Количественная оценка соотношения hsa-miR-30c-5/VIM, hsa-miR-28-3p/VIM, hsa-miR-1-3p/ANXA2, hsa-miR-30c-5p/FBN1, hsa-miR-15b-5p/MYL6 tr.v.1, hsa-miR-15b-5p/MYL6 tr.v.2, hsa-miR-185-3p/FLNA, hsa-miR-1-3p/YWHAZ, hsa-miR-30c-5p/YWHAZ и hsa-miR-654-3p/FGA в плацентарной площадке женщин в день родоразрешения на сроке более 34 недель гестации как способ дифференциальной диагностики синдрома задержки развития плода, преэклампсии и синдрома маловесного к сроку гестации плода Российский патент 2022 года по МПК G01N33/58 C12Q1/6806 C12Q1/6851 C12Q1/686 C12Q1/6876 

Изобретение относится к области биомедицины, а именно - к акушерству и молекулярной биологии, к способу дифференцировки патогенетических особенностей синдрома задержки развития плода (СЗРП), преэклампсии (ПЭ) и синдрома маловесного к сроку гестации плода («маловесный плод») в день родоразрешения на сроке более 34 недель гестации по содержанию hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-28-3р, hsa-miR-1-3р, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-185-3р, hsa-miR-654-3р, мРНК YWHAZ, мРНК FGA, мРНК VIM, мРНК ANXA2, мРНК FBN1, мРНК FLNA, двух транскрипционных вариантов мРНК MYL6, включающих транскрипционный вариант 1 и транскрипционный вариант 2, именуемые далее MYL6 tr.v.1 и MYL6 tr.v.2, соответственно, в плацентарной площадке методом количественной ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция, сопряженная с обратной транскрипцией) в реальном времени для последующего расчета логарифмированных по основанию два значений соотношения hsa-miR-30c-5p/VIM, hsa-miR-28-3p/VIM, hsa-miR-1-3p/ANXA2, hsa-miR-30c-5p/FBN1, hsa-miR-15b-5p/MYL6 tr.v.1, hsa-miR-15b-5p/MYL6 tr.v.2, hsa-miR-185-3p/FLNA, hsa-miR-1-3p/YWHAZ, hsa-miR-30c-5p/YWHAZ и hsa-miR-654-3p/FGA. Может быть использовано для верификации диагноза, выставленного по клинико-лабораторным методам исследования, в день родоразрешения для выбора оптимальной тактики ведения матери и ребенка с целью профилактики возможных послеродовых осложнений. С целью решения долгосрочных задач может быть использовано для разработки профилактических мер по предотвращению развития СЗРП, ПЭ и синдрома «маловесный плод» на этапе планирования беременности и в течение беременности для снижения риска осложнений у матери и плода в связи с участием указанных молекул в регуляции работы системы гемостаза, иммунной системы и ангиогенеза.

Аномальная плацентация рассматривается как ключевой патогенетический механизм ПЭ и СЗРП [1]. Как следствие, структурные и функциональные дефекты плаценты предрасполагают к возникновению ряда хронических заболеваний у матери и ребенка после родов, являются причиной перинатальной гибели плода и материнской смертности [2-4]. Согласно мировой статистике, ПЭ встречается в 2-8% беременностей и характеризуется гипертонией, протеинурией и/или периферическими отеками с дополнительными признаками полиорганной недостаточности в зависимости от ее формы: легкой, средней и тяжелой [5, 6]. Тип ПЭ с поздним началом с клиническими проявлениями после 34 недели гестации составляет более 80% всех случаев ПЭ и ассоциирован с нормальным или слегка измененным функциональным состоянием спиральных маточных артерий и отсутствием признаков ЗРП. Тип раннего начала ПЭ (клиническое проявление до 34 недели гестации) включает наиболее тяжелые случаи ПЭ (5-20%) и связан с неполной инвазией вневорсинчатых клеток цитотрофобласта спиральных маточных артерий, что приводит к изменению гемодинамики в системе «мать-плод», гипоксическому повреждению плаценты, системному эндотелиозу сосудов матери с развитием полиорганной недостаточности, нарушению кровотока в пуповинных артериях и развитию СЗРП.

Синдром ЗРП встречается в 5-10% беременностей, характеризуется медленным внутриутробным ростом плода с предполагаемой его массой менее 10-го перцентиля для данного срока беременности как и при синдроме «маловесного плода», но в отличие от последнего при СЗРП отмечаются аномальные показатели кровотока в сосудах плода и пуповине [7, 8]. Ранний СЗРП (выявление клинических признаков до 32 недели беременности) отличается от позднего СЗРП (выявление клинических признаков после 32 недели беременности) по тяжести плацентарной дисфункции [9]. СЗРП с поздним началом манифестации клинических признаков характеризуется более благоприятными исходами, однако имеются сложности в дифференциальной диагностике с конституционально маловесными плодами [10].

На сегодняшний день отсутствуют молекулярно-биологические данные для четкого понимания патогенетических различий СЗРП и ПЭ, а значит отсутствуют предпосылки для разработки оптимальной терапевтической профилактики развития данных синдромов и их осложнений. В предварительных исследованиях методами глубокого секвенирования малых РНК и белковой масс-спектрометрии коллективом настоящего изобретения продемонстрированы наибольшие статистически значимые изменения уровня экспрессии микроРНК (мкРНК) и белок-кодирующих генов в плацентарной площадке пациенток с СЗРП в отличие от ПЭ, при которой основные изменения транскриптомного и протеомного профилей происходят в ткани плаценты (Фиг. 1). мкРНК являются малыми некодирующими РНК длиной в среднем около 22 нуклеотидов, которые регулируют функцию кодирующего белок гена путем комплементарного взаимодействия с матричной РНК (мРНК), обусловливающего снижение стабильности мРНК и/или ингибирование трансляции соответствующего белка. Одна и та же мкРНК может участвовать в регуляции сотни генов-мишеней, в то время как каждый из структурных генов является мишенью для различных мкРНК [11]. Теоретически, экспрессия 60% генов человека находится под контролем мкРНК [12]. мкРНК участвуют во всех биологических процессах, включая метаболизм, пролиферацию, дифференцировку, подвижность и апоптоз клетки. Аномальная экспрессия мкРНК и, соответственно, их генов-мишеней различных сигнальных путей, участвующих в дифференцировке трофобласта и регуляции маточно-плацентарного кровотока, ассоциирована с ПЭ и СЗРП [13]. В связи с этим, важным показателем нарушенной активности сигнальных путей является соотношение мкРНК и их генов-мишеней в ткани плаценты или плацентарной площадки для дифференциальной диагностики ПЭ, СЗРП и синдрома «маловесного плода».

В качестве прототипа предлагаемого метода взят способ, описанный в [14], согласно которому методом количественной ПЦР в реальном времени возможно определить содержание РНК в ткани или биологической жидкости организма посредством циклической реакции амплификации кДНК, являющейся копией РНК и синтезируемой в ходе реакции обратной транскрипции.

Количественное определение мкРНК или мРНК гена-мишени методом ОТ-ПЦР в реальном времени включает в себя три этапа: 1) синтез кДНК (в ходе сопряженных реакций полиаденилирования и обратной транскрипции мкРНК с олиго(дТ), сцепленного с универсальным праймером; или в ходе обратной транскрипции со случайного шестинуклеотидного праймера); 2) амплификацию последовательности кДНК путем цикличной реакции денатурации ДНК, отжига специфичного для мкРНК или мРНК смыслового и антисмыслового праймера, удлинения праймеров ДНК-полимеразой с одновременной детекцией флуоресценции интеркалирующего в двухцепочечную ДНК красителя SYBR green после каждого цикла реакции; 3) анализ полученных результатов и определение относительного количества кДНК в образце. Количество специфической кДНК в образце зависит от концентрации мкРНК или мРНК в биологическом материале, степени деградации анализируемой РНК, эффективности выделения РНК, реакции обратной транскрипции, которая крайне чувствительна к примесям контаминирующих агентов в образце [15], эффективности ПНР. Для того, чтобы учесть влияние вышеперечисленных факторов на количественную оценку специфической кДНК в каждом из образцов анализируют количество нормировочной эндогенной РНК, уровень экспрессии которой не меняется при развитии исследуемого патологического процесса. Для нормировки количества мкРНК в ткани, используют малую ядрышковую РНК SNORD68; для нормировки количества мРНК используют мРНК генов глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (GAPDH) и бета-изоформа актина (АСТВ).

Как правило, относительный уровень экспрессии кДНК определяют по уравнению (I): (M_0s1/M_0s2)=2^-ΔΔCt, где M_0s1 и M_0s2 - исходные количества кДНК в образцах s1 и s2, ΔΔCt=(Ct_s1-Ct_norm1)-(Ct_s2-Ct_norm2), Ct - значение цикла амплификации в точке пересечения кинетической кривой накопления продукта амплификации с линией порогового уровня флуоресценции, который определяется автоматически программным обеспечением амплификатора; Ct_s1 и Ct_s2 - значение порогового цикла амплификации кДНК анализируемой мкРНК в двух сравниваемых образцах s1 и s2; Ct_norm1 и Ct_norm2 - значение порогового цикла амплификации кДНК нормировочной эндогенной или экзогенной мкРНК в двух сравниваемых образцах s1 и s2. Использование метода ΔΔCt возможно при условии, что эффективности реакций амплификации кДНК анализируемой и нормировочной мкРНК равны и близки к 100%.

Задача, решаемая предложенным изобретением, заключается в создании количественного метода определения маркеров СЗРП, ПЭ и синдрома «маловесный плод» в плацентарной площадке женщин на момент родоразрешения, а именно: соотношение hsa-miR-30c-5p/VIM, hsa-miR-28-3р/VIM, hsa-miR-1-3p/ANXA2, hsa-miR-30c-5p/FBN1, hsa-miR-15b-5p/MYL6 tr.v.1, hsa-miR-15b-5p/MYL6 tr.v.2, hsa-miR-185-3p/FLNA, hsa-miR-1-3р/YWHAZ, hsa-miR-30c-5p/YWHAZ и hsa-miR-654-3p/FGA. Предложенный метод применим в клинической практике в качестве дополнительного метода анализа с целью уточнения диагноза согласно клинико-инструментальным методам исследования для выбора оптимальной тактики ведения матери и ребенка с целью профилактики возможных послеродовых осложнений.

Предложенный способ определения соотношения hsa-miR-30c-5p/VIM, hsa-miR-28-3p/VIM, hsa-miR-1-3p/ANXA2, hsa-miR-30c-5p/FBN1, hsa-miR-15b-5p/MYL6 tr.v.1, hsa-miR-15b-5p/MYL6 tr.v.2, hsa-miR-185-3p/FLNA, hsa-miR-1-3p/YWHAZ, hsa-miR-30c-5p/YWHAZ и hsa-miR-654-3p/FGA в плацентарной площадке женщин методом количественной ОТ-ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени предполагает: 1) биопсию плацентарной площадки во время операции кесарево сечение, содержащей децидуальный слой и прилегающий миометрий толщиной 4 мм, вырезаемой ножницами; 2) выделение суммарной РНК из образцов плацентарной площадки колоночным способом, например, набором miRNeasy Micro Kit (Qiagen, Germany) с последующей дополнительной очисткой набором RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen, Germany) в течение 2 часов; 3) определение концентрации РНК, например, набором QubitTM RNA HS Assay Kit (Invitrogen) в флуориметре Qubit fluorometer 3.0 (Life Technologies, Malaysia) в течение 5 минут; 4) определение качества выделенной суммарной РНК, например, набором RNA 6000 Nano Kit (Agilent Technologies, USA) в биоанализаторе Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent, Germany), где показатель целостности РНК (RIN) должен быть равным или более 8, в течение 1 часа; 5) синтез кДНК в ходе реакции обратной транскрипции мкРНК, например, набором mi Script® II RT Kit protocol (Qiagen, Germany) в течение 1 часа 30 минут, и синтез кДНК в ходе реакции обратной транскрипции мРНК, например, с использованием случайных шестинуклеотидных праймеров, буфера MMLV (Promega), дезоксинуклеозидтрифосфатов (Евроген), обратной транскриптазы MMLV (Promega); 6) амплификацию кДНК с помощью ПЦР в реальном времени, например, набором miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Germany) с использованием специфичных для мкРНК смысловых праймеров, и, например, набором qPCRmix-HS (SYBR+HighROX, Евроген) с использованием специфичных для мРНК смысловых и антисмысловых праймеров на приборе StepOnePlusTM thermocycler (Applied Biosystems, USA) в течение 3 часов, которая включает детекцию флуоресцентного сигнала с интеркалирующего в двухцепочечный продукт реакции красителя SYBRGreen в режиме реального времени, построение кривых плавления продуктов реакции, обработку данных и их представление в графическом виде с помощью специального программного обеспечения. Применение ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени позволяет уменьшить риск контаминации и автоматизировать процесс диагностики.

Предлагается количественное определение соотношения мкРНК и мРНК ее гена-мишени, образующих девять пар «мкРНК/мРНК»: hsa-miR-30 с-5p/VIM, hsa-miR-28-3p/VIM, hsa-miR-1-3p/ANXA2, hsa-miR-30c-5p/FBN1, hsa-miR-15b-5p/MYL6 tr.v.1, hsa-miR-15b-5p/MYL6 tr.v.2, hsa-miR-185-3р/FLNA, hsa-miR-1-3p/YWHAZ, hsa-miR-30c-5p/YWHAZ и hsa-miR-654-3р/FGA в плацентарной площадке в день родоразрешения беременных женщин на сроке более 34 недель при сопоставлении с референсными значениями соотношений мкРНК и мРНК в указанных выше парах в нормальной ткани плацентарной площадки соответствующего срока гестации. Полученные в ходе ПЦР в реальном времени для каждого образца плацентарной площадки значения Ct (мРНК), Ct(ACTB), Ct(мкРНК), Ct(SNORD68) вводят в формулу:

и сопоставляют с референсным значением для данной пары «мкРНК/мРНК» в нормальном образце плацентарной площадки.

Осуществление Изобретения.

Пример 1.

Материалом исследования являются образцы плацентарных площадок женщин, родоразрешенных на сроке более 34 недель беременности, из группы с СЗРП (возраст 28-34 года, n=13), из группы ПЭ (возраст 35-37 лет года, n=7), из группы «маловесный плод» (возраст 27-35 лет, n=8), из контрольной группы (возраст 32-34 года, n=7). Таблица 1.

Взятие образца биопсийного материала плацентарной площадки у каждой женщины осуществляли во время операции кесарево сечение, содержащего децидуальный слой и прилегающий миометрий толщиной 4 мм, вырезаемого скальпелем или хирургическими ножницами. Перенесенные в пробирки (Eppendorf) образцы мгновенно погружали в жидкий азот и хранили при -80°С до стадии выделения суммарной РНК. Весь биопсийный материал растирали в порошок в парах жидкого азота, и из 20-40 мг ткани выделяли суммарную РНК набором miRNeasy Micro Kit (Qiagen, Germany) с последующей дополнительной очисткой набором RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen, Germany). Определяли концентрацию РНК набором Qubit™ RNA HS Assay Kit (Invitrogen) в флуориметре Qubit fluorometer 3.0 (Life Technologies, Malaysia). Качество выделенной РНК определяли по значению показателя целостности РНК (RIN) набором RNA 6000 Nano Kit (Agilent Technologies, USA) в биоанализаторе Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent, Germany). В дальнейший анализ были взяты образцы с показателем RIN≥8.

Для количественного анализа мкРНК 500 нг суммарной РНК, выделенной из плацентарной площадки, конвертируют в кДНК в реакционной смеси (20 мкл), содержащей буфер (1x Hispec buffer), смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (1x Nucleics mix) и обратную транскриптазу (miScript RT) в соответствии с протоколом miScript® II RT Kit (Qiagen, Germany); no окончании реакции объем образца доводят деионизованной водой до 200 мкл. Синтезированную кДНК (2 мкл) используют в качестве матрицы для ПЦР в реальном времени с применением прямого праймера (0,2 мкМ), специфичного для hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-28-3р, hsa-miR-1-3р, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-185-3р, hsa-miR-654-3р, SNORD68 (Таблица 2), и 1x реакционную смесь (SYBR PCR Master Mix) с добавленным 1x универсальным обратным праймером (miScript Universal Primer) из набора miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Germany). Протокол амплификации следующий: (1) денатурация ДНК в течение 15 мин при 95°С, (2) 40 циклов амплификации:

денатурация ДНК при 94°С в течение 15 сек, отжиг прямого и обратного праймеров при оптимизированной температуре (Таблица 2) в течение 30 сек, удлинение праймеров при 70°С в течение 30 сек с детекцией флуоресцентного сигнала после каждого цикла реакции, (3) построение кривых плавления продукта ПЦР (нагревание реакционной смеси с 65°С до 95°С с шагом 0,1°С, сопровождающееся детекцией флуоресцентного сигнала на каждом шаге) в амплификаторе StepOnePlus™ thermocycler (Applied Biosystems, USA). Специфичность амплификации проверяют при анализе кривых плавления продукта ПЦР. Относительный уровень экспрессии анализируемых мкРНК (ΔCt₁=Ct(MKPHK) - Ct(SNORD68)) вычисляют по разнице пороговых циклов амплификации кДНК, соответствующих hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-28-3р, hsa-miR-1-3р, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-185-3р, hsa-miR-654-3р, и порогового цикла амплификации кДНК, соответствующей нормировочной эндогенной малой ядрышковой РНК SNORD68 в одном и том же образце (Таблица 3).

Для количественного анализа мРНК, 500 нг суммарной РНК, выделенной из плацентарной площадки, предварительно инкубируют с случайными шестинуклеотидными праймерами (250 пмоль) в объеме 10 мкл при 70°С в течение 5 минут с последующем синтезом кДНК в реакционной смеси (конечный объем - 25 мкл), содержащей lx MMLV буфер (Promega), 1x смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (Евроген), 200 единиц обратной транскриптазы MMLV (Promega), при 37°С в течение 60 минут с последующей инкубацией при 95°С в течение 5 минут и добавлением 75 мкл деионизованной воды. Синтезированную кДНК (2 мкл) используют в качестве матрицы для ПЦР в реальном времени с применением смысловых и антисмысловых праймеров (0,2 мкМ), специфичных для VIM, ANXA2, FBN1, MYL6, FLNA, YWHAZ, FGA, АСТВ мРНК (Таблица 2), и1 реакционную смесь (qPCRmix-HS, SYBR+HighROX, Евроген). Протокол амплификации следующий: (1) денатурация ДНК в течение 15 мин при 95°С, (2) 40 циклов амплификации: денатурация ДНК при 94°С в течение 30 сек, отжиг смыслового и антисмыслового праймеров при оптимизированной температуре (Таблица 2) в течение 30 сек, удлинение праймеров при 70°С в течение 40 сек с детекцией флуоресцентного сигнала после каждого цикла реакции, (3) построение кривых плавления продукта ПНР (нагревание реакционной смеси с 65°С до 95°С с шагом 0,1°С, сопровождающееся детекцией флуоресцентного сигнала на каждом шаге) в амплификаторе StepOnePlusTM thermocycler (Applied Biosystems, USA). Специфичность амплификации проверяют при анализе кривых плавления продукта ПЦР. Относительный уровень экспрессии анализируемых мРНК (ΔCt₂=Ct(MPHK) - Ct(ACTB)) вычисляют по разнице пороговых циклов амплификации кДНК, соответствующих VIM, ANXA2, FBN1, MYL6, FLNA, YWHAZ, FGA, и порогового цикла амплификации кДНК, соответствующей нормировочной эндогенной мРНК АСТВ, в одном и том же образце (Таблица 3).

В соответствии с формулой (2) определяют соотношение мкРНК и мРНК гена-мишени по разнице ΔCt₂ и ΔCt₁ в каждом образце, значение которого можно сопоставить с референсными значениями для контрольной группы (Таблица 4). Уникальными парами «мкРНК/мРНК», дифференцирующими один акушерский синдром от другого, являются для СЗРП - hsa-miR-30c-5p/VIM, hsa-miR-28-3p/VIM, hsa-miR-1-3p/ANXA2, hsa-miR-1-3p/YWHAZ, hsa-miR-15b-5p/MYL6 tr.v.1, hsa-miR-15b-5p/MYL6 tr.v.2, hsa-miR-30c-5p/FBN1; для ПЭ - hsa-miR-185-3p/FLNA. Общей парой для ПЭ, СЗРП, синдрома «маловесный плод» является hsa-miR-654-3p/FGA, но для синдрома «маловесный плод» и ПЭ характерно более резкое снижение соотношения hsa-miR-654-3р и FGA нежели для СЗРП относительно референсных контрольных значений в плацентарной площадке. Общей для ПЭ и СЗРП парой является hsa-miR-30c-5p/YWHAZ, но для ПЭ характерно более резкое снижение соотношение hsa-miR-30c-5p и YWHAZ нежели для СЗРП относительно референсных контрольных значений в плацентарной площадке.

Диагноз СЗРП при анализе ткани плацентарной площадки методом количественной ПЦР в реальном времени ставят при обнаружении в исследуемом образце соотношения log₂(hsa-miR-30c-5p/VIM) в диапазоне (-5.18,-4.32), log₂(hsa-miR-28-3p/VIM) в диапазоне (-5.79, -4.22), log₂(hsa-miR-1-3p/ANXA2) в диапазоне (-8.25.-5.23), log₂(hsa-miR-1-3p/YWHAZ) в диапазоне (-0.55,2.43), log₂(hsa-miR-15b-5p/MYL6tr.v.1) в диапазоне (1.53,2.46), log₂(hsa-miR-15b-5p/MYL6 tr.v.2) в диапазоне (1.02, 2.5), log₂(hsa-miR-30c-5p/FBN1) в диапазоне(-3.7,-2.55), log₂(hsa-miR-654-3p/FGA)B диапазоне (-3.93, 0.83), log₂(hsa-miR-30c-5p/YWHAZ) в диапазоне (0.89,2.63), log₂(hsa-miR-185-3р/FLNA) в диапазоне (-0.91, 1.17).

Диагноз ПЭ при анализе ткани плацентарной площадки методом количественной ПЦР в реальном времени ставят при обнаружении в исследуемом образце соотношения log₂(hsa-miR-30c-5p/VIM) в диапазоне (-5.58, -3.34), log₂(hsa-miR-28-3p/VIM) в диапазоне (-5.41, -2.67), log₂(hsa-miR-1-3p/ANXA2) в диапазоне (-7.28, -4.87), log₂(hsa-miR-1-3p/YWHAZ) в диапазоне (-0.04, 2.18), log₂(hsa-miR-15b-5p/MYL6 tr.v.1) в диапазоне (2.31, 3.29), log₂(hsa-miR-15b-5p/MYL6 tr.v.2) в диапазоне (2.74, 3.29), log₂(hsa-miR-30c-5p/FBN1) в диапазоне (-3.55, -1.78), log₂(hsa-miR-654-3p/FGA) в диапазоне (-2.88, 0.1), log₂(hsa-miR-30c-5p/YWHAZ) в диапазоне (1.55,3.39), log₂(hsa-miR-185-3p/FLNA) в диапазоне (-0.66, 0.13).

Диагноз «маловесный плод» при анализе ткани плацентарной площадки методом количественной ПЦР в реальном времени ставят при обнаружении в исследуемом образце соотношения log₂(hsa-miR-30c-5p/VIM) в диапазоне (-3.78, -2.87), log₂(hsa-miR-28-3p/VIM) в диапазоне (-4.3, -2.61), log₂(hsa-miR-1-3p/ANXA2) в диапазоне (-7.4, -5.13), log₂(hsa-miR-l-3р/YWHAZ) в диапазоне (0.16, 2.6), log₂(hsa-miR-15b-5p/MYL6 tr.v.1) в диапазоне (2.1, 3.06), log₂(hsa-miR-15b-5p/MYL6 tr.v.2) в диапазоне (2.19, 2.99), log₂(hsa-miR-30c-5p/FBN1) в диапазоне (-1.98, -0.98), log₂(hsa-miR-654-3р/FGA) в диапазоне (-2.5, 1.18), log₂(hsa-miR-30c-5p/YWHAZ) в диапазоне (3.22, 4), log₂(hsa-miR-185-3p/FLNA) в диапазоне (-0.61, 1.18).

Фиг. 1. Диаграммы Венна. Сравнение списков дифференциально экспрессированных мкРНК и белков в образцах плацентарных площадок от женщин с СЗРП и женщин с ПЭ относительно контрольных образцов (К)

Список литературы

1. Brosens, I.; Pijnenborg, R.; Vercruysse, L.; Romero, R. The "Great Obstetrical Syndromes" are associated with disorders of deep placentation. Am. J. Obstet. Gynecol. 2011,204,193-201, doi:10.1016/j.ajog.2010.08.009.

2. Burton, G.J.; Fowden, A.L.; Thornburg, K.L. Placental Origins of Chronic Disease. Physiol. Rev. 2016, 96, 1509-1565, doi:10.1152/physrev.00029.2015.

3. Bassily, E.; Bell, C; Verma, S.; Patel, N.; Patel, A. Significance of Obstetrical History with Future Cardiovascular Disease Risk. Am. J. Med. 2019, 132, 567-571, doi:10.1016/j.amjmed.2018.11.029.

4. Bronson, S.L.; Bale, T.L. The Placenta as a Mediator of Stress Effects on Neurodevelopmental Reprogramming. Neuropsychopharmacol. Off. Publ. Am. Coll. Neuropsychopharmacol. 2016, 41, 207-218, doi: 10.103 8/npp.2015.231.

5. Steegers, E.A.P.; von Dadelszen, P.; Duvekot, J.J.; Pijnenborg, R. Preeclampsia. Lancet (London, England) 2010, 376, 631-644, doi: 10.1016/S0140-6736(10)60279-6.

6. Walker, J.J. Management of Severe Pre-Eclampsia/Eclampsia. In Best Practice in Labour and Delivery; Arulkumaran, S.S., Ed.; Cambridge University Press: Cambridge, 2016; pp.301-311 ISBN 9781107472341.

7. Lausman, A.; McCarthy, F.P.; Walker, M.; Kingdom, J. Screening, diagnosis, and management of intrauterine growth restriction. J. Obstet. Gynaecol. Canada JOGC= Gynecol, du Canada JOGC 2012, 34, 17-28, doi:10.1016/S1701-2163(16)35129-5.

8. Nardozza, L.M.M.; Caetano, A.C.R.; Zamarian, A.C.P.; Mazzola, J.B.; Silva, C.P.; Marcal, V.M.G.; Lobo, T.F.; Peixoto, A.B.; Araujo Junior, E. Fetal growth restriction: current knowledge. Arch. Gynecol. Obstet. 2017, 295, 1061-1077, doi: 10.1007/s00404-017-4341 -9.

9. Schlembach, D. Fetal Growth Restriction - Diagnostic Work-up, Management and Delivery. Geburtshilfe Frauenheilkd. 2020, 80, 1016-1025, doi:10.1055/a-1232-1418.

10. Ульянина E. В., Акопян Г. В., Ахмадеев Н. Р. Комплексный подход в диагностике синдрома задержки развития плода // Практическая медицина. 2018. Т. 16, №6. С.52-55.

11. Gerstein М. Genomics: ENCODE leads the way on big data. Nature. 2012 Sep 13;489(7415):208.

12. Sayed D, Abdellatif M. MicroRNAs in development and disease. Physiol Rev. 2011 Jul;91(3):827-87.

13. Hu XQ, Zhang L. MicroRNAs in Uteroplacental Vascular Dysfunction. Cells.

14. 2019 Oct 29;8(11):1344. doi: 10.3390/cells8111344 14.Saunders NA. Real-time PCR. Methods Mol Biol. 2004;266:191-211.

15. Freeman WM, Walker SJ, Vrana KE. Quantitative RT-PCR: pitfalls and potential. Biotechniques. 1999 Jan;26(l): 112-22, 124-5. Review.

Перечень последовательностей

Изобретение относится к области биомедицины, в частности к акушерству и молекулярной биологии, и предназначено для дифференциальной диагностики синдрома задержки развития плода (СЗРП), преэклампсии (ПЭ) и синдрома маловесного к сроку гестации плода. Осуществляют количественную оценку соотношения hsa-miR-30c-5p/VIM, hsa-miR-28-3p/VIM, hsa-miR-1-3p/ANXA2, hsa-miR-30c-5p/FBN1, hsa-miR-15b-5p/MYL6 tr.v.1, hsa-miR-15b-5p/MYL6 tr.v.2, hsa-miR-185-3p/FLNA, hsa-miR-1-3p/YWHAZ, hsa-miR-30c-5p/YWHAZ и hsa-miR-654-3p/FGA в плацентарной площадке женщин в день родоразрешения на сроке более 34 недель гестации. Осуществляют расчет логарифмированных по основанию два значений указанных соотношений. На основании указанного расчета дифференцируют СЗРП, ПЭ и синдром маловесного к сроку гестации плода. Изобретение обеспечивает верификацию диагноза, выставленного по клинико-лабораторным методам исследования, в день родоразрешения для выбора оптимальной тактики ведения матери и ребенка с целью профилактики возможных послеродовых осложнений. 1 ил., 4 табл., 1 пр.

Способ дифференциальной диагностики синдрома задержки развития плода (СЗРП), преэклампсии (ПЭ) и синдрома маловесного к сроку гестации плода, включающий количественную оценку соотношения hsa-miR-30c-5p/VIM, hsa-miR-28-3p/VIM, hsa-miR-1-3p/ANXA2, hsa-miR-30c-5p/FBN1, hsa-miR-15b-5p/MYL6 tr.v.1, hsa-miR-15b-5p/MYL6 tr.v.2, hsa-miR-185-3p/FLNA, hsa-miR-1-3p/YWHAZ, hsa-miR-30c-5p/YWHAZ и hsa-miR-654-3p/FGA в плацентарной площадке женщин в день родоразрешения на сроке более 34 недель гестации, характеризующийся тем, что методом количественной ПЦР в реальном времени в образце плацентарной площадки определяют содержание hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-28-3р, hsa-miR-1-3р, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-185-3р, hsa-miR-654-3р, мРНК YWHAZ, мРНК FGA, мРНК VIM, мРНК ANXA2, мРНК FBN1, мРНК FLNA, двух транскрипционных вариантов мРНК MYL6, включающих транскрипционный вариант 1 и транскрипционный вариант 2, именуемые далее MYL6 tr.v.1 и MYL6 tr.v.2, соответственно, для последующего расчета логарифмированных по основанию два значений соотношения hsa-miR-30c-5p/VIM, hsa-miR-28-3p/VIM, hsa-miR-1-3p/ANXA2, hsa-miR-30c-5p/FBN1, hsa-miR-15b-5p/MYL6 tr.v.1, hsa-miR-15b-5p/MYL6 tr.v.2, hsa-miR-185-3p/FLNA, hsa-miR-1-3p/YWHAZ, hsa-miR-30c-5p/YWHAZ и hsa-miR-654-3p/FGA, и при значениях log₂(hsa-miR-30c-5p/VIM) в диапазоне (-5.18, -4.32), log₂(hsa-miR-28-3p/VIM) в диапазоне (-5.79, -4.22), log₂(hsa-miR-1-3p/ANXA2) в диапазоне (-8.25, -5.23), log₂(hsa-miR-1-3p/YWHAZ) в диапазоне (-0.55, 2.43), log₂(hsa-miR-15b-5p/MYL6 tr.v.1) в диапазоне (1.53, 2.46), log₂(hsa-miR-15b-5p/MYL6 tr.v.2) в диапазоне (1.02, 2.5), log₂(hsa-miR-30c-5p/FBN1) в диапазоне (-3.7, -2.55), log₂(hsa-miR-654-3p/FGA) в диапазоне (-3.93, 0.83), log₂(hsa-miR-30c-5p/YWHAZ) в диапазоне (0.89, 2.63), log₂(hsa-miR-185-3p/FLNA) в диапазоне (-0.91, 1.17) у женщины диагностируют СЗРП, и при значениях log₂(hsa-miR-30c-5p/VIM) в диапазоне (-5.58, -3.34), log₂(hsa-miR-28-3p/VIM) в диапазоне (-5.41, -2.67), log₂(hsa-miR-1-3p/ANXA2) в диапазоне (-7.28, -4.87), log₂(hsa-miR-1-3p/YWHAZ) в диапазоне (-0.04, 2.18), log₂(hsa-miR-15b-5p/MYL6 tr.v.1) в диапазоне (2.31, 3.29), log₂(hsa-miR-15b-5p/MYL6 tr.v.2) в диапазоне (2.74, 3.29), log₂(hsa-miR-30c-5p/FBN1) в диапазоне (-3.55, -1.78), log₂(hsa-miR-654-3p/FGA) в диапазоне (-2.88, 0.1), log₂(hsa-miR-30c-5p/YWHAZ) в диапазоне (1.55, 3.39), log₂(hsa-miR-185-3р/FLNA) в диапазоне (-0.66, 0.13) у женщины диагностируют ПЭ, и при значениях log₂(hsa-miR-30c-5p/VIM) в диапазоне (-3.78, -2.87), log₂(hsa-miR-28-3p/VIM) в диапазоне (-4.3, -2.61), log₂(hsa-miR-1-3p/ANXA2) в диапазоне (-7.4, -5.13), log₂(hsa-miR-1-3p/YWHAZ) в диапазоне (0.16, 2.6), log₂(hsa-miR-15b-5p/MYL6 tr.v.1) в диапазоне (2.1, 3.06), log₂(hsa-miR-15b-5p/MYL6 tr.v.2) в диапазоне (2.19, 2.99), log₂(hsa-miR-30c-5p/FBN1) в диапазоне (-1.98, -0.98), log₂(hsa-miR-654-3p/FGA) в диапазоне (-2.5, 1.18), log₂(hsa-miR-30c-5p/YWHAZ) в диапазоне (3.22, 4), log₂(hsa-miR-185-3p/FLNA) в диапазоне (-0.61, 1.18) у женщины диагностируют синдром маловесного плода.