на питательной среде ½MS без гормонов с повышенным содержанием аскорбиновой кислоты 2,0 мг/л, с добавлением агар-агара 6 г/л при хранении пробирочных растений при температуре 4-7°С в темноте.

Общим с заявленным способом является подход к условиям сохранения при температуре 4°С в темноте. Отличием от заявленного способа является объект сохранения - береза, среда культивирования, также отсутствие поэтапной адаптации от активного роста к состоянию глубокого покоя. Возможность использования данного способа для растений винограда не описана.

Аналог 2. Известен «Способ длительного сохранения in vitro растений винограда» (патент на изобретение № 2110172, РФ), который предполагает в качестве ингибитора роста растений вносить в среду тонкоразмолотые семена винограда в концентрации, в об.%: 1,0-2,0.

Недостатком данного способа является короткий период между пересадками (четыре месяца).

Заявляемый способ предполагает увеличение периода между пересадками до 1-2 лет.

Прототип. Наиболее близким к заявляемому способу является «Способ размножения винограда» (а.с. № 1695853, СССР) который заключается в том, что для последнего пассажа используется модифицированная обедненная среда, и укорененные на такой среде растения доращивают при 8-часовом фотопериоде до вызревания не менее одного узла побега.

Общим является технологическое решение, заключающееся в стимулировании одревеснения лозы, на основе изменения показателей факторов культивирования. Прототип основан на изменении факторов: среды культивирования (обедненная макро- и микроэлементами) и фотопериода.

В прототипе не указывается период и условия сохранения полученных растений. Проведенные нами исследования, показали нецелесообразность использования обедненных сред для сохранения вегетирующих коллекций, т.к. вследствие недостатка питательных веществ формируются слабые растения.

Заявленный способ предполагает: культивирование на безгормональной среде без пересадок на всем продолжении цикла сохранения, которое осуществляется как в условиях активного роста, так и в состоянии глубокого покоя; для перехода растений в состояние глубокого покоя используется климатическая камера, где на основе изменения показателей двух факторов: фотопериода, температуры, при неизменном освещение и влажности моделируются условия культивирования, что позволяет в дальнейшем успешно сохранять растения в условиях низких положительных температур (2-4°С) в темноте без пересадок в течение одного и более лет.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение эффективности длительного сохранения in vitro микрорастений винограда при пониженной положительной температуре 2-4°С, без пересадок в течение одного года и более.

Поставленный технический результат достигается за счет перехода растений в состояние глубокого покоя в моделируемых условиях климатической камеры на основе изменения показателей двух факторов: фотопериода, температуры, что позволяет в дальнейшем успешно сохранять растения в условиях низких положительных температур в темноте без пересадок в течение одного года и более.

Изобретение представляет собой способ беспересадочного (свыше одного года) сохранения микрорастений (пробирочных растений) винограда в условиях in vitro, что позволяет уменьшить затраты труда и времени, сэкономить расходы на реактивы.

Сущность патента заключается в том, что растения в вегетирующей коллекции культивируют поэтапно в разных режимах и в разных физиологических состояниях: 1 - период активного роста в световой комнате при 16-часовом фотопериоде интенсивностью 1500 кд⋅ср/м2 и температуре 27°С; 2 - переходный период из состояния активного роста в состояние глубокого покоя (моделируется в климатической камере); 3 - сохранение в состоянии глубокого покоя при 2-4°С. Для моделирования условий переходного периода перевода растений в состояние глубокого покоя (освещение, температура, влажность, фотопериод) используется климатическая камера Binder KBWF 240, с микропроцессорным управлением с цветным жидкокристаллическим дисплеем. Программируемый контроллер МВ1 позволяет управлять следующими параметрами внутри климатической камеры: температура (изменяется от минус 5°С (без влажности) до 100°С); относительная влажность в %:10-90. Устанавливаемые значения отображаются на дисплее при программировании. Одновременно на дисплее отображаются действительные значения контролируемых параметров в камере. Культивирование растений происходит при постепенном изменении фотопериода от 22/2 часов до 12/12 часов, волновом изменении температуры от 27°С/27°С до 20°С/5°С, дневной освещенности 2000 кд⋅ср/м2 и постоянной влажности 30% в климатической камере в течение 264 часов; Данный режим культивирования позволяет создать условия для постепенного перехода от активного роста побегов к резкому снижению скорости роста и интенсивности обмена веществ, что положительно влияет на длительное пребывание растений в состоянии глубокого покоя. Глубокий покой связывают с закаливанием растений, поэтому культивирование в данном режиме приводит к частичному одревеснению побега и осенней окраске листа. Затем растения сохраняют в состоянии глубокого покоя в беспересадочном режиме при 2°-4°С в темноте в течение одного года и более.

Новым в предложенном способе является то, что растения культивируют в разных условиях и в разных физиологических состояниях, перевод растений в состояние глубокого покоя происходит в моделируемых условиях на основе изменения показателей двух факторов: фотопериода и температуры, при постоянных освещении и влажности. Затем сохранение растений осуществляется при низких положительных температурах в темноте.

Способ состоит из 3-х этапов и осуществляется следующим образом.

Первый этап культивирования. В условиях ламинарного бокса растения in vitro черенкуют на одно-двуглазковые экспланты, пересаживают в культуральные сосуды с питательной средой. Культивируют на безгормональной среде Н3[19] следующего состава (в мг/л): NH4NO3 308; KNO3 922; MgSO4⋅7H2O 597; Н2РО4 122; CaCl2 331; FeSO4⋅7H2O 28; Na2 ЭДТА⋅Н2О 37; MnSO4⋅4H2O 22,3; H3BO3 6,2; ZnSO4⋅7Н2О 8,6; Na2MoO4⋅2H2O 0,25; CuSO4⋅5H2O 0,025; CoCl2⋅6H2O 0,025; KJ 0,83; мезо-инозит 20; никотиновая кислота 0,5; пиридоксина-HCl 0,2; сахароза 15000; гумат Na 30; рН 5,7. Культивирование растений осуществляют в световой комнате при 16 - часовом фотопериоде, освещенности интенсивностью 1500 кд⋅ср/м2 и температуре 27°С в течение трех-четырех недель.

Второй этап переходный. Переход в состояние глубокого покоя. Растения помещают в климатическую камеру, культивируют в моделируемых условиях, 264 часа. Рекомендуется следующий порядок культивирования растений винограда в режиме адаптации к условиям глубокого покоя, который заключается в постепенном изменении фотопериода от 22/2 часов до 12/12 часов, волновом изменении температуры от 27°С/27°С до 20°С/5°С, дневной освещенности 2000 кд⋅ср/м2 и постоянной влажности 30% в климатической камере в течение 264 часов (Табл. 1, 2).

Третий этап. Сохранение растений в состоянии глубокого покоя в темноте при низких положительных температурах. После закаливания сосуды с растениями помещают в бытовой холодильник и культивируют при температуре 2-4°С в течение года и более.

Предложенный способ позволяет без применения ингибиторов роста, на основе моделирования условий для ускоренного перехода к состоянию покоя подготовить образцы к длительному хранению в темноте при низких положительных температурах (Фиг. 1). Пересадки в течение всего периода не предполагаются. Жизнеспособность растений после сохранения оценивается по регенерирующей способности почки. Использование предлагаемого режима культивирования позволяет удлинить интервал между пересадками (до одного года и более), минимизировать появление аномальных растений и сомаклональной изменчивости, что обеспечит при необходимости получение качественного посадочного материала с сохранением у него хозяйственно ценных признаков и генетической идентичности.

Пример применения способа культивирования растений винограда в коллекции in vitro испытан на 34 образцах двух сортов: Спартанец Магарача и Антей магарачский.

На первом этапе, экспланты побегов растений винограда двух сортов Антей магарачский и Спартанец Магарача в стерильных условиях высажены на безгормональную среду, содержащую в мг/л: NH4NO3 308; KNO3 922; MgSO4⋅7H2O 597; H2PO4 122; CaCl2 331; FeSO4⋅7H2O 28; Na2 ЭДТА⋅Н2О 37; MnSO4⋅4Н2О 22,3; H3BO3 6,2; ZnSO4⋅7Н2О 8,6; Na2MoO4⋅2H2O 0,25; CuSO4⋅5H2O 0,025; CoCl2⋅6Н2О 0,025; KJ 0,83; мезо-инозит 20; никотиновая кислота 0,5; пиридоксина-HCl 0,2; сахароза 15000; гумат Na 30; рН 5,7. В каждый культуральный сосуд помещали по 4-5 эксплантов. Культивируют на свету при 16-часовом фотопериоде, освещенности интенсивностью 1500 кд⋅ср/м2 и температуре 27°С в течение трех-четырех недель.

На втором этапе, на дисплее климатической камеры устанавливают режим, обеспечивающий плавный переход растений из состояния активного роста в состояние глубокого покоя. Сосуды с растениями помещают на полки камеры и культивируют в разработанном режиме в течение 264 часов. Глубокий покой связывают с закаливанием растений, поэтому культивирование в данном режиме приводит к частичному одревеснению побега и осенней окраске листа. Культивирование растений осуществляется на свету при 16-часовом фотопериоде, освещенности интенсивностью 1500 кд⋅ср/м2 и температуре 27°С в течение трех-четырех недель. Одна партия сосудов с растениями обоих сортов закладывалась на сохранение непосредственно после культивирования в световой комнате. Другую партию сосудов с растениями поместили в климатическую камеру (Таб. 1, 2).

Растения культивировали в заданном режиме при постепенном изменении фотопериода от 22/2 часов до 12/12 часов, волновом изменении температуры от 27°С/27°С до 20°С/5°С, дневной освещенности 2000 кд⋅ср/м2 и постоянной влажности 30% в климатической камере в течение 264 часов.

На третьем этапе, после климатической камеры сосуды с растениями закладывали в бытовой холодильник при 2-4°С и сохраняли в течение года в темноте.

После периода сохранения растения сорта Антей магарачский по внешним признакам были более жизнеспособными, чем растения сорта Спартанец Магарача. У значительной части растений этого сорта частично или полностью сохранились зеленые листья (Табл. 3).

О жизнеспособности растений после периода сохранения судили по регенерирующей способности почки. Регенерирующая способность почки при трех этапном режиме была культивирования существенно выше по сравнению с двух этапным способом культивирования коллекции без использования климатической камеры.

Похожие патенты RU2760944C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ДЛИТЕЛЬНОГО ХРАНЕНИЯ IN VITRO МИКРОРАСТЕНИЙ БЕРЕЗЫ 2016
  • Машкина Ольга Сергеевна
  • Табацкая Татьяна Михайловна
  • Внукова Наталья Ивановна
RU2634409C1
Способ длительного депонирования in vitro растений малины ремонтантной 2020
  • Киркач Вадим Валерьевич
  • Акимова Светлана Владимировна
  • Малеванная Наталья Николаевна
  • Деменко Василий Иванович
  • Викулина Александра Николаевна
  • Семенова Наталья Александровна
RU2743965C1
СПОСОБ ДЛИТЕЛЬНОГО БЕСПЕРЕСАДОЧНОГО ХРАНЕНИЯ РАСТЕНИЙ ВИНОГРАДА В КУЛЬТУРЕ IN VITRO 2017
  • Дорошенко Наталья Петровна
RU2708840C2
Способ получения микрорастений лекарственного растения Stephania glabra (Roxb.) Miers 2021
  • Горпенченко Татьяна Юрьевна
  • Верещагина Юлия Витальевна
  • Чернодед Галина Кирилловна
RU2757318C1
СПОСОБ ХРАНЕНИЯ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO РАСТЕНИЙ ВИНОГРАДА С ВЫЗРЕВШЕЙ ЛОЗОЙ 2022
  • Дорошенко Наталья Петровна
  • Пузырнова Валентина Георгиевна
  • Венценосцева Наталья Сергеевна
RU2797364C1
СПОСОБ ФОРМИРОВАНИЯ КОЛЛЕКЦИИ И ДЛИТЕЛЬНОГО ДЕПОНИРОВАНИЯ ВИНОГРАДА IN VITRO 2021
  • Дорошенко Наталья Петровна
  • Пузырнова Валентина Георгиевна
RU2764104C1
СПОСОБ АДАПТАЦИИ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ ЗЕМЛЯНИКИ 2015
  • Амброс Елена Валерьевна
  • Новикова Татьяна Ивановна
  • Ломовский Олег Иванович
  • Трофимова Елена Геннадиевна
RU2614261C1
СПОСОБ ДЛИТЕЛЬНОГО ХРАНЕНИЯ IN VITRO РАСТЕНИЙ ОСИНЫ 2012
  • Видягина Елена Олеговна
  • Шестибратов Константин Александрович
RU2522823C2
СПОСОБ СОХРАНЕНИЯ КАЧЕСТВЕННЫХ ХАРАКТЕРИСТИК КУЛЬТУРЫ in vitro НЕКОТОРЫХ ДРЕВЕСНЫХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ (ЛИМОННИК КИТАЙСКИЙ, РОДОДЕНДРОН, СИРЕНЬ, БЕРЕЗА ПОВИСЛАЯ) 2015
  • Филиппов Михаил Викторович
  • Азарова Анна Борисовна
  • Шестибратов Константин Александрович
RU2590703C1
СПОСОБ СОХРАНЕНИЯ ЮВЕНИЛЬНОГО СТАТУСА КУЛЬТУРЫ IN VITRO МАЛИНЫ (RUBUS IDAEUS) 2016
  • Филиппов Михаил Викторович
  • Азарова Анна Борисовна
  • Шестибратов Константин Александрович
RU2662670C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 760 944 C1

Реферат патента 2021 года СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РАСТЕНИЙ ВИНОГРАДА В КОЛЛЕКЦИИ IN VITRO

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ сохранения микрорастений винограда в условиях in vitro, включающий культивирование растений на безгормональной среде в разных режимах и в разных физиологических состояниях, перевод растений в состояние глубокого покоя моделируется на основе изменения показателей двух факторов: фотопериода и температуры, что позволяет в дальнейшем успешно сохранять растения в условиях низких положительных температур (2-4°С) в темноте без пересадок в течение одного-двух лет. Изобретение может быть использовано в виноградарстве, для поддержания и сохранения ценного генетического материала в вегетирующей коллекции, может быть источником первичного оздоровленного материала для массового производства саженцев категории «оригинальный» в целях закладки элитных (базисных) маточников. 1 ил., 3 табл.

Формула изобретения RU 2 760 944 C1

Способ культивирования растений винограда в коллекции in vitro, заключающийся в поэтапном культивировании растений, где I - период активного роста проводят при 16-часовом фотопериоде с дневной освещенностью 1500 кд⋅ср/м2 и температурой 27°С в световой комнате в течение 3-4 недель; II - переходный период из состояния активного роста в состояние глубокого покоя проводят при постепенном изменении фотопериода от 22/2 часов до 12/12 часов, волновом изменении температуры от 27°С/27°С до 20°С/5°С, дневной освещенности 2000 кд⋅ср/м2 и постоянной влажности 30% в климатической камере в течение 264 часов; III - период сохранения в состоянии глубокого покоя проводят при температуре 2-4°С в темноте в течение года и более.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2021 года RU2760944C1

ПАВЛОВА И.А
и др., Параметры культивирования для длительного хранения растений винограда в вегетирующей коллекции in vitro, Магарач, Виноградарство и виноделие, N 2, 2018, с
Разборный с внутренней печью кипятильник 1922
  • Петухов Г.Г.
SU9A1
ПАВЛОВА И.А
и др., Моделирование климатических условий для адаптации растений винограда in vitro к условиям in vivo, Научные труды СКФНЦСВВ, том 25, 2019, с

RU 2 760 944 C1

Авторы

Павлова Ирина Александровна

Клименко Виктор Павлович

Даты

2021-12-01Публикация

2020-10-02Подача