Нейропротекторное средство Российский патент 2022 года по МПК A61K31/122 C07C50/32 A61P9/00 A61P25/00 

Изобретение относится к области клинической медицины, а именно неврологии и может быть использовано для фармакологической профилактики и коррекции нарушения кровоснабжения в ткани головного мозга на ранней стадии артериальной гипертензии.

Поражение головного мозга при артериальной гипертензии является одним из основных факторов, определяющих неблагоприятный прогноз данного заболевания и основной причиной стойкой утраты трудоспособности. Известно, что при артериальной гипертензии развитие церебральных нарушений обусловлено ухудшением кровоснабжения головного мозга вследствие расстройства микроциркуляции головного мозга [Кобалава Ж.Д. и др. Меморандум экспертов Российского кардиологического общества по рекомендациям Европейского общества кардиологов/Европейского общества по артериальной гипертензии по лечению артериальной гипертензии 2018 г. Российский Кардиологический Журнал. 2018;(12): 131-42].

К ранним проявлениям гипертонической энцефалопатии относятся различные варианты нарушений когнитивных функций, которые чаще всего проявляются в снижении памяти, концентрации внимания, пространственной ориентации. Морфологические изменения сосудов и тканей головного мозга при артериальной гипертензии, детально изученные на аутопсийном материале, однако относятся, в основном, к поздним стадиям заболевания, осложненным очаговыми и диффузными изменениями вещества мозга. При этом спектр патоморфологических изменений головного мозга при артериальной гипертензии включает лейкоареоз, демиелинизацию, глиоз, отек и дегенерацию нейронов.

Показано, что одним из ключевых механизмов нарушения функциональной активности нервных клеток при артериальной гипертензии, является избыточное образование активных форм кислорода, что приводит к изменению проницаемости клеточных мембран и накоплению кальция внутри нейронов [Williams et al. «2018 Practice guidelines for the management of arterial hypertension of the European Society of Cardiology and the European Society of Hypertension». Blood pressure 27.6 (2018): 314-340]. Нейрональные структуры относятся к наиболее уязвимым мишеням свободных радикалов, продуктов окислительного стресса, что обусловлено, в том числе, истощением синтеза эндогенных антиоксидантов и нарушением регуляторных механизмов антиоксидантной защиты.

Одним из известных препаратов, улучшающих кровоснабжение мозга, является антиоксидантный препарат эмоксипин (6-метил-2-этилпиридин-3-ол), который ингибирует свободно-радикальное окисление мембранных липидов, снижает уровень диеновых и триеновых коньюгатов. Эффект эмоксипина проявляется в коррекции активности диэстеразы циклических нуклеотидов, увеличиваю цАМФ в ткани головного мозга. Однако, несмотря на очевидную перспективность данного соединения в литературе отсутствуют данные о положительном терапевтическом эффекте эмоксипина на ранних проявлениях артериальной гипертензии. [Новиков В.Е. и др. Фармакология антиоксидантов на основе 3-оксипиридина [Электронный ресурс] / Режим доступа: http://www.mexifin.ru/nauka, 12.09.2017].

Еще одним из перспективных препаратов является отечественный антиоксидантный препарат мексидол (2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцинат). Мексидол обладает мембранотропным эффектом, ингибирует свободно-радикальное окисление клеточных мембран, повышает активность антиоксидантных ферментов.

Однако, несмотря на то, что мексидол оказывает влияние на основные звенья патогенеза цереброваскулярных заболеваний, он применяется на поздних стадиях развития патологии [Волчегорский И.А. и др. Анксиолитическое и антидепрессивное действие эмоксипина, реамберина и мексидола при экспериментальном сахарном диабете // Ж неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2017. Т. 117, №5. С. 52-57].

Известные препараты способствует снижению артериального давления и улучшению клинических показателей, но не являются хелаторами ионов железа и не стабилизируют систему антиоксидантной защиты.

Задача изобретения - расширение арсенала средств, обладающих нейропротекторным эффектом на ранней стадии развития артериальной гипертензии.

Задача решена применением гистохрома в качестве средства, обладающего нейропротекторным действием на ранней стадии развития артериальной гипертензии.

Технический результат состоит в предотвращении диффузионных изменений ткани головного мозга уже на ранней стадии развития артериальной гипертензии.

Изобретение может быть использовано для фармакологической профилактики и коррекции диффузионных нарушений тканей головного мозга при артериальной гипертензии, преимущественно на начальной стадии ее развития.

Препарат Гистохром^® представляет собой лекарственную форму индивидуального вещества - природного хиноидного пигмента морских ежей эхинохрома А (2,3,5,6,8-пентагидрокси-7-этил-1,4-нафтохинон, номер государственной регистрации Р №002362/01-2003).

Известно применение гистохрома для лечения заболеваний глаз. Гистохром^® в лекарственной форме раствор для инъекций 0,02 мг/мл применяется в качестве средства для лечения дистрофических заболеваний сетчатки и роговицы, диабетической ретинопатии сетчатки, показан при кровоизлияниях в стекловидное тело, сетчатку, переднюю камеру, при дисциркуляторных нарушениях в центральной артерии и вене сетчатки (номер государственной регистрации Р №002363/02-2003) [RU 2134107 С1, 10.08.1999].

В лекарственной форме раствор для внутривенного введения 10 мг/мл Гистохром^® применяют в кардиологии при остром инфаркте миокарда в сочетании с тромболитическими препаратами для устранения вызываемых ими реперфузионных осложнений, для уменьшения размеров инфаркта миокарда и для профилактики реперфузионного поражения миокарда (номер государственной регистрации Р №002363/01-2003) [RU 2137472 С1, 23.04.1999; Большая Российская энциклопедия лекарственных средств. Москва. 2001 «Ремедиум», Т. 2. С. 171].

Известно применение препарата Гистохром^® для лечения геморрагического инсульта [RU 2266737 С1, 27.12.2005] и в качестве средства для лечения ишемии сосудов головного мозга при острых нарушениях мозгового кровообращения [Агафонова и др. Сравнительный анализ изменения мозгового кровообращения у крыс с индуцированным острым нарушением мозгового кровообращения методом МРТ // Тихоокеанский медицинский журнал. 2012. №1. С. 104-107].

Известно применение гистохрома в качестве диуретического средства [RU 2408367 С1, 10.01.2011].

Использование гистохрома в качестве нейропротекторного средства при артериальной гипертензии в доступной патентной и научно-медицинской литературе не описано. Нейропротекторное действие гистохрома на ранних стадиях развития артериальной гипертензии по мнению экспертов не является очевидным фактом в связи с отсутствием объективных результатов, полученных при проведении инструментальных исследований у данного контингента больных.

Применение гистохрома по новому назначению стало возможным благодаря выявленному авторами новому свойству гистохрома снимать отек ткани головного мозга крыс на начальной стадии развития артериальной гипертензии.

Материалы и методы

Обозначения:

АГ - артериальная гипертензия

АД - артериальное давление

ДАД - диастолическое артериальное давление

ГМ - головной мозг

ЗМА - задние мозговые артерии

ИКД - измеряемый коэффициент диффузии

ИС - интенсивность сигнала

МРА - магнитно-резонансная ангиографии

МРТ - магнитно-резонансная томография

ОП - тест «Открытое поле»

ПМА передние мозговые артерии

САД - систолическое артериальное давление

Т₂-ВИ - Т₂ взвешенные изображения

DWI - Diffusion Weight Imaging (диффузионно-взвешенная томография)

ROI - Region of interest, область интереса

ОНМК - острое нарушение мозгового кровообращения

В исследовании использовали фармакопейный препарат «Гистохром®» в форме 0,02% раствора для внутривенного введения (ТИБОХ ДВО РАН, Россия).

Методами МРТ и МРА впервые исследовали нейропротекторные эффекты гистохрома после курсового введения крысам линии Вистар с индуцированной моделью АГ. Сканирование головного мозга проводили в режимах диффузионно-взвешенных изображений. Поведенческий статус животных оценивали в тесте «Открытое поле».

В эксперименте с животными соблюдались требования Директивы Европейского парламента и Совета ЕС (2010/63/ЕС) и Правил лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ №267 от 19.06.2003). Крысы линии Вистар были получены из питомника станция Столбовая (г. Москва). В исследование были включены 36 крыс-самцов в возрасте 6 месяцев весом 250-270 г, которые были размещены по 2 особи в клетке. Животные находились в стандартных условиях содержания вивария при естественном световом режиме и свободном доступе к воде. В контрольную группу входили 6 интактных животных, в экспериментальную группу было включено 30 крыс с многофакторной кардиовазоренальной моделью АГ.

Среди патогенетически ориентированных факторов диеты базовыми являлись холестерин и солевая нагрузка, которая была реализована путем замены питьевой воды на 1% раствор хлорида натрия. Электролитный дисбаланс усугублялся резким дефицитом солей калия и магния в суточном рационе (менее 50 г/кг), избытком солей натрия и соотношением K⁺/Na⁺ (1:18 при норме 1:0,9). Включение в диету холестерина было обусловлено его ключевым значением в процессах альтерации сосудов и эндотелиальной дисфункции. Дополнительным патогенетическим фактором служили ежедневные внутримышечные инъекции гидрокортизона ацетата из расчета 1,5 мг на 100 г массы животного, вызывающие дисбаланс эндокринных механизмов регуляции АД и усугубляющие нарушения водно-солевого обмена. На 13-е сутки эксперимента животные подвергались холодовому стрессу (содержание при 4°С в течение 4 часов) Экспериментальная модель АГ формировалась у крыс в течение 24 дней. Доказательством ее развития служило устойчивое повышение АД, которое фиксировалось уже на 3-ей неделе эксперимента. Его уровень измеряли неинвазивным методом хвостовой манжеты на анализаторе ML U/4 С501 ("MedLab", КНР). Регистрировали САД и ДАД, рассчитывали пульсовое и среднее гемодинамическое АД: 1/3 (САД-ДАД) + ДАД. Мониторинг АД проводили еженедельно в течение 3-х месяцев.

Среди 30 животных экспериментальной группы выделили две подгруппы (2А и 2Б) по 15 голов в каждой. Крысам подгруппы 2А в хвостовую вену вводили гистохром в дозе 0,1 мг/кг 1 раз в три дня на протяжении 4-х недель. Животным подгруппы 2Б внутривенно вводили физиологический раствор хлорида натрия по аналогичному протоколу.

Морфофункциональное состояние ткани и сосудов ГМ крыс контролировали МРТ в режимах DWI на томографе «PharmaScan US 70/16» (Bruker) с напряженностью магнитного поля 7,0 Тесла, частотой процессора 300 Мегагерц, предназначенного для экспериментальных исследований. Перед сканированием животных обездвиживали внутрибрюшинной инъекцией раствора рометара (Xylazinum, SPORA, Prague) в концентрации 5,5 мг/кг и реланиума в концентрации 37 мг/кг. МРТ-сканирование ГМ животных проводили до моделирования АГ и еженедельно на протяжении всего эксперимента. Морфометрические измерения зоны интереса анализировали с использованием программного обеспечения ParaVision 5.0. и вычислением размеров участков исследуемой ткани ROI (Region of Interest).

С применением импульсных последовательностей Т₂-ВИ получали послойные срезы во фронтальной, сагиттальной и горизонтальной плоскостях для анализа анатомических изменений мозговой ткани. Диффузионные изменения ГМ рассчитывали 3-х кратным включением различных градиентов, улавливающих перемещение молекул по трем осям в EPI-DWI импульсной последовательности. Для каждого очага строили карты и регистрировали ИКД. В настоящем исследовании диапазон между импульсами градиента составлял 1000 сек/мм².

Поведенческие реакции крыс оценивали в тесте «Открытое поле» (ОП) с определением локомоторной функции (пройденная дистанция и общая вертикальная активность), исследовательской активности (время обнюхивания норок), эмоционального состояния (количество актов дефекации, кратковременного и продолжительного груминга). Исследования выполнялись в соответствии со стандартными протоколами на оборудовании «OpenScience», РФ. Видеофиксация экспериментов проводилась в режиме реального времени с использованием цифровой видеосистемы EthoVision® ХТ (США) в специальном помещении при освещенности 500 Лк и уровне шума 30 дБ. Подсчет анализируемых показателей осуществляли в течение 5 минут после адаптации животных к условиям эксперимента. Полученные результаты обрабатывали методом вариационной статистики с использованием пакета программ MS Office Excel 2017 и Statistica 5.5 (StatSoft, Inc.). Достоверность различий между группами определяли по t критерию Стьюдента. Данные представлены в виде средней арифметической (М) и ошибки средней (m). Достоверными считали различия при р<0.05.

Результаты исследований нейропротекторной активности гистохрома представлены в примерах 1, 2, 3 и проиллюстрированы на фиг. 1, 2, 3.

Пример 1. В экспериментальной группе животных АД последовательно повышалось по мере формирования АГ и к концу 3 недели эксперимента САД фиксировалось на уровне 174,5±6,1 мм рт.ст., а ДАД - на уровне 102,3±5,3 мм рт.ст., что превышало их исходные значения на 72,7 и 37,6% соответственно. При этом наиболее интенсивный рост отмечен у пульсового АД (с 37,4±2,3 до 72,2±2,7 мм рт.ст.) и среднего гемодинамического АД (с 87,7±2,3 до 126,4±3,1 мм рт.ст.). Существенное повышение пульсового АД ассоциируется, как правило, с увеличением жесткости крупных артерий вследствие гипертрофического ремоделирования их стенок и возрастанием риска поражения органов-мишеней.

Для комплексной оценки нейропротективных эффектов гистохрома нами был проведен анализ поведенческого статуса животных в динамике развития АГ.

На фиг. 1 (а, б, в) показано влияние гистохрома на поведенческий статус гипертензивных крыс в тесте ОП, где 1 - интактные животные; 2 - животные с АГ; 3 и 4 - крысы, получавшие гистохром (второй и третий куре введения препарата).

Результаты исследования показали, что после второго курса введения препарата латентный период выхода крыс с центр поля сокращался на 20%, что свидетельствует о снижении тревожности животных. При этом активность леченых крыс увеличивалась почти в 1,6 раза (р<0.0001). Исследовательский компонент поведения, выраженный количеством вертикальных стоек, возрастал до 30% по сравнению с контролем (р<0.001).

Пример 2. На фоне «бессимптомного» функционального статуса гипертензивных крыс изменения ИС на диффузионных картах в подкорковой области, в зонах ПМА и СМА начали формироваться уже через неделю после начала эксперимента. По мере стабилизации АГ у крыс этой группы были зафиксированы участки гиперинтенсивных сигналов в срединных структурах мозга и в области кортекса (RSG - cortex retrospenialis). На основе полученных данных была выполнена количественная оценка диффузионных изменений ГМ путем анализа ИКД.

На фиг. 2 (а, б) представлена схема ГМ из базы данных http://rat brain atlas.org. Стрелкам отмечены зоны серого и белого вещества, в которых проводились измерения: (а) - схема ГМ, (б) - Т₂- ВИ.

Пример 3. Определены МРТ-индикаторы функционального статуса ГМ гипертензивных крыс после двух курсов терапии гистохромом. На фиг. 3 (а, б, в) представлены результаты изменения ROI, ИС, ИКД в областях интереса ГМ.

В экспериментальной группе крыс наблюдалось снижение ИС в подкорковой области по ИКД до 0,356±0,03 ×10^-3мм²/сек в сравнении с интактными животными - 0,91±0,002 ×10^-3мм²/сек (р<0.0001). Снижение скорости диффузии мозговой ткани в области ПМА находилось в пределах 0,583±0,004 ×10^-3мм²/сек по сравнению с аналогичной зоной у крыс контрольной группы - 0,891±0,003 ×10^-3мм²/сек (р<0.003). Для СМА зона интереса совпадала с областью белого вещества ГМ, где коэффициент диффузии составлял 0,314±0,003 ×10^-3мм²/сек. При этом в соответствующей зоне интактных крыс этот показатель фиксировался на уровне 0,705±0,002 ×10^-3мм²/сек при ROI 0,20 мм² (р<0.0001). На протяжении первых недель эксперимента по мере формирования устойчивой АГ зона гиперинтенсивного сигнала на ДВИ расширялась от 2-х до 4-х раз по показателям ROI (фиг. 3а). На фиг. 3б показано снижение ИС на ИКД в областях интереса. При этом максимальное ограничение ИС отмечено для региона ПМА. Соответственно, количественный показатель ИКД увеличивался после каждого курса гистотерапии (фиг. 3в). Сканирование ткани ГМ в стандартном МРТ-режиме в эти же сроки эксперимента не указывало на наличие ультраструктурных изменений.

Максимальное снижение ИС от мозговой ткани в области интереса (в 2 раза по сравнению с контролем) имело место после 1 курса введения гистохрома. После второго курса экспериментальной терапии границы, сформировавшейся на фоне АГ зоны нарушенной диффузии ГМ, стабилизировались. При этом интенсивность сигнала от мозговой ткани в областях интереса у крыс подгруппы 2А сокращалась и была на 25% ниже аналогичной величины у гипертензивных крыс, не получавших гистохром (р<0,05). Одновременно у большинства крыс данной группы было зафиксировано снижение коэффициента диффузии в подкорковой зоне и в бассейне ПМА. Наиболее выраженное нейропротективное действие гистохром оказывает после проведения трех курсов терапии. В этот период гистохром снижал распространение сигнала от ткани ГМ, более чем на 30%, соответственно показатели ИКД увеличивались (фиг. 3в). При продолжающемся введении препарата (4 курс) его позитивное воздействие на мозговую ткань не проявлялось. Полученные данные позволяют предположить, что гистохром предотвращает расширение зоны нарушенной диффузии в начальный период развития АГ, а при ее стабилизации влияние данного препарата на сигнальные характеристики ДВИ менее заметны.

Таким образом, через три недели от начала формирования АГ было зафиксировано стойкое изменение поведения животных. При этом нейропротекторный эффект гистохрома выражался в достоверном улучшении показателей их поведенческого статуса в тесте ОП уже через две недели после курсового введения препарата.

По данным анализа МРТ установлено, что у гипертензивных крыс по сравнению с интактными животными регистрируется более заметное усиление сигнальных характеристик ГМ, обусловленное избыточным скоплением жидкости в интра- и экстрацеллюлярных пространствах мозговой ткани, что ассоциируется с гиперволемией, индуцированной многофакторной кардиовазоренальной моделью АГ. После курсового введения гистохрома гипертензивным крысам выявлено, что нарушения церебральной микроциркуляции в значительной степени нивелировались, а поведенческий статус характеризовался сокращением латентного периода выхода крыс с центр поля на 20%, увеличением почти в 1,6 раза когнитивной активности и возрастанием на 30% исследовательского компонента поведения.

Результаты исследования свидетельствуют о том, что гистохром в качестве нейропротективного средства может войти в комплексную терапию артериальной гипертензии, особенно на ранних стадиях ее развития.

Настоящее изобретение относится к области медицины и фармакологии, а именно неврологии, и предназначено для применения гистохрома в качестве нейропротекторного средства, предотвращающего диффузионные изменения ткани головного мозга на ранней стадии развития артериальной гипертензии. Техническим результатом настоящего изобретения является предотвращение диффузионных изменений ткани головного мозга уже на ранней стадии развития артериальной гипертензии. 3 пр., 3 ил.

Применение гистохрома в качестве нейропротекторного средства, предотвращающего диффузионные изменения ткани головного мозга на ранней стадии развития артериальной гипертензии.