СПОСОБ ХРАНЕНИЯ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO РАСТЕНИЙ ВИНОГРАДА С ВЫЗРЕВШЕЙ ЛОЗОЙ Российский патент 2023 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к виноградарству и может быть использовано для длительного хранения ценных и редких сортов винограда в коллекции invitro, что способствует сохранению биоразнообразия.

Микроклональное размножение широко используется в разных странах для создания высококачественного посадочного материала различных сельскохозяйственных культур, тем самым эффективно способствуя развитию сельского хозяйства. Благодаря применению данного метода, появилась возможность создания банков invitro редких и ценных генотипов растений.

При хранении коллекций invitro в оптимальных условиях роста (t=20÷25°C) возникает необходимость частого переноса растений на свежую питательную среду, что повышает стоимость хранения образца и увеличивает риск его инфицирования различными микроорганизмами. Кроме того, частое пассирование микропобегов стимулирует активное деление клеток, что может приводить к возникновению самоклональных вариантов.

Для увеличения интервала между пассажами используют различные методы и приемы, основанные на замедлении роста пробирочных растений.

Известен способ минимализации роста растений при низких положительных температурах в условиях invitro, который является приемлемым для сохранения культуры редких и исчезающих видов растений Саратовской области из различных систематических групп. Показано, что использование 60 г/л и 90 г/л сахарозы позволяет сохранить жизнеспособные экспланты на протяжении 6-42 месяцев беспересадочной культуры. (Т.А. Крицкая, А.С. Кашин. Особенности длительного депонирования культуры invitro некоторых редких и исчезающих видов растений Саратовской области Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2016. Т. 16, вып. 1. С74-80).

Недостатком данного способа является короткий беспересадочный период.

Известны способы сохранения в коллекции invitroll редких и исчезающих видов растений, относящихся к 25 семействам с помощью оптимизации питательных сред, для чего применяли большое количество регуляторов роста: кинетин, 6-бензиламинопурин, тидиазурон, зеатин, рибозид, ИМК (индолилмасляная кислота) ИУК (индолилуксусная кислота), что может способствовать появлению сомаклональной изменчивости и генетической нестабильности образцов. Кроме того, использование дорогостоящих реактивов отрицательно сказывается на экономической эффективности данного способа. (О.О. Жолобова, О.И. Коротков, Г.Н. Сафронова, А.В. Буганова, О.А. Скоропудова. Сохранение редких и исчезающих видов растений при помощи методов биотехнологии. Современные проблемы науки и образования. - 2012. - №1).

Известен способ длительного хранения invitro микрорастений березы, включающий культивирование микропобегов на питательной среде MS без гормонов с повышенным содержанием аскорбиновой кислоты 2,0 мг/л, с добавлением агар-агара 6 г/л при хранении пробирочных растений при температуре +4…+7°С в темноте. Данный способ позволяет более года хранить без пересадки различные ценные генотипы березы: продуктивные, быстрорастущие, устойчивые к неблагоприятным факторам среды, с декоративной узорчатой древесиной и др., без потери их высокого регенерационного потенциала и жизнеспособности в условиях invitro и exvitro (патент RU №2634409).

Известен способ длительного беспересадочного хранения растений винограда в культуре invitro. Культивирование осуществляют на твердой питательной среде Мурасиге-Скуга, в которую добавляют антибиотик гентамицин в концентрации 0,005-0,9 мл/л, что позволяет продлить срок беспересадочного хранения, при снижении энергозатрат и упрощении технологического процесса. Способ позволяет увеличить продолжительность культивирования растений без пересадок до 8÷12 месяцев (патент RU №2708840).

Следует отметить, что во всех рассмотренных способах продолжительность беспересадочного хранения увеличивается практически вдвое и составляет около 12 месяцев. Однако биологические особенности растений позволяют более продолжительное беспересадочное хранение растений до 2-КЗх лет.

Исследуется возможность создания банков растений invitro с вызревшей лозой. При этом отмечается, что растения с вызревшей лозой invitro (микросаженцы) можно в течение нескольких лет хранить и перевозить на большие расстояния плотно упакованными в ящиках без освещения при температуре от +1 до +7°С. Однако эти предположения не подтверждены фактическими данными. Авторами не приведены конкретные данные об условиях создания коллекции, продолжительности беспересадочного хранения, регенерационной способности микросаженцев, эффективности способа депонирования винограда в коллекции. (В.А. Зленко, И.В. Котикова, Л.П. Трошина Методы invitro для размножения оздоровленного посадочного материала винограда Институт винограда и вина «Магарач» Виноделие и Виноградарство. - 2003. - №3. - С. 38-39).

Задачей настоящего изобретения является разработка способа длительного депонирования растений винограда invitro с вызревшей лозой, позволяющего обеспечить сохранность генетической стабильности образцов и повысить экономическую эффективность хранения генофонда винограда in vitro зa, счет увеличения продолжительности беспересадочного хранения, сокращения трудозатрат и исключения дорогостоящих реактивов

Поставленная задача достигается с помощью предложенного способа длительного депонирования в культуре invitro растений винограда с вызревшей лозой, включающего введение в культуру апикальных меристем, формирование на их основе коллекции растений с вызревшей лозой, с предварительным культивированием на твердой питательной среде Мурасиге-Скуга и высадку на хранение. При этом пробирочные растения выдерживают на питательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением повышенных концентраций сахарозы 40,0÷70,0 г/л, а культивирование осуществляют в условиях пониженной положительной температуры 1÷8°С.

Предложенный способ получения растений винограда invitro с вызревшей лозой предназначен для долгосрочного хранения генотипов винограда и определяет условия вызревания растений в пробирках в процессе культивирования и их продолжительное хранение в таком состоянии. Экспериментально установлено, что в процессе культивирования происходит вызревание побегов растений в пробирках, которое зависит от содержания сахарозы в составе питательной среды, а пониженная положительная температура, в интервале от +1°С до +8°С, является фактором, замедляющим ростовые процессы.

Новым и существенным в предлагаемом способе является то, что впервые для создания коллекции используются растения винограда, с вызревшими, в условиях invitro, побегами. При этом пробирочные растения выдерживают на питательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением повышенных концентраций сахарозы 40,0÷70,0 г/л, а культивирование осуществляют в условиях пониженной положительной температуры 1÷8°С.

Технический результат выражается в увеличении продолжительности беспересадочного хранения, а также повышении экономической эффективности хранения, сокращении трудозатрат и исключении дорогостоящих реактивов. Продолжительность беспересадочного культивирования таких растений увеличивается до 1÷4 лет, в зависимости от сортовых особенностей, при помещении их в условия пониженной положительной температуры.

Способ осуществляется следующим образом. В начале отбирают растения винограда, регенерированные из апикальных меристем размером 0,1÷0,2 мм и размноженные в культуре invitro. Растения должны иметь 8÷10 междоузлий. Затем подготавливают твердую питательную среду Мурасиге-Скуга следующего состава, мг/л: макроэлементы - аммоний азотнокислый (NH₄NO₃ - 138), калий азотнокислый (KNO₃-950), магний сернокислотный (MgSO₄7H₂O - 185), калий фосфорнокислый однозамещенный (KH₂PO₄ - 68), кальций хлористый 2-водный (CaCl₂ 2H₂O - 296); микроэлементы - борная кислота (Н₃ВО₃ - 6.2), марганец сернокислый 4-водный (MnSO₄4H₂O - 22.3); медь сернокислая 5-водная (CuSO₄ 5Н₂ - 0.025), кобальт хлористый 6-водный (CoCl₂ 6Н₂О - 0.025); цинк сернокислый 4-водный (ZnSO₄4H₂O - 8.6), натрий молибденовокислый 2-водный (Na₂MoO₄ 2Н₂О - 0.25), калий йодистый (KJ - 0.86), хелат железа - железо сернокислое 7-водное (FeSO₄ 7H₂O - 27.8), трилон-Б (Na₂ЭДТА-37.3); витамины - мезоинозит-50, тиамин (HCl - 0,2); ИУК - 0,1-3 мг/л; рН среды перед автоклавированием 5,7-5,9.Сахарозу добавляли в питательную среду в концентрациях 20,0: 30,0; 40,0;50,0;60,0;70,0 г/л.

Микрочеренкование осуществляли в операционной комнате в ламинарном боксе «Фортран». Побеги, имеющие 8÷10 междоузлий, при помощи пинцета извлекали из пробирки, помещали на стерильную чашку Петрии, разрезали на микрочеренки, имеющие глазок с листом. Длина микрочеренка 10÷12 мм и 1+2 мм над глазком, а остальные под глазком. Полученные микрочеренки высадили на твердую питательную среду по одному в пробирку. Культивирование осуществляли в культуральной комнате при освещенности 2,0÷3,0 тыс.люксов, фотопериоде - 16 часов, температуре 25÷27±2°С, при влажности воздуха 70÷75%.

Дополнительно к культивированию при повышенном содержании сахарозы, осуществляли хранение вызревших пробирочных растений в фармацевтическом шкафу при пониженной положительной температуре от +1°С до +8°С. Растения хранились в плотно закрытых пробирках с твердой питательной средой.

Вызревшие растения хранились в холодильнике в течение 1÷4 х лет, а затем были расчеренкованы и высажены на свежую питательную среду. Выявлено, что микрочеренки сохранили регенерационную способность как при хранении в течение одного, так и двух, трех и даже четырех лет.

Таким образом, установлена возможность регенерации invitro растений из вызревших микрочеренков, что способствует продлению сроков беспересадочного хранения в соответствии с предлагаемым способом и подтверждается результатами экспериментов.

Исследования были проведены с использованием вызревших растений различных сортов винограда: Памяти Кострикина, Виерул, Феркаль, Рупе-стисдю Ло, Крестовский, Косоротовский, Кукановский, Кумшацкий, Каберне Совиньон, Красностоп золотовский, Сибирьковый, Денисовский, Фиолетовый ранний, Баклановский, Сыпун черный, Цимладар.

Результаты исследований приведены в Табл. 1÷7.

Таблица 1 - Вызревание invitro растений сорта Баклановский при различном содержании сахарозы в составе питательной среды,2014 г.

Таблица 2 - Вызревание микрочеренков при продолжительном культивировании растений в зависимости от содержания сахарозы в питательной среде, 2011-2012 гг.

Таблица 3 - Вызревание побегов некоторых сортов винограда при содержании сахарозы в питательной среде 60,0 г/л.

Таблица 4 - Показатели жизнеспособности растений различных сортов при хранении их на питательной среде с содержанием сахарозы 70,0 г/л, 2013 г.

Таблица 5 - Состояние растений после хранения при температуре+8°С в течение 3-4 х лет.

Таблица 6 - Регенерация растений в стандартных условиях культивирования (30 дней) после 3+4-х лет хранения их при температуре от +1÷ +8°С.

Таблица 7 - Ростовые процессы восстановленных растений при культивировании в течение 3 месяцев.

Как показали исследования наибольшее число растений сорта Баклановский с вызреванием побегов выявлено при концентрации сахарозы 50÷60 г/л (Табл. 1).

Вызревание лозы произошло и при культивировании растений сортов Крестовский и Сибирьковый (Табл. 2).

Лучшее вызревание выявлено при концентрации сахарозы 60,0 г/л, что позволило получить 140 одноглазковых микрочеренков. Этого количества достаточно для регенерации растений, массового их тиражирования и перезакладке коллекции.

В процессе продолжительного беспересадочного хранения пробирочных растений на питательной среде с повышенными концентрациями сахарозы (50÷60 г/л) появляется осенняя окраска листьев и происходит вызревание побегов у 11-ти различных сортов винограда (Табл. 3). Факт вызревания побегов в условиях депонирования является положительным для создания коллекции. Вызрело по 11 растений сортов Сыпун черный и Виерул, 8 растений сорта Цимлянский черный (клон 2÷3), по 5÷6 растений сортов Каберне Совиньон, Кумшацкий, Рупестрисдю Ло, Цимладар. Более слабое вызревание отмечено у растений сортов Красностоп золотовский, Баклановский, Сибирьковый. Показатели жизнеспособности растений различных сортов при хранении их на питательной среде с содержанием сахарозы 70,0 г/л, 2013 г. представлены в Табл. 4.

Пониженная положительная температура, в интервале от 1÷8°С - фактор замедляющий ростовые процессы. В связи с этим, дополнительно к культивированию при повышенном содержании сахарозы, осуществляли хранение вызревших пробирочных растений в фармацевтическом шкафу при пониженной положительной температуре 1÷8°С. Растения хранились в плотно закрытых пробирках с твердой питательной средой.

В холодильнике в течение одного года хранили, вызревшие растения сортов Памяти Кострикина, Виерул, Феркаль, Рупестисдю Ло; течение 2-х лет растения сортов Крестовский и Сибирьковый; в течение 3-х лет растения сортов Денисовский, Сибирьковый, Фиолетовый ранний; четыре года хранили растения сортов Баклановский, Виерул, Сыпун черный, Цимладар, Сибирьковый. Характеристики их состояния после хранения при температуре +8°С в течение 3÷4 х лет представлены в Табл. 5. Растения после хранения были одревесневшими с различной степенью вызревшей части. Среда в пробирках не высохла. Длина вызревшей части, как это следует из данных Табл. 5, колебалась от 49,8 до 70,3%. Лучшее вызревание, по сравнению с аборигенными, отмечено у межвидовых сортов винограда. Вызревание у подвоев также было высоким. У сортов Виерул и Рупестрисдю Ло оно составило 67,8-67,8%. Более значительное вызревание отмечено у сортов Фиолетовый ранний и Денисовский. Среди аборигенных сортов винограда по степени вызревания выделился Цимладар.

Растения сортов Баклановский, Виерул, Фиолетовый ранний, Денисовский, Сыпун черный, Цимладар и Цимлянский черный были расчеренкованы. Одревесневшие микрочеренки с живыми тканями были высажены на твердую питательную среду Мурасиге-Скуга.

Учет, проведенный через месяц, показал, что произошла единичная регенерация побегов у сортов Баклановский, Сыпун черный. Кроме этого, отмечено образование побега без корней у сорта Фиолетовый ранний, с корнями (4 шт.) у сорта Цимладар. У остальных одревесневших микрочеренков - развитие отсутствовало. Состояние регенерации растений в стандартных условиях культивирования (30 дней) после 3-4-х лет хранения их при температуре от +1 до +8°С представлено в Табл. 6. Дальнейшее культивирование в течение 3-х месяцев этих восстановленных растений в стандартных условиях культуральной комнаты при освещенности 2,0÷3,0 тыс. люксов, фотопериоде 16 часов, температуре 25÷27±2°С, влажности воздуха 70÷75% на твердой питательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением регулятора роста мелафен в концентрации 10^-7 способствовало дальнейшей регенерации и улучшению ростовых процессов как корней, так и побегов. Как видно из Табл. 7 происходит полное восстановление растений. Продолжительность беспересадочного культивирования таких растений увеличивается до 1÷4 лет в зависимости от сортовых особенностей.

Таким образом на основании полученных данных впервые доказана возможность беспересадочного хранения пробирочных растений винограда при температуре от +1 до +8°C в течение 3÷4 лет.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ хранения в культуре in vitro растений винограда с вызревшей лозой, позволяет обеспечить сохранность генетической стабильности образцов и повысить экономическую эффективность хранения генофонда винограда in vitro за счет увеличения продолжительности беспересадочного хранения, сокращения трудозатрат и исключения дорогостоящих реактивов. Способ включает введение в культуру апикальных меристем, формирование на их основе коллекции растений с вызревшей лозой, с предварительным культивированием на твердой питательной среде Мурасиге-Скуга и высадку на хранение. Пробирочные растения выдерживают на питательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением повышенных концентраций сахарозы 40,0-70,0 г/л, а культивирование осуществляют в условиях пониженной положительной температуры 1÷8°С. Изобретение позволяет увеличить продолжительность беспересадочного хранения. 7 табл.

Способ хранения в культуре in vitro растений винограда с вызревшей лозой, заключающийся в отборе растений винограда, регенерированных из апикальных систем и размноженных в культуре in vitro, микрочеренковании на твердую питательную среду Мурасиге-Скуга с добавлением повышенных концентраций сахарозы 40,0-70,0 г/л, культивировании при освещенности 2,0-3,0 тыс. люксов, фотопериоде 16 часов, температуре 25-27±2°С, при влажности воздуха 70-75% до созревания, с последующим хранением вызревших пробирочных растений в плотно закрытых пробирках с твердой питательной средой в холодильнике при температуре от 1 до 8°С в течение 1-4 лет.