КОМБИНИРОВАННЫЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА, СОДЕРЖАЩИЕ МОДУЛЯТОРЫ PKM2 И HMGB1 Российский патент 2022 года по МПК A61K38/17 A61P35/00 

Настоящее изобретение относится к комбинированному лекарственному средству, которое содержит (i) модулятор активности пируваткиназы М2 (PKM2) и (ii) агент, обеспечивающий полипептид высокомобильной группы бокс 1 (HMGB1) или его производное. Настоящее изобретение также относится к применению указанного комбинированного лекарственного средства в качестве медикамента и при лечении нежелательной клеточной пролиферации, предпочтительно при лечении рака. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу определения того, восприимчив ли субъект, страдающий от нежелательной клеточной пролиферации, к лечению, включающему введение модулятора активности PKM2 в качестве единственного ингибитора PKM2, и к связанным с ним способам лечения.

Белок высокомобильной группы бокс 1 (HMGB1) принадлежит к высокомобильной группе (HMG) семейства ядерных белков, которая была так названа в связи с необычно высокой подвижностью ее членов в ДСН-полиакриламидном гель-электрофорезе (ДСН-ПААГ-электрофорез). Эти белки являются вторыми после гистонов по распространенности среди белков, связанных с хроматином, и они играют формообразующую роль в ядре эукариотических клеток, с которым они связаны, искривляя или иным образом модифицируя конформацию ДНК, и тем самым также модифицируя связывание факторов транскрипции с ДНК. Белки HMG участвуют в развитии различных заболеваний, таких как некоторые виды доброкачественных опухолей и аутоиммунных заболеваний. Более того, высвобождение большого количества HMGB1, в частности из NK-клеток, является ключевым событием при активации дендритных клеток (Saidi et al. (2008), PloS one 3, e3601) и хемотаксисе (Yang et al. (2007), Journal of leukocyte biology 81, 59-66). Кроме того, HMGB1 демонстрирует исключительную антимикробную активность, которая приводит к быстрой гибели бактерий (Zetterstrom et al., (2002), Pediatric research 52, 148-154)

Эндогенный HMGB1 также принимает непосредственное участие в энергетическом метаболизме в клетках и органах. Мыши с нокаутом по HMGB1 не способны использовать пулы хранения гликогена в гепатоцитах и умирают из-за перинатальной гипогликемии. Глюкоза временно спасает животных, но мыши погибают через несколько дней из-за тяжелой атрофии внутренних органов, мышечной и жировой ткани (Calogero et al. (1999), Nature genetics 22, 276-280). Инкубация ex vivo мышечной ткани мышей с HMGB1 приводит к быстрому истощению мышечных волокон, а повышенные концентрации HMGB1 обнаружены в миоплазме субъектов, страдающих от полимиозита (Grundtman et al. (2010), The FASEB journal 24, 570-578). Подводя итог, как недостаток, так и избыток HMGB1 серьезно влияет на энергетический метаболизм в клетках.

Внеклеточный HMGB1 является мощным цитокином и сильным фактором активации макрофагов и других клеток иммунной системы, что приводит к обширной воспалительной реакции. По этой причине HMGB1 играет роль в аутоиммунных заболеваниях, таких как системная красная волчанка и ревматоидный артрит. Однако также обнаружено, что высокое количество HMGB1 в крови указывает на тяжелые или опасные для жизни воспалительные заболевания, такие как сепсис. Описаны ингибиторы функции HMGB1, такие как ингибиторные антитела или их фрагменты, варианты HMGB1, содержащие мутации в А-боксе, или полимерные конъюгаты по области А-бокса, которые противодействуют таким связанным с HMGB1 патологиям (US 6,468,533, WO 02/074337, US 2003/0144201, WO 2006024547 и WO 2008031612). С другой стороны, HMGB1 был предложен в качестве противоракового средства (US 2011/0123483 А1).

У белков HMGB1 описано несколько структурных мотивов: два ДНК-связывающих домена (А-бокс и В-бокс), две последовательности ядерной локализации и С-концевой кислотный домен. Белки HMGB1 могут интенсивно модифицироваться после трансляции путем ацетилирования, метилирования, АДФ-рибозилирования, фосфорилирования или гликозилирования. Ацетилирование сайтов ядерной локализации является сигналом, который вызывает активную секрецию белка HMGB1 из активированных клеток иммунной системы. Помимо активной секреции, HMGB1 также пассивно высвобождается из некротических клеток.

Недавно было определено, что фермент пируваткиназа М2 (PKM2) является специфичной мишенью при терапии рака, которую, в частности, вырабатывают раковые клетки. PKM2 представляет собой фермент, определяющий скорость реакции гликолиза, который присутствует в двух формах: тетрамерная форма служит для аэробного расщепления глюкозы и имеет низкое значение К_м для его субстрата фосфоенолпирувата (ФЕП); соответственно, тетрамерная форма высокоактивна при физиологических концентрациях ФЕП, вызывая перенаправление глюкозы в энергетический метаболизм. Димерная форма PKM2 имеет высокое значение K_m для ФЕП и почти неактивна при физиологических концентрациях ФЕП, что приводит к возникновению промежуточных продуктов гликолиза, перед тем как пируват направляется в процессы синтеза.

Известны две группы модуляторов PKM2: Ингибиторы, например специфичные фосфотирозинпептиды, например P-M2tide (тирозин-фосфорилированный пептид GGAVDDDYAQFANGG (SEQ ID №: 1)), которые вызывают расщепление тетрамеров в димерную форму. Активаторы, например ML265 (CAS-NO: 1221186-53-3, 6- (3-аминобензил) -4-метил-2- (метилсульфинил) -4,6-дигидро-5Н-тиено [2', 3' : 4, 5] пирроло [2,3-d] пиридазин-5-он), которые стабилизируют тетрамерную форму PKM2. Представляет интерес, что, как было установлено, ингибиторы, а также активаторы PKM2 обладают противоопухолевой активностью; однако для достижения эффекта следует применять соединения в высоких концентрациях (приблизительно 100 мкМ или выше).

Лечение рака, помимо хирургического удаления опухолевой ткани, по существу зависит от применения лекарственных средств и/или лечения, которые оказывают отрицательное действие на активно делящиеся клетки. По своей природе такое лечение будет также наносить вред не являющимся опухолевыми клеткам и тканям, претерпевающим клеточное деление в организме человека, что приводит к большинству хорошо известных и тяжелых побочных эффектов химиотерапии и лучевой терапии, таким как тошнота, расстройства пищеварения, усталость, потеря волос и так далее. Таким образом, желательно иметь в арсенале новые терапевтические средства, эффективные благодаря прежде неизвестным путям действия, что потенциально позволяет уменьшить дозу при химиотерапии или лучевой терапии и снизить побочные эффекты. Предоставление таких средств, использующих новые пути уничтожения раковых клеток, также может потенциально способствовать удалению раковых стволовых клеток, которые могут выдержать химиотерапию, попав в состояние покоя, и которые, как недавно обнаружили, ответственны за по меньшей мере часть всех рецидивов и метастаз.

Соответственно, настоящее изобретение относится к комбинированному лекарственному средству, содержащему

(i) модулятор активности пируваткиназы М2 (PKM2) и

(ii) агент, обеспечивающий белок высокомобильной группы бокс 1 (HMGB1) или его производное.

В настоящей заявке термины «иметь», «содержать» или «включать» или любые их произвольные грамматические вариации используются неисключающим образом. Таким образом, эти термины могут равным образом относиться к ситуации, в которой, кроме признака, представленного этими терминами, никакие дополнительные признаки не присутствуют в объекте, описанном в этом контексте, и к ситуации, в которой присутствуют один или более дополнительных признаков. Например, выражения «А имеет В», «А содержит В» и «А включает В» могут равным образом относиться к ситуации, в которой, кроме В, в А нет другого элемента (то есть к ситуации, в которой А только и исключительно состоит из В) и к ситуации, в которой помимо В в объекте А присутствуют один или несколько дополнительных элементов, такие как элемент С, элементы С и D или даже большее количество элементов.

Кроме того, в настоящей заявке термины «предпочтительно», «более предпочтительно», «наиболее предпочтительно», «в частности» или подобные термины использованы в сочетании с необязательными признаками, без ограничения дополнительных возможностей. Таким образом, признаки, представленные этими терминами, являются необязательными и не предназначены для какого бы то ни было ограничения объема притязаний. Изобретение, как будет понятно специалисту в данной области техники, может осуществляться с применением альтернативных признаков. Подобным образом, предполагается, что признаки, представленные выражением «в варианте реализации изобретения» или подобными выражениями, являются дополнительными признаками, без каких-либо ограничений относительно дополнительных вариантов реализации изобретения, без каких-либо ограничений относительно объема изобретения и без каких-либо ограничений относительно возможности комбинировать признаки, представленные таким образом, с другими необязательными или обязательными признаками изобретения. Кроме того, если не указано иное, термин «примерно» относится к указанному значению ±20%.

Термин «комбинированное лекарственное средство», при упоминании в настоящей заявке, относится к лекарственному средству, содержащему фармацевтически активные соединения согласно настоящему изобретению в одном препарате. Предпочтительно комбинированное лекарственное средство содержится в контейнере, то есть предпочтительно указанный контейнер содержит все фармацевтически активные соединения согласно настоящему изобретению. Предпочтительно указанный контейнер содержит фармацевтически активные соединения согласно настоящему изобретению в виде отдельных составов, т.е. предпочтительно один состав с модулятором активности PKM2, и один состав с агентом, обеспечивающим белок высокомобильной группы бокс 1 (HMGB1) или его производное, более предпочтительно, указанный контейнер содержит фармацевтически активные соединения согласно настоящему изобретению в одной лекарственной форме, например, предпочтительно в виде двухслойных таблеток или тому подобного. Наиболее предпочтительно комбинированное лекарственное средство представляет собой смешанную лекарственную форму, т.е. предпочтительно комбинированное лекарственное средство содержит смесь соединений согласно настоящему изобретению. Для специалистов в данной области техники будет понятно, что термин «состав» относится к предпочтительно фармацевтически приемлемой смеси соединений, содержащей или состоящей из по меньшей мере одного фармацевтически активного соединения согласно настоящему изобретению. Предпочтительно комбинированное лекарственное средство содержит модулятор активности PKM2 и агент, обеспечивающий белок высокомобильной группы бокс 1 (HMGB1) или его производное в одной лекарственной форме, например таблетке или растворе для инфузии; более предпочтительно, комбинированное лекарственное средство содержит смесь модулятора активности PKM2 и агента, обеспечивающего белок высокомобильной группы бокс 1 (HMGB1) или его производное.

Предпочтительно комбинированное лекарственное средство предназначено для раздельного или комбинированного введения. В настоящем описании «раздельное введение» относится к введению, отличающемуся тем, что по меньшей мере два фармацевтически активных соединения согласно настоящему изобретению вводят различными способами. Например, одно соединение могут вводить энтерально (например, перорально), а второе соединение вводят парентерально (например, внутривенно). Предпочтительно комбинированное лекарственное средство для раздельного введения содержит по меньшей мере два физически отдельных лекарственных средства для раздельного введения, отличающегося тем, что каждое лекарственное средство содержит по меньшей мере одно фармацевтически активное соединение; указанная альтернатива предпочтительна, например, в случаях, отличающихся тем, что фармацевтически активные соединения комбинированного лекарственного средства необходимо вводить различными способами, например парентерально и перорально, из-за их химических или физических свойств. И наоборот, «комбинированное введение» относится к введению, отличающемуся тем, что фармацевтически активные соединения согласно настоящему изобретению вводят одним способом, например перорально или внутривенно.

Также предпочтительно комбинированное лекарственное средство предназначено для одновременного или последовательного введения. В настоящем описании «одновременное введение» относится к введению, отличающемуся тем, что фармацевтически активные соединения согласно настоящему изобретению вводят в одно и то же время, т.е. предпочтительно введение фармацевтически активных соединений начинают в пределах временного интервала менее 15 минут, более предпочтительно в пределах временного интервала менее 5 минут. Наиболее предпочтительно введение фармацевтически активных соединений начинают в одно и то же время, например, путем глотания таблетки, содержащей фармацевтически активные соединения, или путем введения внутривенной инъекции раствора, содержащего фармацевтически активные соединения. И наоборот, в настоящем описании «последовательное введение» относится к введению, обеспечивающему у субъекта концентрации в плазме крови фармацевически активных соединений, которые обеспечивают синергетический эффект согласно настоящему изобретению, но введение предпочтительно не является одновременным введением, описанным в настоящем документе выше. Предпочтительно последовательное введение представляет собой введение, отличающееся тем, что введение фармацевтически активных соединений, предпочтительно всех фармацевтически активных соединений, начинают в пределах временного интервала 1 или 2 дня, более предпочтительно в пределах временного интервала 12 часов, еще более предпочтительно в пределах временного интервала 4 часа, еще более предпочтительно в пределах временного интервала один час, наиболее предпочтительно в пределах временного интервала 5 минут.

Предпочтительно комбинированное лекарственное средство представляет собой фармацевтически совместимое комбинированное лекарственное средство. В настоящем описании термины «фармацевтически совместимое лекарственное средство» и «фармацевтическая композиция» относятся к композициям, содержащим по меньшей мере одно соединение согласно настоящему изобретению и необязательно один или более фармацевтически приемлемых носителей. Соединения согласно настоящему изобретению могут быть представлены в виде фармацевтически приемлемых солей. Предпочтительные приемлемые соли представляют собой ацетат, метилэфир, HCl, сульфат, хлорид и т.п. Фармацевтические композиции предпочтительно вводят местно или, более предпочтительно, системно. Подходящими способами введения, которые обычно применяют для введения лекарственного средства, являются пероральное, внутривенное или парентеральное введение, а также ингаляция. Однако в зависимости от природы и режима действия соединения фармацевтические композиции могут вводить также другими способами. Кроме того, соединения можно вводить в комбинации с другими лекарственными средствами либо в общей фармацевтической композиции, либо в виде отдельных фармацевтических композиций, как описано в настоящем документе, где указанные отдельные фармацевтические композиции могут быть представлены в виде набора из отдельных частей.

Соединения предпочтительно вводят в виде обычных дозированных форм, полученных путем комбинирования лекарственных средств со стандартными фармацевтическими носителями в соответствии с общепринятыми процедурами. Эти процедуры могут включать смешивание, измельчение и прессование или растворение ингредиентов в соответствии с желаемым средством. Понятно, что форму и характер фармацевтически приемлемого носителя или растворителя определяет количество активного ингредиента, с которым его комбинируют, способ введения и другие хорошо известные вариации.

Носитель(и) должен(ы) быть приемлемым(и) в отношении совместимости с другими ингредиентами состава и не должны иметь отрицательного воздействия на реципиентов. Применяемый фармацевтический носитель может представлять собой, например, твердое вещество, гель или жидкость. Примерами твердых носителей являются лактоза, каолин (terra alba), сахароза, тальк, желатин, агар, пектин, гуммиарабик, магния стеарат, стеариновая кислота и т.п. Примерами жидких носителей являются фосфатно-солевой буферный раствор, сироп, масло, такое как арахисовое масло и оливковое масло, вода, эмульсии, различные виды смачивающих агентов, стерильные растворы и т.д. Аналогичным образом носитель или растворитель могут включать обеспечивающий временную задержку материал, хорошо известный специалистам в данной области техники, такой как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат по отдельности или с воском. Указанные подходящие носители включают упомянутые выше и другие, хорошо известные специалистам в данной области техники, например, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Истон, Пенсильвания.

Растворитель(и) выбран(ы) так, чтобы они не оказывали влияние на биологическую активность соединения или соединений. Примерами таких растворителей являются дистиллированная вода, физиологический раствор, растворы Рингера, раствор декстрозы и раствор Хенкса. Кроме того, фармацевтическая композиция или лекарственная форма может также включать другие носители, адъюванты или нетоксичные нетерапевтические, неиммунные стабилизаторы и т.п.

Терапевтически эффективная доза относится к количеству соединений, применяемых в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, которое предотвращает, улучшает или лечит симптомы, сопутствующие заболеванию или патологическому состоянию, упомянутому в этой заявке. Терапевтическую эффективность и токсичность таких соединений можно определить с помощью стандартных фармацевтических процедур на культурах клеток или экспериментальных животных, например, определяя ED₅₀ (дозу, терапевтически эффективную для 50% особей популяции) и LD₅₀ (дозу, смертельную для 50% особей популяции). Соотношение доз, оказывающих токсическое и терапевтическое действие, представляет собой терапевтический индекс и может быть выражено в виде соотношения LD50/ED50.

Режим дозирования будет определяться лечащим врачом в совокупности другими клиническими факторами; предпочтительно в соответствии с любым из выше описанных способов. Как хорошо известно специалистам в области медицины, дозировки для каждого отдельного субъекта зависят от многих факторов, включая размер субъекта, поверхность тела субъекта, возраст, вводимое соединение, пол, время и способ введения, общее состояние здоровья и другие сопутствующие лекарственные средства, вводимые субъекту. Прогресс можно контролировать путем периодической оценки. Типичная доза может быть, например, в диапазоне от 1 до 1000 мкг; однако предусмотрены дозы ниже или выше этого примерного диапазона, особенно с учетом вышеперечисленных факторов. Как правило, дозирование, представляя собой регулярное введение фармацевтической композиции, должно находиться в диапазоне от 1 до 10 мг в день. Если дозирование представляет собой непрерывную инфузию, следует также соблюдать диапазон от 1 мкг до 10 мг единиц на килограмм массы тела в минуту, соответственно. Прогресс можно контролировать путем периодической оценки. Предпочитаемые дозы и концентрации соединений описаны в настоящем документе далее.

Фармацевтические композиции и лекарственные формы, упомянутые в настоящем документе, предпочтительно, вводят по меньшей мере один раз с целью лечения или облегчения или предотвращения заболевания или патологического состояния, упомянутого в этой заявке. Однако указанные фармацевтические композиции можно вводить более одного раза, например, от одного до четырех раз в день в течение неограниченного количества дней.

Конкретные фармацевтической композиции получают способом, хорошо известным специалистам в области фармацевтики, и содержат по меньшей мере одно активное соединение, упомянутое в настоящем документе выше в смеси или иным образом связанное с фармацевтически приемлемым носителем или растворителем. При изготовлении этих конкретных фармацевтических композиций активное(ые) соединение(я) будут обычно смешаны с носителем или растворителем или заключены или инкапсулированы в капсулу, саше, крахмальную облатку, бумагу или другие подходящие контейнеры или средства для транспортировки. Полученные лекарственные формы должны быть адаптированы к способу введения, то есть быть представлены в виде таблеток, капсул, суппозиториев, растворов, суспензий или тому подобного. Для того чтобы предусмотреть корректировку дозы в зависимости от рассматриваемого реципиента, в предписаниях или инструкциях пользователя будут указаны рекомендации по дозированию.

Термин «производное», если речь идет о химическом соединении согласно настоящему изобретению, относится к химической молекуле, имеющей структуру, которая относится к указанному химическому соединению согласно настоящему изобретению. Предпочтительно производное может быть получено из химического соединения согласно настоящему изобретению путем не более чем трех, более предпочтительно не более чем двух, наиболее предпочтительно не более чем одной химических реакций дериватизации. Предпочтительно производное представляет собой соединение, которое в ходе обмена веществ в организме млекопитающего, предпочтительно человека, превращается в химическое соединение согласно настоящему изобретению. Также предпочтительно производное представляет собой соединение, из которого путем гидролиза может быть получено химическое соединение согласно настоящему изобретению. Если химическое соединение представляет собой пептид или полипептид, предпочтительно, чтобы производное представляло собой соединение, имеющее по меньшей мере степень сходства, указанную в настоящем документе ниже, с соединением, из которого оно получено. Указанное в настоящем документе производное полипептида высокомобильной группы бокс 1 (HMGB1), описанное в настоящем документе ниже, или производное бокса В полипептида HMGB1, описанное в настоящем документе ниже, обладает активностью в отношении подавления раковых клеток, предпочтительно клеток рака толстой кишки, более предпочтительно НСТ116 и/или, предпочтительно, подавления активности тетрамерной формы PKM2.

Термин «пируваткиназа» или «PK» понятен специалисту в данной области техники и относится к ферменту, катализирующему перенос фосфатной группы из фосфоенолпирувата в АДФ с получением АТФ и пирувата (ЕС 2.7.1.40). Известно, что позвоночные имеют четыре изоформы пируваткиназы, из которых две кодируются одним и тем же геном, соответственно. Генами человека, кодирующими пируваткиназы, являются PKLR (Genbank Асе. No: NM_000298.5 GI: 189095249) и PKM, описанные в настоящем документе ниже.

В настоящем описании термин «пируваткиназа М» или «PKM» относится к одному из продуктов гена PKM, предпочтительно гена PKM человека. С гена PKM транскрибируются несколько сплайс-вариантов, которые дают несколько изоферментов. Изоформа а, также называемая пируваткиназой М1 (PKM1, Genbank АКК. No: NP_002645.3 GI:33286418, SEQ ID №: 8), представляет собой тетрамерный фермент с высокой аффинностью к фосфоенолпируватному субстрату. Вторую изоформу пируваткиназы М называют «пируваткиназой М2» или «PKM2». Таким образом предпочтительно PKM настоящего изобретения представляет собой PKM2 Предпочтительно PKM2 представляет собой PKM2 млекопитающих, более предпочтительно PKM2 человека. Предпочтительно PKM2 содержит, или, более предпочтительно, состоит из аминокислотных последовательностей Genbank АКК NO: AAQ15274.1 GI:33346925 (SEQ ID №: 2), предпочтительно кодированных полинуклеотидом, содержащем или состоящем из последовательности нуклеиновой кислоты Genbank АКК NO: KJ891817.1 GI:649102182 или SEQ ID №: 3. PKM2 может существовать в тетрамерной форме, предпочтительно нефосфорилированной, предпочтительно имеющей высокую аффинность к фосфоенолпируватному субстрату; и в димерной форме, предпочтительно фосфорилированной, имеющей низкую аффинность к фосфоенолпируватному субстрату. Поскольку стандартные анализы активности не делают различий между PKM1 и высокоаффинной формой PKM2, термины «высокоаффинная пируваткиназа», именуемая также «пируваткиназой с высокой аффинностью» или «PKHA», включают оба вышеупомянутых изофермента. Напротив, термин «низкоаффиннная пируваткиназа», именуемая также «пируваткиназой с низкой аффинностью» или «PKLA», относится к димерной форме PKM2. При необходимости сослаться на конкретную высокоаффинную форму PKM2 используется термин «высокоаффинная PKM2» или «PKM2HA».

В настоящем описании термин «модулятор активности PKM2» относится к агенту, модулирующему активность пируваткиназы М2 (PKM2), то есть предпочтительно, чтобы модулятор увеличивал или уменьшал активность PKM2, по меньшей мере, на 10%, более предпочтительно по меньшей мере на 25%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 50%, если он присутствует в эффективной концентрации в известной специалисту в данной области техники аналитической смеси, определяющей активность PKM2, предпочтительно как описано ниже. Специалист в данной области техники знает, как определить эффективную концентрацию; предпочтительно эффективная концентрация модулятора активности PKM2 составляет от 10 мкМ до 100 мМ, более предпочтительно от 50 мкМ до 50 мМ, наиболее предпочтительно от 100 мкМ до 10 мМ. Как будет понятно специалисту в данной области техники, активность соединения-кандидата при модулировании активности PKM2 предпочтительно определяют в отсутствие дополнительных модуляторов активности PKM2. Предпочтительно модулятор PKM2 представляет собой соединение, которое не вырабатывается организмом субъекта, более предпочтительно соединение, которое не вырабатывается и/или не потребляется при гликолизе. Таким образом, модулятор активности PKM2 не является агентом, обеспечивающим HMGB1 или его производное, и предпочтительно не является D-фруктоза-1,6 бисфосфатом. Предпочтительно, модулятор активности PKM2 деятельности представляет собой ингибитор активности PKM2, более предпочтительно, соединение, дестабилизирующее тетрамерную форму PKM2, еще более предпочтительно, представляет собой P-M2tide (тирозин-фосфорилированный пептид GGAVDDDYAQFANGG (SEQ ID №: 1)) или его производное, указанное производное Р-M2tide, обладающее активностью в отношении ингибирования активности PKM2 или обеспечивающее соединение, обладающее указанной активностью в ходе обмене веществ в организме субъекта. Также предпочтительно, модулятор активности представляет собой активатор активности PKM2, более предпочтительно, соединение, стабилизирующее тетрамерную форму PKM2, еще более предпочтительно, представляет собой ML265 (КАС NO: 1221186-53-3, 6-(3-аминобензил)-4-метил-2-(метилсулфинил)-4,6-дигидро-5Н-тиено[2',3':4,5]-пирроло[2,3-d]пиридазин-5-он) или DASA (1-(2,6-дифторфенилсульфонил)-4-(2,3-дигидробезно[b][1,4]диоксин-6-илсульфонил)пиперазин). Соответственно, согласно настоящему изобретению модулятор активности PKM2 представляет собой агент, модулирующий равновесие тетрамерной и димерной форм PKM2.

Предпочтительно модулятор активности PKM2 применяют в концентрации менее чем 0,1 мМ, более предпочтительно менее чем 0,05 мМ, наиболее предпочтительно менее чем 0,01 мМ; или, предпочтительно, в дозе, обеспечивающей концентрацию в плазме менее чем 0,1 мМ, более предпочтительно менее чем 0,05 мМ, наиболее предпочтительно менее чем 0,01 мМ. Также предпочтительно модулятор активности PKM2 применяют в концентрации от 0,0005 мМ до 0,1 мм, более предпочтительно от 0,001 мМ до 0,05 мМ, наиболее предпочтительно от 0,005 мМ до 0,01 мМ; или, предпочтительно, в дозе, обеспечивающей концентрацию в плазме крови от 0,0005 мМ до 0,1 мМ, более предпочтительно от 0,001 мМ до 0,05 мМ, наиболее предпочтительно от 0,005 мМ до 0,01 мМ.

В настоящем описании термин «полипептид высокомобильной группы бокс 1» (полипептид HMGB1) относится к члену высокомобильной группы полипептидов, известной специалистам в данной области техники; или к их частичным последовательностям или производным, обладающим активностью в отношении ингибирования активности тетрамерной формы PKM2. Предпочтительно, полипептид HMGB1 представляет собой полипептид HMGB1 человека (Genbank АКК No: NP_002119.1 GI:4504425, SEQ ID №: 4) или его частичную последовательность или производное, обладающее указанной выше активностью. Подходящие для измерения вышеупомянутых активностей анализы описаны в прилагаемых Примерах. Полипептид HMGB1 может быть очищен от клеток или тканей, или он может быть химически синтезирован, или, предпочтительно, может быть произведен рекомбинантным способом. Полипептид HMGB1 может содержать дополнительные аминокислоты, которые могут служить маркером для очистки или детекции, или полипептид HMGB1 может находиться в составе гибридного полипептида, как описано в другом месте настоящего документа.

Предпочтительные производные полипептидов согласно настоящему изобретению, включая полипептид HMGB1, описаны в другом месте настоящего документа. В предпочтительном варианте реализации изобретения производное полипептида HMGB1 представляет собой полипептид, содержащий мотив В-бокса HMGB1, предпочтительно содержащий бокс В HMGB1 человека, более предпочтительно содержащий SEQ ID NO: 5 или его производное, более предпочтительно содержащего полифосфорилированный бокс В HMGB1 человека, предпочтительно, как описано в настоящем документе ниже.

Предпочтительно полипептид HMGB1 является фосфорилированным, более предпочтительно тирозин-фосфорилированным по меньшей мере в одной, предпочтительно по меньшей мере в двух, еще более предпочтительно по меньшей мере в трех, наиболее предпочтительно во всех четырех позициях, выбранных из Y109, Y144, Y155 и Y162. Также предпочтительно полипептид, содержащий область В-бокса полипептида HMGB1, является фосфорилированным, более предпочтительно тирозин-фосфорилированным по меньшей мере в одной, предпочтительно по меньшей мере в двух, еще более предпочтительно по меньшей мере в трех, наиболее предпочтительно во всех четырех позициях, выбранных из позиций, соответствующих Y109, Y144, Y155 и Y162 полипептида HMGB1. Соответственно, в настоящем описании термин «полифосфорилированный полипептид HMGB1» относится к полипептиду HMGB1, фосфорилированному по меньшей мере в двух, предпочтительно по меньшей мере в трех, более предпочтительно во всех четырех позициях, выбранных из позиций, соответствующих Y109, Y144, Y155 и Y162 полипептида HMGB1. Наиболее предпочтительно фосфорилированный полипептид HMGB1 представляет собой полипептид HMGB1, фосфорилированный в четырех вышеупомянутых остатках тирозина и дополнительно форсфорилированный по меньшей мере в одном дополнительном остатке, предпочтительно в остатке серина и/или треонина, предпочтительно в В-боксе полипептида. Соответственно, в настоящем описании термин «производное полифосфорилированного полипептида HMGB1» относится к производному полипептида HMGB1, описанному в другом месте настоящего документа, фосфорилированному по меньшей мере в двух, предпочтительно по меньшей мере в трех, более предпочтительно во всех четырех позициях, выбранных из позиций, соответствующих Y109, Y144, Y155 и Y162 полипептида HMGB1. Наиболее предпочтительно производное фосфорилированного полипептида HMGB1 представляет собой производное полипептида HMGB1, фосфорилированное в четырех вышеупомянутых остатках тирозина и дополнительно форсфорилированное по меньшей мере в одном дополнительном остатке, предпочтительно в остатке серина и/или треонина, предпочтительно в В-боксе полипептида.

В предпочтительном варианте реализации полипептид HMGB1 или его производное представляет собой олигофосфорилизованный полипептид HMGB1, описанный в настоящем документе ниже.

В настоящем описании термин «агент, обеспечивающий полипептид HMGB1 или его производное» относится к любому агенту или соединению, обладающему способностью высвобождать полипептид HMGB1 или его производное в биологическую систему, как описано в настоящем документе. Предпочтительно агент, обеспечивающий полипептид HMGB1 или его производное, применяют в дозе, вызывающей концентрацию в плазме крови от 1 нМ до 1000 нМ, более предпочтительно от 10 нМ до 250 нМ, наиболее предпочтительно от 25 нМ до 150 нМ.

В предпочтительном варианте реализации агент, обеспечивающий полипептид HMGB1 или его производное, представляет собой агент, обеспечивающий олигофосфорилизованный полипептид HMGB1, описанный в настоящем документе ниже.

Предпочтительно указанный агент, обеспечивающий полипептид HMGB1 или его производное, представляет собой сам полипептид HMGB1 или его производное, описанные в настоящем документе; термин, предпочтительно, дополнительно включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность по меньшей мере на 70% идентичную полипептиду HMGB1 или боксу В полипептида HMGB1 и обладающий активностью ингибирования активности тетрамерной формы PKM2. Предпочтительно термин также относится к агенту, специфично связывающемуся с опухолевой клетк4ой, содержащей полипептид HMGB1 или бокс В полипептида HMGB1. Предпочтительно указанный агент, специфично связывающийся с опухолевой клеткой, представляет собой антитело, аптамер, лектин или тому подобное. Также предпочтительно термин агент, обеспечивающий полипептид HMGB1 или его производное, относится к клетке, секретирующей HMGB1, в которой секреция полипептида HMGB1 индуцирована. Клетки, в которых можно индуцировать секрецию HMGB1 и способы такой индукции известны специалистам в данной области техники и включают предпочтительно способы, показанные в примерах; предпочтительные клетки, в которых можно индуцировать секрецию HMGB1, представляют собой макрофаги и NK-клетки. Также предпочтительно термин агент, обеспечивающий полипептид HMGB1 или его производное относится к выражению полинуклеотид, кодирующий полипептид HMGB1 и/или бокс В полипептида HMGB1. Как будет понятно специалисту в данной области техники, указанный полинуклеотид предпочтительно содержится в векторе или в клетке-хозяине.

В настоящем описании термин «полинуклеотид» относится к полинуклеотиду, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует имеющий описанную выше биологическую активность полипептид, предпочтительно содержащий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 6 и/или 7. Предпочтительно полинуклеотид представляет собой полинуклеотид, кодирующий полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности ID NO: 4 и/или 5 или ее производную, описанную выше в настоящем документе. Должно быть понятно, что полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, детально описанную выше, может также кодироваться посредством вырожденного генетического кода более чем одним видом полинуклеотидов. Кроме того, термин «полинуклеотид» в настоящем описании согласно настоящему изобретению дополнительно включает варианты вышеупомянутых специфичных полинуклеотидов. Указанные варианты могут представлять собой ортологи, парологи или другие гомологи полинуклеотида согласно настоящему изобретению. Предпочтительно варианты полинуклеотида содержат последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуся тем, что последовательность может быть получена из вышеупомянутых специфичных последовательностей нуклеиновой кислоты путем замены, добавления и/или удаления по меньшей мере одного полинуклеотида, и вариант последовательности нуклеиновой кислоты при этом будет кодировать полипептид, имеющий описанную выше активность. Варианты включают также полинуклеотиды, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, которая способна к гибридизации с вышеупомянутыми специфичными последовательностями нуклеиновой кислоты, предпочтительно при строгих условиях гибридизации. Эти строгие условия известны специалистам, работающим в данной области техники, и их можно найти в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Предпочтительным примером для строгих условий гибридизации будет условия гибридизации в 6х хлориде натрия/цитрате натрия (=SSC) при приблизительно 45°С, после чего следуют один или более этапов промывки в 0,2х SSC, 0,1% SDS при температуре от 50 до 65°С. Специалист, работающий в данной области техники, знает, что эти условия гибридизации отличаются в зависимости от типа нуклеиновой кислоты и, например, если присутствуют органические растворители, в зависимости от температуры и концентрации буфера. Например, при «стандартных условиях гибридизации» температура отличается в зависимости от типа нуклеиновой кислоты от 42°С до 58°С в водяном буфере с концентрацией от 0,1 до 5 х SSC (рН 7.2). Если в вышеупомянутом буфере присутствует органический растворитель, например 50% формамид, температура при стандартных условиях будет приблизительно 42°С. Условия гибридизации для гибридов ДНК:ДНК предпочтительно, например, в 0,1 х SSC и от 20°С до 45°С, предпочтительно между 30°С и 45°С. Условия гибридизации для гибридов ДНК:РНК предпочтительно, например, в 0,1 х SSC и от 30°С до 55°С, предпочтительно между 45°С и 55°С. Вышеупомянутые температуры гибридизации определены, например, для нуклеиновой кислоты с приблизительно 100 bp (= парами оснований) по длине и содержанию G+С 50% при отсутствии формамида. Специалист, работающий в данной области техники, знает, как определить требуемые условия гибридизации с помощью руководств, таких как упомянутое выше руководство.

Альтернативно варианты полинуклеотидов получены с помощью основанных на ПЦР техник, таких как амплификация ДНК с помощью смеси олигонуклеотидных праймеров, т.е. с использованием вырожденных праймеров к консервативным доменам полипептидов согласно настоящему изобретению. Консервативные домены полипептидов настоящего изобретения можно идентифицировать путем сравнения последовательности с нуклеотидной последовательностью полинуклеотида или с аминокислотной последовательностью полипептидов, описанных выше. Подходящие условия ПЦР хорошо известны специалистам в данной области техники. В качестве шаблона можно использовать ДНК или кРНК из AAV. Кроме того, варианты включают полинуклеотиды, содержащие нуклеотидные последовательности, которые по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичны нуклеотидной последовательности, подробно описанной выше. Значения процента идентичности, предпочтительно, рассчитывают, как указано выше.

Полинуклеотид, содержащий фрагмент любой из вышеупомянутых нуклеотидных последовательностей, также относится к полинуклеотидам согласно настоящему изобретению. Фрагмент должен кодировать полипептид, который сохранит биологическую активность, описанную выше. Соответственно полипептид может содержать домены полипептида согласно настоящему изобретению, придающие указанную биологическую активность, или состоять из них. Фрагмент, описанный в настоящем документе, предпочтительно содержит по меньшей мере 50, по меньшей мере 100, по меньшей мере 250 или по меньшей мере 500 последовательных нуклеотидов любой из вышеупомянутых последовательностей нуклеиновой кислоты или кодирует аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 50, по меньшей мере 80, по меньшей мере 100 или по меньшей мере 150 последовательных аминокислот любой из вышеупомянутых аминокислотных последовательностей.

Полинуклеотид согласно настоящему изобретению должен быть представлен, предпочтительно, либо как выделенный полинуклеотид (т.е. выделенный из естественной среды) или в генетически модифицированной форме. Полинуклеотид, предпочтительно, является ДНК, включая кДНК, или РНК. Термин охватывает как однонитевые, так и двухнитевые полинуклеотиды. Кроме того, входят также химически модифицированные полинуклеотиды, включая присутствующие в естественной среде модифицированные полинуклеотиды, такие как гликозилированные или метилированные полинуклеотиды или искусственно модифицированные, такие как биотинилированные полинуклеотиды.

Полинуклеотиды согласно настоящему изобретению либо по существу состоят из вышеупомянутых последовательностей нуклеиновой кислоты, либо содержат вышеупомянутые последовательности нуклеиновой кислоты. Таким образом, они могут также содержать дополнительные последовательности нуклеиновой кислоты. В частности, настоящее изобретение также относится к вектору, содержащему полинуклеотиды согласно настоящему изобретению.

Термин «вектор», предпочтительно, охватывает фаговые, плазмидные, вирусные или ретровирусные векторы, а также искусственные хромосомы, такие как бактериальные или дрожжевые искусственные хромосомы. Более предпочтительно термин относится к вектору, полученному из вируса, указанный вирус, предпочтительно, преимущественно инфицирует опухолевые клетки (опухолетропный вирус) или вирус преимушественно лизирует раковые клетки (онколитический вирус). Кроме того, термин относится также к адресно взаимодействующим конструктам, которые позволяют случайную или направленную интеграцию адресно взаимодействующего конструкта в геномную ДНК. Такие адресно взаимодействующие конструкты предпочтительно содержат ДНК достаточной длины для гомологичной или гетерологичной рекомбинации. Вектор, охватывающий объем полинуклеотида согласно настоящему изобретению, предпочтительно дополнительно содержит селективные маркеры для воспроизводства и / или отбора в хозяине. Вектор может быть встроен в клетку-хозяина с помощью различных общеизвестных в данной области способов. Например, плазмидный вектор может быть введен в преципитате, таком как преципитат фосфата кальция или преципитат хлорида рубидия, или в комплексе с заряженными липидами, или в углеродных кластерах, таких как фуллерены. Альтернативно плазмидный вектор может быть введен методами теплового шока или электропорации. Если вектор представляет собой вирус, его можно упаковать in vitro, использовав перед введением в клетки-хозяева подходящую пакующую клеточную линию. Вирусные векторы могут быть способны или неспособны к репликации.

Предпочтительно в векторе согласно изобретению полинуклеотид согласно изобретению функционально связан с последовательностями контроля экспресии, разрешающими экспрессию в прокариотических или эукариотических клетках или их изолированных фракциях. Экспрессия указанного полинуклеотида включает транскрипцию полинуклеотида, предпочтительно в транслируемой мРНК. Регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию в эукариотических клетках, предпочтительно в клетках млекопитающих, общеизвестны в данной области. Они, предпочтительно, включают регуляторные последовательности, обеспечивающие инициирование транскрипции и, возможно, сигналы полиаденилирования, обеспечивающие прекращение транскрипции и стабилизацию транскрипта. Дополнительные регуляторные элементы могут включать в себя транскрипционные, а также трансляционные энхансеры. Возможные регуляторные элементы, разрешающие экспрессию в прокариотических клетках-хозяевах, включают, например, lac, trp or tac промотор в Е. coli, а примерами регуляторных элементов, разрешающих экспрессию в клетках-хозяевах эукариот, являются АОХ1 или GAL1 промотор в дрожжах или CMV-энхансер, SN/40-энхансер или глобиновые интроны млекопитающих и других животных клеток. Кроме того, в векторе экспрессии, входящем в объем настоящего изобретения, могут быть использованы индуцируемые последовательности для контроля экспрессии. Такие индуцируемые векторы, предпочтительно, содержат последовательности оператора tet или lac или последовательности, индуцируемые тепловым шоком или другими факторами окружающей среды. Подходящие последовательности для контроля экспрессии общеизвестны в данной области. Помимо элементов, которые ответственны за начало транскрипции, такие регуляторные элементы могут также содержать сигналы окончания транскрипции, такие как сайт SV40-поли-А или сайт tk-поли-А, в прямом направлении от полинуклеотида. В этом контексте в данной области техники известны подходящие векторы экспрессии, такие как Okayama-Berg кДНК вектор экспресии pcDV1 (Pharmacia), pBluescript (Stratagene), pCDM8, pRc / CMV, pcDNA1, pcDNA3 (InVitrogene) или pSPORT1 (GIBCO BRL). Векторы экспрессии, полученные из вирусов, таких как ретровирусы, вирус осповакцины, аденоассоциированный вирус, вирусы герпеса или бычьи вирусы папилломы, могут быть использованы для доставки полинуклеотидов или векторов согласно изобретению в целевую популяцию клеток. Для конструирования рекомбинантных вирусных векторов могут быть использованы способы, общеизвестные специалистам в данной области; см., например, технические методы, описанные в Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. и Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)..

Термин «клетка-хозяин», предпочтительно, относится к клетке, совместимой с введением субъекту. Более предпочтительно, указанная клетка является иммунологически совместимой с субъектом. Наиболее предпочтительно клетка представляет собой клетку, которая была получена из указанного субъекта. Предпочтительно клетка-хозяин настоящего изобретения представляет собой клетку с тенденцией мигрировать в пространство, окружающее раковые клетки. Более предпочтительно клетка-хозяин представляет собой иммунную клетку и наиболее предпочтительно представляет собой клетку иммунной системы, специфично распознающую специфичный опухолевый антиген, такую как, например, Т-клетка, специфичная к опухолевому антигену.

В предпочтительном варианте реализации полипептида или пептида согласно настоящему изобретению полипептид или пептид дополнительно содержит детектируемую метку. Термин «детектируемая метка» относится к фрагменту с аминокислотами, которые добавлены к полипептиду или пептиду или встроены в него. Предпочтительно метку следует добавить к С- или N-концу полипептида или пептида; указанный фрагмент с аминокислотами может, например, дать возможность детектировать полипептид или пептид с помощью антитела, которое специфично распознает метку, или дать возможность образования функциональной конформации, такой как хелатор, или дать возможность визуализации люминесцентных меток. Предпочтительными метками являются метки Мус, FLAG, 6-His, НА, GST или GFP. Эти метки общеизвестны в данной области техники.

Предпочтительно, термин «их производные» относящийся к полипептиду или пептиду, включает варианты аминокислотной последовательности или указанного полипептида или пептида, указанные варианты содержат аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичные аминокислотной последовательности полипептида или пептида, и указанные варианты сохраняют функцию полипептида или пептида, описанную в настоящем документе. Процентные значения идентичности, предпочтительно, рассчитываются по всей протяженности аминокислотной последовательности. Специалистам доступен ряд основанных на различных алгоритмах программ для сравнения различных последовательностей. В этом контексте особенно надежные результаты дают алгоритмы Нидлмана-Вунша или Смита-Уотермана. Чтобы выполнить выравнивание последовательностей, используют программу PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) или программы Gap и BestFit (Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol., 48, 443-453 (1970)) и Smith and Waterman (Adv. Appl., Math., 2, 482-489 (1981)), которые являются частью программного пакета GCG (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Мэдисон, Висконсин, США 53711 (1991)). Значения идентичности последовательностей, указанные выше в процентах (%), должны быть определены, предпочтительно, с помощью программы GAP по всей протяженности последовательности со следующими параметрами: Штраф за открытие гэпа: 50, Штраф за продолжение гэпа: 3, Среднее совпадение: 10.000 и среднее несовпадение: 0,000.

Кроме того, производные полипептидов или пептидов дополнительно охватывают варианты вышеупомянутых специфичных аминокислотных последовательностей, которые могут представлять собой ортологи, парологи или другие гомологи специфичных полипептидов или пептидов. Варианты, предпочтительно, содержат аминокислотную последовательность, характеризующуюся тем, что эта последовательность может быть получена из вышеупомянутых последовательностей полипептидов или пептидов, описанных выше, путем замены или добавления и/или удаления по меньшей мере одной аминокислоты.

Термин производное также включает химически модифицированные полипептиды, например полипептиды, содержащие модифицированные аминокислоты или полипептиды, которые, например, биотинилированы или соединены с флюорофорами, такими как флюоресцеин или Су 3, конформационно ограничены, например, дисульфидным мостиком или сшивкой (Walensky 2004, Science 305 (5689): 1466-1470) или связаны с полипептидами пенетрации клетки или доменами трансдукции белка (Snyder 2004, Pharm Res 21 (3): 389-393). Такие модификации могут улучшить биологические свойства полипептидов, например, пенетрацию клетки, связывание, стабильность, или могут быть использованы в качестве детектируемых меток.

Как дополнительное преимущество, в ходе работы, лежавшей в основе настоящего изобретения, было обнаружено, что в комбинированных лекарственных средствах согласно настоящему изобретению два соединения, которые они содержат, опосредуют синергетический эффект, среди прочего позволяя уменьшить дозу, необходимую для модулятора активности PKM2 для достижения терапевтического эффекта. Кроме того, было обнаружено, что устойчивость клеток к модуляторам PKM2 или HMGB1 может быть нарушена при проведении комбинированной терапии, и что наличия такой устойчивости можно избежать благодаря проведению комбинированного лечения.

Приведенные выше определения применяются с соответствующими поправками к следующему. Дополнительные определения и пояснения, сделанные ниже, также применимы для всех вариантов реализации, описанных в этой заявке, с соответствующими поправками.

Соответственно настоящее изобретение также относится к комбинированному лекарственному средству согласно настоящему изобретению для применения в качестве медикамента.

Кроме того, настоящее изобретение относится к комбинированному лекарственному средству согласно настоящему изобретению для применения в лечении нежелательной клеточной пролиферации.

В настоящем описании термин «нежелательная клеточная пролиферация» относится к заболеванию животного, предпочтительно человека, для которого характерен нежелательный или неконтролируемый роста группы клеток организма. Этот неконтролируемый рост может сопровождаться интрузией в окружающие ткани и их разрушением и, возможно, распространением нежелательным образом пролиферирующих клеток в другие места в организме. Предпочтительно указанная нежелательная несоответствующая клеточная пролиферация представляет собой рак, и, предпочтительно, указанные нежелательным образом пролиферирующие клетки представляют собой раковые клетки. Таким образом, предпочтительно, комбинированное лекарственное средство предназначено для применения при лечении рака.

Предпочтительно рак выбирают из списка, состоящего из острого лимфобластного лейкоза, острого миелобластного лейкоза, адренокортикальной карциномы, СПИД-ассоциированной лимфомы, рака ануса, рака аппендикса, астроцитомы, атипичной тератоидной опухоли, базальной карциномы, рака желчных протоков, рака мочевого пузыря, глиомы ствола головного мозга, рака молочной железы, лимфомы Беркитта, карциноидной опухоли, астроцитомы мозжечка, рака шейки матки, хордомы, хронического лимфоцитарного лейкоза, хронического миелолейкоза, рака толстой кишки, колоректального рака, краниофарингиомы, рака эндометрия, эпендимобластомы, эпендимомы, рака пищевода, экстракраниальной герминогенной опухоли, внегонадной герминогенной опухоли, рака внепеченочного желчного протока, рака желчного пузыря, рака желудка, гастроинтерстециальной стромальной опухоли, гестационной трофобластической опухоли, волосатоклеточного лейкоза, рака головы и шеи, гепатоцеллюлярного рака, лимфомы Ходжкина, гипофарингеального рака, глиомы гипоталамуса и зрительного пути, внутриглазной меланомы, саркомы Капоши, рака гортани, медуллобластомы, медуллоэпителиомы, меланомы, карциномы Меркеля, мезотелиомы, рака полости рта, синдрома множественной эндокринной неоплазии, множественной миеломы, фунгоидного микоза, рака полости носа и околоносовых пазух, рака носоглотки, нейробластомы, неходжкинской лимфомы, немелкоклеточного рака легких, рака ротовой полости, рака ротоглотки, остеосаркомы, рака яичников, эпителиального рака яичников, герминогенной опухоли яичников, пограничной опухоли яичников, рака поджелудочной железы, папилломатоза, рака околоносовых пазух и полости носа, рака паращитовидных желез, рака полового члена, фарингеального рака, феохромоцитомы, опухоли гипофиза, плевролегочной бластомы, первичной лимфомы центральной нервной системы, рака предстательной железы, рака прямой кишки, почечно-клеточного рака, ретинобластомы, рабдомиосаркомы, рака слюнных желез, синдрома Сезари, мелкоклеточного рака легких, рака тонкой кишки, саркомы мягких клеток, плоскоклеточной карциномы, плоскоклеточного рака шеи, рака яичка, рака горла, карциномы вилочковой железы, тимомы, рака щитовидной железы, рака уретры, саркомы матки, рака влагалища, рака вульвы, макроглобулинемии Вальденстрема и опухоли Вильмса.

Более предпочтительно рак представляет собой лейкоз, лимфому, рак, связанный с ВПЧ, колоректальный рак, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак легких, рак мозга или рак молочной железы. Предпочтительная колоректальная карцинома представляет собой карциному толстой кишки. Еще более предпочтительно рак представляет собой лейкоз, наиболее предпочтительно хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ).

В соответствии с вышеизложенным настоящее изобретение также относится к модулятору активности PKM2 для применения в комбинированной терапии против нежелательной клеточной пролиферации, которая включает введение агента, обеспечивающего HMGB1 или его производное.

Предпочтительно по меньшей мере часть клеток с указанной нежелательной клеточной пролиферацией устойчива к лечению HMGB1 или его производным; предпочтительно указанная часть составляет по меньшей мере 2%, более предпочтительно по меньшей мере 5%, еще более предпочтительно по меньшей мере 25%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 50%. Термин «устойчив к лечению» понятен специалисту и, предпочтительно, относится к нежелательной клеточной пролиферации, отличающейся тем, что по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 90% клеток с указанной нежелательной пролиферацией жизнеспособны после 24 часов лечения in vivo исследуемым соединением в клинически значимой концентрации; предпочтительно, клинически значимая концентрация составляет 80 нМ для HMGB1 или его производного, и 100 мкм для модулятора активности PKM2.

Также в соответствии с вышеизложенным настоящее изобретение также относится к агенту, обеспечивающему HMGB1 или его производное для применения в комбинированной терапии против нежелательной клеточной пролиферации, которая включает введение модулятора активности PKM2.

Предпочтительно по меньшей мере часть клеток с указанной нежелательной клеточной пролиферацией устойчива к лечению модулятором активности PKM2; предпочтительно указанная часть составляет по меньшей мере 2%, более предпочтительно по меньшей мере 5%, еще более предпочтительно по меньшей мере 25%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 50%.

Предпочтительно лечение отличается тем, что указанный способ представляет собой способ предотвращения селекции клеток с указанной нежелательной клеточной пролиферацией, которые (i) устойчивы к лечению модулятором активности PKM2 или (ii) устойчивы к лечению агентом, обеспечивающим HMGB1 или его производное.

Предпочтительно соединения согласно настоящему изобретению предназначены для применения для предотвращения селекции клеток с нежелательной клеточной пролиферацией, которые (i) устойчивы к лечению модулятором активности PKM2 или (ii) устойчивы к лечению агентом, обеспечивающим HMGB1 или его производное.

Также настоящее изобретение относится к способу лечения нежелательной клеточной пролиферации у субъекта, страдающего от нежелательной клеточной пролиферации, который включает введение модулятора активности PKM2 и агента, обеспечивающего HMGB1 или его производное, тем самым оказывая лечение нежелательной клеточной пролиферации.

Способ лечения нежелательной клеточной пролиферации согласно настоящему изобретению предпочтительно является способом in vivo. Кроме того, он может включать дополнительные этапы помимо прямо упомянутых выше. Например, дополнительные этапы могут относиться, например, к хирургическому удалению опухолевой ткани до или после введения указанных фармацевтически активных соединений. Кроме того, один или несколько из указанных этапов могут быть выполнены на автоматизированном оборудовании.

В настоящем описании термин «субъект» относится к животному, предпочтительно к сельскохозяйственному или домашнему животному, более предпочтительно к млекопитающему, наиболее предпочтительно к человеку.

Термин «лечение» относится к облегчению заболеваний или патологических состояний, упомянутых в настоящем документе, или симптомов, сопровождающих их в значительной степени. В настоящем описании указанное лечение также включает, предпочтительно, полное восстановление здоровья в отношении заболеваний или патологических состояний, упоминаемых в настоящем документе. Следует понимать, что лечение, которое применяют в соответствии с настоящим изобретением, может не иметь эффективность у всех субъектов, получающих лечение. Однако термин будет предпочтительно требовать, что статистически значимую часть субъектов, страдающих от заболевания или патологического состояния, упомянутого в настоящем документе, можно успешно излечить. Является ли часть статистически значимой, специалист в данной области может определить без дополнительных затруднений, используя различные общеизвестные статистические инструменты оценки, например, определение доверительных интервалов, определение р-значения, t-критерий Стьюдента, тест Манна-Уитни и так далее. Предпочтительные доверительные интервалы составляют по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%. Р-значения составляют, предпочтительно, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 или 0,0001. Предпочтительно лечение должно быть эффективным по меньшей мере для 60%, по меньшей мере для 70%, по меньшей мере для 80% или по меньшей мере для 90% субъектов из данной когорты или популяции.

Настоящее изобретение также относится к применению модулятора активности PKM2 и агента, обеспечивающего HMGB1 или его производное для получения фармацевтической композиции или набора для лечения рака.

Кроме того, настоящее изобретение относится к процессу производства комбинированного лекарственного средства согласно настоящему изобретению, включающему этап смешивания модулятора активности PKM2 и агента, обеспечивающего HMGB1 или его производное. Предпочтительно указанный способ дополнительно включает этап приготовления смеси модулятора активности PKM2 и HMGB1 или его фрагмента или производного в качестве фармацевтической композиции.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей модулятор активности PKM2 и агент, обеспечивающий HMGB1 или его производное, и фармацевтически приемлемый носитель, и к набору, содержащему модулятор активности PKM2 и агент, обеспечивающий HMGB1 или его производное.

В настоящем описании термин «набор» относится к комплекту, содержащему по меньшей мере вышеупомянутые средства, например, модулятор активности PKM2 и агент, обеспечивающий HMGB1 или его производное, предпочтительно, отдельно или в сочетании, предпочтительно внутри одного контейнера. Контейнер также предпочтительно дополнительно содержит инструкции для выполнения способа настоящего изобретения. Компоненты набора представлены предпочтительно в готовом к применению виде, например, концентрации соответственно скорректированы, и т.д.

Настоящее изобретение дополнительно относится к олигофосфорилированному полипептиду HMGB1 или его производному, в котором по меньшей мере один из остатков тирозина, соответствующих аминокислотам Y109, Y144, Y155 и Y162 полипептида HMGB1, заменен на нефосфорилируемую аминокислоту.

Дополнительно настоящее изобретение относится к олигофосфорилированному полипептиду HMGB1 или его производному для лечения заболевания; и настоящее изобретение относится к олигофосфорилированному полипептиду HMGB1 или его производному для лечения нежелательной клеточной пролиферации.

В настоящем описании термин "олигофосфорилированный полипептид HMGB1" относится к полипептиду HMGB1, описанному в настоящем документе выше, в котором по меньшей мере один из остатков тирозина, соответствующих аминокислотам Y109, Y144, Y155 и Y162 полипептида HMGB1, заменен на нефосфорилируемую аминокислоту. Таким образом, по сравнению с полипептидом HMGB1 дикого типа, в олигофосфорилированном производном полипептида HMGB1 отсутствует по меньшей мере один из вышеупомянутых потенциальных сайтов фосфорилирования. Как должно быть понятно, термин «олигофосфорилированный» относится к полипептиду, имеющему меньше потенциальных сайтов фосфорилирования, при этом несущественно, в какой степени сайты фосфорилирования на самом деле фосфорилированы в полипептиде HMGB1 дикого типа и/или в олигофосфорилированном полипептиде HMGB1. Олигофосфорилированный полипептид HMGB1 или его производное по-прежнему обладает активностью в отношении вызова гибели клеток в клеточных линиях карциномы. Специалист может установить активность соединения в отношении вызова гибели клеток, предпочтительно путем сравнения жизнеспособности клеток в клеточной культуре, обработанной указанным соединением, с необработанным контролем. Предпочтительно указанную активность устанавливают путем определения высвобождения лактатдегидрогеназы, более предпочтительно, как описано в настоящем документе в примерах, наиболее предпочтительно с помощью клеточной линии SW480, которую можно получить, например, в European Collection of AuthenticatedCell Cultures (ЕСАСС) под номером: SW 480 (ECACC 87092801). Предпочтительно заменен по меньшей мере остаток тирозина, соответствующий аминокислоте Y109, предпочтительно на одну из аминокислот, указанных выше, более предпочтительно на глютамин. Предпочтительно заменен по меньшей мере остаток тирозина, соответствующий аминокислоте Y144, предпочтительно на одну из аминокислот, указанных выше, более предпочтительно на глютамин. Предпочтительно заменен по меньшей мере остаток тирозина, соответствующий аминокислоте Y155, предпочтительно на одну из аминокислот, указанных выше, более предпочтительно на глютамин. Предпочтительно заменен по меньшей мере остаток тирозина, соответствующий аминокислоте Y162, предпочтительно на одну из аминокислот, указанных выше, более предпочтительно на глютамин. Предпочтительно заменены по меньшей мере остатки тирозина, соответствующие аминокислотам Y109 и Y144, предпочтительно на аминокислоты, независимо выбранные из аминокислот, указанных выше, более предпочтительно на глутамин. Предпочтительно заменены по меньшей мере остатки тирозина, соответствующие аминокислотам Y109 и Y155, предпочтительно на аминокислоты, независимо выбранные из аминокислот, указанных выше, более предпочтительно на глутамин. Предпочтительно заменены по меньшей мере остатки тирозина, соответствующие аминокислотам Y109 и Y162, предпочтительно на аминокислоты, независимо выбранные из аминокислот, указанных выше, более предпочтительно на глутамин. Предпочтительно заменены по меньшей мере остатки тирозина, соответствующие аминокислотам Y144 и Y155, предпочтительно на аминокислоты, независимо выбранные из аминокислот, указанных выше, более предпочтительно на глутамин. Предпочтительно заменены по меньшей мере остатки тирозина, соответствующие аминокислотам Y144 и Y162, предпочтительно на аминокислоты, независимо выбранные из аминокислот, указанных выше, более предпочтительно на глутамин. Предпочтительно заменены по меньшей мере остатки тирозина, соответствующие аминокислотам Y155 и Y162, предпочтительно на аминокислоты, независимо выбранные из аминокислот, указанных выше, более предпочтительно на глутамин. Предпочтительно заменены по меньшей мере остатки тирозина, соответствующие аминокислотам Y109, Y144 and Y155, предпочтительно на аминокислоты, независимо выбранные из аминокислот, указанных выше, более предпочтительно на глутамин. Предпочтительно заменены по меньшей мере остатки тирозина, соответствующие аминокислотам Y109, Y144 и Y162, предпочтительно на аминокислоты, независимо выбранные из аминокислот, указанных выше, более предпочтительно на глутамин. Предпочтительно заменены по меньшей мере остатки тирозина, соответствующие аминокислотам Y109, Y155 и Y162, предпочтительно на аминокислоты, независимо выбранные из аминокислот, указанных выше, более предпочтительно на глутамин. Предпочтительно заменены по меньшей мере остатки тирозина, соответствующие аминокислотам Y144, Y155 и Y162, предпочтительно на аминокислоты, независимо выбранные из аминокислот, указанных выше, более предпочтительно на глутамин. Более предпочтительно заменены по меньшей мере остатки тирозина, соответствующие аминокислотам Y109, Y144, Y155 и Y162, предпочтительно на аминокислоты, независимо выбранных из аминокислот, указанных выше, более предпочтительно на глутамин. Наиболее предпочтительно заменены по меньшей мере остатки тирозина, соответствующие аминокислотам Y109, Y144, Y155 и Y162, предпочтительно на аминокислоты, независимо выбранных из аминокислот, указанных выше, более предпочтительно на глутамин. Таким образом предпочтительно олигофосфорилированный полипептид HMGB1 или его производное представляет собой полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, более предпочтительно SEQ ID NO: 12.

В настоящем описании термин «нефосфорилируемая аминокислота» относится к аминокислоте, про которую известно, что с ней не происходит посттрансляционное фосфорилирование в эукариотической клетке, предпочтительно неизвестно, что оно происходит в живой клетке. Известно, что посттрансляционное фосфорилирование происходит у эукариотических организмах на остатках серина, треонина, тирозина, аргинина, лизина и цистеина в эукариотических клетках и дополнительно на остатках гистидина в прокариотической клетке. Соответственно нефосфорилируемая аминокислота, предпочтительно, представляет собой протеиногенную аминокислоту, которая не является серином, треонином, тирозином, аргинином, лизином, цистеином или гистидином. Предпочтительно нефосфорилируемая аминокислота представляет собой аминокислоту с незаряженной боковой цепью, предпочтительно представляет собой аланин, валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, триптофан, аспарагин или глутамин, предпочтительно аланин, валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, аспарагин или глутамин, еще более предпочтительно представляет собой аланин, валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, триптофан, аспарагин или глутамин. Более предпочтительно нефосфорилируемая аминокислота представляет собой аминокислоту с незаряженной боковой цепью, размер которой аналогичен размеру боковой цепи тирозина, более предпочтительно представляет собой фенилаланин или глутамин, наиболее предпочтительно глутамин.

Дополнительно настоящее изобретение относится к способу определения того, восприимчив ли субъект, страдающий от нежелательной клеточной пролиферации, к лечению, включающему введение модулятора активности PKM2 в качестве единственного модулятора активности PKM2, который включает в себя:

(a) обеспечение образца нежелательно пролиферирующих клеток указанного субъекта

(b) инкубацию первой подпорции указанных нежелательно пролиферирующих клеток в атмосфере, содержащей по меньшей мере 15% кислорода в течение по меньшей мере 12 часов (нормоксическая подпорция),

(c) инкубацию второй подпорции указанных нежелательно пролиферирующих клеток в атмосфере, содержащей не более чем 5% кислорода в течение по меньшей мере 12 часов (гипоксическая подпорция),

(d) определение активностей по меньшей мере ферментов высокоаффинной пируваткиназы и низкоаффинной пируваткиназы в клетках указанных первой и второй подпорций,

(e) сравнение указанных активностей, определенных на этапе (d), и

(f) на основе результатов этапа сравнения (е) определение того, восприимчив ли указанный субъект, страдающий от нежелательной клеточной пролиферации, к лечению, включающему введение модулятора активности PKM2 в качестве единственного модулятора PKM2.

Способ определения того, восприимчив ли указанный субъект, страдающий от нежелательной клеточной пролиферации, к лечению, включающему введение модулятора активности PKM2 в качестве единственного ингибитора PKM2 согласно настоящему изобретению, является способом in vitro. Кроме того, он может включать дополнительные этапы помимо прямо упомянутых выше. Например, дополнительные этапы могут относиться, например, к решению, страдает ли указанный субъект от нежелательной клеточной пролиферации, с помощью способов, известных специалистам. Кроме того, один или несколько из указанных этапов могут быть выполнены на автоматизированном оборудовании. Предпочтительно способ определения того, восприимчив ли субъект, страдающий от нежелательной клеточной пролиферации, к лечению, включающему введение модулятора активности PKM2 в качестве единственного ингибитора PKM2, выполняют, как описано в ЕР 2 821 790 А1, который тем самым включен здесь посредством ссылки в отношении полного раскрытия его сущности.

Термин «образец» относится к образцу биологической жидкости, образцу отдельных клеток или образцу из ткани или органа или образцу омывающей/промывочной жидкости, полученной с внешней или внутренней поверхности организма. Образец содержит клетки, предпочтительно образец содержит нежелательно пролиферирующие клетки. Образцы могут быть получены с помощью общеизвестных методов и включают, предпочтительно, соскобы, мазки или биопсию из любой поверхности тела, полости тела, органа или ткани. Такие образцы могут быть получены с помощью скребков, (хлопкового) тампона, лопаточек, омывающей/промывочной жидкости, штанцевой биопсии, прокола полостей иглами или хирургическими инструментами. Однако образцы крови, мочи, слюны, слезной жидкости, стула также входят в способ согласно настоящему изобретению. Образцы ткани или органа могут быть получены из любой ткани или органа посредством, например, биопсии или других хирургических процедур. Отдельные клетки могут быть получены из биологических жидкостей или тканей или органов посредством различных методов, таких как фильтрация, центрифугирование или сортировка клеток. Предпочтительно образцы клеток, тканей или органа получены из этих клеток, тканей или органов, которые являются известными или предполагаемыми мишенями нежелательной пролиферации. Следует понимать, что образец может быть дополнительно обработан для выполнения способа согласно настоящему изобретению, в частности, как описано в формуле изобретения, вариантах реализации и примерах. Предпочтительно образец предварительно обработан для получения жизнеспособных клеток, содержащихся в указанном образце. Предпочтительно подпорции получены таким образом, что существует высокая вероятность того, что имеется аналогичное количество нежелательно пролиферирующих клеток во всех подпорциях, полученных, например, путем срезов кусочков ткани аналогичного размера, предпочтительно полученных методом последовательных срезов; или путем приблизительно аналогичных количеств маленьких кусочков ткани, или путем ферментативного переваривания образца (например с трипсином) для выделения клеток и получения аналогичных количеств клеток.

Термин «инкубировать» понятен специалисту и предпочтительно относится к культивированию клеток в условиях, позволяющих выживание и/или пролиферацию указанных клеток. Предпочтительные условия культивирования нежелательно пролиферирующих клеток известны специалистам. Предпочтительно инкубация составляет от 6 часов до 24 часов, более предпочтительно от 7 часов до 15 часов, еще более предпочтительно от 10 часов до 14 часов, наиболее предпочтительно 12 часов ±1 час. Предпочтительно первую подпорцию и вторую подпорцию инкубируют в одно и то же время, то есть разница во времени инкубации между первой подпорцией и второй подпорцией предпочтительно составляет не более 1 часа, более предпочтительно составляет не более 0,5 часа, еще больше предпочтительно составляет не более 0,25 часа. Предпочтительно, образцы предварительно выдерживают в стандартных условиях культивирования клеток в течение по меньшей мере 12 ч, более предпочтительно по меньшей мере 18 ч, наиболее предпочтительно в течение по меньшей мере 24 ч.

В соответствии с настоящим изобретением по меньшей мере первую часть образца инкубируют в нормальных условиях, то есть в атмосфере, содержащей кислород, в количестве, приблизительно соответствующем содержанию кислорода в раковой ткани (приблизительно от 1% до 10%) или нормальной атмосфере (21% кислорода). Предпочтительно концентрация кислорода составляет по меньшей мере 1%, более предпочтительно по меньшей мере 5%, более предпочтительно по меньшей мере 10%; наиболее предпочтительно, концентрация кислорода составляет 21%.

В соответствии с настоящим изобретением по меньшей мере вторую подпорцию инкубируют в гипоксических условиях, т.е. в атмосфере, которая содержит концентрацию кислорода, вызывающую гипоксический ответ в клетке. Предпочтительно концентрация кислорода составляет не более 0,5%, более предпочтительно не более 0,3%, еще более предпочтительно не более 0,1%, наиболее предпочтительно составляет 0%.

Предпочтительно нормоксические и гипоксические условия выбирают таким образом, чтобы значительная разница между указанными двумя концентрациями кислорода влияла на образцы. Соответственно разница в концентрации кислорода между нормоксическими и гипоксическими условиями, предпочтительно, составляет по меньшей мере 1%, более предпочтительно, по меньшей мере 2%, еще более предпочтительно по меньшей мере 10%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 20%.

Способы определения активности ферментов, в частности высокоаффинной пируваткиназы, низкоаффинной пируваткиназы известны в данной области техники. Предпочтительно в способе определяют дополнительные активности ферментов, в частности по меньшей мере у одного фермента из гексокиназы, малатдекарбоксилазы, лактатдегидрогеназы (LDH) и цитохрома с оксидазным комплексом IV. Предпочтительно определяют активности по меньшей мере ферментов высокоаффинной пируваткиназы, низкоаффинной пируваткиназы и лактатдегидрогеназы. Активности ферментов можно измерить, как описано в руководствах и известно специалистам, например, из ЕР 2 821 790 А1. В таблице 1 приведены потенциальные анализы и условия реакций для определения соответствующих активностей ферментов.

Предпочтительно определяемые активности являются специфичными активностями, т.е. активность на массу белка (Ед/мг). Специалисту должно быть понятно, что вышеуказанный анализ для высокоаффинной РК не проводит различия между активностью пируваткиназы М1 (продукта гена PKM1) и высокоаффинной пируваткиназы М2 (продукта гена PKM2); соответственно, в анализе будет определена общая активность высокоаффинной пируваткиназы и низкоаффинной пируваткиназы.

Согласно способу настоящего изобретения сильное изменение активности PKHA или PKLA в гипоксических условиях по сравнению с активностью в нормоксических условиях указывает на то, что образец принадлежит пациенту, восприимчивому к лечению, которое включает введение модулятора активности PKM2 в качестве единственного модулятора PKM2. Предпочтительно указанное изменение может представлять собой увеличение или уменьшение; также предпочтительно, указанное изменение является изменением по меньшей мере в 1,5, более предпочтительно по меньшей мере в 2, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 3 раза. Напротив, умеренное изменение активности РКНА или PKLA в гипоксических условиях или отсутствие изменения активности по сравнению с активностью в нормоксических условиях, или параллельное изменение как PKHA, так и PKLA указывает на то, что образец принадлежит пациенту, не восприимчивому к лечению, которое включает введение модулятора активности PKM2 в качестве единственного модулятора PKM2. Предпочтительно указанному пациенту, не восприимчивому к лечению, включающему введение модулятора активности PKM2 в качестве единственного модулятора PKM2, рекомендовано комбинированное лечение с HMGB1, описанное в другом месте настоящего документа.

Предпочтительно этап (е) способа представляет собой вычисление отношений ферментативной активности в гипоксических подпорциях к ферментативной активности в нормоксических подпорциях. Более предпочтительно вышеупомянутый этап (е) способа дополнительно включает вычисление отношения суммы активностей анаэробного(ых) фермента(ов) к сумме активности аэробного(ых) фермента(ов).

Если, например, ферментативные активности ферментов LDH, PKLA в качестве анаэробных ферментов и аэробных ферментов PKHA определяют в опухолевой ткани пациента, можно действовать следующим образом: На первом этапе предпочтительно рассчитывают нормализованные активности гипоксических / нормоксических ферментов (X_N, с X = интересующий фермент): LDH_N=LDH_{гипокисческий}/ LDH_{нормоксический}, PKLA_N=PKLA_{гипоксический}/ PKLA_{нормоксический} и PKHA_N=PKHA_{гипоксический}/ PKHA_{нормоксический}.

Дополнительно, предпочтительно, может быть рассчитано аэробное/анаэробное соотношение S согласно, например, следующему уравнению:

Как должно быть понятно из вышесказанного, значение S, соответствующее числу слагаемых в делимом, деленное на число слагаемых в делителе в формуле, применяемой для вычисления S (контрольная оценка S_R), указывает на то, что образец принадлежит пациенту, не восприимчивому к лечению, включающему введение модулятора активности PKM2 в качестве единственного модулятора PKM2; в таком случае S предпочтительно соответствует S_R±0,5S_R, более предпочтительно ±0,25S_R, наиболее предпочтительно ±0.1S_R. Напротив, значение S, сильно отклоняющееся от S_R, указывает на то, что образец принадлежит пациенту, восприимчивому к лечению, включающему введение модулятора активности PKM2 в качестве единственного модулятора PKM2; в таком случае S предпочтительно выше или ниже, чем S_R±0,1S_R, более предпочтительно ±0,25S_R, наиболее предпочтительно ±0,5S_R. В примере уравнения 1, S_R равняется 2 ((1+1)/1).

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения нежелательной клеточной пролиферации у страдающего от нее субъекта, который включает:

(A) определение того, восприимчив ли указанный субъект к лечению, включающему введение модулятора активности PKM2 в качестве единственного модулятора PKM2, предпочтительно способом согласно настоящему изобретению, и

(B) введение указанному субъекту модулятора активности PKM2 в случае, если определено, что указанный субъект восприимчив к лечению, включающему введение модулятора активности PKM2 в качестве единственного ингибитора PKM2 на этапе А), тем самым оказывая лечение нежелательной клеточной пролиферации.

Способ лечения нежелательной клеточной пролиферации, предпочтительно, представляет собой способ in vivo. Кроме того, он может включать дополнительные этапы помимо прямо упомянутых выше. Например, дополнительные этапы могут относиться, например, к решению, страдает ли указанный субъект от нежелательной клеточной пролиферации, с помощью способов, известных специалистам. Кроме того, один или несколько из указанных этапов могут быть выполнены на автоматизированном оборудовании. Предпочтительно, способ включает дополнительный этап (С) введения указанному субъекту модулятора активности PKM2 и HMGB1 или его фрагмент или производное, предпочтительно в виде комбинированного лекарственного средства согласно настоящему изобретению, в случае, если определено, что указанный субъект не восприимчив к лечению, включающему введение модулятора активности PKM2 в качестве единственного ингибитора PKM2 на этапе А), тем самым оказывая лечение нежелательной клеточной пролиферации.

Как дополнительное преимущество, в экспериментах, лежащих в основе настоящего изобретения, было обнаружено, что дифференцированная активность указанных выше ферментов в образцах опухолей, инкубированных в нормоксических условиях по сравнению с активностями в условиях гипоксии, указывает на то, являются ли содержащиеся в ней клетки чувствительными к модулятору PKM2.

Учитывая вышеизложенное, следующие варианты реализации являются предпочтительными:

1. Комбинированное лекарственное средство, содержащее

(i) модулятор активности пируваткиназы М2 (PKM2) и

(ii) агент, обеспечивающий полипептид высокомобильной группы бокс 1 (HMGB1) или его производное.

2. Комбинированное лекарственное средство согласно варианту реализации 1, отличающееся тем, что указанный HMGB1 или его производное ингибирует активность тетрамерной формы высокоаффинной пируваткиназы, предпочтительно PKM2.

3. Комбинированное лекарственное средство согласно вариантам реализации 1-2, отличающееся тем, что указанный агент, обеспечивающий полипептид HMGB1 или его производное, представляет собой

(i) полипептид, содержащий полипептид HMGB1,

(ii) полипептид, содержащий бокс В полипептида HMGB1,

(iii) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную полипептиду согласно (i) или (ii) и обладающий активностью ингибирования активности тетрамерной формы PKM, предпочтительно PKM2,

(iv) агент, специфично связывающийся с опухолевыми клетками, содержащий любой полипептид согласно (i) - (iii),

(v) секретирующие HMGB1 клетки, в которых индуцировали секрецию полипептида HMGB1,

(vi) экспрессируемый полинуклеотид, кодирующий полипептид согласно (i), (ii) и/или (iii), предпочтительно содержащийся в векторе и/или клетке-хозяине, или

(vii) любую комбинацию (i) - (vi).

4. Комбинированное лекарственное средство согласно любому из вариантов реализации 1-3, отличающееся тем, что указанный полипептид HMGB1 (ii) будет полипептидом HMGB1 человека, который предпочтительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

5. Комбинированное лекарственное средство согласно любому из вариантов реализации 3-4, отличающееся тем, что указанный бокс В полипептида HMGB1 (ii) будет боксом В полипептида HMGB1 человека, который предпочтительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5.

6. Комбинированное лекарственное средство согласно любому из вариантов реализации 3-5, отличающееся тем, что указанный полипептид согласно (i), (ii) или (iii) будет гибридным полипептидом.

7. Комбинированное лекарственное средство согласно любому из вариантов реализации 3-6, отличающееся тем, что указанные секретирующие HMGB1 клетки (iv) представляют собой макрофаги и NK-клетки.

8. Комбинированное лекарственное средство согласно любому из вариантов реализации 3-6, отличающееся тем, что указанный экспрессируемый полинуклеотид согласно (vi) представляет собой полинуклеотид, содержащий

(I) последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 6 и/или 7, или

(II) последовательность нуклеиновой кислоты, идентичную по меньшей мере на 70% последовательности нуклеиновой кислоты согласно (I),

и промотор, предпочтительно гетерологичный промотор.

9. Комбинированное лекарственное средство согласно любому из вариантов реализации 3-6, отличающееся тем, что указанный агент, специфично связывающийся с опухолевой клеткой (iv), представляет собой антитело или его фрагмент или аптамер.

10. Комбинированное лекарственное средство согласно любому из вариантов реализации 3-9, отличающееся тем, что указанный вектор (vi) представляет собой вирусный вектор, предпочтительно онкотропный вирусный вектор.

11. Комбинированное лекарственное средство согласно любому из вариантов реализации 3-10, отличающееся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой иммунную клетку, предпочтительно опухолеспецифичную В-клетку.

12. Комбинированное лекарственное средство согласно любому из вариантов реализации 1-11, отличающееся тем, что указанный HMGB1 представляет собой фосфорилированный HMGB1 и/или отличающееся тем, что указанный бокс В полипептида HMGB1 представляет собой фосфорилированный бокс В полипептида HMGB1.

13. Комбинированное лекарственное средство согласно любому из вариантов реализации 1-12, отличающееся тем, что указанный модулятор PKM2 представляет собой ингибитор PKM2, предпочтительно ингибитор тетрамеризации PKM2, более предпочтительно P-M2tide (тирозин-фосфорилированная SEQ ID NO: 1).

14. Комбинированное лекарственное средство согласно любому из вариантов реализации 1-13, отличающееся тем, что указанный модулятор PKM2 представляет собой активатор PKM2, предпочтительно агент, стабилизирующий тетрамеры PKM2, более предпочтительно ML265 (6-(3-аминобензил)-4-метил-2-(метилсулфинил)-4,6-дигидро-5Н-тиено[2',3':4,5]-пирроло[2,3-d]пиридазин-5-он).

15. Комбинированное лекарственное средство согласно любому из вариантов реализации 1-14, отличающееся тем, что указанная PKM2 представляет собой PKM2 человека.

16. Комбинированное лекарственное средство согласно любому из вариантов реализации 1-15, отличающееся тем, что указанное комбинированное лекарственное средство представлено в комбинации или раздельно и предназначено для одновременного или последовательного применения.

17. Комбинированное лекарственное средство согласно любому из вариантов реализации 1-16, отличающееся тем, что указанное комбинированное лекарственное средство представляет собой фармацевтически совместимое лекарственное средство.

18. Комбинированное лекарственное средство согласно любому из вариантов реализации 1-17 для применения в качестве медикамента.

19. Комбинированное лекарственное средство согласно любому из вариантов реализации 1-17 для применения при лечении нежелательной клеточной пролиферации, предпочтительно рака.

20. Модулятор активности PKM2 для применения в комбинированной терапии против нежелательной клеточной пролиферации, которая включает введение агента, обеспечивающего HMGB1 или его производное.

21. Модулятор активности PKM2 для применения согласно варианту реализации 20, отличающийся тем, что нежелательная клеточная пролиферация устойчива к лечению HMGB1 или его производным.

22. Агент, обеспечивающий HMGB1 или его производное для применения в комбинированной терапии против нежелательной клеточной пролиферации, которая включает введение модулятора активности PKM2.

23. Агент, обеспечивающий HMGB1 или его производное для применения согласно варианту реализации 22, отличающийся тем, что нежелательная клеточная пролиферация устойчива к лечению модулятором активности PKM2.

24. Комбинированное лекарственное средство для применения согласно любому из вариантов реализации 1-17 для применения в предотвращении селекции клеток с нежелательной клеточной пролиферацией, которые (i) устойчивы к лечению модулятором активности PKM2 или (ii) устойчивы к лечению агентом, обеспечивающим HMGB1 или его производное.

25. Комбинированное лекарственное средство для применения согласно варианту реализации 19 или модулятор активности PKM2 для применения согласно варианту реализации 20 или 21, отличающееся тем, что указанный модулятор активности PKM2 применяют в концентрации менее чем 0,1 мМ, предпочтительно менее чем 0,05 мМ, более предпочтительно менее чем 0,01 мМ; или в дозе, вызывающей концентрацию в плазме крови менее чем 0,1 мМ, предпочтительно менее чем 0,05 мМ, более предпочтительно менее чем 0,01 мМ.

26. Комбинированное лекарственное средство для применения согласно варианту реализации 19 или модулятор активности PKM2 для применения согласно варианту реализации 20 или 21, отличающееся тем, что указанный модулятор активности PKM2 применяют в концентрации от 0,0005 мМ до 0,1 мМ, предпочтительно от 0,001 мМ до 0,05 мМ, более предпочтительно от 0,005 до 0,01 мМ; или в дозе, вызывающей концентрацию в плазме крови от 0,0005 мМ до 0,1 мМ, предпочтительно от 0,001 мМ до 0,05 мМ, более предпочтительно от 0,005 до 0,01 мМ.

27. Комбинированное лекарственное средство для применения согласно варианту реализации 19, Модулятор активности PKM2 для применения согласно варианту реализации 20 или 21, или агент, обеспечивающий HMGB1 или его производное для применения согласно варианту реализации 22 или 23, отличающиеся тем, что указанный рак представляет собой колоректальную карциному или хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ).

28. Способ лечения нежелательной клеточной пролиферации у субъекта, страдающего от нежелательной клеточной пролиферации, который включает введение модулятора активности PKM2 и агента, обеспечивающего HMGB1 или его производное, тем самым оказывая лечение нежелательной клеточной пролиферации.

29. Применение модулятора активности PKM2 и агента, обеспечивающего HMGB1 или его производное для получения фармацевтической композиции или набора для лечения рака.

30. Применение варианта реализации 29, отличающееся тем, что указанная фармацевтическая композиция представляет собой комбинированную композицию согласно любому из вариантов реализации 1-17.

31. Процесс приготовления комбинированного лекарственного средства согласно любому из вариантов реализации 1-17, включающий этап смешивания модулятора активности PKM2 и агента, обеспечивающего HMGB1 или его производное.

32. Процесс согласно варианту реализации 31, дополнительно включающий этап создания смеси модулятора активности PKM2 и агента, обеспечивающего HMGB1 или его производное, в виде фармацевтической композиции.

33. Фармацевтическая композиция, которая содержит модулятор активности PKM2 и агент, обеспечивающий HMGB1 или его производное, и фармацевтически приемлемый носитель.

34. Набор, содержащий модулятор активности PKM2 и агент, обеспечивающий HMGB1 или его производное.

35. Способ определения того, восприимчив ли субъект, страдающий от нежелательной клеточной пролиферации, к лечению, включающему введение модулятора активности PKM2 в качестве единственного ингибитора PKM2, который включает в себя:

(a) обеспечение образца нежелательно пролиферирующих клеток указанного субъекта,

(b) инкубацию первой подпорции указанных нежелательно пролиферирующих клеток в атмосфере, содержащей по меньшей мере 1% кислорода в течение по меньшей мере 12 часов ± 1 час (нормоксические условия),

(c) инкубацию второй подпорции указанных нежелательно пролиферирующих клеток в атмосфере, содержащей не более чем 0,1% кислорода в течение по меньшей мере 12 часов ± 1 час (гипоксические условия),

(d) определение активностей по меньшей мере ферментов высокоаффинной пируваткиназы и низкоаффинной пируваткиназы в клетках указанных первой и второй подпорций,

(e) сравнение указанных активностей, определенных на этапе (d), и

(f) на основе результатов этапа сравнения (е) определение того, восприимчив ли указанный субъект, страдающий от нежелательной клеточной пролиферации, к лечению, включающему введение модулятора активности PKM2 в качестве единственного ингибитора PKM2.

36. Способ согласно варианту реализации 35, отличающийся тем, что сильное изменение активности PKHA или PKLA в гипоксических условиях по сравнению с активностью в нормоксических условиях указывает на то, что образец принадлежит пациенту, восприимчивому к лечению, которое включает введение модулятора активности PKM2 в качестве единственного модулятора PKM.

37. Способ согласно варианту реализации 35 или 36, отличающийся тем, что умеренное изменение активности PKHA или PKLA в гипоксических условиях или отсутствие изменения активности по сравнению с активностью в нормоксических условиях, или параллельное изменение как PKHA, так и PKLA указывает на то, что образец принадлежит пациенту, не восприимчивому к лечению, которое включает введение модулятора активности PKM2 в качестве единственного модулятора PKM2.

38. Способ лечения нежелательной клеточной пролиферации у страдающего от нее субъекта, включающий

(A) определение того, восприимчив ли указанный субъект к лечению, включающему введение модулятора активности PKM2 в качестве единственного ингибитора PKM2, предпочтительно посредством способа согласно любому из вариантов реализации 35-37, и

(B) введение указанному субъекту модулятора активности PKM2 в качестве единственного ингибитора PKM2 в случае, если определено, что указанный субъект восприимчив к лечению, включающему введение модулятора активности PKM2 в качестве единственного ингибитора PKM2 на этапе А), тем самым оказывая лечение нежелательной клеточной пролиферации.

39. Способ согласно варианту реализации, дополнительно включающий

(C) введение указанному субъекту модулятора активности PKM2 и HMGB1 или его фрагмент или производное, предпочтительно в виде комбинированного лекарственного средства согласно любому из вариантов реализации 1-17, в случае, если определено, что указанный субъект не восприимчив к лечению, включающему введение модулятора активности PKM2 в качестве единственного ингибитора PKM2 на этапе А), которое оказывает лечение нежелательной клеточной пролиферации.

40. Фосфорилированный полипептид высокомобильной группы бокс 1 (HMGB1) или его производное.

41. Фосфорилированный полипептид HMGB1 или его производное для применения в качестве лекарственного средства.

42. Фосфорилированный полипептид HMGB1 или его производное для применения при лечении рака.

43. Комбинированное лекарственное средство согласно любому варианту реализации из 1-18, отличающееся тем, что указанный полипептид HMGB1 или его производное представляют собой фосфорилированный полипептид HMGB1 или его производное.

44. Способ лечения субъекта, страдающего от нежелательной клеточной пролиферации, предпочтительно рака, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективной дозы фосфорилированного полипептида HMGB1 или его производного.

45. Способ получения фосфорилированного полипептида HMGB1 или его производного, включающий

(i) индуцирование в моноцитах периферической крови, предпочтительно в NK-клетках, образования HMGB1 или его производного; и

(ii) очистка указанного HMGB1 или его производного от супернатанта культуры клеток или от цитозоля этих клеток.

46. Комбинированное лекарственное средство согласно любому варианту реализации из 1-11 или из 13-17, агент, обеспечивающий HMGB1 или его производное для применения согласно варианту реализации 22 или 23, способ согласно варианту реализации 28, применение согласно варианту реализации 29 или 30, способ согласно варианту реализации 31 или 32, фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 33, набор согласно варианту реализации 34, отличающиеся тем, что указанное производное полипептида HMGB1 представляет собой полипептид, содержащий бокс В полипептида HMGB1, в котором по меньшей мере один, предпочтительно по меньшей мере два, более предпочтительно по меньшей мере три, наиболее предпочтительно все четыре остатка тирозина, соответствующие аминокислотам Y109, Y144, Y155 и Y162 полипептида HMGB1, заменены на нефосфорилируемые аминокислотные остатки, предпочтительно глутаминовые остатки, более предпочтительно полипептид, содержащий SEQ ID NO: 11, более предпочтительно состоящий из SEQ ID NO: 11.

47. Комбинированное лекарственное средство согласно любому варианту реализации из 1-11 или из 13-17, агент, обеспечивающий HMGB1 или его производное для применения согласно варианту реализации 22 или 23, способ согласно варианту реализации 28, применение согласно варианту реализации 29 или 30, способ согласно варианту реализации 31 или 32, фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 33, набор согласно варианту реализации 34, отличающиеся тем, что указанное производное полипептида HMGB1 представляет собой полипептид, содержащий бокс В полипептида HMGB1, в котором по меньшей мере один, более предпочтительно по меньшей мере два, еще более предпочтительно по меньшей мере три, наиболее предпочтительно все четыре остатка тирозина, соответствующие аминокислотам Y109, Y144, Y155 и Y162 полипептида HMGB1, заменены на нефосфорилируемые аминокислотные остатки, предпочтительно глутаминовые остатки, более предпочтительно полипептид, содержащий SEQ ID NO: 12, более предпочтительно состоящий из SEQ ID NO: 12.

48. Олигофосфорилированный полипептид HMGB1 или его производное, в котором по меньшей мере один из остатков тирозина, соответствующих аминокислотам Y109, Y144, Y155 и Y162 полипептида HMGB1, заменен на нефосфорилируемую аминокислоту.

49. Олигофосфорилированный полипептид HMGB1 или его производное согласно варианту реализации 48, отличающийся тем, что указанная нефосфорилируемая аминокислота представляет собой не замененную аминокислоту.

50. Олигофосфорилированный полипептид HMGB1 или его производное согласно варианту реализации 48 или 49, отличающийся тем, что указанная нефосфорилируемая аминокислота в каждом случае независимо выбрана из групп, состоящих из аланина, валина, лейцина, изолейцина, фенилаланина, триптофана, аспарагина, глутамина, предпочтительно представляет собой глутамин.

51. Олигофосфорилированный полипептид HMGB1 согласно любому из вариантов реализации 48-50 для применения в лечении заболеваний.

52. Олигофосфорилированный полипептид HMGB1 согласно любому из вариантов реализации 48-50 для применения в лечении нежелательной клеточной пролиферации.

Все ссылки, приведенные в этой заявке, включены в нее посредством ссылки и раскрывают содержание во всей полноте, и раскрытие содержания отдельно упомянуто в этой заявке.

Подписи к фигурам

Фиг. 1: HMGB1 из NK-клеток человека вызывает гибель клеток колоректального рака. (A) HMGB1 очищали из NK-92 Cl-клеток посредством хроматографии. Стрелка = HMGB1-содержащая фракция (элюат #38). (В) Иммуноблот, показывающий мембрану, которая содержит элюаты 37-42. Специфичная полоса HMGB1 на 30 «Да была обнаружена только в элюате # 38. (С) Анализ цитотоксичности после 72 ч инкубации с HMGB1 (n=3). В Использовали разведение 1:40 очищенного HMGB1 (#38) (соответствует приблизительно 16 Нм). Рекомбинантный HMGB1 человека был использован в 80 Нм. (D) Цитотоксичность супернатантов из активированных NK-клеток периферической крови человека (кросс-линкерные с антителами к Nkp30) от двух доноров была протестирована в анализе с кристаллическим фиолетовым красителем (72 часа, n=3). В качестве ингибитора HMGB1 использовали глицирризин (200 мкМ). (Е) Иммуноблот супернатанта, использованный в (D). При кросслинкинге Nkp30 специфично секретировался HMGB1. *=неспецифичная полоса. **р=0,002 (F) к (М) HMGB1, полученный из NK-клеток, вызывает гибель клеток колоректального рака. (F, G) HMGB1 из цитотоксичных гранул из линии клеток NK-92 CI был очищен методом обращенно-фазовой хроматографии на колонке Resource RPC (F) и на колонке Source 15RPC ST 4.6/100 (G) перед этапом окончательной очистки. Подробная информация приведена в разделе Экспериментальные процедуры. Пунктирная линия показывает градиент ацетонитрила. HMGB1-содержащие фракции обозначены стрелками. (Н) Выход очищенного продукта составил приблизительно 90%, что определили при окрашивании соответствующего геля красителем кумасси голубой. (I, слева) Выживание раковых клеток НТ29 по анализу жизнеспособности с помощью кристаллического фиолетового красителя. Клетки были обработаны рекомбинантным HMGB1 человека (160 нМ) или полученным из NK-клеток HMGB1 (160 нМ); как указано, использовали 200 мкМ глицирризин (72 часа, n=3). (I, справа) Параллельное сравнение цитотоксичности HMGB1 провели с использованием концентраций HMGB1 80 нМ (72 часа, n=3). (К) Серебряный гель, показывающий чистоту HMGB1 в элюате # 38 (0,5 мкг загруженного белка). (L) HMGB1 (80 нМ, 24 часа, n=3) из супернатанта стимулированных Nkp30 NK-клеток из донорской крови, очищенный с помощью ВЭЖХ, был разведен в контрольном супернатанте IgG1 и показывает частичную цитотоксичность. (М) Концентрацию гамма-интерферона определяли с помощью ELISA (см. Экспериментальные процедуры) и использовали в качестве положительного контроля для активации культивируемых и стимулированных NK-клеток, полученных из донорской крови. Планки погрешностей представляют СО, **р<0,002.

Фиг. 2: HMGB1 ингибирует митохондриальное дыхание. (А) Активность комплексов дыхательной цепи, измеренная в митохондриальных фракциях клеточных линий колоректального рака после обработки HMGB1 (80 нМ, 24 часа, n=5). (В) Срезы тканей были получены из свежих хирургических образцов карциномы толстой кишки человека и обработаны с HMGB1 (160 нМ, 72 часа). После гомогенизации срезов ткани активность КДЦ была измерена в митохондриальных фракциях (n=8). (C-F) Клетки и срезы тканей колоректального рака были обработаны HMGB1, как описано в (А) и (В), соответственно. Затем была измерена чувствительность дыхания к цианиду, *р<0,05, **р<0,001.

Фиг. 3: HMGB1 блокирует гликолиз при интерференции с РК М2. (А) Активность гликолитических ферментов, измеренная в цитозольных фракциях после обработки HMGB1 (80 нМ, 24 часа, n=5). НК=гексокиназа, PFK=фосфофруктокиназа, GAPDH=глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, TPI=триоза-фосфат-изомераза, PGM=фосфоглицератмутаза, ENO=энолаза, LDH=лактатдегидрогеназа. (В) Срезы тканей рака толстой кишки, полученные из свежих хирургических образцов, были обработаны с HMGB1 (160 нМ, 72 часа). Активность тетрамерной РК М2 измерили в восьми гомогенатах. (С) Активность РК М2 в клетках колоректального рака измерили после 24 часов инкубации с супернатантом, полученным из стимулированных NK-клеток из крови донора #2 (см. Фиг. 1D). В качестве ингибитора HMGB1 использовали глицирризин (200 мкМ) (n=3). (D) Выход 5-3Н-глюкозы определили после обработки HMGB1 (80 нМ, 24 часа, n=3). (Е) Эксперимент с использованием клеток SW480 проводили, как описано в (D). В качестве ингибитора HMGB1 использовали глицирризин (200 мкМ) РК М2 (n=3). (F) Обогащение 14С в мРНК сырых экстрактов после обработки HMGB1 (80 нМ, 24 часа, n=3). (G) Выделение комплекса РК M2-HMGB1: ультрафильтрация раствора, содержащего 2 мкм РК М2 человека и 2 мкм HMGB1 человека. Фильтрованный комплекс РК M2-HMGB1 подвергли вестерн-блоттингу, *р<0.05, **р<0.002, ***р<0.00008.

Фиг. 4: HMGB1 является аллостерическим ингибитором тетрамерной РК М2. (А Расчеты были проведены для следующих конструктов HMGB1: крайний слева: А-бокс (темный), нефосфорилированные тирозины; центр слева: А-бокс, фосфорилированные тирозины; центр справа: В-бокс, нефосфорилированные тирозины; крайний справа: В-бокс, фосфорилированные тирозины. (В) Темное затуманивание=электростатические потенциалы А и В боксов HMGB1, с: крайний слева) А бокс, нефосфорилированные тирозины; центр слева) А бокс, фосфорилированные тирозины; центр справа) В бокс, нефосфорилированные тирозины; крайний справа) В бокс, фосфорилированные тирозины. (С) Слева: Расстояния от остатков HMGB1 бокс В pTyr 116 и pTyr 162 (нумерация согласно PDB-файлу: 2YRQ, соответствующая остаткам 109 и 155, соответственно, в последовательности человека) до PK М2 K433 для наилучшей позиции стыковки и PK М2 Y105 до ближайшего заряженного остатка от бокса В HMGB1. Справа: Повернутый вид с электростатическим потенциалом (темный) PK М2. (D) Эксперимент был проведен, как изложено в (А), в данном случае в присутствии FBP (слева) или с фосфорилированным Tyr105 (в центре) или в отсутствие FBP и с нефосфорилированным Tyr 105 (справа).

Фиг. 5: Ферментация глюкозы и глютаминолиз преодолевают запущенный HMGB1 метаболитический блок в раковых клетках. (А) Анализ жизнеспособности, проведенный с клетками с дефицитом дыхательной цепи (ρ0) и контрольными (дикого типа) клетками, обработанными HMGB1 (160 нМ, 72 часа, n=3), **р<0,0001. (В) Количество продукции АТФ рассчитали по потреблению 2 и по эффлюксу 13С-лактата, производного от немеченой глюкозы. (С) Количество продукции АТФ рассчитали по эффлюксу 13С-лактата, производного от 13С-меченого глютамина. Клетки были обработаны HMGB1 (80 нМ, 24 часа, n=3, *р<0,02). (D) Клетки, выжившие после обработки олигомицином (10 нг/мл) и HMGB1 (80 нМ) (и то, и другое по 72 часа, n=3, ** р<0,0001). (Е) Анализ выживаемости при окраске кристаллическим фиолетовым в безглюкозной среде после обработки HMGB1 (80 нМ, SW480 и НСТ116; 160 нМ, НТ29; 24 часа). L-DON (1 мкм) был добавлен как указано (n=3, *р<0,02). (F) После опосредованного малыми интерферирующими РНК нокдауна МЕ1 клетки НТ29 были обработаны HMGB1 (80 нМ, 72 часа, n=3, * р<0,0003, ** р<0,000002). Правая панель: иммуноблот с антителами к МЕ1 для подтверждения нокдауна. (G) Уровни экспрессии МЕ1 и глубина местной инвазии раковой (рТ стадия) у пациентов с карциномой прямой кишки; + низкая, ++ умеренная +++ сильная экспрессия МЕ1. (Н) Связь уровней экспрессии МЕ1 и метастаз в лимфоузлы (pN стадия) у пациентов с карциномой прямой кишки. (I) Ингибирование тетрамерной PKM2 фенокопирует цитотоксичность HMGB1. (I) Клетки были обработаны 100 мкм P-M2tide (фосфотирозин пептид) в течение 24 часов (n=3). Активирующая PKM2 небольшая молекула ML-265, которая связывается с димер-димерным интерфейсом, удаленным от сайта связывания P-M2tide, не вызывает цитотоксичность. (K) Цитозольные фракции указанных клеток, обработанные 125I-меченым HMGB1 (80 нМ, 24 часа, n=3). (L) PKM2 временно была подавлена или сверхэкспрессирована и затем получила обработку HMGB1 (80 нМ, 72 часа, n=3). Успешный нокдаун или сверхэкспрессия PKM2 были подтверждены вестерн-блоттингом (М, N). Планки погрешностей представляют СО, *р<0,05, **р<0,01.

Фиг. 6: Совместное введение HMGB1 и активатора (А слева и справа) или ингибитора (В) РМК2 имеет синергетический цитотоксический эффект, как определено по анализу с окраской кристаллическим фиолетовым (анализы были проведены дважды, * указывает на р<0,05). (С) Иммунопреципитация с I125-меченым HMGB1 (аффинная адсорбция PKM2). HMGB1, как фосфотирозин пептиды, связывается рядом с аллостерическим центром PKM2, что ведет к конкуренции при связывании. В противоположность этому активатор ML265, который связывается с тетрамером на димер-димерном интерфейсе, находящемся далеко от аллостерического центра, не конкурирует с HMBG1.

Фиг. 7: Вызывающее гибель клеток влияние олигофосфорилированного HMGB1: показанные линии раковых клеток инкубировали с двумя различными концентрациями GInHMGB1 (SEQ ID NO: 12), и жизнеспособность клеток тестировали с помощью МТТ-анализа; контроль: без добавления GInHMGB1; у-ось: оптическая плотность при 630 нм.

Фиг. 8: Вызывающее гибель клеток влияние олигофосфорилированного HMGB1: показанные линии раковых клеток инкубировали с двумя различными концентрациями GlnHMGB1 (SEQ ID NO: 12), и жизнеспособность клеток тестировали с помощью анализа высвобождения LDH; контроль: без добавления GInHMGB1; ось у: фракция LDH в супернатанте (%).

Следующие Примеры предназначены только для иллюстрации изобретения. Они никоим образом не должны ограничивать объем изобретения.

Пример 1: Белок HMGB1, полученный из NK-клеток, вызывает гибель клеток колоректального рака

Принимая во внимание цитотоксическое действие рекомбинантного белка человека HMGB1 на раковые клетки⁹, авторы настоящего изобретения предприняли усилия с целью исследовать клеточное влияние иммунных клеток, полученных из эндогенного HMGB. Для этого авторы настоящего изобретения выделили HMGB1 из цитозольных гранул линии NK-клеток NK-92 CI посредством ВЭЖХ (Фиг. 1А). Элюирование HMGB1 было подтверждено иммуноблотным анализом (Фиг. 1В). Как HMGB1, полученный из NK-клеток, так и, в качестве сравнения, рекомбинантный HMGB1 человека эффективно убивали клетки колоректального рака SW480 и НСТ116 (Фиг. 1С). Наблюдаемая гибель клеток была специфична для HMGB1, поскольку глицирризин, ингибитор HMGB1, значительно блокировал его цитотоксические эффекты. В противоположность этому, клетки НТ29 были устойчивы к концентрациям HMGB1 от низких до промежуточных (от 16 до 80 нМ). Более высокие концентрации (80 нМ или 160 нМ) полученного из NK-клеток HMGB1 вызывают более высокую цитотоксичность, чем у рекомбинатного HMGB1, что определили в параллельных экспериментах по цитотоксичности (Фиг. 1I). Серебряный окрашивающий гель с элюатом #38 подтвердил, что HMGB1 был выделен с высокой степенью чистоты (одна полоса на приблизительно 30 кД, Фиг. 1K).

После стимуляции активированных NK-клеток из периферической крови человека от здоровых доноров крови агонистами анти-Nkp30 мАт, зависимое от NK-клеток цитотоксическое действие на клетки рака толстой кишки НТ29 и НСТ116 было уменьшено HMGB1-специфичным ингибитором глицирризином, указывая на то, что HMGB1 частично опосредовал вызванную NK-клетками гибель опухолевых клеток (Фиг. 1D). В противоположность этому глицирризин не изменил цитотоксичность в клетках SW480.

Секреция HMGB1 NK-клетками была подтверждена иммуноблотом (Фиг. 1Е). Кроме того, в супернатанте были обнаружены высокие уровни интерферона-γ, что указывает на активацию NK-клеток агонистичными анти-NKp30 мАт. Таким образом, белок HMGB1, полученный из NK-клеток, вызывает гибель клеток колоректального рака.

Пример 2: HMGB1 ингибирует аэробное дыхание в колоректальных карциномах in vitro и ex vivo

Для опосредованной HMGB1 гибели клеток были характерны образование гигантских митохондрий и существенное сокращение АТФ в чувствительных к HMGB1 (SW480) и частично устойчивых к HMGB1 (НСТ116) раковых клетках, но не в устойчивых к HMGB1 клетках НТ29. Из-за наблюдаемой потери эквивалентов энергии и измененной митохондриальной морфологии мы изучили, влияет ли HMGB1 на основные пути образования АТФ, окислительного фосфорилирования (OXPHOS) и гликолиза. Обработка HMGB1 приводила к значительно более низким уровням активности цитохромоксидазы (СОХ), которая жизненно важна для образования АТФ с участием кислорода (Фиг. 2А). Поток электронов от комплекса I к комплексу III был неизменным, тогда как парная активность комплексов II и II была снижена в чувствительных к HMGB1 клетках (SW480), и сохранена или даже повышена в частично устойчивых к HMGB1 клетках линии НСТ116 и устойчивых к HMGB1 клетках линии НТ29. Активность АТФ-синтетазы не снижалась, что поддерживает гипотезу, что снижение внутриклеточной АТФ было вызвано ингибированием восходящего потока энергетического метаболизма в дыхательной цепи. Затем мы подтвердили наши основанные на монослойной культуре in vitro результаты в альтернативной модели, показывающей строение ткани колоректального рака человека в vivo с использованием срезов толщиной 300 мкм из свежей опухолевой ткани пациентов с колоректальным раком. Обработка HMGB1 снижала выход кислорода, как демонстрировало сильное ингибирование активности СОХ в первичной опухолевой ткани (Фиг. 2В). Соответственно HMGB1 сильно снижал митохонтриальное потребление кислорода в ткани рака прямой кишки (Фиг. 2С). Аналогичный эффект наблюдали в культуре клеток рака толстой кишки, где ингибирование митохондриального потребления кислорода было показано в чувствительных к HMGB1 клетках SW480 и клетках НСТ116 с частичной устойчивостью к HMGB1 (Фиг. 2 D+Е), тогда как митохондриальное дыхание клеток НТ29 с устойчивостью к HMGB1 было снижено HMGB1 лишь в незначительной степени (Фиг. 2F). Эти результаты указывают на то, что HMGB1 подавляет аэробное дыхание в клетках колоректальной карциномы.

Пример 3: HMGB1 контролирует гликолиз в клетках колоректальной карциномы путем специфичного ингибирования тетрамерной РК М2

Поскольку аэробное дыхание может стимулировать глюкоза, мы изучили влияние HMGB1 на активность основных гликолитических ферментов. После обработки HMGB1 мы наблюдали снижение активности изоформы (М2) пируваткиназы (РК) (Фиг. 3А), которая, как известно, усиливает опосредованное глюкозой дыхание. HMGB1 специфично ингибировал тетрамерную изоформу пируваткиназы PK М2 во всех исследованных линиях клеток колоректального рака, а также в культурах срезов тканей ex vivo (Фиг. 3А+В). Дальнейшие эксперименты показали, что содержащие HMGB1 супернатанты от стимулированных Nkp30 NK-клеток из донорской крови (донор #2, см. Фиг. 1) также в значительной степени ингибировали тетрамерную PK М2 (Фиг. 3С). Важно отметить, что это ингибирование было вызвано HMGB1, поскольку глицирризин полностью восстанавливал активность тетрамерной PK М2. Активность димерной PK М2 оставалась неизменной. Поток глюкозы в клетках, обработанных HMGB1, был уменьшен на этапе реакции с енолазой (Фиг. 3D). Наблюдаемое метаболическое переключение было частично обратимо при совместной обработке с ингибитором HMGB1 глицирризином (Фиг. 3Е). Кроме того, обработка HMGB1 привела к увеличению потока промежуточных продуктов гликолиза в пентозофосфатный путь (Фиг. 3F). Одновременно с аккумуляцией глюкозных промежуточных продуктов верхнего пути пируваткиназы наблюдалось сильное увеличение гексокиназного (HK) продукта глюкозо-6-фосфата, что может объяснять наблюдаемое уменьшение активности HK при ингибитировании продукта. HMGB1 физически взаимодействовал с PK М2 (Фиг. 3G) in vitro, что поддерживает результаты ферментативных тестов. С помощью ¹²⁵I-меченых HMGB1 мы смогли показать специфичное связывание HMGB1 с PKM2 in vivo при иммунопреципитации PKM2 (Фиг. 6с). Не являющиеся цитотоксичными концентрации P-M2tide существенно ингибировали связывание HMGB1 с PKM2, что поддерживает наши результаты in silico (компьютерного моделирования) (Фиг. 6С). Эти данные свидетельствуют о том, что связывание HMGB1 конкурирует с сайтом связывания PKM2 P-M2tide с участием K433 вблизи от кармана для связывания FBP в PKM2. Важно отметить, что малая молекула ML-265, активатор PKM2, которая, как выявили ранее, связывается с димер-димерным интерфейсом PKM2,¹⁰ (вдали от кармана для связывания FBP) не конкурировала со связыванием HMGB1 с PKM2 (Фиг. 6С).

Пример 4: Связывание и аллостерическое ингибитирование тетрамерной PK М2 посредством HMGB1

Чтобы более детально охарактеризовать ингибирование тетрамерной PK М2 посредством HMGB1, мы провели in silico исследования стыковочного белка. Фосфорилированный В-бокс HMGB1 давал один позиционный кластер, что указывает на специфичное связывание с PK М2 (Фиг. 4А). Специфичное связывание не наблюдали, если к нефосфорилированному В-боксу HMGB1, или полифосфорилированному или нефосфорилированному А-боксу HMGB1 применяли одинаковую процедуру расчета (Фиг. 4А). Это дополнительно подтвердил энергетический анализ кластеров связывания, который показал сильно электростатически стимулируемое связывание для полифосфорилированного В-бокса HMGB1, в отличие от преимущественно гидрофобно стимулируемого связывания, типичного для неспецифичного связывания в трех других исследуемых случаях (Фиг. 4 В). В случае фосфорилированного В-бокса, где наблюдали специфичное связывание, присутствовал большой участок отрицательного электростатического потенциала (красный изопотенциал) поблизости от интерфейса связывания (Фиг. 4В), тогда как в случаях неспецифичного связывания такой участок отсутствовал. Кроме того, во взаимодействии участвует K433 PK М2 (Фиг. 4С), которая, как было ранее показано, участвует в связывании фосфотирозина (pTyr) пептида возле кармана для связывания FBP¹¹ и в регуляции активности PK М2 в ходе контрольной тетрамеризации¹². Существуют различия в электростатическом потенциале в участке, окружающем предполагаемый сайт связывания HMGB1 при связывании FBP или фосфорилировании Y105 (Фиг. 4D). Уменьшение величины положительного электростатического потенциала при связывании FBP, или появление отрицательного электростатического потенциала при фосфорилировании Y105, по всей вероятности, препятствует связыванию отрицательно заряженных фосфатных групп из фосфорилированного В-бокса HMGB1 (Фиг. 4D). Эти результаты подтверждают, что HMGB1 является аллостерическим ингибитором тетрамера PK М2.

Кроме того, мы смогли фенокопировать наблюдаемую гибель клеток, применив известный ингибитор тетрамера PKM2, фосфотирозин пептид, называемый P-M2tide (Фиг. 5L). Ранее было показано, что P-M2tide связывается возле кармана для связывания FBP, что включает взаимодействие с K433 PKM2¹¹. Если P-M2tide индуцировал частичную гибель клеток, то малая молекула ML-265 не обладала способностью индуцировать гибель клеток (Фиг. 5L). Пенетрацию клеточной мембраны подтвердили, применив ¹²⁵I-меченый HMGB1⁹, что показало быстрое (24 ч) увеличение цитозольной радиоактивности (Фиг. 5K). Эксперименты с усилением и потерей функции PKM2 с использованием PKM2 миРНК / плазмиды показали, что отрицательная регуляция PKM2 сенсибилизировала клетки к HMGB1, тогда как сверхэкспрессия PKM2 сделала их более устойчивыми к HMGB1 (Фиг. 5L-N).

Пример 5: Для устойчивых к HMGB1 раковых клеток характерны усиление ферментации глюкозы и повышение глютаминолиза

Наблюдаемая гибель клеток, вызванная специфичным ингибированием тетрамера PK М2 и последующим ингибированием стимулируемого глюкозой дыхания, должна благоприятствовать выживанию раковых клеток, выполняющих главным образом (анаэробный) гликолиз. Для проверки этой гипотезы мы получили клетки колоректального рака, лишенные интактной дыхательной цепи (ρ⁰ клетки) из одной клеточной линии чувствительных к HMGB1 клеток (SW480) и одной клеточной линии частично чувствительных к HMGB1 клеток (НСТ116). Эти модифицированные клеточные линии, в которых шел только гликолиз, стали почти полностью устойчивы к HMGB1 (Фиг. 5А). Чтобы оценить сравнительный вклад гликолиза, глютаминолиза и аэробного дыхания в выживаемость клеток в присутствии HMGB1, мы рассчитали общую выработку АТФ (Фиг. 5В+С) по темпам образования лактата и по потреблению кислорода. Как частично (НСТ116), так и высоко устойчивые (НТ29) к HMGB1 раковые клетки эффективно компенсировали вызванное HMGB1 уменьшение образования АТФ в ходе гликолиза, тогда как клетки SW480 показали сильное снижение образования АТФ на ~ 50% (Фиг. 5В). Однако после обработки HMGB1 только клетки НТ29 могли поддержать образование АТФ при аэробном дыхания, задействовав глютаминолиз, поскольку выход АТФ от глютаминолиза (Фиг. 5С) хорошо соответствовал образованию АТФ при утилизации О₂ (Фиг. 5В). Соответственно, после того как клетки НТ29 были обработаны HMGB1, окисление глюкозы сильно понизилось (на ~50%), а окисление глютамина возросло (на ~35%), что оценили, измерив образование меченого СО₂. Важно отметить, что энергия от аэробного дыхания имела решающее значение для выживания клеток SW480 и НСТ116, что показал вызов быстрой гибели клеток с помощью олигомицина (Фиг.а 5D). Ингибирование глютаминолиза L-DON привело к синергитической цитотоксичности как в безглюкозной среде (Фиг. 5Е), так и в среде с добавлением глюкозы. После отрицательного регулирования МЕ1 мы наблюдали сенсибилизацию клеток НТ29 к цитотоксичности HMGB1 (Фиг. 5F). Дополнительный HMGB1 ингибировал рост чувствительного к HMGB1 ксенотранспланта опухоли SW480 у голых мышей, тогда как обработка HMGB1 ксенотрансплантов опухолей НТ29, устойчивых к HMGB1, комбинированной терапией HMGB1 и L-DON существенно подавляла рост опухоли. Взятые вместе, как усиленная ферментация глюкозы, так и повышенный глютаминолиз могут сделать раковые клетки устойчивыми к HMGB1, а эксперименты на животных показывают, что лечение рекомбинантным HMGB1 может стать терапевтическим вариантом.

Пример 6: СПОСОБЫ

Культура клеток и исследования на животных

Колоректальная карцинома человека, глиобластома человека и линии NK-клеток человека были приобретены на коммерческой основе у АТСС.NK-клетки человека были выделены из концентратов лейкоцитов. Все работы, связанные с животными, были проведены в соответствии с инструкциями NIH «Руководства по содержанию и использованию лабораторных животных. Клеточные линии, культура клеток и поколение rho нулевых клеток и исследования на животных.

Клеточные линии карциномы толстой кишки SW480, НСТ116, НТ29 и СаCO2, клеточная линия глиобластомы человека U251MG и клеточная линия NK-92 CI естественных клеток-киллеров были приобретены на коммерческой основе у АТСС. Отсутствие загрязнений в клеточных линиях регулярно проверяли с помощью мультиплексной ПЦР, которую проводили в геномной и протеомной центральной лаборатории 2 (DKFZ, Гейдельберг, Германия). Для экспериментов клетки пересевали не более 10 раз. Rho нулевые клетки были получены, как описано ранее 1. (Gdynia, G. et al. Danger signaling protein HMGB1 induces a distinct form of cell death accompanied by formation of giant mitochondria. Cancer research 70, 8558-8568). Клетки, используемые в экспериментах, культивировали в среде RPMI (#1640, карциномы толстой кишки, NK-клетки) или в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (#41965-039, клетки глиобластомы). Rho нулевые клетки были получены, как описано ранее (Gdynia, G. et al. ibd.). Вкратце, клетки культивировали в среде RPMI (FCS 10%, 1% ФСБ) с добавлением 250 нг/мл этидиумбромида, L-пирувата 50 мкг/мл и 5 мг/мл уридина в течение 12 недель. Для измерений цитотоксичности клетки культивировали в 96-луночных планшетах, обработанных рекомбинатным белком HMGB1 человека (Sigma-Aldrich®), глицирризиновой кислотой ((3β, 18α) - 30-гидрокси-11, 30-диоксоолеан-12-ен-3-ил 2-О-β-D-глюкопирануроназил-β-D-глюкопиранозидуроник)) (Sigma-Aldrich®), 10 мкМ (нетоксично) или 100 мкМ (цитотоксично) P-M2tide (последовательность аа: GGAVDDDpYAQFANGG; #BML-P239-0001; Enzo LifeSciences) или 100 мкМ ML-265 (Cayman Chemical), затем жизнеспособность клеток оценили с помощью красителя кристаллический фиолетовый (Gillies, R. J., Didier, N. & Denton, M. Determination of cell number inmonolayer cultures. Analytical biochemistry 159, 109-113(1986)). Нокдаун с малатдегидрогеназой 1 был выполнен с 40 нМ миРНК с использованием липофектамина в 6-лунчных планшетах с последующей обработкой 80 нМ HMGB1 в течение 72 часов. Последовательности миРНК были следующими: МЕ1, 5'-CCCUGUGGGUAAAUUGGCUCUAUAU-3' и скремблированный контроль 5'-CCUGCAGUACUUCAAGCGGtt-3'. PKM2 миРНК были из Санта-Крус. Контролем служили неспецифичные миРНК (Dharmacon, Шверте, Германия). Для сверхэкспрессии PKM2 или МЕ1 клетки были трансфицированы pCMV-PKM2 (Sino Biological Inc. Пекин, Китай) или pCMV-ME1 (OriGene, Роквилл, Мэриленд, США) с использованием Lipofectamine 2000. Для измерений цитотоксичности конфлюэнтные клетки культивировали в 96-луночных планшетах, если не указано иное. Цитотоксическую активность супернатантов от стимулированных NK-клеток оценивали в 96-луночных планшетах в течение 3 дней со средой RPMI в качестве эталона. Положительным контролем служил рекомбинантный HMGB1 человека (10 нг, Sigma). Для анализов массы изотопомеров клетки культивировали в среде с глюкозой или в безглюкозной среде с добавлением во всех случаях одинаково меченых (U) -13 C-D-глюкозы или U-13 С-глютамина (Sigma-Aldrich®).

Для исследований на животных бестимусным CD1 голым мышам, самцам и самкам в возрасте 6 недель (Charles River, n=40) ввели подкожно 5×10⁶ клеток SW480 или НТ29 в 100 мкл ФСБ в правый бок, иглой 30-го калибра. Обработку начали, когда опухоли были прощупываемыми. Ежедневные внутрибрюшинные инъекции на контралатеральной стороне в течение 2 недель проводили с использованием 10 мкг rhHMGB1 в 500 мкл ФСБ или только ФСБ (контрольная группа) и/или инъекции L-DON 12,5 мг / кг (Ovejera, А. А., Houchens, D. P., Catane, R., Sheridan, М. А. & Muggia, F. М. Efficacy of 6-diazo-5-oxo-L-norleucine and N-[N-gamma-glutamyl-6-diazo-5-oxo-norleucinyl]-6-diazo-5-oxo-norleucine against experimental tumors in conventional andnude mice. Cancer research 39, 3220-3224 (1979). Объем опухоли был измерен штангенциркулем с использованием эллипсоидов по формуле (длина х ширина х высота х ) как описано (Tomayko, М. М. & Reynolds, С.Р. Determination of subcutaneous tumorsize in athymic (nude) mice. Cancer Chemother Pharmacol 24, 148-154 (1989)). После 2 недель обработки животные были умерщвлены.

Очистка обращенно-фазовой ВЭЖХ и идентификация HMGB1

Обращенно-фазовая хроматография: HMGB1 был выделен и очищен посредством обращенно-фазовой хромотографии по Zetterstrom и сотр. (Zetterstrom, С.K. et al. High mobility group box chromosomalprotein 1 (HMGB1) is an antibacterial factor produced by thehuman adenoid. Pediatric research 52, 148-154) за исключением того, что для хроматографии применили среду Source 15. На первом этапе очистки применили колонку Resource RPC (6,4×100 мм, GE Healthcare). Растворитель А представлял собой воду с 0,17% TFA, растворитель В представлял собой ацетонитрил с 0,15% TFA. Скорость потока составила 1 мл/мин. Была применена следующая программа элюирования: 5% растворитель В изократический в течение 10 мин, 5-30% В линейный в течение 15 мин, 30-60% В линейный в течение 45 мин, 60-90% В в течение 5 мин, 90% В изократический в течение 5 мин. Второй этап очистки провели на колонке Source 15RPC ST 4.6 / 100, применив те же условия элюирования, которые описаны выше. Финальную очистку провели на колонке Source ST 4.6/100 15RPC с элюированием 5% В изократический в течение 10 мин, 5-40% В линейный в течение 15 мин, 40-50% В линейный в течение 45 мин, 50-90% В в течение 5 мин и 90% В изократический в течение 5 мин.

Клетки NK-92 CI культивировали в минимальной питательной среде (MEM) альфа (Gibco) с добавлением 12,5% эмбриональной бычьей сыворотки (Gibco), 12,5% лошадиной сыворотки (Life technologies GmbH), 0,1% 2-меркаптоэтанола (Gibco) и 100 МЕ/мл пенициллина (Sigma Aldrich) и 100 мкг / мл стрептомицина (Sigma Aldrich). Клетки ежедневно разделяли и распределяли, аккуратно взбалтывая культуральные колбы и при необходимости добавляя свежую среду. За 24 часа до сбора клеток был добавлен рекомбинантный IL-2 человека (Tecin™ от Roche, любезно предоставленный NIH) в концентрации 100 МЕ/мл. 6×10⁸ NK-92 CI клетки были собраны из 1,8 л культуральной среды и использованы для очистки внутриклеточных мембранных везикул, как описано⁷. Окрашивание всех элюатов (80) кумасси голубым провели красителем Brilliant Blue R-250 (Sigma) согласно стандартным протоколам. HMGB1 детектировали посредством иммуноблот-анализа с применением человеческих антител к HMGB1 (1:1, 000, abeam). Гель окрасили Pierce Silver Stain Kit (ThermoScientific, Рокфорд, Иллинойс) в соответствии с инструкциями производителя.

Подготовка и культура естественных клеток-киллеров человека

NK-клетки человека были очищены из концентратов лейкоцитов из банка крови в Мангейме (Германия). Концентрат развели ФСБ и провели с ним этап центрифугирования на биоколлоидном разделительном растворе (Biochrom AG). Собрали лейкоцитарную пленку и провели адгезию на пластике в течение 45 минут. Из полученных лейкоцитов периферической крови человека NK-клетки были выделены с помощью набора для выделения NK-клеток человека (Miltenyi) согласно инструкциям производителя. NK-клетки с высокой степенью очистки (95% CD3 - CD56+, как определили с помощью проточной цитометрии) затем культивировали в среде для роста стволовых клеток CellGro (CellGenix) с 10% сывороткой крови человека АВ (Лаборатории РАА), 200 ед/мл рекомбинантного интерлейкина-2 человека (IL-2, Национальные институты здравоохранения) и 100 ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина (Sigma-Aldrich) при плотности 1×10⁶ клеток/мл. Через 6 дней NK-клетки собрали, сосчитали и повторно посеяли при плотности 2×10⁶ клеток/мл в предварительно покрытые антителами лунки 96-луночного планшета в RPMI (Sigma-Aldrich) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Invitrogen) и 100 ед/мл Ил-2. Для покрытия лунок за один день перед посевом клеток лунки инкубировали с 1 мкг/мл или mlgG1 (клон МОРС-21) или антител к NKp30 (клон Р30-15, оба от BioLegend) в ФСБ на ночь при 4°С. После 2 дней на предварительно покрытых планшетах супернатанты были собраны и центрифугированы, чтобы осадить потенциальные клеточные загрязнения. Аликвоты супернатантов использовали для проведения ELISA IFN-γ (BioLegend) в соответствии с инструкциями производителя.

ex vivo Образцы рака толстой кишки, микроматричный анализ ткани карциномы толстой кишки

Сразу после хирургического удаления части толстой кишки, содержащей опухоль, материал свежей биопсии опухоли обработали микротомом с вибрирующим лезвием (Vibratome ™, Leica). Были получены тканевые срезы размером 300 мкм, которые инкубировали в течение указанного времени в среде для культивирования клеток RPMI. Контрольные срезы были зафиксированы на ночь в буферном 4% растворе формалина (рН 7,4), затем провели заливку в парафин и окрашивание гематоксилином и эозином (НЕ) на автоматизированной системе окрашивания (Techmate 500, DakoCytomation). НЕ-срезы изучили патологоанатомы (WR, GG) для выявления колоректальной карциномы. Все хирургические образцы были получены в Отделе общей, висцеральной и хирургии несчастных случаев в больнице при Гейдельбергском университете (Германия). Использование ткани человека для исследовательских целей было одобрено местным комитетом по этике в больнице Гейдельбергского университета.

Для создания микроматричного анализа опухоли (ТМА) образцы ткани от 1260 больных колоректальным раком, включенные в немецкий DACHS (Darmkrebs: Chancen der Verhutung durch Screening; Рак толстой кишки: возможности профилактики путем скрининга) в исследование случай-контроль, были собраны Банком опухолевых тканей NCT Хайдельберга. Использование тканей человека было одобрено местным комитетом по этике Гейдельбергского университета и медицинскими советами Баден-Вюртемберга и Рейнланд-Пфальца. Письменное информированное согласие было получено от каждого участника на исходном уровне, включая предназначение опухолевой ткани от больных с CRC.

Иммуногистохимия

Иммуноокрашивание срезов ТМА было проведено, как описано выше (Gdynia, G. et al. Basal caspase activity promotes migration andinvasiveness in glioblastoma cells. Molecular cancer research: MCR 5, 1232-1240, doi:10.1158/1541-7786. MCR-07-0343(2007)) с помощью автоматизированной системы окрашивания (Techmate 500, DakoCytomation). Визуализацию провели с авидин-биотиновым комплексом, аминоэтиокарбазолом и гематоксилином. Срезы инкубировали с кроличьими поликлональными антителами к малатдегидрогеназе 1 (1:100, ab97445, abcam) и обработали со следующими наборами: ChemMate Detection Kit (K5003, DakoCytomation), ChemMate буфер Kit (K5006, DakoCytomation) и Avidin/Biotin Blocking Kit (SP-2001, Vector Laboratories). Два патолога (WR, GG) оценили полуколичественно и независимо баллы интенсивности окрашивания и количество положительных раковых клеток. Степень интенсивности оценивали как 0=отрицательная; 1=низкая; 2=средняя и 3=высокая, а количество оценивали как 0=отсутствие положительных клеток; 1=0-10% положительных клеток; 2=11-50% положительных клеток; 3=51-80%) положительных клеток; 4=более 80% положительных клеток. Для нескольких случаев несовпадающей валидации установили консенснусный балл. Окрашивание и оценку дополнительно провели на второй ТМА, что дало аналогичные результаты. Итоговый балл иммунореактивности (IRS, от 0 до 12) получен путем умножения баллов интенсивности на баллы количества. Для МЕ1 низкую, умеренную и сильную положительную экспрессию определили как IRS менее 3, IRS между 3 и 6 и IRS более 6, соответственно. Для HMGB1 сильную и сильную положительную экспрессию определили как IRS между 3 и 6 и IRS более 6, соответственно. Только 5 опухолей были полностью HMGB1 негативными, поэтому в данном случае статистический анализ мог быть выполнен только с использованием сильной и сильной положительной экспрессии. Специфичность антител МЕ1: клетки высевали и трансфицировали на стеклянных покровных стеклах в 6-луночных планшетах. Покровные стекла собирали, фиксировали параформальдегидом и иммунизировали антителами МЕ1, как описано для срезов ТМА.

Электронная микроскопия

Клетки фиксировали (2,3% глутаральдегида в 50 мМ какодилата натрия, рН 7,2) in situ в течение 30 мин при 4°С, очищали, центрифугировали при 200 × об. в течение 10 мин при 4°С и окрашивали (2% тетроксида осмия, 5% уранилацетат). Были сделаны микрофотографии ультратонких срезов из дегидратированных и заключенных в смолу Epon образцов на электронным микроскопе Zeiss ЕМ-10А на 80 кВ. Реплика дифракционной решетки служила контролем индикатора увеличения.

Анализы ферментативной активности

Ферментативные активности комплексов дыхательной цепи, гликолитических белков и малатдегидрогеназы были определены в субклеточных фракциях как описано выше (Kaminski, М. М. et al. Т cell activation is driven by an ADP-dependentglucokinase linking enhanced glycolysis with mitochondrialreactive oxygen species generation. Cell reports 2, 1300-1315(2012). Bruncko, M. et al. Naphthamidine urokinaseplasminogen activator inhibitors with improvedpharmacokinetic properties. Bioorganic & medicinal chemistryletters 15, 93-98, (2005)) с помощью компьютерным образом настраиваемого спектрофотометра (Spectramax плюс Spectramax Plus Microplate Reader, Molecular Devices; Саннивейл, Калифорния, США) в режиме двойной длины волны; образцы были проанализированы в 96-луночных планшетах с контролируемой температурой в окончательном объеме 300 мкл. Активность МЕ1 регистрировали в присутствии возрастающих количеств яблочной кислоты (0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2,5 мМ). Vmax и Km были рассчитаны с использованием графика Хейнса-Вульфа. При наличии высоких уровней субстрата Km яблочной кислоты был аналогичным во всех трех исследованных клеточных линиях (SW480: 0,32 мМ, НСТ116: 0,30 мМ, НТ29: 0,31 мМ). Значения Vmax (мЕд/мг белка) составили 3,38 (SW480, 0,5-5,0 мм яблочная кислота), 5,77 (НСТ116, 0,5-5,0 мМ яблочная кислота) и 3.68 (НТ29, 0,5-5,0 мМ яблочная кислота) и 1,68 (SW480, 0,02-0,2 мМ яблочная кислота), 3.24 (НСТ116, 0,02-0,2 мМ яблочная кислота) и 1,89 (НТ29, 0,02-0,2 мМ яблочная кислота). Две изоформы МЕ1, митохондриальная (NAD (Р)+зависимая) МЕ3 и митохондриальная (NAD+зависимая) МЕ2, имели очень низкие или не обнаруживаемые активности (данные не показаны). Димерная PK М2 практически неактивна на физиологических уровнях PEP, что позволяет дифференцировать обе формы с помощью очень высокого (10 мМ) и низкого (100 мкМ) количества PEP в ферментативном анализе.

Уровни глюкозы-6-фосфата в клетках измерили с использованием набора для анализа глюкозы-6-фосфата (Sigma) в соответствии с протоколом производителя.

Метаболические анализы

Лактат, полученный в результате обмена ¹³С₆-D-глюкозы или ¹³С₅-глутамина, определяли путем сравнения интенсивности СН_3-группы меченых и немеченых лактатов в ЯМР. Митохондриальное дыхание измерили с помощью оксиграфической системы Oroboros 1. Гликолиз измерили путем контроля превращения 5-³Н-глюкозы в ³H₂O. Включение ¹⁴С в рибозу РНК из U-¹⁴С-меченой глюкозы было принято как утилизации глюкозы в пентозы фосфат шунта. Ферментативную активность определяли в субклеточных фракциях, как описано ранее²⁴.

In silico исследования стыковочного белка HMGB1 - PK М2

Из-за сложности точного учета структурной гибкости линкерного участка (остатки 79-94) между двумя доменами были использованы отдельные HMGB1 домены (PDB: 1CKT, 2YRQ), а не полная структура HMGB1. Первичные структуры были взяты из Банка данных по белкам (PDB), а рентгеновские структуры использовали предпочтительно по отношению к ЯМР-структурам там, где это было возможно,. Использовали структуру PK М2 (PDB код: 3BJF), бокс A HMGB (PDB код: 1CKT), бокс В HMGB (PDB код: 2YRQ, остатки 95-163). Во все расчетах использовали цепь А из 3BJF. Для расчетов с наличием FBP этот остаток был сохранен как файл mol2 в UCSF Chimera и подан на веб-сервер PDB2PQR в дополнение к модифицированному файлу PDB. Во всех остальных расчетах все лиганды были удалены из структур. Для подготовки всех структур для моделирования с помощью SDA, с использованием параметров силового поля AMBER и конфигурациями протонирования, заданными при рН 7. использовали веб-сервер PDB2PQR. Каждую структуру HMGB1 и PK М2, фосфорилированную на Y105, фосфорилпровали с использованием функции сборки Chimera. Заряды и радиусы были вручную добавлены в файлы PQR с использованием параметров фосфотирозина, как указано в базе данных AMBER (http://personalpages.manchester.ac.uk/staff/Richard.Bryce/amber/pro/phos2_inf.html). APBS версии 1.2.1 был использован для решения линейного уравнения Пуассона-Больцмана с простыми граничными условиями Дебая-Хюккеля, белковая диэлектрическая константа 1 и растворенный диэлектрик 78 для вычисления электростатического потенциала каждого белка на кубической сетке из 129 точек, с шагом сетки 1 . Потенциал был рассчитан при ионной силе 50 мМ с положительными и отрицательными ионами с радиусом 1,5 . Диэлектрические коэффициенты и коэффициенты доступности ионов рассчитали с использованием метода сглаживания (вариант smol), и окно сглаживания было равным 0,3 . Для целей расчета эффективного заряда исследуемые заряды были размещены согласно первоначальным расчетам SDA и дополнительно на атомах фосфора и кислорода остатков фосфотирозина. Для расчета более 40000 стыковочных точек соприкосновения комплексов для каждой из четырех моделей HMGB1 (нефосфорилированный бокс А, фосфорилированный бокс А, нефосфорилированный бокс В, фосфорилированный бокс В) с PK М2 использовали программу SDA. Расчеты SDA включали электростатическое взаимодействие, условия электростатической десольватации и гидрофобной десольватации, с весовыми коэффициентами 0,5, 1,0 и -0,013 соответственно. Радиус белкового зонда установили равным 1,77 , зонда растворителя равным 1,4 , а исключающий шаг сетки равным 0,5 . Белки первоначально разделяли на 260 , и симуляция останавливали, если расстояние центр-центр превышало 540 или общее время моделирования превышало 5000 ps. Верхние 5000 стыковочных комплексов, в соответствии с благоприятной энергией взаимодействия, были сохранены для кластерного анализа с использованием инструмента иерархической кластеризации, предоставляемого с SDA. В каждом моделировании стыковочные комплексы были сгруппированы для получения 10 кластеров для количественного и визуального анализа. Все изображения были подготовлены с использованием программного обеспечения для визуализации VMD.

ЯМР-анализ метаболитов

Для анализа ¹³эффлюкса С-лактата 1 мл клеточного супернатанта центрифугировали (8000 × об, 10 мин, 4°С) для осаждения клеточного дебриса. К 500 мкл супернатанта добавляли 10% D₂O и переносили в 5 мм пробирки для образцов ЯМР. Образцы измеряли с помощью спектрометра Bruker Avancelll 600 NMR, снабженного криогенно охлаждаемым детекционным зондом (QNP-CryoProbe™).

Параметры измерения:

Магнитное поле 14.09 Tesla; температура образца 295 K; ширина импульса 4,7 мкс (соответствует углу поворота 30°); широкополосное расщепление основного импульса (Waltz65) во время задержки захвата и релаксации, 128 K суммарных точек задержки данных; время захвата 1,8 сек; задержка релаксации 1,5 сек; 512 переходов; общее время эксперимента 30 мин.

Технологические параметры:

Нулевое заполнение до 256 K реальных точек данных, экспоненциальное умножение (Ib=1,0 Гц); преобразование Фурье с обратным линейным прогнозом для компенсации артефактов на исходном уровне.

Анализ данных:

Интеграл сигнала ¹³СН₃ группы лактата (синглет на δ=20,108 ppm для немеченого лактата и дуплет для меченого лактата на δ=20,097 ppm (¹J (^13C13 С)=36,8 Гц) соответственно) был принят в качестве показателя концентрации лактата. Для того чтобы получить надежные количественные результаты, интенсивность откалибровали со стандартными образцами, содержащими известные количества меченого и немеченого лактата. Эта процедура также компенсирует ошибки из-за неполной релаксации ядер ¹³С в течение выбранного времени повторения (3,3 с). Определение концентраций провели с использованием функционала «ERETIC», встроенного в программное обеспечение Bruker NMR (Topspin 3.2, Bruker BioSpin 2012). Концентрации, полученные таким образом, были скорректированы для неполной степени ¹³С обогащения в ¹³С₆ глюкозе и ¹³С₅ глютамине, соответственно (98%).

Иммуноблот-анализ, субклеточное фракционирование, ультрафильтрация

Клетки лизировали в лизирующем буфере Р (20 мМ Трис-HCl (рН 7,4), 137 NaCl, 10% (об/об) глицерина, 1% Тритон Х-100, ЭДТА 2 мм, 100 мМ фенилметилсульфонил фторида и ингибиторы протеазы (Complete mini от Roche). Лизаты центрифугировали при 14000×10 (10 мин) при 4°С. Общий белок измеряли методом Брэдфорда (Bio-Rad). Растворенный белок разделяли посредством ДСН-ПААГ-электрофореза, блоттировали на нитроцеллюлозу и инкубировали с одними из следующих антител: мышиными моноклональными антителами к β-актину (1:3000, Sigma-Aldrich), кроличьими антителами к PK М2 (1:1000, Cell Signaling), кроличьими антителами к малатдегидрогеназе 1 (1:1000, abcam). Соответствующие вторичные антитела (1:3000, конъюгированные с пероксидазой хрена) были получены от Bio-Rad. Визуализацию проводили с помощью усовершенствованной техники хемилюминесценции (GE-Healthcare). Митохондриальные фракции экстрагировали с использованием набора для фракционирования клеток ApoAlert (Clontech), как описано ранее (Gdynia, G. Et al. BLOC1S2 interacts with the HIPPI protein and sensitizesNCH89 glioblastoma cells to apoptosis. Apoptosis: aninternational journal on programmed cell death 13, 437-447, (2008)).

Ультрафильтрация комплекса PK М2-HMGB1:эквимолярные количества HMGB1 и PKM2 смешивали в конечном объеме 300 мкл и фильтровали (14000 г, 4°С) до конечного объема 15 мкл в устройстве Amicon Ultra 0,5 мл 30k (Merck-Millipore, Дармштадт, Германия). После центрифугирования ультраконцентрат был доведен до первоначального объема. Затем фильтрат и ультраконцентрат проанализировали с помощью вестерн-блота. HMGB1 и PKM2 для контролей также были проанализированы отдельно. Чистый HMGB1 (2 мкМ) служил отрицательным контролем.

Количественный анализ ПЦР

Количественный ПЦР-анализ проводили, как описано ранее (Fassl, A. et al. Notch1 signaling promotes survivalof glioblastoma cells via EGFR-mediated induction of anti-apoptotic Mcl-1. Oncogene 31, 4698-4708, doi:10.1038/onc.2011.615 (2012)).

Статистический анализ

Мы оценили связь между экспрессией МЕ1 или HMGB1 и локальной величиной опухоли (рТ) и метастаз в лимфатические узлы (pN) у всех колоректальных образцов вместе взятых, а также в подгруппах толстой кишки и прямой кишки с использованием теста линейно-линейной связи (Agresti A. Categorical Data Analysis. JohnWiley & Sons. Hoboken, New Jersey, 2002). Общее время выживаемости определяли как время от постановки диагноза до смерти по любой причине. Конечными точками выживаемости без прогрессирования были рецидив опухоли, отдаленные метастазы или смерть от любой причины, независимо от того, что произошло в первую очередь. Для анализа выживаемости, связанной с CRC (колоректальным раком), смертность от несвязанных причин рассматривали как конкурирующее явление. Мультивариантные (причиноспецифичные) модели регрессии пропорционально опасности включали экспрессию МЕ1 или HMGB1 (показатель IRS), возраст, пол, образование, рТ, pN, рМ, локацию опухоли, адъювантную и неоадъювантную химио- и лучевую терапию. Стадию рТ определяют по степени инвазии опухоли в стенку толстой кишки: подслизистая (рТ1), мышечная оболочка (рТ2), субсерозная оболочка/околотолстокишечная жировая ткань (рТ3) и перфорация через брюшину / инвазия в другие органы (рТ4). Стадию pN определяют по количеству региональных метастаз в лимфатические узлы: метастазы в 1 региональный лимфатический узел (pN1a), метастазы в 2-3 региональных лимфатических узлах (pN1b), метастаза(ы) опухоли в субсерозную оболочку или в не перитонеализованную околотолстокишечную или околопрямокишечную мягкую ткань без региональных метастаз в лимфатические узлы (pN1c), метастазы в 4 или более региональных лимфатических узла (pN2). Стадию рМ0 или рМ1 определяют по отсутствию или появлению отдаленных метастаз, соответственно.

Результаты лабораторных экспериментов были проанализированы с использованием парных t-критериев. Результаты были проиллюстрированы с использованием среднего ± СО. Для всех статистических тестов использовали уровень значимости 5%. Значимость на фигурах показана звездочками. Статистический анализ провели с использованием статистической программной среды R, версия 2.15.3 и программного обеспечения Microsoft Excel 2010.

Пример 7:

В отдельном предпочтительном варианте реализации изобретения реактивы, необходимые для определения ферментативной активности, в твердом виде осаждены на дно и/или стенки луночного планшета. Луночные планшеты, обработанные таким образом, позволяют добавлять образец в буфер для образца и проводить фотометрическое измерение активности различных ферментов в образцах в лунках планшета.

Луночные планшеты с твердыми реактивами, осажденными на стенку и/или дно лунок, могут быть получены, например, путем сухого замораживания (лиофилизации), например обработки стенок луночного планшета определенным количеством буферного раствора с реактивами, необходимыми для определения активности фермента в подходящей концентрации. Под вакуумом лунки, обработанные таким образом, можно высушить при низкой температуре для того чтобы испарить воду буферного раствора. Высушенные реактивы для определения ферментативной активности определенного фермента прикреплены к дну и стенкам лунки.

Таблица 2: Использованные в этом исследовании клетки CLL с чувствительностью к PKM2 модулирующему препарату-кандидату PM2-tide (ингибитор; 100 мкМ, 250 мкМ) и DASA (активатор; 100 мкМ) и прогноз чувствительности с помощью прогностического фактора анаэробного гликолиза EnFin. Клетки были классифицированы как чувствительные к препарату, если менее чем 60% из них сохраняли жизнеспособность после обработки (25000-50000 клеток CLL, люминисцентный анализ жизнеспособности клеток CellTiter-Glo®, Promega). *=Высокочувствительные лейкозные клетки, реагирующие на 100 мкМ PM2-tide. $=Интервал 10 месяцев между взятием крови (один и тот же пациент). ™=Интервал 3 месяца между взятием крови (один и тот же пациент). Значения прогностического фактора анаэробного гликолиза S для образцов были рассчитаны согласно уравнению 1, как описано здесь выше, и составляли: 14РВ0079: 1.30; 14РВ0132: 2.33; 13РВ0500: 1.97; 13РВ0473: 2.03; 13РВ0555: 2.04; 13РВ0649: 2.15; 13РВ0501: 1.51; 14РВ0471: 1.22; 14РВ0451: 1.68.

Таблица 3: Прогноз реакции на PM2-tide (ингибитор; 100 мкМ, 250 мкМ) и DASA (активатор; 100 мкМ) образцов колоректального рака и хронического лимфоцитарного лейкоза с применением прогностического фактора анаэробного гликолиза EnFin. CRC: использовали 50 мг колоректальной первичной раковой ткани (стадия I-IV UICC). CLL: для анализа использовали объем 500 мкл лейкемических клеток из лейкоцитарной пленки.

Пример 8: нефосфорилируемый HMGB1

Получение GInHMGB1

Плазмиду, кодирующую полипептид HMGB1 с остатками тирозина в домене В-Вох, замещенными глутамином (SEQ ID NO: 12), трансфицировали в клетки НЕК (бессывороточная культура суспензии клеток, 1000 мл (приблизительно 2,5×10×1669 6×1678 клеток/мл), в которую затем добавили вальпроевую кислоту). Осадок клеток гомогенизировали и очистили с помощью смол IMAC и TALON (Clontech) и элюировали с использованием имидазола. Элюаты анализировали посредством ДСН-ПААГ-электрофореза (окрашивание Кумасси). После объединения положительных элюатов белок подвергли гель-фильтрации (Superdex) и провели финальный анализ в ходе ДСН-ПААГ-электрофореза. Очищенный белок использовали в концентрациях, указанных на Фиг. 7 и 8 в ингибиционном анализе.

МТТ-анализ

Анализы провели на трех временных точках (0, 24, 48 часов), и эксперимент повторили четыре раза. На каждой временной точке жизнеспособность клеток измеряли, используя анализ на основе 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ). МТТ-анализ провели, как описано у Мосманн (Mosmann Т. Rapid colorimetric assay for cellular growth andsurvival: application to proliferation and cytotoxicity assays.J Immunol Methods. 1983;65:55-63.). Вкратце, на каждой временной точке среду аспирировали из лунок, и МТТ (1 мг/мл) осторожно добавляли в каждую лунку. Клетки инкубировали в течение 3 часов при 37°С в 5% СО₂, после чего МТТ аспирировали и добавляли подкисленный изопропанол (0,04 М HCl) для солюбилизации восстановленных кристаллов синего формазана. Аликвоты переносили в 96-луночный планшет и измеряли оптическую плотность на тестовом фильтре 590 нм и контрольном фильтре 630 нм на 96-луночном планшетном ридере. Во всех клеточных линиях карциномы толстой кишки, используемых в эксперименте, наблюдали значительное снижение пролиферации по сравнению с необработанным контролем (р<0,05, n=4).

LDG-анализ

Активность лактатдегидрогеназы анализировали спектрофотометрически путем измерения окисления НАДФ пируватовым субстратом при 340 нм, как описано в Bergmeyer and Berndt Е. (1974). Результаты проанализировали с использованием следующего уравнения:

Во всех клеточных линиях карциномы толстой кишки, используемых в эксперименте, наблюдали значительное высвобождение LDG по сравнению с необработанным контролем (р<0,05, n=4). Таким образом, GInHMGB1 может вызвать гибель клеток в разных клеточных линиях карциномы.

СПРАВОЧНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

1. Wang, H. et al. HMG-1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice. Science 285, 248-251 (1999).

2. Lotze, M. Т. & Tracey, K. J. High-mobility group box 1 protein (HMGB1): nuclear weapon in the immune arsenal. Nature reviews. Immunology 5, 331-342, doi:10.1038/nri1594 (2005).

3. Apetoh, L. et al. Toll-like receptor 4-dependent contribution of the immune system to anticancer chemotherapy and radiotherapy. Nature medicine 13, 1050-1059, doi:10.1038/nm1622 (2007).

4. Saidi, H., Melki, M. T. & Gougeon, M. L. HMGB1-dependent triggering of HIV-1 replication and persistence in dendritic cells as a consequence of NK-DC cross-talk. PloS one 3, e3601, doi:10.1371/journal.pone.0003601 (2008).

5. Yang, D. et al. High mobility group box-1 protein induces the migration and activation of human dendritic cells and acts as an alarmin. Journal of leukocyte biology 81, 59-66, doi: 10.1189/jlb.0306180 (2007).

6. Zetterstrom, С.K. et al. High mobility group box chromosomal protein 1 (HMGB1) is an antibacterial factor produced by the human adenoid. Pediatric research 52, 148-154, doi: 10.1203/00006450-200208000-00004 (2002).

7. Calogero, S. et al. The lack of chromosomal protein Hmg1 does not disrupt cell growth but causes lethal hypoglycaemia in newborn mice. Nature genetics 22, 276-280, doi: 10.1038/10338 (1999).

8. Grundtman, C. et al. Effects of HMGB1 on in vitro responses of isolated muscle fibers and functional aspects in skeletal muscles of idiopathic inflammatory myopathies. The FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 24, 570-578, doi:10.1096/fj.09-144782 (2010).

9. Gdynia, G. et al. Danger signaling protein HMGB1 induces a distinct form of cell death accompanied by formation of giant mitochondria. Cancer research 70, 8558-8568, doi: 10.1158/0008-5472. CAN-10-0204 (2010).

10. Anastasiou, D. et al. Pyruvate kinase M2 activators promote tetramer formation and suppress tumorigenesis. Nature chemical biology 8, 839-847, doi: 10.1038/nchembio. 1060 (2012).

11. Christofk, H. R., Vander Heiden, M. G., Wu, N., Asara, J. M. & Cantley, L. C. Pyruvate kinase M2 is a phosphotyrosine-binding protein. Nature 452, 181-186, doi:10.1038/nature06667 (2008).

12. Hitosugi, T. et al. Tyrosine phosphorylation inhibits PKM2 to promote the Warburg effect and tumor growth. Science signaling 2, ra73, doi:10.1126/scisignal.2000431 (2009).

13. Bhat, R. & Rommelaere, J. NK-cell-dependent killing of colon carcinoma cells is mediated by natural cytotoxicity receptors (NCRs) and stimulated by parvovirus infection of target cells.

BMC cancer 13, 367, doi:10.1186/1471-2407-13-367 (2013).

14. Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C. & Thompson, С.B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science 324, 1029-1033, doi: 10.1126/science. 1160809 (2009).

15. Ikeda, Y. & Noguchi, T. Allosteric regulation of pyruvate kinase M2 isozyme involves a cysteine residue in the intersubunit contact. The Journal of biological chemistry 273, 12227-12233 (1998).

16. Erlandsson Harris, H. & Andersson, U. Mini-review: The nuclear protein HMGB1 as a proinflammatory mediator. European journal of immunology 34, 1503-1512, doi: 10.1002/eji.200424916 (2004).

17. Youn, J.H. & Shin, J.S. Nucleocytoplasmic shuttling of HMGB1 is regulated by phosphorylation that redirects it toward secretion. J Immunol 177, 7889-7897 (2006).

18. Lazzarino, G., Viola, A.R., Mulieri, L, Rotilio, G. & Mavelli, I. Prevention by fructose-1,6-bisphosphate of cardiac oxidative damage induced in mice by subchronic doxorubicin treatment. Cancer research 47, 6511-6516 (1987).

19. Sahdev, S., Khattar, S.K. & Saini, K.S. Production of active eukaryotic proteins through bacterial expression systems: a review of the existing biotechnology strategies. Molecular and cellular biochemistry 307, 249-264, doi:10.1007/s11010-007-9603-6 (2008).

20. Veith, N. et al. Organism-adapted specificity of the allosteric regulation of pyruvate kinase in lactic acid bacteria. PLoS computational biology 9, e1003159, doi: 10.1371/journal.pcbi.1003159 (2013).

21. Zhdanov, A.V., Waters, A.H., Golubeva, A.V., Dmitriev, R.I. & Papkovsky, D.B. Availability of the key metabolic substrates dictates the respiratory response of cancer cells to the mitochondrial uncoupling. Biochimica et biophysica acta 1837, 51-62, doi:10.1016/j.bbabio.2013.07.008 (2014).

22. Ren, J. G., Seth, P., Everett, P., Clish, С.B. & Sukhatme, V. P. Induction of erythroid differentiation in human erythroleukemia cells by depletion of malic enzyme 2. PloS one 5, doi:10.1371/journal.pone.0012520 (2010).

23. Tennant, D. A., Duran, R. V. & Gottlieb, E. Targeting metabolic transformation for cancer therapy. Nature reviews. Cancer 10, 267-277, doi:10.1038/nrc2817 (2010).

24. Kaminski, M. M. et al. T cell activation is driven by an ADP-dependent glucokinase linking enhanced glycolysis with mitochondrial reactive oxygen species generation. Cell reports 2, 1300-1315, doi:10.1016/j.celrep.2012.10.009 (2012).

Группа изобретений относится к медицине и касается комбинированного лекарственного средства для лечения нежелательной клеточной пролиферации, содержащего модулятор активности пируваткиназы М2 (PKM2) и агент, обеспечивающий полипептид высокомобильной группы бокс 1 (HMGB1) или его производное. Группа изобретений также касается набора для лечения нежелательной клеточной пролиферации, содержащего модулятор активности PKM2 и агент, обеспечивающий HMGB1 или его производное; олигофосфорилированного полипептида HMGB1 или его производного для лечения нежелательной клеточной пролиферации, в котором по меньшей мере один из остатков тирозина, соответствующих аминокислотам Y109, Y144, Y155 и Y162 полипептида HMGB1, заменен на нефосфорилируемую аминокислоту. Группа изобретений обеспечивает лечение нежелательной клеточной пролиферации. 12 н. и 8 з.п. ф-лы, 8 пр., 3 табл., 8 ил.

1. Комбинированное лекарственное средство для лечения нежелательной клеточной пролиферации, содержащее

(i) модулятор активности пируваткиназы М2 (PKM2) и

(ii) агент, обеспечивающий полипептид высокомобильной группы бокс 1 (HMGB1) или его производное.

2. Комбинированное лекарственное средство по п. 1, отличающееся тем, что указанный агент, обеспечивающий полипептид HMGB1 или его производное, представляет собой

(i) полипептид, содержащий полипептид HMGB1,

(ii) полипептид, содержащий бокс B полипептида HMGB1,

(iii) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную полипептиду (i) или (ii) и обладающий активностью ингибирования активности тетрамерной формы PKM2,

(iv) агент, специфично связывающийся с опухолевыми клетками, содержащий полипептид по любому из пп. (i) - (iii),

(v) секретирующую HMGB1 клетку, в которой индуцировали секрецию полипептида HMGB1,

(vi) экспрессируемый полинуклеотид, кодирующий полипептид (i), (ii) и/или (iii), пpедпочтительно содержащийся в векторе и/или клетке-хозяине, или

(vii) любую комбинацию с (i) по (vi).

3. Комбинированное лекарственное средство по п. 2, где указанный полипептид HMGB1 согласно (i) представляет собой полипептид HMGB1 человека, который предпочтительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; где указанный бокс B полипептида HMGB1 согласно (ii) представляет собой бокс B полипептида HMGB1 человека, который предпочтительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; где указанная секретирующая HMGB1 клетка согласно (iv) представляет собой макрофаг или NK-клетку; и/или где указанный экспрессируемый полинуклеотид согласно (vi) представляет собой полинуклеотид, содержащий (I) последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 6 и/или 7, или (II) последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 70% идентичную последовательности нуклеиновой кислоты согласно (I), и промотор, предпочтительно гетерологичный промотор.

4. Комбинированное лекарственное средство по любому из пп. 1-3, отличающееся тем, что указанный модулятор PKM2 представляет собой ингибитор PKM2, предпочтительно ингибитор тетрамеризации PKM2, более предпочтительно P-M2tide (тирозин-фосфорилированная SEQ ID NO: 1).

5. Комбинированное лекарственное средство по любому из пп. 1-3, отличающееся тем, что указанный модулятор представляет собой активатор PKM2, предпочтительно агент, стабилизирующий тетрамеры PKM2, более предпочтительно ML265 (6-(3-аминобензил)-4-метил-2-(метилсульфинил)-4,6-дигидро-5H-тиено[2',3':4,5]-пирроло[2,3-d]пиридазин-5-он).

6. Комбинированное лекарственное средство по любому из пп. 1-5, отличающееся тем, что указанное комбинированное лекарственное средство предназначено для комбинированного или раздельного и/или одновременного или последовательного применения.

7. Применение комбинированного лекарственного средства по любому из пп. 1-6 в качестве лекарственного средства.

8. Применение комбинированного лекарственного средства по любому из пп. 1-6 в лечении нежелательной клеточной пролиферации, предпочтительно в лечении рака.

9. Применение комбинированного лекарственного средства по любому из пп. 1-6 в предотвращении селекции клеток с нежелательной клеточной пролиферацией, которые (i) устойчивы к лечению модулятором активности PKM2 или (ii) устойчивы к лечению агентом, обеспечивающим HMGB1 или его производное.

10. Применение модулятора активности PKM2 в комбинированной терапии против нежелательной клеточной пролиферации, включающей введение агента, обеспечивающего HMGB1 или его производное.

11. Применение агента, обеспечивающего HMGB1 или его производного, в комбинированной терапии против нежелательной клеточной пролиферации, включающей введение модулятора активности PKM2.

12. Применение по п. 11, отличающееся тем, что нежелательная клеточная пролиферация устойчива к лечению модулятором активности PKM2.

13. Набор для лечения нежелательной клеточной пролиферации, содержащий модулятор активности PKM2 и агент, обеспечивающий HMGB1 или его производное.

14. Олигофосфорилированный полипептид HMGB1 или его производное для лечения нежелательной клеточной пролиферации, в котором по меньшей мере один из остатков тирозина, соответствующих аминокислотам Y109, Y144, Y155 и Y162 полипептида HMGB1, заменен на нефосфорилируемую аминокислоту.

15. Олигофосфорилированный полипептид HMGB1 или его производное по п. 14, отличающийся тем, что указанная нефосфорилируемая аминокислота представляет собой незаряженную нефосфорилируемую аминокислоту.

16. Олигофосфорилированный полипептид HMGB1 или его производное по п. 14 или 15, отличающийся тем, что указанная нефосфорилируемая аминокислота, в каждом случае независимо выбранная из групп, состоящих из аланина, валина, лейцина, изолейцина, фенилаланина, триптофана, аспарагина, глутамина, предпочтительно представляет собой глутамин.

17. Применение олигофосфорилированного полипептида HMGB1 по любому из пп. 14-16 в лечении рака.

18. Применение олигофосфорилированного полипептида HMGB1 по любому из пп. 14-16 в лечении нежелательной клеточной пролиферации.

19. Применение фосфорилированного полипептида HMGB1 или его производного в качестве лекарственного средства для лечения нежелательной клеточной пролиферации.

20. Применение фосфорилированного полипептида HMGB1 или его производного в лечении рака.