Способ диагностики мембранозной нефропатии как одной из форм хронического гломерулонефрита Российский патент 2022 года по МПК G01N33/68 G01N21/64 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано при диагностике хронического гломерулонефрита (ХГ), а именно его морфологической формы - мембранозной нефропатии. Хронический гломерулонефрит является глобальной проблемой здравоохранения, которая становится все более распространенной среди населения мира разного возраста.

На данный момент проблема осложнений гломерулонефрита приобретает все большее значение, так как затруднение ранней диагностики все чаще приводит к усугублению клинической картины и повреждению не только мочевыделительной, но и сердечно-сосудистой, дыхательной, нервной систем организма человека. К наиболее типичным осложнениям патологии относят острую почечную недостаточность, хроническую почечную недостаточность, энцефалопатию (эклампсию) с отеком мозга, отек легких, а также острую сердечную недостаточность. Развитие осложнений приводит к значительному ухудшению состояния человека, снижению его нормальной физической активности, а иногда приводит к летальному исходу [1].

Наряду с большим количеством методов исследования патологии почек, ведущими являются: биопсия почечной ткани [2] и определение скорости клубочковой фильтрации (расчетные формулы, проба Реберга-Тареева) [3]. Важно отметить, что биопсия почечной ткани является достаточно дорогостоящим и инвазивным методом обследования, методы определения скорости клубочковой фильтрации позволяют диагностировать заболевание при непосредственном обращении пациента к врачу с жалобами. Таким образом, целесообразна разработка способа ранней диагностики мембранозной нефропатии с целью прогнозирования развития патологии и предупреждения развития глубокой стадии заболевания.

Наиболее частой причиной развития осложнений при хроническом гломерулонефрите является развитие окислительного стресса, который сопровождается повреждением белков, липидов и как следствие приводит к изменению структурно-функциональных особенностей тканей и апоптозу [4].

Изменение содержания и структуры альбумина является важным клиническим показателем происходящих патологических процессов, поэтому в клинике обращают внимание на изменение сывороточного альбумина человека в качестве дополнительного клинического обследования при ряде патологий [5].

Известно об использовании ишемически-модифицированного сывороточного альбумина для ранней диагностики острого коронарного синдрома [6]. Кроме этого окислительная модификация альбумина по остаткам цистеина (Cys34) является признаком фокально-сегментарного гломерулосклероза [7], раннего когнитивного расстройства и болезни Альцгеймера [8], возрастной катаракты [9], цирроза печени [10].

В отечественной и зарубежной литературе мы не встретили исследований по определению окислительной модификации альбумина по остатку триптофана (Trp 189), выделенного из сыворотки крови пациентов с мембранозной нефропатией. Известно, что окисление триптофановых остатков до конечных продуктов (кинуренин, 3-гидроксикинуренин, гидроксипиролиндол, оксииндол, N-формилкинуренин, 3-гидроксикинуренин) сопровождается снижением флуоресценции, характерной для триптофана.

Техническим результатом настоящего изобретения является разработка раннего способа дополнительной диагностики мембранозной нефропатии.

В исследовании использовалась сыворотка крови пациентов с мембранозной нефропатией как одной из основных форм гломерулонефрита по клинико-морфологической классификации. Пациенты поступали в стационар с клиникой нефротического синдрома. В качестве контроля использовали сыворотку крови доноров.

Перед забором крови у пациентов проводилась оценка состояния выделительной и сердечно-сосудистой системы с помощью общего анализа крови и мочи, где выявлялись лейкоцитоз, снижение количества общего белка и протеинурия.

После подписания информированного согласия у пациентов забиралась кровь из вены без антикоагулянтов. Кровь откручивали на центрифуге (ELMI CM-6M, Германия) при 3000 об/мин в течение 20 минут для получения сыворотки крови. Далее из сыворотки крови выделяли альбумин методом проточного диализа в течение 18-20 часов [11], подтверждали полученную фракцию методом электрофорез [12] (CN-PAGE, система для электрофореза OmniPAGE «WAVE» Maxi 20 x 20 см, Cleaver Scientific Ltd, Великобритания). Степень поврежденного альбумина по аминокислотным остаткам триптофана определяли флуориметрическим методом [13] (Shimadzu RF-6000, Япония).

Полученные результаты обрабатывали с помощью программы Statistica 10.0. Для оценки статистически значимых различий использовали дисперсионный анализ (ANOVA), попарные сравнения выполняли с помощью рангового критерия Манна-Уитни (U-тест). Критический уровень статистической значимости различий нулевой гипотезы (р) принимали равным 0,05.

Пациенты были разделены на две группы по наличию или отсутствию мембранозной нефропатии, как одной из морфологических форм хронического гломерулонефрита. В исследование были включены пациенты с хроническим гломерулонефритом с нефротическим синдромом, а также здоровые доноры. Пациенты поступали в стационар для лечения хронического гломерулонефрита с жалобами на отеки нижних конечностей, нарушение мочеотделения, после обследования у кардиолога и сосудистого хирурга (исключен сердечно-сосудистый генез отеков).

Перед подборкой индивидуального способа лечения проводились различные диагностические исследования: биохимический анализ крови, общий анализ крови и мочи, ультразвуковое исследование почек, биопсия почечной ткани.

Было доказано, что у здоровых доноров флуоресценция триптофана составила 0,23 ед.фл./г белка, что находится в пределах допустимой нормы данного показателя и свидетельствует об отсутствии окислительного стресса, У группы пациентов с мембранозной нефропатией флуоресценция триптофана снижалась менее 0,097 ед.фл./г белка, что свидетельствует о повышении продуктов окисления триптофана на 57,8 % (р<0,05). Важно отметить, что у пациентов, не имеющих мембранозную нефропатию, флуоресценция триптофана не изменялась относительно доноров и составила 0,24 ед.фл./г белка.

Клиническое наблюдение 1: Пациент С., 45 лет, поступил в нефрологическое отделение с диагнозом хронический гломерулонефрит, нефротический синдром. Диагноз выставлен на основании клинико- лабораторных исследований (общие анализы крови и мочи, биохимический анализ крови), подтвержден данными биопсии почечной ткани. Морфологическое исследование подтвердило наличие мембранозной нефропатии, а также острого канальцевого некроза. По результатам общего анализа крови выявлен лейкоцитоз 10,2 * 10⁹/л, а также увеличение уровня креатинина до 145 мкмоль/л. Пациенту было выполнено исследование концентрации продуктов окисления триптофана в сыворотке крови в альбумине, что показало значительное снижение флуоресценции триптофана до 0,083 ед.фл./ г белка, то есть окислительное повреждение аминокислоты на 63,9 % относительно доноров.

Клиническое наблюдение 2: Пациент К., 49 лет, поступил в нефрологическое отделение с диагнозом хронический гломерулонефрит в стадии обострения. Нефротический синдром. По данным УЗИ контуры почек Контуры нечеткие. Rs: 138*70 мм, ТСП 22-23 мм. Эхогенность паренхиматозного слоя повышена. ЧЛС не расширена с обеих сторон. Конкременты с средней трети размером 4 мм. ПО данным морфологического исследования доказано развитие мембранозной нефропатии. По результатам общего анализа крови выявлен лейкоцитоз 14,75 * 10⁹/л, а также увеличение уровня креатинина до 196 мкмоль/л. Общий анализ мочи выявил протеинурию - 3,3 г/л. Пациенту было выполнено исследование концентрации продуктов окисления триптофана в альбумине сыворотке крови, что показало значительное снижение флуоресценции триптофана до 0,078 ед.фл./г белка, то есть окислительное повреждение аминокислоты на 66,1 % относительно доноров.

Клиническое наблюдение 3: Пациент М., 41 год, поступил в нефрологическое отделение с диагнозом Хронический гломерулонефрит, хроническая болезнь почек 1 стадии. По данным УЗИ контуры почек нечеткие. Rd: 115-52. ТПС 15 мм. ЧЛС не расширена. В с/3 киста 13мм. Эхогенность паренхиматозного слоя повышена с обеих сторон. ПО данным морфологического исследования доказано, что у больного болезнь минимальных изменений, ранняя стадия фокально-сегментарного гломерулосклероза. По результатам общего анализа крови выявлен лейкоцитоз 16,5 * 10⁹/л, а также увеличение уровня креатинина до 216 мкмоль/л. Общий анализ мочи выявил протеинурию - 6,6 г/л. Пациенту было выполнено исследование концентрации продуктов окисления триптофана в сыворотке крови по альбумину, что показало почти полное отсутствие изменений - 0,24 ед.фл./ г белка, что не отличается от значений данного показателя доноров.

Таким образом, доказано достоверно значимое снижение флуоресценции триптофана менее 0,097 ед.фл./г белка у пациентов с мембранозной нефропатией, что позволяет использовать данный критерий для диагностики мембранозной нефропатии.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики мембранозной нефропатии. Осуществляют определение флуоресценции триптофана. Из сыворотки крови выделяют альбумин. Далее флуориметрическим методом определяют степень поврежденного альбумина по аминокислотным остаткам триптофана. При значении флуоресценции триптофана менее 0,097 ед. фл./г белка диагностируют мембранозную нефропатию. Способ обеспечивает возможность ранней диагностики мембранозной нефропатии за счет определения флуоресценции аминокислотных остатков триптофана, входящих в состав альбумина сыворотки крови. 3 пр.

Способ диагностики мембранозной нефропатии, включающий определение флуоресценции триптофана, при этом из сыворотки крови выделяют альбумин, далее флуориметрическим методом определяют степень поврежденного альбумина по аминокислотным остаткам триптофана, и при значении флуоресценции триптофана менее 0,097 ед. фл./г белка диагностируют мембранозную нефропатию.